KR101820115B1 - Ｆｓｈ의 안정화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 FSH 제형, 특히 FSH 액체 제형의 안정화 분야에 관한 것이다. 안정화는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온의 첨가에 의해, 바람직한 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염, 즉, 소듐 염 또는 포타슘 염을 첨가함으로써, 달성된다.
Description
본 발명은 일반적으로 FSH 제형, 특히 FSH 액체 제형의 안정화와 관련된 분야에 관한 것이다. 안정화는 염 첨가에 의해, 바람직한 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 염의 알카리 금속 양이온을 포함하는 염, 즉, Na- 또는 K-염, 또는 이의 조합을 첨가함으로써, 달성된다.
고나도트로핀(gonadotropin)은 본래 여성 및 남성의 생식 주기에 주로 작용하는 호르몬계이다. 고나도트로핀은 연구 목적 및 치료 목적으로 뇨로부터 입수할 수 있지만, 몇가지 고나도트로핀은 재조합 방식으로도 생산할 수 있다.
특히, 고나도트로핀은 불임 치료에 사용할 수 있다.
이러한 분야에 사용되며, 모두 동일한 당단백질 패밀리에 속하는 4종의 주요 고나도트로핀으로는, 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 황체화 호르몬 (LH) 및 융모성 고나도트로핀 (hCG)이 있다. 이들 고나도트로핀 모두 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 이루어져 있으며, 알파 서브유닛은 이들 모두에 있어서 공통적이며, 즉, 전술한 4가지 고나도트로핀들 모두 알파 서브 유닛이 동일하지만, 베타 서브유닛은 각각 다르다.
전술한 바와 같이, 고나도트로핀은 수컷과 암컷에서 생식선 기능을 조절하는 이형이량체형의 당단백질 호르몬에 속한다. 이러한 것으로는 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체화 호르몬 (LH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 (인간) 융모성 고나도트로핀 (hCG)이 있다.
FSH는 뇌하수체 전엽에서 자연적으로 분비되며, 여포 발생과 배란을 지원하는 기능을 수행한다. FSH는, 다른 당단백질 호르몬, 예를 들어, LH 및 hCG에서 공통적인, 92개로 구성된 아미노산 알파 서브유닛과, 호르몬의 생물학적 특이성을 부여하는 FSH에 고유한 111개의 아미노산 서브유닛을 포함한다 (Pierce and Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495). 각 서브유닛은 복잡한 탄수화물 잔기의 부가에 의해 번역 후 변형된다. 이들 서브유닛 둘다 N-연결된 글리칸 결합을 위한 부위 2곳을 가지고 있는데, 알파 서브유닛은 52번 및 78번 아미노산 위치에, 베타 서브유닛은 7번 및 24번 아미노산 위치에 존재한다 (Rathnam and Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17) : 6735-6746 ; Saxena and Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251(4) ; 993-1005)). 즉, FSH는 중량의 약 30%까지 당화된다 (Dias and Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519; Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89).
폐경 후 인간 뇨에서 정제한 FSH는 불임 치료에 다년간 사용되고 있으며, 자연 생식에서는 배란을 자극하고, 보조 생식술을 위한 난모세포를 공급한다. FSH의 2가지 재조합 버전인 Gonal-f (Merck Serono)와 Puregon (Schering-Plough)이 1990년대 중반에 이르러 이용가능하게 되었다. 이들 둘다 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된다 (Howies, CM. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191). CG는 LH 활성을 가지고 있기 때문에, 불임 치료제로 흔히 사용된다.
인간 FSH와 hCG는 모두 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 이형이량체이다. 이들 2가지 호르몬은 알파 서브유닛이 동일하다. 이들 2가지 호르몬 간의 차이는 베타 서브유닛에 기인한다. FSH의 성숙한 베타 서브유닛은 111개의 아미노산으로 구성되지만, hCG의 베타 서브유닛은 145개의 아미노산으로 구성되며, 아울러, FSH와 hCG 베타 서브유닛의 일차 아미노산 서열 역시 베타 체인 전체적으로 상이하다. FSH와 hCG의 베타 체인은 6개의 이황화 결합을 포함하지만, 이들의 아미노산 서열 차이로 인해 이의 고차원 구조 측면에서는 상이하며, 다르게 폴딩되며, 하전된 영역, 극성 영역과 소수성 영역의 분포도 상이하다 (Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle- stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89).
FSH와 hCG의 베타 서브유닛은 둘다 당화되지만, FSH의 베타 서브유닛은 N-당화 (N-7 및 N-24)만 포함하며, hCG의 베타 서브유닛은 N- 및 O-당화 (N-13, N-30, 0-121, 0-127, 0-132 및 0-138) 둘다를 포함한다. hCG의 베타 서브유닛이 과다 당화되면, hCG는 FSH 보다 친수성이 강해진다. β-서브유닛은 수용체와의 상호작용에 특이성을 제공한다.
