EA004631B1 - Полипептидные композиции, обладающие повышенной стабильностью - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предложены средства для повышения химической стабильности водных фармацевтических композиций для парентерального использования, включающих полипептид и глицерин. Реакционноспособные альдегиды идентифицируют в коммерческих глицеринах, предложены способы снижения их содержания. Предложены удобные способы анализа реакционноспособных альдегидов в глицерине, и продемонстрирована четкая линейная зависимость между содержанием в глицерине реакционноспособных альдегидов и химической стабильностью композиций, включающих полипептид и глицерин. Настоящее изобретение включает водные композиции, включающие полипептид и глицерин и обладающие повышенной химической стабильностью по сравнению с известными ранее композициями.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины человека. В частности, настоящее изобретение относится к области фармацевтических композиций для лечения различных заболеваний, включая сахарный диабет и гипергликемию.

Предпосылки изобретения

Многие полипептидные фармацевтические композиции используют для лечения заболеваний людей и других млекопитающих. Из-за своей высокой лабильности после перорального введения полипептидные лекарства обычно вводят парентерально. Основными способами введения являются подкожный, внутримышечный и внутривенный.

Полипептидные лекарственные препараты традиционно поставляют в аптеки, больницы и пациентам в виде растворов, суспензий или лиофилизованных продуктов. Жидкая форма каждой полипептидной лекарственной формы требует некоторого минимального уровня химической и физической стабильности в течение определенного промежутка времени, который определяется схемой лечения, удобством для пациента, безопасностью для пациента и регулирующими инструкциями.

Чтобы избежать болевых ощущений или возможных повреждений тканей, жидкие полипептидные лекарственные композиции готовят таким образом, чтобы обеспечить тоничность и осмолярность, близкие по значению к тем, которые присущи жидкостям организма вблизи места введения. Для этой цели часто используют наполнители, такие как глицерин, декстроза, маннит, лактоза, и такие соли, как хлорид натрия. Примеры полипептидных лекарственных препаратов, в которых используется глицерин, включают те, в которых в качестве активного агента используется человеческий инсулин, инсулин йкрто, инсулин акрай и глюкагон.

Глицерин используют также в фармацевтических композициях как солюбилизатор, смачивающий агент, эмульгатор, растворитель, вещество, придающее объем, антиоксидант, хелатирующий агент и консервант |8р1сдс1. Ά.Ι., е! а1., 1. Рйатт. 8ά. 52:917-927 (1963); ^апд, Υ-С. 1, е! а1., 1. Рагеп!ега1 Эгид Аккос. 34:452-462 (1980); К.етшд!оп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек, Маск РиЬйкЫпд Сотрапу 18'¹' Εάίίίοη, р. 1316 (1990); Ь1, 8., е! а1., 1. Рйатт. 8ά. 85:868-872 (1996); 81едег, О.М., е! а1., патент США № 4016273, выданный 5 апреля 1977 года; Нет/, Ό.Ν., \У1Р0 публикация ^098/29131, 9 июля 1998 года].

В некоторых полипептидных композициях физическая нестабильность препятствует использованию солей для придания изотоничности - проблема, которую часто решают, используя глицерин. Однако, как известно, глицерин вносит вклад в химическую нестабильность полипептидных продуктов. В частности, считают, что присутствующие в глицерине примеси, такие как альдегиды, инициируют реакции ковалентной сшивки, что приводит к образованию полипептидных димеров и полимеров. См., например, Ве11о, 1., е! а1. [Атсй. Вюсйет. Вюрйук. 172:608-610 (1976)]. Для инсулиновых продуктов такие димеры и полимеры были связаны с антигенностью и кожной аллергией, о чем сообщают ВоЬЬтк, И.С., е! а1. [И1аЬе!ек 36:838-841 (1987)], ВоЬЬтк, Ό.Ο, е! а1. [О1аЬе!ек 36:147-151 (1987)]; и К.а!пег. В.Е., е! а1. [И1аЬе!ек 39:728-732 (1990)]. Вгапде, 1. е! а1. [Рйатт. Век. 9:727-734 (1992)], которые пришли к выводу, что присутствие ковалентных инсулиновых димеров и полимеров должно быть сведено к минимуму, чтобы избежать этих аллергических реакций, однако, в этих работах не были предложены и не предполагались какие-либо способы для достижения этой цели.

Относительно проблемы получения надежно стабильных полипептидных композиций для парентерального введения, содержащих глицерин, можно сделать три замечания. Вопервых, не существовало простого точного анализа для определения содержания реакционноспособных альдегидов, присутствующих в глицерине, которые приводят к образованию сшитых полипептидных примесей. Во-вторых, в известном уровне техники не существовало указаний или предположений относительно того, что коммерческие партии глицерина, полученные из различных источников, следует оценивать, определяя, есть ли источники, в которых минимальны реакции сшивки полипептидов. В третьих, не существовало удобного, эффективного способа снижения содержания в глицерине реакционноспособных альдегидов, чтобы исключить или свести к минимуму вызываемые альдегидами реакции образования сшивок в водных фармацевтических полипептидных композициях. Каждое из этих трех замечаний далее обсуждается более конкретно.

Определение реакционноспособных альдегидов в глицерине

Отсутствие простого, надежного способа измерения реакционноспособных альдегидных примесей в глицерине, которые приводят к образованию сшитых полипептидных примесей, затрудняло решение проблемы сшитых полипептидов в композициях, содержащих глицерин.

Формальдегид может инициировать сшивание полипептидов за счет реакционноспособных связей в цепочке [8сйетепбетап, 8.Р., е! а1., Р^8 92:11234-11238 (1995) и Етаепке1-Сопта!. Н. е! а1., 1АС8 70:2673-2684 (1948)]. Глицеральдегид и гликольальдегид реагируют с аминогруппами в полипептидных растворах, образуя сшитые полипептиды, как раскрыто у Асйатуа, А.8., е! а1. [Р^8 80:3590-3594 (1983)] и Асйагуа, А.8., е! а1. [Вюсйетщйу 27:4522-4629 (1988)].

Предполагают, что альдегидные примеси в глицерине участвуют в образовании высокомолекулярных полимеров в инсулиновых композициях [Вгапде 1., е! а1., Рйагт. Век. 9:727-734 (1992); Вгапде, 1., 8!аЫ1йу οί Ιηκυΐίη. Кйпгег Леабет1е РиЬйкйегк, Вок!оп, рр. 23-36 (1994); Вгапде, 1., е! а1., Ногтопе Игидк, РиЬйкйеб Ьу !йе и8 Рйагтасорое1а1 Сопуепйоп, ВоскуШе, Магу1аиб, рр. 95-105 (1982)], но не обсуждались способы количественного определения или удаления альдегидных примесей для повышения химической стабильности инсулиновых композиций.

В литературе известно множество способов анализа для определения альдегидов, но их применимость к проблеме определения содержания в глицерине реакционноспособных альдегидов как предшественников полипептидных сшивок в фармацевтических композициях, находится под вопросом.

В Еигореап Рйагтасорое1а 8ирр1етеп1 2000 [Соипсй ок Еигоре, 8!гакЬошд, Егапее, рр. 747751 (1999)] описан тест на альдегиды в монографии о глицерине. В этом тесте используется реагент парарозанилингидрохлорид и стандартный раствор 5 м.д. формальдегида для сравнения.

В фармакопее Великобритании 1999 [Вгй1кй Рйагтасорое1а Соттйкюп, Ьопбоп, рр. 710711 (1999)] описан тест на альдегиды и восстанавливающие вещества в глицерине с использованием парарозанилингидрохлорида и визуального сравнения со стандартным раствором, содержащим 5 м.д. формальдегида.

Реагент Ригра1б, 4-амино-3-гидразино-5меркапто-1,2,4-триазол [Июкшкоп, В.6., е! а1., Сйет. Соттип. р. 15, 1719 (1970)] реагирует с альдегидами и был использован для определения содержания формальдегида в воздухе, гликолях, вакцинах, смолах и изделиях из пластиков и для определения ацетальдегида в срезах тканей печени и во фруктах | Л1бпсй Тесйшса1 1икогта!юп Ви11е!ш № АЬ-145, Л1бг1сй Сйет1са1 Со.; Норрк, Н.В., А1бйсй1т1са Ас!а 33:28-29 (2000)].

Реакция формальдегида с ацетилацетоном с образованием окрашенного продукта раскрыта Ыакй, Т.[Вюсйет. 1. 55:416-425 (1953)]. Этот реагент, по-видимому, довольно специфичен для формальдегида, так как перекрывание за счет ацетальдегида составляет всего 1% в расчете на моль.

В монографии, посвященной глицерину Тйе 1п!егпайопа1 Рйагтасорое1а [Тййб Ебйюп, ^НО, 4:176-181 (1994)], описан тест для альдегидов и восстанавливающих веществ с использованием раствора фуксин/серная кислота. Интенсивность окраски сравнивают с интенсивностью окраски 0,2 М раствора перманганата калия.

В рекламном бюллетене, озаглавленном Ищсоуег !йе Опдшк ок 8оте ок !йе \Уог1б'к Мок!

Сопк1к!еп!1у Риге Ргобис!к; 8уп!йе!ю С1усеппе Ргобис!к Ьу Ио\\' Сйет1са1 Сотрапу (Егеерой, ТХ, И8А), стр. 10-11, Уф спектроскопию используют для сравнения образца глицерина ОРТ1М™ 61усейпе 99,7% И8Р с менее чистыми образцами глицерина. Там не предложены способы количественного определения содержания альдегидов или других органических примесей.

Глицеральдегид реагирует с 3-метил-2бензотиазолинон-гидразонгидрохлоридом (МВТН). 8а\\аскй Е., е! а1. [Апа1. Сйет. 33:93-96 (1961)] показали, что этот реагент реагирует с ИЬ-глицеральдегидом, но в статье обсуждается только лишь определение формальдегида в выхлопных газах автомобилей и проблема загрязнения воздушной среды. Рах, М.А., е! а1. [Агсй. Вюсйет Вюрйук. 109:548-559 (1965)] показали, что Ь-глицеральдегид реагирует с МВТН и предложили способ определения следовых количеств альдегидов в присутствии кетонов, кетокислот и различных типов пиранозных углеводов в процессе биохимических реакций. ЕЬегйагб!, М.А., е! а1. [Маппе Сйетййу 17:199-212 (1985)] раскрывают использование МВТН для определения альдегидов, особенно формальдегида в морской воде и в бактериальных культурах. МВТН используют в коммерческих анализах, используя глутаральдегид или 1,5-пентандиал [61и!ата1бейубе Тек! Кй Мобе1 6Т-1, Насй (Ьоуе1апб, СО, И8А)] в качестве стандарта. В этом тесте используют цветовой круг для определения столь низкого содержания глутаральдегида, как 1 мг/л.

Вайеу, В.^., е! а1. [Апа1. Сйет. 43:782-784 (1971)] показали, что реагент парафенилендиамин реагирует с формальдегидом, ацетальдегидом и бензальдегидом, но оказывается высоко селективным в отношении формальдегида. Его используют для определения низких концентраций формальдегида в воздухе.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили новый МВТН тест с использованием в качестве стандарта глицеральдегида, который можно эффективно использовать для определения содержания реакционноспособных альдегидов, присутствующих в образцах глицерина. Авторы обнаружили также, что уровень сшивок в полипептидных композициях, содержащих глицерин, в значительной степени линейно коррелирует с содержанием реакционноспособного альдегида в глицерине, который используют для приготовления композиций, при определении с помощью вышеуказанного способа определения. Так, новый тест МВТН авторов можно использовать для быстрого предсказания относительной химической стабильности водных полипептидных композиций для парентерального введения, которые включают глицерин, и можно использовать для выбора подходящих партий глицерина для использования при приготовлении таких композиций.

Глицерин, полученный из различных источников

Другим препятствием для решения проблемы полипептидных сшивок в содержащих глицерин композициях было отсутствие понимания важности учета источника получения промышленного глицерина, а также способа получения глицерина. В частности, не существовало указаний или упоминаний о том, что коммерческие партии глицерина, полученного из различных источников, следует оценивать для определения того, являются ли некоторые источники лучше других в плане минимизации реакций образования полипептидных сшивок.

Альдегиды в глицерине образуются в результате автокаталитического или термического окисления, как указывает Мойг, 1., с1 а1. [Патентная заявка Канады № 2242591, опубликованная 13 июля 1998 года]. Как сообщает Ζίβίδ, Ν.^. [1. Атег. 011 Сйеткк' 8ос. 33:556-565 (1956)], процессы, которые используют при коммерческом производстве и очистке глицерина, сильно влияют на конечную степень чистоты глицерина, независимо от исходного материала. Глицерин получали из различных источников, включая животные жиры, растения, продукты ферментации, химический синтез из более мелких органических молекул и из пропилена. Способы получения глицерина из этих и других источников хорошо известны специалистам. Однако до сих пор не исследовали, или не определили влияние, которое оказывают источники на содержание реакционноспособных альдегидов, которые находятся в партиях промышленного глицерина, и на конечную химическую стабильность водных полипептидных композиций для парентерального введения, которые включают глицерин.

Койке, Τ.Ό., е1 а1. [Ттаик. Ат. 8ос. Ατίίί. 1п1егп. 0тдаи8 33:316-318 (1987)] раскрывают новую инсулиновую композицию для использования в имплантируемых насосах, содержащих около 80% глицерина, в которых глицерин животного происхождения заменен глицерином из произвольного синтетического источника, который авторы подвергают дальнейшей очистке, используя ионообменную колонку со смешанным слоем. Новые и использованные ранее композиции отличаются также по значениям рН, ключевому фактору, который влияет на степень реакций сшивок в инсулиновых композициях. При лечении пациентов с сахарным диабетом более длительный цикл вливаний и использование меньшего количества инсулина при новых композициях предполагает повышенную стабильность, которая связана с различием величин рН и дополнительной очисткой синтетических глицеринов.

Используя описанный здесь тест МВТН, авторы с удивлением обнаружили, что промышленные партии глицерина, полученные не из животных источников, имеют более низкое со держание реакционноспособных альдегидов, нежели глицерины, полученные из животных источников. Это продемонстрировано для глицерина, полученного из растений и пропилена. Глицерин, полученный из пропилена, отличается особенно низким содержанием реакционноспособных альдегидов. Авторы обнаружили также, что партии промышленного глицерина, полученного из растительных источников и пропилена, через месяц хранения содержат в среднем гораздо меньше реакционноспособных альдегидов, нежели партии глицерина, полученного из животных источников, что дает возможность предположить, что содержание реакционноспособных альдегидов с течением времени возрастает быстрее в глицеринах, полученных из животных источников, нежели в глицеринах, полученных из растений и пропилена.