CHO 세포는 약제학적 재조합 단백질을 제조하는데 일반적으로 사용되고 있다. 구조 분석을 통해, 시알산이 알파2,3-결합으로만 연결된다는 것이 확인되었다. 다수의 인간 당단백질은 시알산 잔기의 알파2,3- 및 알파2,6-결합을 혼합된 형태로 포함하고 있다. 따라서, CHO 시스템을 이용하여 발현시킨 재조합 단백질은 말단 시알산 결합 타입이 이의 천연 산물과 다를 것이다.
불임
본원에서, "불임"은 자손을 임신하고 출산하는 능력의 상실 또는 불능으로 정의될 것이다. 임신할 수 있지만 반복적으로 유산하는 여성도 불임이라고 한다. 또한, 불임은 피임하지 않고 일년간 규칙적인 성 관계를 가짐에도 불구하고 임신하지 못하는 구체적인 용어로도 정의된다. 불임은 많은 요인들에 의해 유발될 수 있다. 불임 사례의 절반 보다 약간 많은 비중이 여성의 병태로 인한 것이다. 나머지 사례는 해명되지 않은 인자나 정자 장애가 원인이다. 불임을 치료하기 위한 몇가지 방법들이 현재 가능한 실정이다. 그러한 것으로는 계획된 성관계(timed intercourse), 보조 생식술 (ART), 자궁내막증, 자궁 근종 및 여성 성 기능 장애 (FSD)에 대한 의학적 조처 및 이상을 교정하기 위한 수술이 있다. 보조 생식술의 경우, 배란을 자극하는 약물을 사용한다. FSH는 LH와 hCG 다음으로 이러한 상황에 많이 사용되는 화합물들 중 하나이다.
투여하는 경우, 이들 화합물은 액체 제형이 적합하다. 그러나, 공교롭게도, 액체 제형에 첨가되는 보존제, 특히 벤질 알코올 (BA), 페놀 및 m-크레졸이 단백질을 불안정하게 만드는 작용을 하는 것으로 확인되었다 (Maa, Y.F. and Chung, C.H. 1996, Aggregation of recombinant human growth hormone induced by phenolic compounds. Int. J. Pharm. 140:155-168; Lam, X.M., Patapoff, T.W., and Nguyen, T.H. 1997, The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma. Pharm. Res. 14:725-729; Hoffmann, J.A. and Lu, J. 2002, FSH and FSH variant formulations comprising benzyl alcohol as a preservative. EΡ0974359B1, 1-50).
이에, 특히, 투여할 FSH의 투여량(dosage)이, FSH 비-천연형이 존재하는 경우, 면역 반응과 같은, 분해된 또는 응집된 형태의 부작용 위험성을 낮추어야 한다는 점에서, 안정화된 제형을 제공하는 것이 중요하다. 그러나, 보존제로 인해 불안정해지는 현상들은 액체 제형내 활성 고나도트로핀, 즉, FSH의 실제 농도를 떨어뜨린다.
따라서, 본 발명의 목적은 제형, 특히 안정한 FSH 액체 제형, 및 이의 안정화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 FSH 액체 제형을 안정화시키기 위해, FSH 액체 제형의 안정화를 위한 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염의 용도에 관한 것이다. 안정화시킬 액체 제형은 보존제를 첨가하거나 첨가하지 않은 제형일 수 있다.
아래 구현예들이 바람직하다:
1. FSH 액체 제형의 안정화를 위한, 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염의 용도로서,
상기 염은 약제학적으로 허용가능한 Na+-염 및 K+-염, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 염.
2. 제1의 용도에 있어서, 상기 염은 Na+-염이다.
3. 제1 또는 2의 용도에 있어서, 상기 염은 NaCl 또는 Na2S04이다.
4. 제1 또는 2의 용도에 있어서, 상기 염은 Na2S04이다.
5. 제1 또는 2의 용도에 있어서, 상기 염은 NaCl와 Na2S04의 조합이다.
6. 제1 내지 제5 중 어느 하나의 용도에 있어서, 상기 염은 20 - 500 mM, 30 - 300 mM 또는 50 - 200 mM의 양으로 포함된다.
7. 제1 내지 제6 중 어느 하나의 용도에 있어서, 상기 FSH 제형은 rFSH 제형이다.
8. 제1 내지 제7 중 어느 하나의 용도에 있어서, 상기 제형은 보존제를 더 포함한다.
9. 제8의 용도에 있어서, 상기 제형은 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함한다.
10. 제1 내지 제9 중 어느 하나의 용도에 있어서, 상기 제형은 주사 제형이다.
11. FSH 액체 제형의 안정화 방법으로서,
상기 방법은, 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 상기 제형에 첨가하는 단계를 포함하며,
상기 염은 Na+-염 및 K+-염, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
12. 제11의 방법에 있어서, 상기 염은 제2 내지 제6에 따라 정의된다.
13. 제11 및/또는 제12의 방법에 있어서, 상기 안정화되는 FSH는 rFSH이다.
14. 제11 내지 제13 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제형은 보존제를 더 포함한다.
15. 제14의 방법에 있어서, 상기 보존제는 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
16. 제1 내지 제10 중 어느 하나의 용도에 있어서,
상기 액체 제형은 동결-건조 제형으로부터 수득되어진 재-구성된 액체 제형(re-constituted liquid formulation)이다.
17. 제11 내지 제15 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 염을 첨가하는 단계는 동결-건조 단계 전에 수행한다.
18. 제17의 방법에 있어서, 상기 동결-건조 단계 이후에 재-구성 단계를 수행한다.
19. 제17 및/또는 제18의 방법에 있어서, 상기 염은 동결 건조된 제형에 포함되거나, 상기 염은 재-구성된 액체에 포함된다.
안정화를 위한 염이 첨가된 제형은 다른 구현예에서 동결-건조된 상태로 보관된다. 동결-건조는 당해 기술 분야의 당업자들에게 일반적으로 공지된 바와 같이 수행한다. 동결-건조 제형은 환자가 최종 사용하기 전까지 보관할 수 있다. 동결-건조 제형은, 투여하기 전에, 공지의 재구성용 매질들 중 어느 하나, 예를 들어 멸균수를 사용하여 재구성한다. 염은 동결-건조 제형 또는 재-구성 액체에 포함된다.
20. 상기 용도 또는 방법에 있어서, 상기 액체 제형은 1회용 제형 또는 다회 투약용 제형이며, 바람직하게는 주사용 제형이다.
바람직한 구현예에서, 염은 동결-건조하지 않고 보관시 액체로서 유지되는 액체 제형 자체에 포함된다.
구체적으로, 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 알칼리 금속 양이온이 Na+및 K+로 이루어진 군으로부터 선택되는, FSH 액체 제형의 안정화에 관한 것이다. 특히 바람직하게는, 상기 염은 NaCl 또는 Na2S04이다.
전술한 바와 같이, FSH 액체 제형은 불임 치료에 적합하다. 이와 관련하여, FSH 액체 제형이 불안정할 수 있다는 것이 자명하며, 1회용으로 지정된 제형을 비롯한 모든 FSH 액체 제형들이 그러하다. 불안정성은, 모든 다회 투약용 제형에게 필수적인 보존제를 FSH 액체 제형이 포함하는 경우에, 훨씬 더 심각해질 수 있다. 이러한 보존제는 FSH 제형을 보존하는데 유용한 모든 보존제일 수 있으며, 따라서, 보존제는 FDA로부터 FSH 제형으로 승인된 보존제, 특히, 예를 들어, FSH 비경구 제형에 대해 승인된 FDA 승인된 보존제, 예컨대 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸일 수 있지만; 보존제가 이러한 예들로 한정되진 않는다. FSH의 안정성은, 예를 들어 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸에 의해 감소된다.
따라서, 약제학적으로 허용가능한 양이온을 포함하는 본원에서 청구되고 기술되는 염은, 1회용 FSH 제형을 안정화하는데 사용된다.
아울러, 약제학적으로 허용가능한 양이온을 포함하는 본원에서 청구되고 기술되는 염은 다회 투약용 FSH 제형을 안정화하는데 사용되며, 이러한 제형은 보존제를 포함할 필요가 없지만, 또한 보존제를 포함할 수도 있다.
약제학적으로 허용가능한 양이온을 포함하는 본원에서 청구하는 염, 즉, Na+-염 및 K+-염의 첨가는, FSH 액체 제형을 안정하게 만든다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 염은 약제학적으로 허용가능한 염이다. 안정화는 1회용 또는 다회 투약용 제형에서, 특히 장기간의 저장 기간 동안에 달성되며, 추가적인 가능한 구현예에서, 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸과 같은 보존제의 불안정화 유발 효과에 대한 대책으로서 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 염은, 바람직한 구현예에서, NaCl와 Na2S04를 포함한다.
상기 염은, 바람직하게는, 20 - 500 mM의 양으로 포함되며, 보다 바람직하게는 30 - 300 mM의 양으로 포함되며, 특히 바람직하게는 50 - 200 mM의 양으로 포함된다.
첨가되는 염의 최대량은 용액의 삼투질농도(osmolality)에 의해 제한된다. 주입시 통증을 최소화하기 위해, 용액은 바람직하게는 등장성이거나 적어도 고장성(hypertonic)은 아니어야 한다. 용액내 모든 부형제들이 삼투질농도에 기여하므로, 용액에 첨가될 수 있는 염의 최대량은 존재하는 다른 성분들의 양에 따라 결정된다.