Кроме того, авторы обнаружили, что водные фармацевтические композиции полипептидов для парентерального использования, включающие глицерин, полученный из пропилена, обладают повышенной химической стабильностью по сравнению с аналогичными композициями, полученными с глицерином животного происхождения.

Снижение содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине

И, наконец, не было предложено простого эффективного способа снижения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине для повышения химической стабильности фармацевтических полипептидных композиций, включающих глицерин. Ве11о, 1. [Вюейеткйу 8:4535-4541 (1969)] и Ве11о, 1., е1: а1. [Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 172:608-610 (1976)] пытались предотвратить сшивание в растворах белков, содержащих глицерин, путем очистки глицерина. Глицерин вначале обрабатывали восстанавливающим агентом, боргидридом натрия. После стадии восстановления глицерин обрабатывали МВ-3 смолой для удаления неорганических солей, и наконец, перегоняли в вакууме. Не существует указаний на содержание реакционноспособных альдегидов до или после такой обработки. Уменьшение образования сшивок, достигаемое в результате такой очистки глицерина, не было длительным. Различные способы очистки глицерина раскрыты также у К|кк1ск. 1.А., е1 а1. |Тесйпк|ие5 о! Сйеткйу II: Отдашс 8океик, Рйу81са1 Рторетйез аик Ме1йок§ о! Рипйсайои, ^11еу-1и!ег8с1еисе, Νονν Уотк, рр. 689-690 (1970)], ϋΪ3ζ, Ζ., е1 а1. [патент США № 4683347, выданный 28 июля 1987 года], 81тотдик1, И.М., е1 а1. [1ик. Еид. Сйет. 43:1065-1070 (1951)] и Ζ^е18, упомянутого ранее, но ни в одной из работ нет указаний на снижение содержания реакционноспособных альдегидов за счет контактирования глицерина с полимерной смолой, содержащей свободные аминогруппы. ^акйайаидй, М.№., е1 а1. [Аиа1. Вюсйет. 134: 144-152 (1983)] описывают громоздкую процедуру для сниже ния содержания альдегидов в этиленгликоле, которая включает восстановление боргидридом натрия, четырехкратное разбавление водой и пропускание водного раствора через хроматографические колонки, содержащие различные смолы. Содержание альдегидов в растворе снижается на 86% по данным, полученным с использованием МВТН и гликольальдегида в качестве стандарта.

ΜοΙιγ. 1., с1 а1., (ссылка была приведена ранее), раскрывают очистку этиленгликоля за счет контактирования раствора с восстанавливающим фосфорным соединением. Содержание альдегидов по данным МВТН снижалось. Мигао, с1 а1. [патент США Νο. 5969175, выданный 19 октября 1999] раскрывают способ очистки нитрила, содержащего альдегид, путем контактирования нитрила с катионообменной смолой, содержащей полиамин. Нет предположений о том, что какой-либо из этих способов можно использовать для снижения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине для повышения химической стабильности полипептидных композиций, включающих глицерин.

Авторы обнаружили простой эффективный способ снижения содержания реакционноспособных альдегидов в образцах глицерина, который обеспечивает повышенную химическую стабильность полипептидных композиций, включающих глицерин. Этот способ позволяет избежать использования восстанавливающих агентов, избежать необходимости разбавлять глицерин, и совместим с непосредственным использованием очищенного глицерина в композициях, включающих полипептиды.

Описанные выше открытия были объединены для получения новых препаратов полипептидных композиций для парентерального введения, содержащих глицерин, которые обладают повышенной химической стабильностью по сравнению с известными ранее полипептидными композициями. Эти стабилизированные полипептидные композиции обеспечивают повышенную безопасность для пациентов, которые используют их для лечения своих заболеваний или болезненных состояний.

Краткое содержание изобретения

Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения состоит в использовании глицерина не животного происхождения в качестве глицериновой компоненты в водных композициях для парентерального введения, включающих полипептид и глицерин, для повышения химической стабильности композиции.

Повышенная химическая стабильность направлена на снижение содержания образовавшихся ковалентно сшитых полипептидов, благодаря тому, что глицерин, используемый для приготовления композиции, имеет более низкое содержание реакционноспособных альдегидов. Более конкретно, настоящее изобретение создано для использования глицерина, полученного из растений или пропилена, для повышения химической стабильности водных фармацевтических композиций для парентерального введения, включающих полипептид и глицерин.

Другой аспект настоящего изобретения составляет использование глицерина, в котором содержание реакционноспособных альдегидов составляет менее 8 м.д., в качестве глицериновой компоненты в водных фармацевтических композициях для парентерального использования, включающих полипептид и глицерин, для повышения химической стабильности композиции.

Следующий аспект настоящего изобретения составляет водная фармацевтическая композиция для парентерального введения, включающая полипептид и глицерин, где глицерин получен не из источника животного происхождения.

Следующий аспект настоящего изобретения составляет водная фармацевтическая композиция для парентерального введения, включающая полипептид и глицерин, где содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляет менее 8 м. д.

Другой аспект настоящего изобретения составляет способ получения водной фармацевтической композиции для парентерального введения, включающей воду, полипептид и глицерин не животного происхождения.

Другой аспект настоящего изобретения составляет способ получения водной фармацевтической композиции для парентерального введения, включающей воду, полипептид и глицерин, в котором содержание реакционноспособного альдегида составляет менее 8 м.д.

Другой аспект настоящего изобретения составляет способ снижения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, включающий осуществление контакта глицерина с твердым осушающим агентом и полимерной смолой, содержащей свободные аминогруппы.

Композиции настоящего изобретения могут быть в форме растворов или суспензий, в которых полипептид остается частично или полностью нерастворимым в композиции. Композиция может быть также в форме продуктов в двух отдельных упаковках, где полипептид, находящийся в твердой форме, объединяют с раствором разбавителя, включающим глицерин, непосредственно перед парентеральным введением.

Полипептид, содержащийся в фармацевтической композиции настоящего изобретения, может быть синтезирован химически или может быть получен с помощью биосинтеза с использованием методик рекомбинантных ДНК.

Настоящее изобретение включает использование композиции настоящего изобретения в качестве лекарства или использование ее при получении лекарства для лечения заболеваний у млекопитающих.

Краткое описание чертежа

Чертеж демонстрирует линейную зависимость (К² = 0,90) между результатами анализов промышленных партий глицерина, полученного из источников не животного происхождения, осуществленных с помощью МВТН теста настоящего изобретения и модифицированного 10Х-68Т теста.

Подробное описание изобретения

Термин глицерин относится к химическому соединению пропан-1,2,3-триол, СА8 регистрационный номер [56-81-5]. Эмпирическая формула глицерина имеет вид С(3)Н(8)О(3), а его структурная формула имеет вид ОН-СН₂-СН(ОН)-СН₂-ОН. В некоторых литературных источниках термин глицерол используют для обозначения химического соединения, термин глицерин относится к очищенным промышленным продуктам, содержащим 95% или более глицерола, и термин глицерин используют в качестве коммерческого названия продуктов, основным содержанием которых является глицерол. В настоящем описании глицерин, означая химическое соединение пропан-1,2,3-триол, может быть включен в водные фармацевтические композиции для парентерального введения настоящего изобретения, с использованием любого раствора, включающего химическое соединение пропан-1,2,3триол.

Концентрацию глицерина в фармацевтической полипептидной композиции настоящего изобретения определяют в единицах миллиграмм пропан-1,2,3-триола в миллилитре композиции, и она составляет менее 500 мг/мл.

Глицерин был впервые открыт в 1779 году Саг1 V. 8скее1е, который получил его, нагревая оливковое масло с окисью свинца. С этого времени для производства глицерина было использовано, по крайней мере, пять различных источников материалов.

Одним из источников глицерина являются животные. Твердый жир или сало животных, таких как крупный рогатый скот и овцы, этерифицируют, а затем омыляют в процессе, при котором глицерин образуется как побочный продукт производства мыла. Животные жиры также гидролизуют или омыляют непосредственно для получения глицерина.

Вторым промышленным источником глицерина являются растения. Обычно масла, получаемые из кокосов, пальм, канолы, сои или других растений, используют для производства глицерина способами, которые сравнимы со способами, в которых используют животные жиры.

Третьим источником глицерина является процесс ферментации. Глицерин получают в результате процесса ферментации таких природных источников, как меласса сахарной свеклы, или используя микроорганизмы, модифицированные с помощью рекомбинантной ДНК технологии, такие как те, которые указаны Виккшз, В. А., с1 а1. |^1РО публикация ^098/21340, 22 мая 1998 года] и ЫащК.. V., е1 а1. |^1РО публикация XVО 98/28480, 10 июня 1999 года].

Четвертым источником глицерина является химический синтез, исходя из органических молекул, содержащих менее трех атомов углерода. Один из таких способов, в котором используют метанол, описан Отез1еу, Э.С., е1 а1. [патент США № 4076758, выданный 28 февраля 1978 года].

Пятым источником глицерина является пропилен, который получают из нефтяных продуктов. Глицерин, полученный из пропилена, стал доступен, начиная примерно с 1948 г. Доступно множество синтетических способов превращения пропилена в глицерин, включая те, которые раскрыты Отез1еу, Ό. С, е1. а1., (ссылка приведена ранее), Кйк-ОШтег [Еисус1ореб1а о£ Скет1са1 Тес1шо1оду 12:681-694 (1994)] и в К.етшд1ои'з Ркагтасеи11са1 8с1еисез [Маск РиЬНзЫпд Сотраиу, 18⁴¹¹ 5 Ебйюи, р. 1316 (1990)]. В одном из способов синтеза, например, пропилен хлорируют до аллилхлорида, затем превращают его в гипохлорноватистую кислоту для получения дихлоргидрина, подвергают взаимодействию с гидроксидом кальция для получения эпихлоргидрина, и, наконец, гидролизуют до глицерина.

Глицерин коммерчески доступен из различных источников, от различных поставщиков и распространителей [см. Скетюа1 Vеек, 8рес1а1 1ззие Виуег'з Сшбе, 159:321-322 (1997), и Скет1са1 1ибиз1гу Еигоре 93; Тке Ьеабшд СиШе £ог Тобау'з Еигореаи Скетка1 1ибиз1гу (1993)].

Глицериновые продукты, полученные из растений, включают Рпсегше 9091 [Ишскета №г111 Атенса, СЫсадо, 1Ь, И8А] , Козкег 8ирего1 61усегше [Ргос1ог аиб СатЬ1е Скетка1з, Сшсшиак, ОН, И8А], 61усепие-99,7% [Скетюа1 Аззос1а1ез о£ 111шо1з, 1ис., Сор1еу, ОН, И8А], Етегу® 61усегше-99,7% Козкег [Неике1 Согрогакои, Стскша1г ОН, И8А] и безводный глицерин высшей степени чистоты (С1усего1 аикубгоиз ех!га риге) [ЕМ 1ибиз1пез, Нате1коте, ΝΥ, И8А].

Глицериновые продукты, полученные из пропилена, включают Оркт™ 61усепие 99,7% И8Р Роте Ске1шса1 Сотраиу, Ггеерой ТХ, И8А], 61усегш, зугИкекс [8окау Р1иог1без, 1ис, Сгееитеюк, СТ, И8А] и ОрОт™ 61усегше 99,7%, Роте Ске1шса1 Сотраиу. 81абе, Сегтаиу]. Глицерин, полученный из пропилена, использовали в качестве вспомогательного вкусового агента для покрытия зерен попкорна [8ске11каазз, 8.К., патент СшА № 5750166, выданный 12 мая 1998 года], и использовали в низких концентрациях в хирургических лосьонах [8скоН, М.Т., е1 а1., патент США № 5951993, выданный 14 сентября 1999 года]. Глицерин, полученный из пропилена, использовали также в пищевых продуктах и фармацевтических препаратах [Бооб Епщпееппд. 1п1етпайопа1 Εάίίίοη (СЫИоп Сотрапу), р. 14 (1997)].

Термин глицерин не животного происхождения относится к глицерину, который получен не из жира или какой-либо другой части животного. Источники производства глицерина не животного происхождения включают растения, пропилен, продукты ферментации и химического синтеза из более мелких органических молекул.

В настоящем изобретении предложена водная фармацевтическая композиция для парентерального введения, включающая полипептид и глицерин, где концентрация глицерина в композиции составляет менее 500 мг/мл. Концентрация глицерина относится к концентрации пропан-1,2,3-триола. Предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в композиции составляла от около 1 мг/мл до около 300 мг/мл. Более предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в композиции составляла от около 3 мг/мл до около 100 мг/мл. Более предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в водной фармацевтической полипептидной композиции составляла от около 10 мг/мл до около 30 мг/мл. Более предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в композиции составляла от около 20 мг/мл до около 25 мг/мл. Более предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в композиции составляла около 22 мг/мл. Другой предпочтительный интервал концентрации глицерина в композиции составляет от около 15 мг/мл до около 18 мг/мл. Более предпочтительно, чтобы концентрация глицерина в композиции составляла около 16 мг/мл.

Термин альдегид относится к классу органических соединений, содержащих СНО радикал или функциональную группу.

Термин реакционноспособный альдегид относится к тем альдегидам, которые а) присутствуют в качестве примеси в промышленных партиях глицерина, и Ь) реагируют с аминогруппами, присутствующими в водных фармацевтических полипептидных композициях, что приводит к образованию ковалентных полипептидных димеров и/или полимеров. Примером реакционноспособного альдегида является глицеральдегид.

Термин МВТН относится к химическому соединению, 3 -метил-2-бензотиазолинонгидразонгидрохлориду, СЛ8 регистрационный номер [14448-67-0].

Термин МВТН тест относится к способу определения содержания реакционноспособного альдегида в образцах глицерина с использованием глицеральдегида в качестве стандарта, который подробно раскрыт в разделе Способ 1.

Сокращение м.д. относится к миллионным долям в расчете на массу. Для целей настоящего изобретения, м. д. относится к милли онным долям реакционноспособных альдегидов присутствующего в образце глицерина. Более конкретно, термин м.д. относится к массе реакционноспособных альдегидов относительно массы глицерина. Так, например, величина 2 м. д. в тесте МВТН для конкретной партии глицерина соответствует 2 мас. ч. реакционноспособных альдегидов на миллион массовых частей глицерина. Это эквивалентно концентрации 2 мкг/г или 2 мг/кг реакционноспособных альдегидов в глицерине. Если образец глицерина разбавлен другим растворителем до проведения анализа, тогда результаты теста, выраженные в м. д., следует умножить на степень разбавления, чтобы получить количество реакционноспособных альдегидов, выраженное в м.д. исходного неразбавленного глицерина.