염은 바람직하게는 최대 삼투질농도 350 mosmol/kg, 더 바람직하게는 최대 삼투질농도 320 mosmol/kg, 가장 바람직하게는 최대 삼투질농도 300 mosmol/kg을 형성하는 양으로 포함된다.
삼투질농도 이론
삼투질농도 이론은 용액의 삼투압에 작용하는 용액에 존재하는 다양한 용질의 전체 측정치를 제공하는 실질적인 수단이다. 삼투질농도는 the Ph. Eur. 2.2.35, 7th edition, supplement 2011 (7,2), Osmolality, 01/2008: 20235에 따라 측정할 수 있다.
본 발명에서 "염"은 수소를 금속 또는 양전하 라디컬(electropositive radical)로 전체적으로 또는 일부 치환함으로써 산으로부터 파생되는 화합물이다.
"약제학적으로 허용가능한 염의 양이온을 가진 (또는 포함하는) 염"의 정의는 FDA 비활성 성분 리스트에 따라 i.m. 또는 s.c.용으로 승인된 양이온으로 이루어진 그러한 모든 염을 지칭하며; 이러한 그룹의 알칼리 금속 양이온은 소듐 (Na+) 및 포타슘 (K+)이다.
본 발명자들은 2종의 매우 특이적인 양이온들이 특히 FSH 제형을 안정화하는데 적합하다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다.
이에, 염은 다음과 같은 약제학적으로 허용가능한 양이온으로 이루어질 수 있다: 포타슘 (모노-, 디- 또는 트리베이직), 또는 소듐 (모노-, 디- 또는 트리베이직). 바람직하게는, 염은 소듐염이다.
특히 바람직하게는 NaCl 및 Na2S04이다.
본 발명에 따라 안정화될 수 있는 고나도트로핀은 FSH, 즉 여포 자극 호르몬이며, 선택적으로 다른 활성 성분과 조합된 형태이다.
FSH는 뇨나 혈장으로부터 유래되는 FSH이거나 또는 재조합 FSH (rFSH)이다. 바람직한 구현예에서, FSH는 뇨 유래이거나 또는 rFSH이며, 특히 바람직하게는 rFSH이다.
전술한 바와 같이, FSH를 재조합 방식으로 생산하는 것은 현재 가능한 일이다. 따라서, 본원에서 FSH에 대한 언급은 일반적으로 뇨로부터 유래된 것 뿐만 아니라 재조합 (r) 고나도트로핀 둘다를 항상 포함한다. 따라서, FSH에 대한 언급은 rFSH를 포괄한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제형은, Na2S04 또는 NaCl에 의해 안정화된, rFSH 액체 제형이며, 가장 바람직하게는 주사용 제형이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제형은, Na2S04 또는 NaCl에 의해 안정화된, rFSH 액체 제형이며, 가장 바람직하게는 주사용 제형이다.
다른 구현예에서, 모든 구현예들에서 rFSH는 장기 작용성 FSH이다. 장기 작용성 FSH 제형은 일반적으로 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 바와 같이, 예를 들어 FSH 분자를 변형시킴으로써 또는 제형을 변형시킴으로써, 수득할 수 있다.
따라서, FSH는 모든 가능한 뇨 유래이거나 또는 전술한 FSH의 재조합 형태, 뿐만 아니라 모든 가능한 FSH 형태들의 조합을 포괄한다. 또한, 1회용 제형 및 다회 투약을 위한 (동일한 또는 상이한 고나도트로핀의) 하나 이상의 추가적인 제형들이 포괄된다.
가능한 한가지 산물은, 다른 바이얼내의, 모든 FSH를 포함하는 (선택적으로, CG, LH, LH 활성 등을 포함함) 제형일 수 있다. LH 활성은, 존재하는 경우, LH 또는 CG로부터 기원할 수 있다. LH는 등가 용량(equivalent dose)의 CG로 대체되거나 또는 반대일 수 있으며; "등가 용량"은 Pharmacopeia Van Hell Bioassay (Van Hell, H et al, Acta Endocrin. 47, 409-418, 1964)에서 CG 1U이 LH 5-7 IU에 해당한다는 전제로 계산할 수 있다.
바람직한 조합은, 여러가지 바이얼내, 모든 (r)FSH, (r)LH 및 (r)hCG의 조합이다.
여러가지 바이얼에서 가능한 조합들은 또한, 뇨 (u) FSH + uhCG 또는 uFSH + uLH; 또는 (rhCG 또는 rLH 또는 rFSH) + (uhCG 또는 uLH 또는 rhCG 또는 rLH), 및 모든 가능한 배열을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 각각 다른 바이얼에서의 (r)FSH와 (r)hCG의 조합이다.
다른 바람직한 조합은 각각 다른 바이얼에서의 (r)FSH와 (r)LH의 조합이다.
본 발명의 FSH 제형은 액체 제형이다.
바람직하게는, 제형은 주사용이다. 제형은 별도로 또는 함께 투여하기 위한, FSH 또는 FSH/hCG를 포함하여, 1, 2 또는 그 이상의 약학 조성물(들)을 구비한 제품으로써 공급될 수 있다. 별도로 투여하는 경우, 투여는 순차적일 수 있다. 제품은 임의의 적정 패키지로 공급할 수 있다. 예를 들어, 제품은 각각 FSH (FSH 조성물) 또는 추가적으로 hCG(hCG 조성물)을 포함하는, 복수개의 사전-충전된 주사기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 주사기는 블리스터 패키지나 또는 멸균성을 유지하기 위한 다른 수단으로 포장할 수 있다. 제품은 선택적으로 FSH 제형을 사용하기 위한 설명서를 구비할 수 있다. 다른 측면에 있어서, 본 발명의 FSH 제형은 다회 투약용 조제물로서 제공된다. 그러나, 본 발명은 명백하게는 1회용으로 고안된 제형이다. 또한, 본 발명은 키트 부품(part of a kit)으로서 제형의 안정화에 관한 것이다. 이러한 키트는 1일 FSH 용량 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하거나, 또는 예를 들어, 각각 다른 고나도프로핀을 포함하는 2개의 용기 (예, 바이얼), 및 예를 들어 추가적인 설명서 (예, 투여를 위한 설명서)와, 예를 들어 다른 주사 수단을 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 다회 주사를 위한 주사 펜이 바람직하며, 이 경우 FSH 용액은 각 카트리지에 충전된다.
바람직한 구현예에서, FSH는 35 - 850 IU/ml, 더 바람직하게는 50 - 800 IU/ml, 보다 더 바람직하게는 100 - 600 IU/ml로 포함된다.
예를 들어, 600 IU/ml rFSH에 대해 특히 바람직한 제형은 아래 조성을 가진다:
600 IU/ml rFSH
0.001 - 0.05, 바람직하게는 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20
0.1 - 10, 바람직하게는 1.0 mg/ml L-메티오닌
0.5 - 50, 바람직하게는 5.0 mg/ml 페놀
1 - 100, 바람직하게는 14 mg/ml 디소듐 설페이트 (i.e. 0.1 )
0.1 - 10, 바람직하게는 1 mM 소듐 포스페이트 완충액, (pH 6 - 8, 바람직하게는 pH 6.5).
용액의 삼투질농도는 바람직하게는 300 mosmol/kg이다.
(pH는 전체 용액의 pH를 의미함).
주사용 데포 형태(injectable depot form)는 생분해성 폴리머내 FSH (및 존재하는 경우, 기타 물질)의 마이크로엔캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조할 수 있다. 폴리머 기반의 데포 형태/지속 방출형 시스템은, 이의 화학적 특성에 따라, 예를 들어, 마이크로 입자 또는 나노 입자, 하이드로겔, 마이셀, 에멀젼 또는 임플란트일 수 있다. FSH : 폴리머의 비율과 사용되는 개별 폴리머의 성질에 따라, FSH의 방출율을 조절할 수 있다. 생분해성 폴리머의 예로는 폴리락티드/폴리글리콜리드 공중합체 시스템, 폴리비닐피롤리돈, 폴리(오르소에스테르), 폴리(안하이드라이드), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리 아미노산, 다당류, 예컨대, 소듐 히알루로네이트 (NaHA) 또는 이의 다른 염들, 젤라틴, 키토산 등이 있다. 언급된 폴리머들 모두 단백질 약물 전달이나 그 안정성을 최적화하기 위해 유도체화하거나 변형할 수 있다. 또한, 데포 주사 제형은, 신체 조직에 친화적인, 지질 시스템, 또는 마이셀, 리포좀 또는 마이크로에멀젼으로서 폴리머 지질 혼합물내에 FSH를 포획함으로써, 제조한다.
주사용 제형은 예를 들어 박테리아 체류 필터(bacterial-retaining filter)를 통해 여과하거나, 또는 사용하기 직전에 멸균수 또는 기타 멸균된 주사용 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있는, 살균 고체 조성물 형태에 살균제를 투입함으로써, 살균할 수 있다. 주사용 제형은, 적술한 바와 같이, 임의의 적합한 용기, 예컨대, 바이얼, 사전-충전된 주사기, 주사 카트리지 등에 넣어 제공될 수 있다.