В одном из вариантов изобретения предложена водная фармацевтическая полипептидная композиция, которая включает глицерин не животного происхождения. В этом варианте настоящего изобретения можно приготовить фармацевтическую композицию, не измеряя содержание альдегидов в глицерине до его использования. Однако предпочтительно анализировать глицерин, который используют для получения полипептидной композиции, до его использования, и предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в нем составляло менее 33 м.д. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло менее 24 м.д.. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло 15 м. д. или менее. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло менее 8 м.д. И наиболее предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, который используют для получения полипептидных композиций настоящего изобретения, составляло 3 м.д. или менее.

Для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, который используют для получения полипептидных композиций настоящего изобретения, можно использовать различные способы. Одним из таких способов является новый способ с использованием ВЭЖХ, описанный в разделе Способ 4. В другом варианте можно использовать известные специалистам способы анализа альдегидов. Содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, который используют для получения полипептидных композиций настоящего изобретения, предпочтительно определять способом, в котором в качестве стандарта используют глицеральдегид. Более предпочтительно определять содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине с помощью раскрытого здесь теста МВТН.

Термин 10Х-О8Т относится к глицериновому стрессовому тесту, при котором содер жание глицерина в растворимом препарате инсулина в 10 раз больше, чем обычно, который был создан для того, чтобы ускорить реакцию образования в инсулине ковалентных димеров и полимеров. Этот тест подробно описан далее в разделе Способ 2.

Термин Моб. 10Х-С8Т относится к глицериновому стрессовому тесту, при котором содержание глицерина в суспензионной композиции инсулина в 10 раз больше, чем обычно, который был создан для того, чтобы ускорить реакцию образования в инсулине ковалентных димеров и полимеров. Этот тест подробно описан далее в разделе Способ 3.

Термин полипептид относится к соединению, включающему три или более аминокислот и, по крайней мере, одну свободную аминогруппу, и включает его аналоги и производные. Полипептиды можно получить с помощью химического синтеза и/или с помощью биосинтеза, с использованием рекомбинантной ДНК технологии.

Полипептиды могут содержать одну или более цепочек аминокислот, соединенных вместе ковалентными связями, такими, как дисульфидные связи, или в результате не ковалентных взаимодействий. Небольшие полипептиды здесь могут также называться пептидами. Крупные полипептиды здесь могут называться белками.

Полипептиды, включенные в композиции настоящего изобретения, могут содержать природные Ь-аминокислоты или не природные аминокислоты, такие как Б-аминокислоты.

Аминокислотные последовательности полипептидов могут быть идентичны последовательностям, которые встречаются у животных или в других организмах, или могут быть их аналогами, в которых последовательность изменена различными способами. В аналогах полипептидов одна или более из аминокислот может быть добавлена, удалена или заменена другими аминокислотами у Ν-конца, С-конца или внутри полипептида. Аналоги полипептидов хорошо известны специалистам.

Полипептиды, которые должны быть включены в композиции настоящего изобретения, могут также содержать органические химические группы, присоединенные к аминокислотным боковым цепям, к Ν-концевой аминогруппе или к С-концевой карбоксильной группе полипептида. Такие соединения являются примерами производных полипептидов. Другие примеры производных полипептидов включают гликопептиды, в которых природные полисахариды присоединены к боковым цепям аминокислот аспарагина или треонина. Другие группы, создающие производные, которые могут быть присоединены к полипептидам, включают ацильные группы и полиэтиленгликоль. Производные полипептидов хорошо известны специалистам.

Полипептиды, включенные в композиции настоящего изобретения, могут присутствовать в различных формах, включая форму фармацевтически приемлемых солей. Термин фармацевтически приемлемая соль полипептида означает соль, образованную одной или более из заряженных групп полипептида и одним или более из фармацевтически приемлемых, нетоксичных катионов или анионов. Органические и неорганические соли включают, например, соли натрия, калия, ТгЕ. кальция, цинка или магния и соли, полученные из таких кислот, как хлористоводородная, серная, сульфоновая, винная, фумаровая, гликолевая, лимонная, малеиновая, фосфорная, янтарная, уксусная, азотная, бензойная, аскорбиновая, п-толуолсульфоновая, бензолсульфоновая, нафталинсульфоновая, пропионовая, угольная и т. п.

Полипептиды, включенные в композиции настоящего изобретения, можно выделить из таких источников, как трансгенные растения или трансгенные животные, или можно получить способами химического синтеза, включая классические (в растворе) способы, способы получения в твердой фазе, полусинтетическими способами или другими способами, хорошо известными специалистам.

Полипептиды, включенные в композиции настоящего изобретения, можно также получить биосинтетическими способами с использованием технологии рекомбинантных ДНК. См., например, Сйаисе, Я.Е., с1 а1., патент США № 5514646, выданный 7 мая 1996 года; Сйаисе, К..Е., е1 а1., ЕРО публикация № 383472, 7 февраля 1996 года; Вгаиде, 1., е1 а1., ЕРО публикация № 214826, 18 марта 1987 года; и Ве1ада]е, К..М., е1 а1., патент США № 5304473, выданный 19 апреля 1994 года. Используя технологию рекомбинантных ДНК, полипептиды или их предшественники можно получить с помощью биосинтеза в любых из ряда клеток-хозяев, включая бактерии, клетки млекопитающих, клетки насекомых, дрожжи и грибки. Более предпочтителен биосинтез в бактериях, дрожжах и в клетках млекопитающих. Наиболее предпочтителен биосинтез в Е. сой или в дрожжах. Примеры биосинтеза в клетках млекопитающих и трансгенных животных раскрыты Нако1а, К. [Мо1еси1аг апб Се11и1аг Епбосгшо1о§у, 127:59-69, (1997)].

Специально исключены предназначенные для включения в композиции настоящего изобретения природные полипептиды, которые выделены из тканей, желез, органов, крови, мочи или каких-либо других частей нетрансгенных животных. Примером исключенного полипептида является свиной инсулин, который получают из поджелудочной железы поросят.

Предполагается, что настоящее изобретение применимо к любым полипептидам и включает (наряду с другими) антитела, цитокины, рецепторы, полипептидные гормоны и их фраг менты. Композиции настоящего изобретения могут также включать более одного полипептида. Не ограничивая общей сути настоящего изобретения, для лучшего понимания его читателем будут перечислены некоторые конкретные полипептиды и группы полипептидов.

Предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из рекомбинантного человеческого инсулина, рекомбинантного свиного инсулина и рекомбинантного бычьего инсулина.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из мономерных аналогов инсулина. См., например, Βαίχοΐιιηίάΐ. Р., е! а1., патент США № 5164366, выданный 17 ноября 1992 года; Вгапде, 1., е! а1., патент США № 5618913, выданный 8 апреля 1997 года; С На псе, К..Е., е! а1., патент США № 5514646, выданный 7 мая 1996 года; и ЕгИ, 1., е! а1., ЕРО публикация 885961, 23 декабря 1998 года. Особенно предпочтительны мономерные аналоги инсулинов, в которых аминокислотные остатки в положении В28 представляют Акр, Ьук, 11е, Ьеи, Уа1 или А1а, а аминокислотные остатки в положении В29 представляют Ьук или Рго. Наиболее предпочтительными мономерными аналогами инсулина являются Ьук(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин. Акр(В28)-человеческий инсулин и Ьук(В3)11е(В28)-человеческий инсулин.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из аналогов инсулина, причем у этих аналогов инсулина изоэлектрическая точка находится между 7,0 и 8,0. Эти аналоги называют инсулиновыми аналогами с ρίсдвигом. Наиболее предпочтительная группа аналогов с р1-сдвигом состоит из Агд(В31) Агд(В32)-человеческого инсулина и О1у(А21) Агд(В31)Агд(В32)-человеческого инсулина.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из производных инсулина и производных аналогов инсулина.

Более предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из ацилированных производных инсулина и ацилированных производных аналогов инсулина. Более предпочтительная группа полипептидов состоит из ацилированных производных инсулина и ацилированных производных аналогов инсулина, в которых ацильная группа состоит из насыщенных жирных кислот с неразветвленными цепями. Примеры насыщенных жирных кислот с неразветвленными цепями включают углеводороды С4, С6, С8, С10, С12, С14, С16 и С18. Наиболее предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из пальмитоил-е-Еук(В29)-человеческого инсулина и миристоил-е-Еук(В29) дез(В30)-человеческого инсулина, причем неразветвленные цепочки пальмитоила(С16) и миристоила(С14) присоединены к эпсилон (ε) аминогруппе Ьук(В29) остатка.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из глюкагоно-подобного пептида-1 (ОЬР-1), аналога ОЬР-1, производных ОЬР-1 и производных аналогов ОЬР-1. Как это принято специалистами, аминоконцу ОЬР-1 (737)ОН был присвоен номер 7, а карбоксильному концу был присвоен номер 37. Более подробное описание аналогов ОЬР-1 и производных можно найти у Нойтапп, 1.А. 1^099/29336, публикация 17 июня 1999 года] и Кпибкеп, Ь.В., е! а1. [1. Меб. Сйеш. 43:1664-1669 (2000)]. Примером производного ОЬР-1 аналога является Агд(34), Ж:-(у-С1и(Ж(/.-гексадеканоил))-Ьу5(26)-СЬР1(7-37)ОН, описанный №е1коп, 1., е! а1. |\¥О 00/07617, публикация 17 февраля 2000 года]. Более предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из природного ОЬР-1(736)ΝΗ₂, природного ОЬР-1(7-37)ОН, Уа1(8)ОЬР-1(7-37)ОН, О1у(8)-ОЬР-1(7-37)ОН и

Агд(34), N-ε-(у-О1и(N-α-гексадеканоил))Ьук(26)-ОЬР-1(7-37)ОН.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из эксендина, аналогов эксендина, производных эксендина и производных аналогов эксендина. Эксендиновые полипептиды и аналоги включают эксендин-3 и эксендин-4, описанные Уоипд, А., е! а1. [^1РО публикация XVО 00/41546, 20 июля 2000 года). Примеры производных эксендина и производных аналогов эксендина описаны Кпибкеп, е! а1. ^1РО публикация VО 99/43708, 2 сентября 1999 года]. Более предпочтительным полипептидом для включения в композиции настоящего изобретения является эксендин-4.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из фактора, стимулирующего колонии гранулоцитов (О-С8Р), описанного Оо1бепЬегд, М.8., е! а1. ^1РО публикация VО 00/38652, 6 июля 2000 года], О-С8Р аналогов, О-С8Р производных и производных аналогов О-8СР. О-С8Р композиции настоящего изобретения могут быть в форме растворов или суспензий. Предпочтительны суспензионные композиции О-С8Р.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из лептина, аналогов лептина, производных лептина и производных аналогов лептина. Более предпочтительная группа полипептидов состоит из ацилированных аналогов лептина. Более подробное описание последовательности природного лептина и примеры аналогов лептина можно найти у Веа!к, 1.М. е!

а1. [ЕРО публикация № 849276, 24 июня 1998 года].

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из полной длины паратироидного гормона человека РТН(1-84), его фрагментов, таких как РТН(1-38) и РТН(1-34), и его аналогов и производных [См. СЬапд, С-М., е! а1., ΧΥΙΡΟ публикация XV О 99/29337, 17 июня

1999 года]. Более предпочтительная группа полипептидов состоит из РТН(1-34) человека и РТН(1-84) человека.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из рекомбинантного гормона, стимулирующего фолликулы (Е8Н), его рекомбинантных аналогов и его производных. Е8Н представляет собой гетеродимерный гликопротеин, в котором альфа и бета субъединицы связаны не ковалентно, как раскрыто 8 Но те. е1 а1. [1. Рго!. СЬет., 7:325-339, (1988)]. Более предпочтительная группа полипептидов состоит из рекомбинантных Е8Н человека и рекомбинантных аналогов Е8Н, в которых удалены один, два, три или более из С-концевых аминокислотных остатков, природно кодирующих бета субъединицу, и их гликозилированных производных.

Другая предпочтительная группа полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения состоит из рекомбинантного человеческого гормона роста (НСН), рекомбинантного бычьего гормона роста (ВОН) и их аналогов и производных. Более предпочтительная группа полипептидов состоит из рекомбинантного НОН и рекомбинантного ВОН.

Предпочтительными полипептидами, которые могут быть включены в водные фармацевтические композиции для парентерального введения настоящего изобретения, являются Е8Н или его аналоги или производные, РТН или его фрагменты, аналоги или производные, НОН или его аналоги, человеческий лептин или его аналоги или производные, человеческий инсулин или его аналоги или производные, или производные аналогов человеческого инсулина.

В водные фармацевтические композиции для парентерального введения настоящего изобретения могут быть включены несколько полипептидов. Примеры таких комбинаций включают (наряду с другими) смеси амилина или пептида агониста амилина и инсулина, как это описано Соорег, С.1.8. [патент США № 5124314, выданный 23 июня 1992 года] и Ь'ИаНеп, 1., е! а1. [патент США № 6136784, выданный 24 октября

2000 года].

Полипептиды в фармацевтических композициях настоящего изобретения биологически активны. Эту активность можно продемонстрировать ίη У11го или ίη у|уо. и она обусловлена взаимодействием полипептидов с рецепторами и/или другими внутриклеточными или внекле точными сайтами, что и определяет биологический эффект.

Термин водный описывает жидкий растворитель, который содержит воду. Системы водных растворителей могут состоять из одной воды или могут включать воду плюс один или более из смешивающихся с водой растворителей, и могут содержать растворенные в ней вещества, такие как сахара или другие наполнители.

Термин водная композиция для парентерального использования относится к фармацевтической композиции для парентерального введения, количество воды в которой составляет 500 мг/мл или более.

Термин фармацевтическая означает, что она содержит лекарственное вещество или препарат, которые используют для лечения заболеваний. Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат полипептиды, обладающие биологической активностью. Композиции приготавливают способом, подходящим для фармацевтического использования и соответствующим его фармацевтическому использованию.

Термин парентеральный означает доставку или введение лекарства нуждающемуся в этом пациенту способом, который отличается от введения через кишечник. Предпочтительными способами парентерального введения полипептидных композиций настоящего изобретения являются подкожный, внутримышечный, внутривенный, за щеку, через нос, через легкие, внутриглазной и чрескожный.

Термин химически стабильный относится к образованию ковалентно связанных полипептидных димеров и полимеров, инициируемому реакционноспособными альдегидами в полипептидной композиции. Стабильной композицией является такая композиция, в которой скорость образования ковалентно связанных полипептидных димеров и полимеров контролируется приемлемым образом и не возрастает неприемлемым образом с течением времени. Термин повышенная в отношении химической стабильности конкретной композиции означает, что для нее уровень повышения высокомолекулярных полипептидных димеров и полимеров после некоторого промежутка времени меньше, чем уровень для композиции, полученной и обработанной сопоставимым способом. Химическую стабильность можно оценить способами, хорошо известными специалистам. Примеры определения химической стабильности с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам включены в описываемые здесь 10Х-С8Т и модифицированный 10Х-С8Т способы.