약학 조성물의 다양한 성분들의 pH와 실제 농도는 당해 분야의 일반적인 실무 절차에 따라 조정한다. GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th edition을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물로서 제공한다. 비경구 제형을 제조하는 일반적인 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, at pages 780-820에 기술되어 있다. 비경구 조성물은 액체 제형으로 제공되거나 또는 투여하기 직전에 멸균 주사 매질과 혼합하는 고형으로 제공될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투약 단위 형태(dosage unit form)로 제공된다.
본 발명의 FSH는 통상적인 수단에 의해 뇨로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 가능한 제조 방법으로서, 또한 WO 2009/127826을 참조한다.
hCG는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단으로 수득할 수 있다. 본원에서 hCG는 인간 유래 및 재조합 hCG를 포함한다. 인간 유래 hCG는 임의의 적합한 소스 예, 뇨 및 태반)로부터 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 정제할 수 있다. 재조합 hCG를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
LH는 당해 기술 분야에 공지된 임의 수단으로 수득할 수 있다. 본원에서 LH는 인간 유래 및 재조합 LH를 포함한다. 인간 유래 LH는 임의의 적합한 소스 예, 뇨)로부터 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 정제할 수 있다. 재조합 LH를 발현 및 정제하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
약학 조성물은 불임 치료, 예를 들어, 예컨대 보조 생식술 (ART), 배란 유도 (OI) 또는 자궁내 정자 주입(IUI: intrauterine insemination)을 위한 것일 수 있다. 약학 조성물은, 예를 들어, 공지 FSH 조제물이 사용되는 의학적 증상에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 불임 치료용 약제를 제조하기 위해 또는 제조에 있어서, (본 발명의 측면에 따른) 본원에 기술된 안정화된 FSH 조제물의 용도를 제공한다. 약학 조성물은 임의의 약물 투여 경로를 위한 잘 공지된 조성물, 예컨대 구강, 직장, 비경구, 진피 (예, 패치 기술), 정맥내, 근육내, 피하, 강내(intracisternal), 질내, 복막내, 국소 (산제, 연고 또는 점적제) 또는 볼 또는 코 스프레이로 제형화할 수 있다. 전형적인 조성물은, Remington's Pharmaceutical Sciences fifteenth edition {Matt Publishing Company, 1975), at pages 1405 - 1412 및 1461 - 87, and the national formulary XIV fourteenth edition (American Pharmaceutical Association, 1975)에 기술된 바와 같이, 수용액, 염 및 보존제 등의 무독성 부형제, 완충제 등과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
적합한 수성 및 비수성 약제학적 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로피러렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시-메틸셀룰로스 및 이들의 적정 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일), 및 에틸 올리에이트 등의 주사용 유기 에스테르를 포함한다.
또한, 조성물은, 비제한적인 예로서, 보존제, 습윤제, 유화제, 완충제 및 분산제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 미생물의 증식을 방지하기 위해 항세균제 및 항진균제를 포함시킬 수 있으며, 그 예로는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등이 있다. 아울러, 긴장성 제제(tonicity agent)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 경우에, 지속적인 작용을 구현하기 위해, 피하 또는 근육내 주입으로부터 FSH (및 존재하는 경우, 기타 활성 성분)의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 수용성이 낮은 결정형 또는 비정질 물질의 액체 현탁물을 이용함으로써 달성할 수 있다. 예컨대 FSH의 흡수율은, 용해 속도에 의존하며, 용해 속도는 결정의 크기와 결정 형태에 따라 결정될 수 있다. 다른 예로, 비경구 투여된 FSH 조합 형태의 지연성 흡수는, FSH 조합물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁함으로써 달성한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 액체 고나도트로핀 제형의 안정성에 대한 특정 화합물의 효과를 조사하고자 시도하였으며, 그 결과 특정 화합물들의 안정화 효과와 불안정화 효과가 확인되었다.
용어 "안정성"은 아미노산 서열에서의 공유 결합 변형이 포함되는 화학적 안정성을 지칭 수 있으며, 단백질 안정성 측면에서는, 또한, 공유 결합 절단을 포함하지 않는 (즉, 천연 상태) 단백질의 폴딩 상태의 변화를 포함하는, 물리적 안정성도 지칭할 수 있다.
본원에서, 용어 "안정성"은 고나도트로핀, 특히 본 발명의 FSH의 제형의 물리적 안정성을 지칭한다. 단백질 제형의 물리적 불안정성은, 단백질 분자의 응집에 의한 고차 구조의(higher order) 응집체 형성에 의해, 이형이량체의 단량체로의 해리에 의해 또는 본 발명에 포함되는 FSH의 한가지 이상의 생물 활성을 낮추는 임의의 다른 구조적 변화에 의해 유발될 수 있다.
"안정한" 용액 또는 제형은, 그 안에 존재하는 단백질의, 응집도, 해리도, 구조적 변형 수준, 생물학적 활성 소실 정도 등이, 허용가능한 수준으로 제어되며, 시간 경과에 따라 허용불가한 수준으로 증가되지 않는다. 안정성은 샘플의 광 산란 측정, 가시적인 투명도 조사 및/또는 색, 흡광 또는 광 밀도, 분자 크기 결정 (예, 크기 배제 크로마토그래피 또는 장 흐름 분획법(field flow fractionation)), 시험관내 또는 생체내 생물 활성 및/또는 시차 주사 열량법(DSC) 등의, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법으로 평가할 수 있다. 안정성을 평가하는 다른 방법들도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
몇가지 보존제들이 고나도트로핀 제형에 충분한 불안정한 효과를 나타낸다는 것이 알려져 있으며, 본원에서 FSH 액체 제형을 안정화시키는데 적합한 것으로 입증된, 염, 특히 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온, 특히 Na+ 또는 K+을 포함하는 염, 예컨대 NaCl 또는 Na2S04가, 의학적 사용을 위해 액체 다회 투여용 FSH 제형에 포함되어야 하는, 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸과 같은 보존제의 불안정 유발 효과를 상쇄하는데에도 또한 유용하다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 본원에서 청구하는 염은, FSH 액체 제형에 대해, 예컨대 슈크로스와 같이 알려져 있는 안정화제의 안정화 효과 보다 유익하고 놀라운 방식으로 훨씬 더 강력한, 안정화 효과를 발휘한다. 기존의 안정화제 보다 개선된 안정화 효과가 특히 놀라운 점이다. 아울러, 거의 예상하지 못하게도, 매우 유사한 hCG에서는 안정화 효과를 입증할 수 없었음에도 불구하고, FSH 제형에서는 본 발명에 따른 염의 안정화 효과를 입증할 수 있었다. 또한, 놀랍게도, 관찰되는 안정화 효과는 소위 호프마이스터 시리즈(Hofmeister series) (하기 참조)에 따르지 않으며, 실제 이와 상충한다.
FSH 약학 제형에서 FSH가 분해된다는 것은 종래에 공지되어 있으며, 이는 본 발명의 실시예 제1 세트에서도 확인된 바 있다.
FSH는 시간 함수로서, 그리고 온도 함수로서 분해될 것이다. 특히, 실온 보다 높은 온도에서, 2차, 3차 및 4차 구조가 변성될 것이다.
가열시 발생하는 FSH의 3차 및 2차 구조의 구조적 언폴딩(conformational unfolding)은 2-상 전이(two-state transition) (단백질 응집이 제한되는 경우)인 것으로 보인다. 이러한 언폴딩은 서브유닛 해리 (4차 구조의 변화)과는 독립적일 수 있다.
아울러, 본 발명에서는, 보존제가 FSH 액체 제형내 항균제로서 필요한 경우, 이러한 벤질 알코올 또는 페놀과 같은 보존제를 함유하는 FSH는, 다회 투약용 FSH 제형의 안정성에 명백하게 부정적으로 작용한다는 것이 명백해졌다. FSH 제형에 보존제가 첨가되지 않으면, FSH의 장기 안정성은 감소되고, FSH 변성 온도는 낮아지고, 이미 변성된 형태는 보다 낮은 수준의 2차 구조를 취한다.
또한, 본 발명은, FSH 액체 제형의 안정화를 위한 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온, 즉 Na 및 K를 포함하는 염이 FSH 액체 제형의 안정성에 대해 현저한 효과를 나타낸다는 것을 처음으로 입증한다. 이들 염을 포함하는 FSH 액체 제형내에서 FSH의 이차 구조는 76.5℃까지로 가열하더라도 현저하게 변성되지 않을 것이다. 변성된 형태는 예컨대 Na2S04 존재 중에서 상대적으로 구조화되며, 이는 변성이 더욱 가역적일 수 있게 하며, 따라서, 단백질의 카이네틱 안정성을 현저하게 증가시킨다. 이는, FSH의 이형이량체 구조에 대해 충분한 안정화 효과를 입증하는, 본원에 나타낸 실시간 안정성 데이타에 의해 뒷받침된다.
이러한 결과들은, 본원에서 청구하는 염들, 예컨대 황산 나트륨 및 염화 나트륨이, FSH 분자의 해리되는 경향을 제한하며, 따라서 저장 안정성을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을, 명확하게 입증준다.
또한, 본 발명은, 상기 제형에 상기 염을 첨가하는 단계를 포함하는, FSH 액체 제형의 안정화 방법에 관한 것이다. 모든 실험들은 추가적으로 수행한 실시간 데이타로 검증하였다.