Раньше при разработке полипептидных композиций для фармацевтического использования проводили эксперименты для определения того, какие наполнители следует включать в композицию. Обычно композиции создают та ким образом, чтобы они включали как можно меньшее число и количества наполнителей, необходимых для обеспечения эффективности продукта, который отвечает требованиям безопасности и стабильности для пациента и для регулирующих органов. Требования стабильности включают как физическую, так и химическую стабильность.

В композициях, использующих глицерин, количество ковалентных сшивок полипептидов, инициируемое реакционноспособными альдегидами, должно быть сведено к минимуму во время обычного хранения изготовленного продукта. Например, для инсулиновых растворов содержание высокомолекулярного белка должно оставаться ниже 1,5% во все время хранения продукта в холодильнике. [И8Р 2000, ИпПеб 81а1с5 Рйагтасоре1а1 Соиуеийоп, 1пс. КоскуШе. ΜΌ, И8Л (1999)]. Изготовители прилагают усилия для постоянного удовлетворения этого типа требований к хранению, чтобы гарантировать безопасность продукта для пациента. Для содержащих глицерин полипептидных композиций важна проблема реакции ковалентной полимеризации, инициируемая реакционноспособными альдегидами. Было бы непредусмотрительно просто включать любую партию промышленного глицерина в полипептидные композиции для использования человеком, без соответствующей проверки реакционной способности. Действительно, каждую партию глицерина, полученного из коммерческого источника, нужно оценить, чтобы удостовериться, что полипептидные продукты в ней отвечают требованиям стабильности.

Один из способов проверки стабильности глицерина состоит в приготовлении небольших партий реального фармацевтического продукта, а затем в оценке образования полимеров, обычно с помощью ВЭЖХ, за обычное время хранения в стандартных условиях хранения. Различные способы выделения и анализа полипептидов в исследованиях стабильности описаны ИибегЬегд, \ν.ΤΜ.. е! а1. [1. Сйгота1одгарйу В 742:401-409 (2000)]. Однако такой подход к тестированию неприменим на практике, так как он слишком длителен и требует множества аналитических ресурсов.

Гораздо лучшим способом оценки стабильности партий глицерина, полученного из промышленных источников, является увеличение скорости образования ковалентных полипептидных полимеров. Такие реакции можно ускорить, повышая температуру хранения [Вгапде, 1., Са1ешс5 о! [пзиНп, 8ргшдег-Уег1ад (1987)], увеличивая содержание глицерина по сравнению с нормальным, или и то и другое. Двумя примерами ускоренных стрессовых тестов являются 10Х-С8Т тест и модифицированный 10Х-С8Т тест, описанные в разделах Способ 2 и Способ 3 далее.

В типичных 100Ед инсулиновых продуктах инсулин присутствует в концентрации 3,5 мг/мл, или около 600 нмоль/мл. Содержание глицерина в обычных инсулиновых препаратах составляет 16 мг/мл, или около 174 нмоль/мл. Если содержание реакционноспособных альдегидов в партии глицерина составляет, например, 10 м. д., тогда концентрация реакционноспособных альдегидов в обычных композициях инсулина будет всего около 1,74 нмоль/мл, или в 345 раз меньше концентрации инсулина. Увеличение этой концентрации глицерина в 10 раз приведет к получению композиции, в которой содержание реакционноспособных альдегидов все еще в 34 раза ниже концентрации инсулина в расчете на моль, но это увеличит скорость реакции реакционноспособных альдегидов с молекулами инсулина. Для ускоренных тестов, описанных в способах 2 и 3, используют как повышенные температуры (30°С), так и повышенное содержание глицерина (в 10 раз).

В соответствующим образом контролируемых условиях ускоренные тесты стабильности надежно предсказывают относительную стабильность получаемых полипептидных композиций. Это обусловлено тем, что все ингредиенты, используемые в конечной композиции, уже содержатся в тестируемых растворах. Полученные из результатов ускоренных тестов на стабильность относительные скорости образования ковалентных полимеров коррелируют со скоростями образования в нормальных условиях хранения. Эта корреляция основана на анализе, например, с использованием уравнения Аррениуса для интервала температур, с использованием количественных расчетов на основании предполагаемого механизма реакции альдегида с вплоть до двумя молекулами полипептида, и/или на основании сравнения относительных скоростей образования полимеров в композициях. Способы установления конкретного предела стабильности полипептидных композиций хорошо известны специалистам. С учетом этих соображений максимальный уровень образования полимеров в ускоренном тесте, например, 1% в неделю при 30°С, можно установить как конкретный предел, которому должна отвечать композиция, чтобы обеспечить высокую степень надежности того, что будет достигнута удовлетворительная стабильность при нормальных условиях хранения.

Несмотря на полученные надежные результаты, существует множество недостатков ускоренных способов оценки партий композиций. Во-первых, получение множества образцов фармацевтических композиций занимает много времени, особенно если их нужно приготовить способом, идентичным способу приготовления композиций. Так как скорости реакций реакционноспособных альдегидов с каждым полипептидом в каждой отдельной композиции непредсказуемы, каждую полипептидную композицию необходимо тестировать независимо. Вовторых, при приготовлении множества образцов полипептидных композиций тратится много ценного материала и особенно самого ценного терапевтического полипептида. В-третьих, хотя реакции образования сшивок можно ускорить, время, необходимое для создания достаточного количества сшитых примесей, которое обеспечило бы надежное количественное определение, может занять неделю или больше. В-четвертых, процедуры анализов для определения сшитых продуктов в полипептидных композициях, сложны, длительны и дорогостоящи. Способы анализа, которые обычно включают ВЭЖХ, требуют специальных колонок, специально обученных операторов и много времени для проведения анализов, сбора данных и интерпретации результатов.

Непосредственный анализ каждой партии глицерина позволяет избежать недостатков ускоренных тестов на стабильность.

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ определения идентичности и содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине. В частности, был разработан новый способ осуществления ВЭЖХ (способ 4) для определения того, какие из альдегидов присутствуют в промышленных партиях глицерина, и для определения их относительных концентраций. Полученные результаты показывают, что во всех протестированных источниках глицерина основной альдегидной примесью является глицеральдегид, причем присутствуют гораздо меньшие количества формальдегида и даже еще меньшие количества гликольальдегида. Содержание формальдегида несколько выше в глицерине, полученном из растительных источников, нежели в глицерине животного происхождения и глицерине, полученном из пропилена.

Тем не менее, в качестве теста для проверки партий глицерина этот способ имеет описанные выше недостатки, связанные с ВЭЖХ анализом.

Другой аспект настоящего изобретения состоит в создании нового колориметрического способа анализа, в котором глицеральдегид используют в качестве стандарта, и с помощью которого просто и надежно количественно определяют содержание альдегидов в промышленных партиях глицерина. Этот анализ называется МВТН тест, который подробно описан далее как способ 1. Как видно в примере 1, этот анализ обеспечивает очень высокую молярную поглощательную способность после реакции с глицеральдегидом, который с помощью ВЭЖХ анализа (способ 4) идентифицировали как преобладающий альдегид в коммерческих партиях глицерина.

Чаще всего тест МВТН демонстрирует превосходную линейную корреляцию между содержанием реакционноспособных альдегидов в глицерине и повышенным содержанием димеров и полимеров, определенным в ускоренном тесте на стабильность, а именно, в модифицированном 10Х-О8Т тесте (см. пример 2 и чертеж). Хорошие показатели корреляции достигаются для партий глицерина животного происхождения, растительного происхождения и партий, полученных из пропилена. Простой, непосредственный анализ партий глицерина с использованием МВТН теста был создан для замены неэффективных ускоренных тестов, осуществляемых с использованием полипептидных композиций, длительного времени инкубирования и сложных ВЭЖХ систем.

Для получения спецификационного предела содержания реакционноспособных альдегидов, определенного с помощью МВТН теста, можно просто использовать корреляционную кривую, например, как представлено на чертеже, чтобы определить содержание реакционноспособных альдегидов по данным МВТН, в точке пересечения с линией с конкретным пределом, определенным с помощью ускоренного теста стабильности. Например, согласно чертеже, конкретный предел 1% роста полимера, определенный с помощью модифицированного 10Х-О8Т теста, приводит к конкретному пределу в 14 м. д. для МВТН теста. Спецификационный предел является наивысшим содержанием реакционноспособных альдегидов (например, определенным с помощью МВТН теста), допустимым в партиях глицерина, которые предстоит использовать для приготовления полипептидных композиций. Если необходимо более низкое содержание сшитых полипептидов или большая уверенность в том, что композиции сохраняют необходимую стабильность при хранении, тогда можно установить более низкие пределы спецификации.

С учетом вышеизложенного максимальный общий предел спецификации для содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине не животного происхождения для использования при приготовлении водных фармацевтических композиций для парентерального введения настоящего изобретения, при анализе составляет 33 м.д. Более предпочтительный конкретный предел для глицерина не животного происхождения составляет 24 м.д. Более предпочтительный конкретный предел составляет 15 м. д. Более предпочтительный конкретный предел составляет 8 м.д. Наиболее предпочтительный конкретный предел составляет 3 м.д. Если содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине определяют до его использования при получении композиции, то предпочтительно использовать при анализе глицеральдегид в качестве стандарта. Более предпочтительно, если содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине определяют до его использования при получении композиции, для анализа использовать МВТН тест, раскрытый здесь.

Авторы использовали МВТН тест для оценки свежей и старой партий коммерческого глицерина, полученных от нескольких производителей. Совершенно неожиданно авторы обнаружили, что глицерин животного происхождения содержит больше реакционноспособных альдегидов (10-1069 м.д. п=19), нежели глицерин, полученный из растений (4-153 м.д., п=29), или глицерин, полученный из пропилена (0-169 м.д., п=41). Среднее содержание реакционноспособных альдегидов в партиях глицерина животного происхождения также оказалось выше, чем для партий глицерина, полученных не из животных источников.

Раскрытый МВТН тест также используют для оценки промышленных партий глицерина, дата изготовления которых составляет 1-48 месяцев до анализа. Эти тесты, раскрытые в примере 3, четко показывают, что при сравнимых сроках хранения партии глицерина, полученного из растений или пропилена, в среднем содержат гораздо меньше реакционноспособных альдегидов, нежели партии глицерина животного происхождения. Из-за неопределенности, присущей процессам получения и времени хранения и условий хранения, которые используют изготовители глицерина, поставщики и доставщики, эти данные демонстрируют четкие преимущества выбора глицерина, полученного не из животных, для приготовления полипептидных композиций для парентерального использования. Так как содержание реакционноспособных альдегидов увеличивается с увеличением срока хранения даже для глицеринов не животного происхождения (см. таблицу 2), выгодно также выбирать наиболее свежие партии глицерина для использования при приготовлении полипептидных композиций.

При сравнении различных коммерческих источников глицерина для использования при приготовлении полипептидных композиций, четкое предпочтение следует отдать глицерину не животного происхождения. Более предпочтительны коммерческие партии глицерина, полученного из пропилена или растений. Если используют скорее глицерин не животного происхождения в водных фармацевтических полипептидных композициях для парентерального введения, это обычно приводит к повышению химической стабильности за счет более низкого содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине. Корреляция повышенной химической стабильности с более низким содержанием реакционноспособных альдегидов в глицерине проиллюстрирована для композиций аналога лептина, человеческого инсулина и аналогов инсулина в примерах 4-8, приводимых далее.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения состоит в использовании глицерина не животного происхождения в качестве компонента глицерина в водных фармацевтических композициях для парентерального введения, включающих полипептид и глицерин, для повышения химической стабильности композиции. Более предпочтительный вариант состоит в использовании глицерина, полученного из пропилена или растительных источников в качестве компонента глицерина в водных фармацевтических композициях для парентерального введения, включающих полипептид и глицерин, для повышения химической стабильности композиции. Наиболее предпочтительный вариант состоит в использовании глицерина, полученного из пропилена, в качестве компонента глицерина в водных фармацевтических композициях для парентерального введения, включающих полипептид и глицерин, для повышения химической стабильности композиции. В примерах 9-26 и 28-34 раскрыто получение полипептидных композиций, включающих глицерин не животного происхождения.

Повышенная химическая стабильность полипептидной композиции настоящего изобретения означает, что в ней повышенное содержание высокомолекулярных полипептидных димеров и полимеров после некоторого промежутка времени оказывается ниже, чем в аналогичным образом обработанной сравнительной композиции. Образование ковалентных димеров и полимеров можно определить количественно в тестах, которые проводят в различных условиях в течение различных промежутков времени и при различных температурах. В примерах 4-8 настоящего описания представлены результаты тестов, в которых пониженные уровни увеличения высокомолекулярных димеров и полимеров очевидны в полипептидных композициях настоящего изобретения после определенных промежутков времени и при различных температурах. Предпочтительно, чтобы повышенная химическая стабильность полипептидных композиций настоящего изобретения приводила к такому увеличению содержания высокомолекулярных димеров и полимеров, которое, по крайней мере, на 3% ниже, чем для сравнимых композиций, известных ранее. Более предпочтительно, чтобы повышение образования димеров и полимеров было, по крайней мере, на 10% ниже. Более предпочтительно, чтобы увеличение образования димеров и полимеров было, по крайней мере, на 30% ниже. Наиболее предпочтительно, чтобы увеличение образования высокомолекулярных димеров и полимеров в композициях настоящего изобретения было, по крайней мере, на 60% ниже, чем для известных ранее композиций.

Другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения являются водные композиции для парентерального введения, включающие полипептид и глицерин, в которых глицерин получен не из животных источников. Более предпочтительным вариантом является полипептидная композиция, включающая глицерин, в которой глицерин получен из растений или пропилена. Наиболее предпочтительным вариантом является полипептидная композиция, включающая глицерин, в которой глицерин получен из пропилена.

Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, выбор партии коммерческого глицерина не животного происхождения не гарантирует того, что может быть достигнуто чрезвычайно низкое содержание реакционноспособных альдегидов, например, 3 м.д. или менее. Для любой приготовляемой фармацевтической полипептидной композиции желательно, чтобы в закупаемых партиях коммерческого глицерина, независимо от того, из какого источника получен глицерин, содержание реакционноспособных альдегидов было достаточно низким, чтобы удовлетворить спецификационные пределы.

Так, следующим аспектом настоящего изобретения является способ снижения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине. В частности, как раскрыто в примере 8, такой способ включает осуществление контакта глицерина с твердым осушающим агентом и полимерной смолой, содержащей свободные аминогруппы.

Тип аминосодержащей смолы, природа осушающего агента и физическая конфигурация контакта глицерина, полимера и осушающего агента, по-видимому, не являются критическими для удаления реакционноспособных альдегидов.

Аминосодержащие полимерные смолы, которые можно использовать для целей настоящего изобретения, включают смолы на основе полистирола, такие как трис(2-аминоэтил) аминполистирольная смола, Тап1аСс1® 8 ΝΗ₂ смола и аминометильная полистирольная смола. Предпочтительной смолой является аминометильная полистирольная смола.

В этом способе для снижения содержания альдегидов можно использовать широкий интервал количеств аминосодержащей полимерной смолы. Предпочтительно использовать значительный молярный избыток аминосодержащей полимерной смолы относительно содержания альдегидов в глицерине, чтобы ускорить процесс и максимизировать эффект снижения содержания реакционноспособных альдегидов.

Контакт между глицерином, полимерной смолой и осушающим агентом можно осуществить, пропуская глицерин через иммобилизованный твердый агрегат, который включает твердый осушающий агент и смолу. Сам иммобилизованный твердый агрегат может быть помещен в цилиндрическую колонку. Такой тип физической конфигурации может облегчить прохождение глицерина через иммобилизованный твердый агрегат, так что можно быстро и эффективно получать большие объемы глицерина с низким содержанием реакционноспособных альдегидов.

В другом варианте, контакт можно осуществлять порционно, когда твердый осушающий агент и полимерную смолу добавляют к глицерину для создания суспензии. При порционном способе предпочтительные последовательные стадии включают нагревание суспензии до температуры в интервале от около 40°С до около 100°С, перемешивание нагретой суспензии в течение примерно от 1 мин до 100 ч, пропускание суспензии через фильтр, который удерживает твердый осушающий агент и полимерную смолу, а затем сбор глицерина, прошедшего через фильтр. У глицерина, обработанного порционным способом, будет пониженное содержание реакционноспособных альдегидов. Такой порционный способ можно также использовать для очень быстрого и эффективного снижения содержания реакционноспособных альдегидов при очень крупных объемах глицерина.

Удаление полимера и осушающего агента из очищенного глицерина можно осуществить многими способами. Способ фазового разделения, который можно использовать в этом аспекте настоящего изобретения, включает центрифугирование и фильтрование. Предпочтительным способом является фильтрование. Для фазового разделения пригодно различное оборудование для фильтрования и различные способы, включая фильтры, состоящие из целлюлозы и стекловолокна. Предпочтительны фильтры из стекловолокна. Наиболее предпочтительным фильтром является 5-микронная стекловолоконная мембрана Согшпд. Рай #25981-РР (Согшпд 1пс., Согшпд, ΝΥ, и8А).

При осуществлении порционного способа не важно, но предпочтительно, чтобы процесс очистки глицерина происходил, насколько это возможно, в не окисляющем окружении, особенно во время стадий нагревания и перемешивания. Такое не окисляющее окружение можно обеспечить, создавая над глицерином инертную атмосферу, например, используя бокс, или продувая глицерин аргоном или азотом, или создавая пониженное давление или частичный вакуум.

Наиболее предпочтительно на стадиях нагревания и перемешивания обеспечить атмосферу азота.

Хотя природа осушающего агента, повидимому, не является критической для успешного процесса уменьшения содержания альдегидов, предпочтительные осушающие агенты для использования в этом аспекте настоящего изобретения включают сульфат магния (Мд8О₄) и хлорид кальция (СаС1₂). Более предпочтительным осушающим агентом является сульфат магния.

Количество осушающего агента, которое необходимо использовать в процессе уменьшения содержания альдегидов настоящего изобретения, зависит от многих факторов, включая сам используемый осушающий агент, содержание альдегидов и воды, присутствующих в глицерине, содержание и природу используемой аминосодержащей полимерной смолы, температуру, при которой нагревают глицерин, и длительность перемешивания нагретого глицерина. Специалисту должно быть ясно, как каждый из этих факторов влияет на реакции, которые снижают содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, и он сможет определить, либо эмпирически, либо с помощью расчетов, соответствующее количество осушающего агента, которое необходимо использовать в этом способе. Предпочтительно в этом способе использовать избыточное количество осушающего агента.

Хотя для описанного здесь способа снижения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине подходит глицерин, полученный из любого источника, предпочтителен глицерин, полученный из животных, пропилена или растений. Более предпочтителен глицерин, полученный из пропилена или растений. Наиболее предпочтителен глицерин, полученный из пропилена.

Поэтому после выбора коммерческой партии глицерина не животного происхождения, предпочтительно свежеполученного глицерина из растений или пропилена, и более предпочтительно из пропилена, с помощью соответствующего анализа можно определить содержание в нем реакционноспособных альдегидов. Если содержание реакционноспособных альдегидов ниже предела спецификации для конкретной фармацевтической полипептидной композиции, тогда глицерин можно непосредственно вводить в композицию с гарантией того, что будет обеспечен желательный уровень химической стабильности.

Если содержание реакционноспособных альдегидов превышает предел спецификации, установленный для конкретной фармацевтической полипептидной композиции, тогда содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине можно снизить за счет обработки описанным здесь способом. Таким образом, в партии глицерина не животного происхождения с содержанием реакционноспособных альдегидов, например, 45 м. д. или выше можно снизить содержание реакционноспособных альдегидов до менее чем 33 м. д. до включения глицерина в полипептидную композицию.

В другом варианте можно выбрать промышленную партию глицерина животного происхождения и содержание в нем реакционноспособных альдегидов можно определить до его использования при получении полипептидной композиции. Предпочтительно, если проводят измерения, определять содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине с помощью анализа, в котором используют в качестве стандарта глицеральдегид, и более предпочтительно, чтобы в качестве анализа использовали раскры тый здесь МВТН тест. Если содержание реакционноспособных альдегидов ниже 8 м.д., тогда глицерин можно включать непосредственно в композицию с гарантией того, что будет обеспечен нужный уровень химической стабильности. Если содержание реакционноспособных альдегидов составляет 8 м.д. или более, тогда содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине можно снизить, обрабатывая его описанным выше способом. Таким образом, в партии глицерина животного происхождения с содержанием реакционноспособных альдегидов, например, 24 м.д., содержание в нем реакционноспособных альдегидов можно снизить до 2 м.д. до включения глицерина в полипептидную композицию.

Водные фармацевтические композиции настоящего изобретения для парентерального введения могут включать глицерин не животного происхождения для повышения их химической стабильности. В примерах 5-7 настоящего описания четко продемонстрирована повышенная химическая стабильность для фармацевтических полипептидных композиций в виде раствора и суспензии, включающих глицерин не животного происхождения, по сравнению с аналогичными полипептидными композициями, включающими глицерин животного происхождения.

Водные фармацевтические полипептидные композиции настоящего изобретения могут включать глицерин не животного происхождения. Если определяют содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, предпочтительно, чтобы это содержание реакционноспособных альдегидов было менее чем 33 м.д. для дальнейшего повышения химической стабильности полипептидных композиций. В примерах 4 и 8 настоящего описания четко показана повышенная химическая стабильность растворов и суспензий фармацевтических полипептидных композиций, включающих глицерин не животного происхождения и содержащих реакционноспособные альдегиды в количестве менее 33 м. д., по сравнению с аналогичными полипептидными композициями, включающими глицерин не животного происхождения с содержанием реакционноспособных альдегидов более 33 м.д.

Для повышения химической стабильности водные фармацевтические композиции для парентерального введения могут в другом варианте включать глицерин, полученный из любого источника, включая глицерин, полученный из пропилена, растений или животных, и содержащий менее 8 м.д. реакционноспособных альдегидов. В примерах 4 и 8 настоящего описания четко показана повышенная химическая стабильность для растворов и суспензий композиций фармацевтических полипептидов, включающих глицерин, содержащий менее 8 м.д. реакционноспособных альдегидов, по сравне нию с аналогичными полипептидными композициями, включающими глицерин, содержащий 8 м. д. реакционноспособных альдегидов или более.

Считают, что настоящее изобретение применимо к любой водной полипептидной композиции, включающей глицерин. Такие полипептидные композиции часто включают другие компоненты и наполнители, и их получают способом, который обычно используют для приготовления таких композиций. Не ограничивая сути настоящего изобретения, далее будут раскрыты следующие композиции, наполнители и способы их получения для более четких инструкций для читателя.

В настоящем изобретении предложены композиции, включающие воду, полипептид и глицерин не животного происхождения, или глицерин, полученный из любого источника, который содержит менее 8 м. д. реакционноспособных альдегидов. В частности, в настоящем изобретении предложены композиции, включающие по крайней мере, один полипептид или его фармацевтически приемлемую соль. Интервал концентраций полипептида, который можно использовать для целей настоящего изобретения, составляет от около 1,0 мкг/мл до около 100 мг/мл, хотя возможны более низкие и более высокие концентрации, в зависимости от способа введения. Предпочтительны концентрации полипептидов от около 5,0 мкг/мл до 20 мг/мл, и наиболее предпочтительны концентрации от около 20 мкг/мл до около 10 мг/мл. На основании требуемой дозы, эффективности полипептида и стабильности полипептида в композиции, специалисту будут известны подходящие концентрации полипептидов для включения в композиции настоящего изобретения.

В композициях настоящего изобретения могут быть использованы другие наполнители, такие как агенты, придающие изотоничность в дополнении к глицерину, консерванты, протамины, буферы, солюбилизаторы, детергенты, антиоксиданты, стабилизаторы растворов и катионы металлов в соответствии с композициями, которые обычно используют для полипептидов. Для использования в полипептидных композициях настоящего изобретения возможны и другие наполнители.

Содержание воды в композициях настоящего изобретения составляет 500 мг/мл или более. Концентрация глицерина в композициях настоящего изобретения составляет менее 500 мг/мл.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно получить различными способами, которые хорошо известны специалистам. Способ настоящего изобретения не требует заранее определенного порядка добавления компонентов в композицию. С учетом природы полипептида, терапевтического применения и желательной формы специалисту будут ясны соответствующие процедуры и порядок добавления для получения композиций настоящего изобретения.

В соответствии со способом настоящего изобретения, если глицерин, полученный из растений или пропилена, достаточно свежий, его можно использовать с достаточной уверенностью для повышения химической стабильности полипептидных композиций по сравнению с известным использованием глицерина животного происхождения в такой же самой композиции. Однако во всей полноте широту настоящего изобретения можно осознать, если вначале измерить содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, предназначенном для использования в полипептидной композиции. Предпочтительно определять содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине за две недели до включения его в композицию; более предпочтительно определять содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине за три дня до включения его в композицию. Предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине не животного происхождения при его измерении до использования при приготовлении полипептидной композиции составляло менее 33 м.д. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло менее 24 м.д. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло менее 15 м.д. Более предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло менее 8 м. д. И наиболее предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло 3 м.д. или менее. Предпочтительно, чтобы в анализе, который используют для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, использовали в качестве стандарта глицеральдегид. Более предпочтительно, чтобы анализом, который используют для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, был описанный здесь МВТН тест.

В другом варианте глицерин животного происхождения, который можно тестировать на содержание в нем реакционноспособных альдегидов таким способом и в таких временных рамках, которые указаны выше, можно также использовать в полипептидных композициях настоящего изобретения с большой уверенностью в повышенной химической стабильности, если содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляет менее 8 м. д.

Поэтому в одном аспекте настоящего изобретения предложены водные фармацевтические композиции для парентерального введения, включающие полипептид и глицерин, в которых глицерин получен из любого источника, включая пропилен, растения и животных, и в котором содержание реакционноспособных альдеги дов составляет менее 8 м.д. Предпочтительно, чтобы содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине составляло 3 м.д. или менее. Предпочтительно, чтобы в анализе, который используют для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, в качестве стандарта использовали глицеральдегид. Более предпочтительно, чтобы анализом, который используют для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине, был описанный здесь МВТН тест.

Водные фармацевтические полипептидные композиции настоящего изобретения используют в качестве лекарств или для получения лекарств для лечения заболеваний у млекопитающих. Более конкретно, если полипептидом является инсулин или его аналог или производное инсулина, или СЬР-1 или аналог или производное СБР-1. такое лекарство можно использовать для лечения сахарного диабета или гипергликемии.

Заявленные полипептидные композиции можно сделать доступными пациентам в виде прозрачных растворов, суспензионных смесей или в виде упаковок из двух ампул, включающих ампулу лиофилизованного или сухого полипептида, который растворяют в растворителе из другой ампулы. Предпочтительными полипептидными композициями являются прозрачные растворы и суспензионные смеси.

Заявленные композиции можно вводить нуждающимся в них пациентам различными парентеральными способами, принятыми у специалистов. Предпочтительные способы включают подкожные инъекции, внутримышечные инъекции, внутривенные инъекции или вливания, введение через легкие, введение за щеку, через нос, в глаза или чрескожно, и внутреннее или внешнее введение с помощью насоса. Более предпочтительными способами введения являются подкожные и внутримышечные инъекции.

Во время хранения заявленные композиции неожиданно оказываются более химически стабильными, нежели известные ранее композиции.

Способ 1. Тест МВТО.

МВТН раствор приготавливают, растворяя 250 мг твердой смеси примерно 20-25 мас.% 3-метил-2-бензотиазолинонгидразонгидрохлорида (МВТН) и около 75-80 мас.% хлорида натрия в 100 мл полного объема воды.

Раствор хлорида железа (3) приготавливают, помещая около 5,4 г раствора, содержащего около 20-30 мас.% хлорида железа (РеС1₃) и около 5 мас.% хлористоводородной кислоты в пропиленгликоле, и добавляя около 1,5 г сульфаминовой кислоты. Затем эту смесь разбавляют до 100 мл полного объема водой.

От около 50 мг до около 400 мг образцы глицерина из подлежащей анализу партии тщательно взвешивают в 15 мл тестовую ампулу. Добавляют 1,0 мл воды. Затем добавляют 4,0 мл

МВТН раствора, и все тщательно перемешивают. Затем раствор нагревают в течение 60±5 с в бане с кипящей водой. После 5-минутного охлаждения при комнатной температуре добавляют 5,0 мл раствора хлорида железа и тщательно перемешивают.

После примерно 30 мин (или более) охлаждения при комнатной температуре с помощью спектрофотометра определяют поглощение раствора на длине волны 624 нм.

Сравнительный тестовый раствор приготавливают, как указано выше, за исключением того, что исключают глицерин. Стандартную кривую получают, разбавляя водный 100 мкг/мл раствор глицеральдегида дополнительным количеством воды для получения стандартов глицеральдегида с концентрацией от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл. Затем эти стандартные растворы обрабатывают тестовыми реагентами.

После вычитания поглощения сравнительного раствора из поглощения стандартных и тестовых растворов количественно определяют содержание реакционноспособных альдегидов в образцах глицерина на основании стандартной кривой для глицеральдегида. В образцах глицерина, в которых содержание реакционноспособных альдегидов ниже 0,5 мкг/мл глицеральдегидного стандарта, содержание реакционноспособных альдегидов определяют путем экстраполяции наиболее подходящей кривой, полученной для глицеральдегидных стандартов. Образцы обычно проверяют по три. Вся используемая в анализах вода предпочтительно не должна содержать альдегидов.

Способ 2. 10Х глицериновый стрессовый тест (10Х-О8Т).

В 10Х глицериновом стрессовом тесте (10Х-68Т) определяют образование ковалентных димеров и полимеров в инсулиновых композициях. Подлежащий тестированию глицерин добавляют в Нишийи® К (И40. Ей ЬШу & Со., 1пШапароЙ8 ΙΝ, И8Л) до конечной концентрации 160 мг/мл глицерина, т.е. до десятикратного содержания глицерина, которое обычно используют в этих композициях. Одну аликвоту полученной композиции инкубируют при 30°С в течение 7 дней, тогда как вторую аликвоту хранят в течение этого времени в замороженном состоянии. Затем с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам определяют содержание высокомолекулярного белка (НМАР) в двух аликвотах в денатурирующих условиях (например, колонка 2огЬах СЕ 250 8рее1а1; подвижная фаза 65 частей 0,1 М фосфат аммония, буферированный при рН 7,5 и 35 частей ацетонитрила; детектирование на 214 нм). Увеличение НМ АР в тестовой композиции составляет величину концентрации НМАР в 30°С образце минус концентрация НМАР в замороженном контрольном образце.

Способ 3. Модифицированный 10Х глицериновый стрессовый тест (Моб. 10Х-О8Т).

В 1 мл Нιιιηιι1ίп® N (И40, Ей ЬШу & Со., 1пб1апаро11к ΙΝ, И8А) добавляют около 160 мг (около 128 мкл) подлежащего тестированию глицерина. Это количество глицерина примерно в 10 раз больше обычного количества, которое находится в коммерческих продуктах. В другой миллилитр Нитийп® N И40 добавляют 128 мкл воды. Оба образца выдерживают при 30°С в течение 7 дней. Затем определяют содержание высокомолекулярного белка в двух образцах с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам в денатурирующих условиях [например, ^а!егк колонка марки Рго!ет-Рак 125 ткийп аккау сег!1йеб, ^а!егк Согрогайоп (Мбкогб, МА, И8А) номер партии 20574; подвижная фаза 65 ч. 1 мг/мл раствора Ь-аргинина, 20 ч. ацетонитрила и 15 ч. ледяной уксусной кислоты]. Тестовые образцы солюбилизируют, подкисляя небольшим объемом 9,6н. НС1 до проведения анализа.

Увеличение НМ\УР в образце рассчитывают как содержание НМ\УР в 30°С тестовом образце минус содержание НМ\УР в контроле с добавлением воды. Процент увеличения сообщается за 7-дневный период.

Способ 4. ВЭЖХ анализ производных альдегидов в глицерине.

Образец 160 мг партии глицерина, подлежащей тестированию, модифицируют 1 мл 0,5 мкг/мл 2-дифенилацетил-1,3-индандион-1-гидразона [(ИР1Н), см. В1беои!, ЕМ., е! а1., Сйп. Сй1т. Ас!а 161:29-35 (1986) и 8\уап1Е 8., е!. а1., б. Ыс.|шб Сйгота!одгарйу 6:425-444 (1983)] в ацетонитриле в 3,5 мл стеклянной ампуле. Добавляют 10 мкл трифторуксусной кислоты, и ампулу плотно закрывают и вращают при 20 об/мин в течение 3 ч при комнатной температуре. Глицерин не смешивается с раствором ацетонитрил-ИРГН реагента, но при вращении ампулы глицерин распределяется тонким слоем на поверхности ампулы, что приводит к максимальному контакту двухслойной поверхности. Альдегиды и кетоны в глицерине реагируют с ИР1Н с образованием азинов, которые экстрагируются в ацетонитрил-ИРШ реагентный раствор. Затем этот раствор вводят в колонку 2огЬах Вх С8 НРЬС (Мас-Моб Апа1уйса1 1пс., Сйаббк Еогб, РА, И8А). Азины выделяют с помощью ступенчатого градиента, достигаемого за счет раствора А (0,1% ТЕА в воде) и раствора В (0,1% ТЕА в ацетонитриле) ступенчато смесями от 48% В до 66% В в течение 30 мин. Производные детектируют, используя спектрофотометр на 290 нм или используя спектрофлюориметр с длиной волны возбуждения 425 нм и с длиной волны испускания 525 нм. Альдегидные стандарты разделяются по порядку элюирования; гицеральдегид, гликольальдегид, гидроксипропиональдегид, формальдегид, ацетальдегид и пропиональдегид.

Нижеследующие примеры приведены просто для дальнейшей иллюстрации изобретения. Объем изобретения не следует рассматривать как просто состоящий из следующих примеров.

Пример 1. Тесты на селективность альдегидов.

Образец полученного из растений глицерина дополняют определенным содержанием альдегидов, которые представлены в табл. 1. Затем дополненные образцы глицерина анализируют с помощью описанного ранее МВТН теста (способ 1) и трех других тестов.

Для №1кй теста альдегиды в глицерине экстрагируют фосфатным буфером с рН 7,5, а затем обрабатывают ацетилацетоном в присутствии избытка ацетата аммония [би Сйайшег, е! аЕ, Апа1уйса1 Ье!!егк 22:875-883 (1989)]. Окрашенные продукты реакции количественно определяют по поглощению на длине волны 415 нм с помощью спектрофотометра.

Для Ригра1б теста реагент 4-амино-3гидразино-5-меркапто-1,2,4-триазол [А1бпсй Сйет1са1 Сотрапу] растворяют в 1н. №1ОН. Этот раствор добавляют затем к растворам глицерина, которые были разбавлены водой. После аэрации измеряют поглощение растворов на длине волны 401 нм с помощью спектрофотометра.

Для теста европейской фармакопеи (Рй. Еиг.) глицериновые растворы смешивают с раствором парарозанилингидрохлорида [Еигореап Рйагтасорое1а 1997, рр. 906-907, Соипсй ок Еигоре, 8!гакЬоигд]. Спустя 1 ч измеряют поглощение на длине волны 550 нм с помощью спектрофотометра.

Величины поглощения для каждого теста рассчитывают, вычитая значения для недополненных образцов глицерина из значений для глицерина, дополненного каждым из добавляемых соединений. Поглощение рассчитывают на молярной основе для каждого альдегида, и результаты представлены в табл. 1. Отрицательные величины означают, что значения поглощения оказываются действительно сниженными за счет добавления альдегида.

Таблица 1. Молярное поглощение альдегидов, добавленных к глицерину

	№кй тест	МВТН тест	Ригра1б тест	Рй. Еиг. тест
Формальдегид	363	3567	114	1090
Ацетальдегид	3	2138	-532	пб
Глицеральдегид	34	1525	-108	85
Гликольальдегид	10	3379	3924	пб

пб = не определяли №1кй метод не регистрирует сильного поглощения ни для одного из альдегидов. Ригра1б метод оказался высокочувствительным для гликолевого альдегида, но не регистрировал поглощения для глицеральдегида. Метод Европейской фармакопеи регистрировал умеренное поглощение для формальдегида, но был относи тельно нечувствительным при определении глицеральдегида.

Этот эксперимент четко показывает, что из четырех тестов, которые сравнивали, наибольший сигнал поглощения на моль глицеральдегида регистрировался в МВТН тесте. По данным ВЭЖХ (метод 4) было показано, что преимущественным альдегидом, обнаруженным в промышленных партиях глицерина, является глицеральдегид. В МВТН тесте наибольшие значения поглощения также регистрировались для формальдегида и гликольальдегида, реакционноспособных альдегидов, которые по данным ВЭЖХ анализа (метод 4) должны присутствовать в небольших количествах в партиях промышленного глицерина. Таим образом, МВТН тест является чувствительным методом для определения содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине.

Пример 2. Корреляция МВТН теста с модифицированным 10Х-С8Т тестом.

Содержание реакционноспособных альдегидов в свежей и старой промышленных партиях глицерина определяют с помощью описанного выше МВТН теста. Каждый образец глицерина оценивают также, используя модифицированный 10Х-С8Т тест (метод 3). Для объединенных образцов глицерина, полученных из пропилена и растений (п=39, и п=25, соответственно), результаты, представленные на фиг. 1, демонстрируют хорошую линейную корреляцию (К.²=0.90. для наиболее подходящей прямой, проходящей через начало) между содержанием реакционноспособных альдегидов по результатам МВТН теста (<100 м.д.) и усиленными пиками ковалентных НМАР, измеренными в НитиИп® N инсулиновых композициях с помощью модифицированного 10Х-С8Т теста. Образцы глицерина животного происхождения (п=19) также демонстрируют хорошую линейную корреляцию между этими тестами (В²=0,93, результаты не представлены).

Пример 3. Содержание реакционноспособных альдегидов в старых партиях промышленного глицерина.

Промышленные партии глицерина, даты изготовления которых были известны, хранились при комнатной температуре в течение от 1 до 48 месяцев со дня изготовления. Для каждой из партий глицерина содержание реакционноспособных альдегидов определяли с помощью описанного здесь МВТН теста. Результаты, полученные для этих партий, представлены далее в табл. 2.

Таблица 2. Анализ реакционноспособных альдегидов в партиях глицерина, полученных из трех источников

	Из животных	Из растений	Из пропи- лена
Анализировано партий	6	10	36
Срок хранения (мес.)	3-47	1-29	1,5-48
Средний срок хранения (мес.)	22,0	10,6	19,9

Содержание альдегидов (м.д.)	24-1069	4-43	0-169
Среднее содержание альдегидов (м.д.±8ЕМ)	301,5±162,5	23,6±4,5	25,2±6,2
Среднее содержание альдегидов за среднее время хранения (м.д./мес.)	13,7	2,2	1,3
Среднее содержание для партии альдегидов за месяц хранения (м.д. ± 8ЕМ)	16,5±7,1*	3,6+1,3*

8ЕМ = средняя стандартная ошибка;

* = статистическая разница, р=0,003 рассчитано по тесту АПсохоп К.апк-8ит.

Эти данные четко показывают, что в старых партиях глицерина, полученного из пропилена и растений, содержание реакционноспособных альдегидов ниже, чем у глицерина животного происхождения. Эти результаты показывают также, что в партиях глицерина, полученного из растений и пропилена, гораздо ниже среднее содержание реакционноспособных альдегидов за средний срок хранения, нежели для партий глицерина животного происхождения.

Значения в последней строке таблицы 2 получены в результате деления содержания реакционноспособных альдегидов в каждой из партий глицерина на срок хранения, считая с даты изготовления.

Эти расчеты показывают, что в глицерине не животного происхождения образуется значительно меньше реакционноспособных альдегидов за месяц хранения, нежели в глицерине животного происхождения. Разумное объяснение этих результатов состоит в том, что содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине животного происхождения возрастает со временем гораздо быстрее, нежели содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, полученном из пропилена или растений.

На основании этих исследований можно считать, что если хранить глицерин растительного, животного происхождения или полученный из пропилена с эквивалентным содержанием реакционноспособных альдегидов в одинаковых условиях, содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине животного происхождения будет возрастать гораздо быстрее с течением времени, нежели содержание реакционноспособных альдегидов в глицерине, полученном из растений или пропилена.

Пример 4. Стабильность композиций лептина.

Аналог человеческого лептина А§р(72), А§р(100)-0Ь, [Последовательность ΙΌ. 6 в Веак, 1. М., е1 а1., АО 98/28335, опубликованная 24 июня 1998] используют для приготовления композиций, содержащих глицерин в концентрации 220 мг/мл. Образец глицерина (содержание реакционноспособных альдегидов = 1 м.д., определено по МВТН тесту) получен из пропилена, а образец глицерина 2 (содержание реакционно способных альдегидов = 85 м.д., определено по МВТН тесту) получен из растительного источника. Каждая композиция содержит 15,2 мг/мл белка в 10 мМ фосфатном буфере с рН 7,8.

Объемы по 50 мл каждой из композиций образцов приготавливают одновременно и стерилизуют на фильтре. Затем аликвоты по 3 мл заполняют в асептических условиях в стерильные 5-мл стеклянные ампулы, закрывают, герметизируют и затем хранят при 5°С и 25°С в течение 3, 7, 10 и 24 дней. Растворы анализируют в условиях диссоциации с помощью ВЭЖХ с исключением по размерам, используя колонку ТокоНаак Т8К-СЕБ С30008№-ХБ (ТокоНаак, МоШдотегууШе, РА, И8А) и подвижную фазу 0,1 М фосфат натрия, 0,1 М сульфат натрия и 0,6% додецилсульфат натрия при рН 8,5. Пики элюирующихся полипептидов детектируют по УФ поглощению на длине волны 214 нм.

Помимо основного пика белка наблюдаются два элюирующихся ранее пика (т.е. с большей молекулярной массой). Один из них соответствует ковалентному димеру, который представляет более 90% площади элюировавшихся ранее пиков. Другой элюировавшийся ранее пик соответствует ковалентному белковому полимеру, который крупнее димера. В день приготовления образцов суммарная площадь элюировавшихся ранее пиков составляет от 0,31% до 0,33% от полной площади пиков на хроматограмме образцов, тогда как пик димера составляет от 0,30 до 0,32% от полной площади хроматограммы.

Все образцы оставались прозрачными и бесцветными за время исследования. Увеличение площади пиков высокомолекулярных белков (объединенные пики димера и более высокомолекулярных соединений), как процент от полного содержания белка, представлено в табл. 3 далее. Что касается исходных растворов белков, то более рано элюировавшиеся пики были главным образом связаны с димером во всех образцах.

Таблица 3. Увеличение площади пиков, соответствующих высокомолекулярному белку (% от полного содержания белка)

Дни	Температура инкубирования	Образец глицерина 1	Образец глицерина 2
3	5°С	0,06	0,06
7	5°С	0,11	0,12
10	5°С	0,10	0,18
24	5°С	0,11	0,22
3	25°С	0,15	0,29
7	25°С	0,26	0,63
10	25°С	0,32	0,80
24	25°С	0,50	1,53

Этот эксперимент демонстрирует, что для аналога лептина человека Акр(72)Акр(100)-ОЬ, в композиции, содержащей глицерин с меньшим содержанием реакционноспособных альдегидов (образец 1), происходит меньше образования высокомолекулярных белковых примесей при хранении как при 5°С, так и при 25°С, чем в сравнимой композиции, содержащей глицерин с большим содержанием реакционноспособных альдегидов (образец 2). Спустя 24 дня хранения при 5°С повышение содержания высокомолекулярного белка в композиции, полученной с глицерином, в котором содержание реакционноспособных альдегидов составляет 1 м.д. (образец 1), примерно на 50% меньше, чем для композиции, полученной с глицерином, в котором содержание реакционноспособных альдегидов составляет 85 м.д. (образец 2). Спустя 24 дня хранения при 25°С повышение содержания высокомолекулярного белка в композиции, полученной с глицерином образца 1, оказывается на 67% ниже, чем для композиции, полученной с глицерином образца 2.

Пример 5. Стабильность композиций инсулина и аналогов инсулина.

Содержание реакционноспособных альдегидов в трех различных промышленных партиях глицерина количественно определяют с помощью МВТН теста. Глицерин образца 3 получен из пропилена (содержание реакционноспособных альдегидов составляет 1 м.д.), а глицерин образцов 4 и 5 имеет животное происхождение (содержание реакционноспособных альдегидов составляет 45 и 156 м.д., соответственно).

Две промышленные композиции человеческого инсулина (растворимый Нити1т® К, и суспензия кристаллов Нити1т® Ν) и четыре промышленные композиции Бук(В28)Рго(В29)человеческого инсулина [растворимый Нита1од®, суспензия кристаллов Нита1од® ΝΡΕ и их фиксированные смеси, обозначенные ЫкРго Боте Μίχ (25:75, Нита1од®:Нита1од® ΝΡί, см КоасЬ, Р., е!, аБ, Б1аЬе1ек Саге 22:12581261 (1999)) и Б1кРго Μίά Μίχ (50:50,

Нита1од®: Нита1од® ЖБ)|, каждая по 100 Ед на мл концентрации, дополняют образцами глицерина 3, 4 и 5 до конечной концентрации 160 мг/мл.

Через 7 дней хранения при 30°С определяют увеличение процента содержания высокомолекулярного белка (НМ^Р) для каждой из композиций по способу 3. Увеличение содержания НМ\УР представлено в табл. 4 далее.

Таблица 4. Увеличение пиков, соответствующих высокомолекулярному белку, через 7 дней хранения при 30°С (% от полного содержания белка)

Композиция	Глицерин образец 3	Глицерин образец 4	Глицерин образец 5
НитиНп® N	0,04	1,85	5,18
Нита1од® N14.	0,11	1,69	4,61
ЫкРго Ьом М1х	0,17	1,38	4,27
ЫкРго ММ М1х	0,05	1,05	3,78
НитиНп® К	0,05	0,78	3,21
Нита1од®	0,05	0,46	2,68

Результаты этого эксперимента четко показывают, что использование глицерина не животного происхождения приводит к получению растворов, суспензий и смесей раствор/суспен зия полипептидов с повышенной стабильностью по сравнению с аналогичными композициями, полученными с глицерином животного происхождения. Через 7 дней хранения при 30°С увеличение содержания высокомолекулярного белка в композициях с глицерином, полученным из пропилена (образец 3), составило интервал от около 87% ниже для ЫкРго Боа М1х (в сравнении с образцом 4, где глицерин был животного происхождения) до около 99% ниже для Нити1ίη® N (в сравнении с образцом 5, где глицерин был животного происхождения).

Пример 6. Получение суспензий Ьук(В28) Рго(В29)-человеческого инсулина.

Композиции суспензий, соответствующие концентрации 100 Ед. аналога Ьук(В28)Рго (В29)-человеческого инсулина (Нита1од® ΝΕΕ Ε1ί Ы11у & Со., 1пШапаро11к, ΙΝ, И8А) приготавливают, используя четыре промышленные партии глицерина, которые не подвергают дополнительной очистке.

Во-первых, содержание реакционноспособных альдегидов в трех партиях глицерина определяют с помощью МВТН теста по способу 1. Партии глицерина оценивают также, используя 10Х глицериновый стрессовый тест (способ 2) и модифицированный 10Х глицериновый стрессовый тест (способ 3). Результаты этих анализов приведены в табл. 5 далее.

Таблица 5. Анализы партий глицерина, использованных для приготовления суспензий Ьук(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина

Образец глицерина	Источник	МВТН тест	10Х-С8Т тест	Мод. 10Х- С8Т тест
6	Пропилен	1	0,13	0,13
7	Пропилен	2	0,22	0,09
8	Пропилен	1	0,01	0,17
9	Животные	пд	пд	пд

пд = не определяли

Для приготовления композиций Ьук(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина приготавливают несколько промежуточных растворов.

Исходный раствор с консервантом, содержащий 3,52 мг/мл м-крезола и 1,43 мг/мл фенола (рассчитано на 89 мас.%) приготавливают в деионизированной воде.

Исходные растворы глицерина для каждого из образцов глицерина приготавливают в концентрации 160 мг/мл в воде.

Исходный раствор цинка приготавливают, подкисляя раствор оксида цинка 10% НС1.

Растворы консервант-глицерин-цинк приготавливают, объединяя соответствующие объемы исходного раствора с консервантом, исходные растворы глицерина, исходный раствор цинка, достаточные для того, чтобы в результате получить раствор, содержащий 1,76 мг/мл м-крезола, 0,715 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и такую концентрацию цинка, чтобы при объединении с цинком, присутствующим в материале Ьук(В28)Рго(В29)-человеческий ин сулин, получить всего 25 мкг/мл. В это время рН растворов консервант-глицерин-цинк составляет около 4,7.

Затем к растворам консервант-глицеринцинк добавляют такие количества Ьук(В28) Рго(В29)-человеческого инсулина (объемные цинковые кристаллы), чтобы получить концентрацию 200 Ед/мл, или около 7,0 мг/мл в растворах Ьук(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина концентрации 200 Ед, описываемых далее. Растворение Ьук(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина осуществляют при комнатной температуре, снижая значение рН за счет добавления небольших аликвот 10% НС1. После того, как растворы становятся прозрачными, для каждого снова устанавливают значения рН около

7.3, добавляя небольшие аликвоты 10% №10Н. Добавляют такие объемы раствора гептагидрата двухосновного фосфата натрия в концентрации 75,6 мг/мл в деионизированной воде, чтобы в итоге получить в этом растворе концентрацию двухосновного фосфата натрия 3,78 мг/мл. После перемешивания для завершения растворения всего материала добавляют 10% №10Н чтобы довести рН каждого из четырех растворов Ьук(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина до около 7,4. Добавляют деионизированную воду, чтобы получить в результате растворы Ьук(В28) Рго(В29)-человеческого инсулина концентрации 200 Ед, которые затем фильтруют через 0,22 мк фильтры 81ег|уех СУ (М1Шроге Ргодис!к ЭМкюп, ВедГогд, МА, И8А). Эти четыре раствора затем именуют Растворы Ьук(В28) Рго(В29)-человеческого инсулина концентрации 200 Ед.

Исходный раствор протамина приготавливают, растворяя твердый протаминсульфат (Скит ка1топ) в исходном растворе консерванта до достижения концентрации, эквивалентной 0,6 мг/мл свободного основания протамина в конечных растворах протамин-консервантглицерин, описанных далее. После перемешивания в течение 45 мин добавляют такие объемы гептагидрата двухосновного фосфата натрия концентрации 75,6 мг/мл в деионизированной воде, чтобы получить концентрацию 3,78 мг/мл гептагидрата двухосновного фосфата натрия в конечном растворе протамин-консервантглицерин. Затем рН раствора устанавливают

7.4, добавляя небольшие аликвоты 10% хлористоводородной кислоты. Затем добавляют объемы 160 мг/мл исходных растворов глицерина, чтобы получить растворы, содержащие 16 мг/мл глицерина в каждом из растворов. Добавляют деионизированную воду, чтобы установить конечный объем, и четыре раствора протамин-консервант-глицерин фильтруют через 0,22 мк фильтры 8!ег1уех СУ.

После уравновешивания каждого из четырех растворов 200 Ед Ьук(В28)Рго(В29)человеческий инсулин и каждого из четырех растворов протамин-консервант-глицерин при

15°С равные объемы каждого из растворов объединяют и инкубируют в течение 61 ч при 15°С.

Каждый мл четырех суспензионных композиций, полученных в этом эксперименте, содержит примерно: 3,5 мг Ьу5(В28)Рго(В29)человеческого инсулина, 3,78 мг гептагидрата двухосновного фосфата натрия, 16 мг глицерина, 1,76 мг м-крезола, 0,715 мг фенола, 25 мкг цинка и 0,3 мг протамина.

Пример 7. Стабильность суспензий Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина.

Четыре композиции суспензий Ьу§(В28) Рго(В29)-человеческого инсулина, приготовленные с глицерином из различных источников, как раскрыто в примере 6, инкубируют вплоть до 12 недель при 30°С. В различные моменты времени определяют содержание в образцах высокомолекулярного белка (НМ\УР). как процент от полного содержания белка, используя ВЭЖХ хроматографию с исключением по размерам, по способу модифицированного 10Х-О8Т теста (способ 3). Результаты теста на стабильность представлены в табл. 6 далее.

Таблица 6. Содержание НМА’Р в суспензиях Ьуз(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина, полученных с различными партиями глицерина

Недели при 30°С	Глицерин образец 6	Глицерин образец 7	Глицерин образец 8	Глицерин образец 9
0	0,24	0,20	0,20	0,23
1	0,41	0,39	0,40	0,64
2	0,55	0,51	0,54	0,92
4	0,75	0,71	0,77	1,43
8	1,24	1,21	1,28	2,15
12	2,00	1,95	2,02	3,16

Результаты этого эксперимента четко показывают, что глицерин, полученный из пропилена, повышает химическую стабильность суспензионных композиций Ьу5(В28)Рго(В29)человеческого инсулина по сравнению с суспензионными композициями, полученными с глицерином животного происхождения. Через 12 недель хранения при 30°С повышение содержания высокомолекулярного белка в суспензионных композициях, полученных с глицерином из пропилена (образцы 6-8), было в среднем на около 39% ниже, чем повышение содержания НМ\УР в композициях, полученных с глицерином животного происхождения (образец 9).

Пример 8. Снижение содержания реакционноспособных альдегидов в глицерине.

Глицерин (3,0 г) из партии, полученной из пропилена, помещают в каждый из пяти стаканов, содержащих магнитные брусочки для мешалки. Одновременно приготавливают пять стаканов, используя партию глицерина, полученного из растений. В четыре стакана из каждой серии добавляют около 50 мг твердого безводного сульфата магния (Мд8О₄). Затем в три стакана из каждой серии, в которые был добавлен сульфат магния, добавляют взвешенное количество одной из следующих полимерных смол от Адуапсед СйешТесй 1пс. (ЬоищуШе, ΚΥ,

И8А): смола А, 0,1 г смолы трис(2-аминоэтил) амина (0,7 ммоль/г, 100-200 меш); смола В, 0,2 г смолы Тап1аОе1® 8 ΝΗ₂ (0,3 ммоль/г, 90 мкм); смола С, 0,1 г аминометильной полистирольной смолы (0,7 ммоль/г, 100-200 меш).

Все 10 стаканов помещают на перемешивающую пластину в боксе в атмосфере азота и нагревают до примерно 60°С. После перемешивания в течение 24 ч образцы фильтруют через целлюлозную мембрану и анализируют содержание реакционноспособных альдегидов (м.д.) с помощью МВТН теста, раскрытого в способе 1. Некоторые из образцов глицерина оценивают также с помощью модифицированного 10Х-О8Т теста (способ 3). Результаты этих экспериментов представлены далее в табл. 7.

Таблица 7. Результаты обработки образцов глицерина поли мерными аминосодержащими смолами

Обра- зец	Источник глицерина	М§8О4	Смола	МВТН тест	Мод.10Х- О8Т тест
1	пропилен	нет	нет	21	1,84
2	пропилен	да	нет	25	1,58
3	пропилен	да	А	2	пд
4	пропилен	да	В	1	пд
5	пропилен	да	С	1	-0,27
6	растения	нет	нет	36	4,68
7	растения	да	нет	45	3,65
8	растения	да	А	10	пд
9	растения	да	В	3	пд
10	растения	да	С	1	-0,03

пд = не определяли

Эти результаты четко показывают, что используемые способы очистки значительно снижают концентрации реакционноспособных альдегидов в промышленных партиях глицерина. В инсулиновых суспензиях, исследованных с помощью модифицированного 10Х-О8Т теста, очищение партий глицерина с использованием аминометильного полистирола (смола С), не привело к увеличению НМ\УР пиков, тогда как для неочищенных партий глицерина произошло значительное увеличение НМ\УР пиков.

Пример 9. Раствор человеческого инсулина.

Рекомбинантный человеческий инсулин (35 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют раствор оксида цинка (1 мл, 0,17 мг/мл), как оксид цинка, растворенный в 0,1н. НС1, затем 25 мг м-крезола. Затем добавляют 160 мг свежеприготовленного глицерина, полученного из пропилена. рН раствора устанавливают 7,4, добавляя 1н. ΝαΟΗ, и разбавляют до примерно 10 мл полного объема водой. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 2,5 мг м-крезола и около 0,017 мг цинка.

Пример 10. Раствор человеческого инсулина.

Рекомбинантный человеческий инсулин (35 мг) растворяют в около 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют раствор оксида цинка (1 мл, 0,17 мг/мл цинка в виде оксида цинка, растворенного в 0,1н. НС1), а затем добавляют 16 мг м-крезола, 6,5 мг фенола и 1 мл 140 мМ натрийфосфатного буфера в воде. Затем добавляют 160 мг свежеприготовленного из пропилена глицерина. рН раствора доводят до около рН 7,4, добавляя 1н. №1ОН, и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, 14 мМ натрийфосфата, около 1,6 мг м-крезола, около 0,65 мг фенола и около 0,017 мг цинка.

Пример 11. Суспензия человеческого инсулина.

Суспензию кристаллов человеческого инсулин-протамина приготавливают, вначале растворяя 35 мг рекомбинантного человеческого инсулина в 5 мл 0,01н. НС1, затем добавляя 16 мг м-крезола и 6,5 мг фенола. Затем добавляют 1 мл 160 мг/мл водного раствора глицерина, полученного из пропилена, 1 мл раствора оксида цинка (0,25 мг/мл цинка) в 0,1н. НС1, и 2,7 мг протамина (в расчете на свободное основание), затем разбавляя водой до полного объема около 9 мл. Затем добавляют раствор (1 мл) 38 мг/мл гептагидрата двухосновного фосфата натрия, получая раствор с рН около 8. рН полученного раствора доводят до 7,4, и процесс кристаллизации продолжается в течение около 24 ч при температуре около 19°С. Каждый мл этой суспензии содержит около 3,5 мг человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 0,27 мг протамина (в расчете на свободное основание), около 0,025 мг цинка, около 1,6 мг м-крезола, около 0,65 мг фенола и около 3,8 мг двухосновного фосфата натрия.

Пример 12. Человеческий инсулин 70/30 смесь.

Смесь, включающую 70 частей суспензии примера 11, объединяют с 30 частями раствора человеческого инсулина примера 10. Оба эти препарата приготовлены из глицерина, полученного из пропилена.

Пример 13. Человеческий инсулин 50/50 смесь.

Смесь, включающую 50 частей суспензии примера 11, объединяют с 50 частями раствора человеческого инсулина примера 10. Оба эти препарата приготовлены из глицерина, полученного из пропилена.

Пример 14. Человеческий инсулин 30/70 смесь.

Смесь, включающую 30 частей суспензии примера 11, объединяют с 70 частями раствора человеческого инсулина примера 10. Оба эти препарата приготовлены из глицерина, полученного из пропилена.

Пример 15. Раствор Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина.

Рекомбинантный Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин (35 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,2 мг/мл цинка), растворенного в 0,01н. НС1, затем добавляют 31,5 мг м-крезола и 1 мл 70 мМ раствора в воде фосфатного буфера. Затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена. рН раствора доводят до примерно 7,4 1н. №1ОН и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, 7 мМ фосфата натрия, около 3,15 мг м-крезола и около 0,02 мг цинка.

Пример 16. Раствор Ьу§(В28)Рго(В29)человеческого инсулина.

Рекомбинантный Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин (35 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,2 мг/мл цинка), растворенного в 0,01н. НС1, затем добавляют 16 мг м-крезола, 6,5 мг фенола и 1 мл 140 мМ раствора в воде фосфатного буфера. Затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена. рН раствора доводят до примерно 7,4 1н. №1ОН и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг Ьу§(В28)Рго(В29)человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, 14 мМ фосфата натрия, около 1,6 мг м-крезола, около 0,65 мг фенола и около 0,02 мг цинка.

Пример 17. Суспензия Ьу§(В28)Рго(В29)человеческого инсулина.

Суспензию №Н-подобных кристаллов Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина приготавливают, используя глицерин, полученный из пропилена по способу примера 6.

Пример 18. Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин 75/25 смесь.

Смесь, включающую 75 частей суспензии Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 17, объединяют с 25 частями раствора Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 16. В каждом из этих препаратов используют глицерин, полученный из пропилена.

Пример 19. Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин 50/50 смесь.

Смесь, включающую 50 частей суспензии Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 17, объединяют с 50 частями раствора Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 16. В каждом из этих препаратов используют глицерин, полученный из пропилена.

Пример 20. Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческий инсулин 25/75 смесь.

Смесь, включающую 25 частей суспензии Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 17, объединяют с 75 частями раствора Ьу§(В28)Рго(В29)-человеческого инсулина примера 16. В каждом из этих препаратов используют глицерин, полученный из пропилена.

Пример 21. Раствор Л§р(В28)-человеческого инсулина.

Рекомбинантный А§р(В28)-человеческий инсулин (35 мг) растворяют примерно в 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,2 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1, затем 17 мг м-крезола и 15 мг фенола. Затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена, затем 1 мл 70 мМ раствора фосфатного буфера в воде. рН раствора доводят затем до около 7,4, добавляя 1н. ΝαΟΗ, и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг А§р(В28)-человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 7 мМ фосфата, около 1,7 мг м-крезола, около 1,5 мг фенола и около 0,02 мг цинка.

Пример 22. А§р(В28)-человеческий инсулин 70/30 смесь.

Раствор А§р(В28)-человеческого инсулина приготавливают, растворяя 76,5 мг А§р(В28)человеческого инсулина в воде, содержащей около 0,32 мл 0,2н. НС1, и добавляя около 0,16 мл 0,4 мг/мл раствор хлорида цинка. Затем добавляют протаминсульфат (эквивалентно примерно 4,5 мг протамина в виде свободного основания) в воде, затем смесь, состоящую из 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола и 160 мг глицерина, полученного из пропилена, причем все растворенное в воде. Полученный раствор, рН которого примерно 2,7, разбавляют до 10 мл водой и уравновешивают до примерно 30°С. К этому раствору добавляют 10 мл раствора, содержащего 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола, 25 мг дигидрата динатрийфосфата и 160 мг глицерина, поученного из пропилена при рН 9, и уравновешивают до примерно 30°С. Спустя 2 дня при температуре 30°С кристаллизация завершается, в результате получают суспензионную смесь, содержащую около 70% А§р(В28)-человеческого инсулина, находящегося в виде нерастворимых МРН-подобных кристаллов и 30% в растворе.

Пример 23. А§р(В28)-человеческий инсулин 50/50 смесь.

Раствор А§р(В28)-человеческого инсулина приготавливают, растворяя 76,5 мг А§р(В28)человеческого инсулина в воде, содержащей около 0,32 мл 0,2н. НС1, и добавляя около 0,16 мл 0,4 мг/мл раствор хлорида цинка. Затем добавляют протаминсульфат (эквивалентно примерно 3,2 мг протамина в виде свободного основания) в воде, затем смесь, состоящую из 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола и 160 мг глицерина, полученного из пропилена, причем все растворенное в воде. Полученный раствор, рН которого примерно 2,7, разбавляют до 10 мл водой и уравновешивают до примерно 30°С. К этому раствору добавляют 10 мл раствора, содержащего 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола, 25 мг дигидрата динатрийфосфата и 160 мг глицерина, поученного из пропилена при рН 9, и уравновешивают до примерно 30°С. Спустя 2 дня при температуре 30°С кристаллизация завершается, в результате получают суспензионную смесь, содержащую около 50% А§р(В28)-человеческого инсулина, находящегося в виде нерастворимых МРН-подобных кристаллов и 50% в растворе.

Пример 24. А§р(В28)-человеческий инсулин 30/70 смесь.

Раствор А§р(В28)-человеческого инсулина приготавливают, растворяя 76,5 мг А§р(В28)человеческого инсулина в воде, содержащей около 0,32 мл 0,2н. НС1, и добавляя около 0,16 мл 0,4 мг/мл раствор хлорида цинка. Затем добавляют протаминсульфат (эквивалентно примерно 2,0 мг протамина в виде свободного основания) в воде, затем смесь, состоящую из 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола и 160 мг глицерина, полученного из пропилена, причем все растворенное в воде. Полученный раствор, рН которого примерно 2,7, разбавляют до 10 мл водой и уравновешивают до примерно 30°С. К этому раствору добавляют 10 мл раствора, содержащего 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола, 25 мг дигидрата динатрийфосфата и 160 мг глицерина, полученного из пропилена при рН 9, и уравновешивают до примерно 30°С. Спустя 2 дня при температуре 30°С кристаллизация завершается, в результате получают суспензионную смесь, содержащую около 30% А§р(В28)-человеческого инсулина, находящегося в виде нерастворимых МРН-подобных кристаллов и 70% в растворе.

Пример 25. Раствор миристоил-е-Ьук (В29) -дез (В30)-человеческого инсулина.

Производное аналога инсулина миристоиле-Ьу8(В29)-дез (В30)-человеческий инсулин (37 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,17 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1, затем добавляют 32 мг м-крезола, 1 мл 70 мМ раствора фосфатного буфера в воде, и затем 160 мг глицерина, полученного из пропилена. рН раствора доводят до примерно 7,9, и разбавляют водой до полного объема около 10 мл. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,7 мг миристоил-е-Ьу8(В29)-дез(В30)человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, 7 мМ фосфата натрия, около 3,2 мг м-крезола и около 0,017 мг цинка.

Пример 26. Раствор 61у(А21)Агд(В21) Агд(В32)-человеческого инсулина.

Аналог инсулина 61у(А21)Агд(В31)Агд (В32)-человеческий инсулин (37 мг) растворяют в около 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,80 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1. Добавляют бензиловый спирт (100 мг), затем 188 мг глицерина, полученного из растений. рН раствора устанавливают около 4,0, и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл такой полипропиленовой композиции содержит около 3,7 мг 61у(А21)Агд(В31) Агд(В32)-человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 0,08 мг цинка и 10 мг бензилового спирта.

Пример 27. Раствор 61у(8)-6ЬР-1.

61у(8)-6ЬР-1 (10 мг) растворяют примерно в 5 мл 0,01н. №ЮН. Затем добавляют м-крезол (20 мг), затем 160 мг глицерина животного происхождения с содержанием реакционноспособных альдегидов 2 м.д. по данным описанного здесь МВТН теста. рН раствора доводят до 8,0, и разбавляют водой до полного объема 10 мл. Каждый мл такой полипептидной композиции содержит около 1 мг С1у(8)-СЬР-1, около 16 мг глицерина и 2 мг м-крезола.

Пример 28. Раствор человеческого лептина.

Рекомбинантный человеческий лептин (10 мг) растворяют примерно в 5 мл 0,01н. №ЮН. Затем добавляют м-крезол (30 мг) затем 160 мг глицерина, полученного из растений и 1 мл 70 мМ раствора фосфатного буфера в воде. рН раствора устанавливают 8,0, и разбавляют водой до полного объема 10 мл. Каждый мл такой полипептидной композиции содержит около 1 мг человеческого лептина, около 16 мг глицерина, 7 мМ фосфата натрия и 3 мг м-крезола.

Пример 29. Раствор человеческого Е8Н.

Рекомбинантный человеческий Е8Н (5 мг) растворяют в 10 мМ раствора натрийфосфата рН 7,4. К этому раствору добавляют 30 мг мкрезола, затем 160 мг глицерина, полученного из пропилена. Раствор разбавляют до 10 мл полного объема 10 мМ раствора фосфата натрия рН 7,4. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит 0,5 мг Е8Н, около 10 мМ фосфата натрия, 3 мг м-крезола и 16 мг глицерина.

Пример 30. Раствор 61у(А21)Агд(В21)Агд (В32)-человеческого инсулина.

Аналог инсулина 61у(А21)Агд(В31)Агд (В32)-человеческий инсулин (36 мг) растворяют в около 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,30 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1. Затем добавляют м-крезол (27 мг), затем 200 мг раствора 85% глицерин15% вода, где глицерин получен из пропилена. рН раствора устанавливают около 4,0, и разбавляют водой до примерно 10 мл полного объема. Каждый мл такой полипропиленовой композиции содержит около 3,6 мг 61у(А21)Агд(В31) Агд(В32)-человеческого инсулина, около 17 мг глицерина, полученного из пропилена, около 0,03 мг цинка и около 2,7 мг м-крезола.

Пример 31. Раствор А§р(В28)-человеческого инсулина.

Рекомбинантный А§р(В28)-человеческий инсулин (35 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,2 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1, затем 17 мг м-крезола и 15 мг фенола. Затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена, а затем добавляют 1 мл 70 мМ фосфатного буферированного раствора, содержащего 5,8 мг/мл хлорида (ΝηΟ) в воде. Затем рН раствора устанавливают около 7,4 1н. №10Н и разбавляют водой до полного объема около 10 мл. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг А§р(В28)-человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 7 мМ фосфата, около 1,7 мг м-крезола, около 1,5 мг фенола, около 0,58 мг №101 и около 0,02 мг цинка.

Пример 32. Раствор Агд (34), Ν-ε- (у-61и (Ν-α-гексадеканоил)) -Ьу§ (26) -6ЬР-1(7-37)0Н.

Агд (34), N-ε-(γ-61и(N-α-гексадеканоил))Ьу§ (26)-6ЬР-1 (7-37)0Н (10 мг) растворяют в примерно 5 мл 0,01н. №ЮН. Затем добавляют м-крезол (20 мг), затем 160 мг глицерина, полученного из пропилена. рН раствора устанавливают 8,0, и разбавляют водой до полного объема 10 мл. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 1 мг Агд(34), Ν-ε-(γ61и(№а-гексадеканоил))-Ьу8(26)-6ЬР-1(7-37) ОН, около 16 мг глицерина и около 2 мг мкрезола.

Пример 33. Композиция эксендина-4.

Эксендин-4 (1 мг) добавляют к 5 мл рН 4,5 раствора, содержащего 5 мг/мл ацетата натрия. Затем добавляют м-крезол (27 мг), затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена. При необходимости рН полученной композиции устанавливают 4,5, и разбавляют водой до полного объема 10 мл. Каждый мл такой полипептидной композиции содержит около 0,1 мг эксендина-4, около 2,5 мг ацетата натрия, около 16 мг глицерина и около 2,1 мг м-крезола.

Пример 34. Раствор Ьу§ (В3) 11е (В28)человеческого инсулина.

Рекомбинантный Ьу§(В3)Пе(В28)-человеческий инсулин (35 мг) растворяют примерно в 5 мл 0,01н. НС1. Добавляют 1 мл раствора оксида цинка (0,2 мг/мл цинка), растворенного в 0,1н. НС1, затем 31,5 мг м-крезола и 1 мл 70 мМ раствора фосфатного буфера в воде. Затем добавляют 160 мг глицерина, полученного из пропилена. рН раствора устанавливают около 7,8 1н. №ЮН и разбавляют водой до полного объема 10 мл. Каждый мл этой полипептидной композиции содержит около 3,5 мг Ьу§ (В3) 11е (В28)-человеческого инсулина, около 16 мг глицерина, около 7 мМ фосфата натрия, около 3,15 мг м-крезола и около 0,02 мг цинка.

Принципы, предпочтительные варианты и типы способов настоящего изобретения были раскрыты в предшествующем описании. Однако настоящее изобретение, которое нужно защитить, не следует рассматривать как ограниченное раскрытыми здесь формами, так как они являются лишь иллюстрацией и не ограничивают изобретение конкретными раскрытыми формами. Варианты и изменения могут осуществить специалисты, не выходя за рамки сути настоящего изобретения.

Claims (7)

1. Водная фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая полипептид и глицерин, где содержание альдегида в глицерине, определенное с помощью анализа с использованием глицеральдегида в качестве стандарта, составляет менее 8 м.д.

2. Водная фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая полипептид и глицерин, где концентрация глицерина составляет менее 500 мг/мл, причем указанный глицерин не животного происхождения.

3. Композиция по и. 2, где содержание альдегида в глицерине, определенное с помощью анализа с использованием глицеральдегида в качестве стандарта, составляет менее 8 м.д.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где полипептид представляет собой человеческий инсулин, аналог инсулина, производное человеческого инсулина или производное аналога инсулина.

5. Применение глицерина, содержащего менее 8 м.д. альдегида по данным анализа с использованием глицеральдегида в качестве стандарта, в качестве глицеринового компонента водной фармацевтической композиции для парентерального введения, охарактеризованной в п.1 или 4, для повышения химической стабильности композиции.

6. Применение глицерина не животного происхождения в качестве глицеринового компонента водной фармацевтической композиции для парентерального введения, охарактеризованной в любом из пи.2-4, для повышения химической стабильности композиции.

7. Применение по и. 5 или 6, где полипептид представляет собой человеческий инсулин или его аналог, или его производное, или производное аналога человеческого инсулина.