도 1:
다양한 온도에서 rFSH에 대한 파장(nm)의 함수로서 CD(원편광 이색성, 하기 참조) 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았지만, 50℃ 이상에서의 온도 의존적인 CD 신호 감소가 관찰되었다. rFSH 단백질 (0.93 mg/ml)을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선), 63.4℃ (*), 67.8℃ (◇) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 2:
다양한 온도에서 Na2S04를 포함하는 rFSH에 대한 파장(nm)의 함수로서 CD 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. rFSH 단백질을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20과 8.6 mg/ml 황산 나트륨 (Na2S04)이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 3:
다양한 온도에서 벤질 알코올을 포함하는 rFSH에 대해 파장(nm)의 함수로서 CD 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. rFSH 단백질 (0.93 mg/ml)을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20과 0.17 mg/ml 벤질 알코올이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 45.9℃ (○), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선), 63.4℃ (*), 67.8℃ (◇) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 4:
hCG와 rFSH에 대한 이후의 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 5 mg/ml hCG의 DSC 데이타와, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.24 NaCl, 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 2.4 mg/ml rFSH의 DSC 데이타. 스캔 속도 2.0℃/분. 1차 rFSH 스캔 (실선), 2차 rFSH 스캔 (줄-점선), 1차 hCG 스캔 (-----) 및 2차 hCG 스캔 (점선). 1차 스캔 후, 샘플을 2차 스캔하기 전에 20℃로 냉각시켰다.
도 5:
hCG + 다양한 당 또는 염에 대한 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌 및 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 5 mg/ml hCG에 대한 DSC 데이타. 당 또는 염 무첨가 (진한 실선), 0.1 M Na2S04 (실선), 0.1 M NaCl (점선), 0.1 M NaCl04 (-----) 및 0.1 M 슈크로스 (줄-점선). 스캔 속도 2.0℃/분.
도 6:
rFSH + 다양한 당 또는 염에 대한 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌 및 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 2.4 mg/ml rFSH에 대한 DSC 데이타. 당 또는 염 무첨가 (진한 실선), 0.1 M Na2S04 (실선), 0.1 M NaCl (점선), 0.1 M NaCl04 (-----) 및 0.1 M 슈크로스 (줄-점선). 스캔 속도 1.0℃/분.
다양한 온도에서 rFSH에 대한 파장(nm)의 함수로서 CD(원편광 이색성, 하기 참조) 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았지만, 50℃ 이상에서의 온도 의존적인 CD 신호 감소가 관찰되었다. rFSH 단백질 (0.93 mg/ml)을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선), 63.4℃ (*), 67.8℃ (◇) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 2:
다양한 온도에서 Na2S04를 포함하는 rFSH에 대한 파장(nm)의 함수로서 CD 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. rFSH 단백질을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20과 8.6 mg/ml 황산 나트륨 (Na2S04)이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 3:
다양한 온도에서 벤질 알코올을 포함하는 rFSH에 대해 파장(nm)의 함수로서 CD 신호 (mdegree)를 나타낸다. 24.0 ℃ -> 45.9 ℃ 스펙트럼 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. rFSH 단백질 (0.93 mg/ml)을 0.0036 mg/ml 폴리소르베이트 20과 0.17 mg/ml 벤질 알코올이 함유된 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3에 용해하였다. 24.0℃ (진한 실선), 45.9℃ (○), 50.3℃ (-----), 54.7℃ (점선), 59.0℃ (줄-점선), 63.4℃ (*), 67.8℃ (◇) 및 76.5℃ (실선)에서의 스캔.
도 4:
hCG와 rFSH에 대한 이후의 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 5 mg/ml hCG의 DSC 데이타와, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.24 NaCl, 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 2.4 mg/ml rFSH의 DSC 데이타. 스캔 속도 2.0℃/분. 1차 rFSH 스캔 (실선), 2차 rFSH 스캔 (줄-점선), 1차 hCG 스캔 (-----) 및 2차 hCG 스캔 (점선). 1차 스캔 후, 샘플을 2차 스캔하기 전에 20℃로 냉각시켰다.
도 5:
hCG + 다양한 당 또는 염에 대한 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌 및 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 5 mg/ml hCG에 대한 DSC 데이타. 당 또는 염 무첨가 (진한 실선), 0.1 M Na2S04 (실선), 0.1 M NaCl (점선), 0.1 M NaCl04 (-----) 및 0.1 M 슈크로스 (줄-점선). 스캔 속도 2.0℃/분.
도 6:
rFSH + 다양한 당 또는 염에 대한 DSC 스캔. 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 0.5 mg/ml L-메티오닌 및 1 mM 포스페이트 완충액, pH 6.5 중의 2.4 mg/ml rFSH에 대한 DSC 데이타. 당 또는 염 무첨가 (진한 실선), 0.1 M Na2S04 (실선), 0.1 M NaCl (점선), 0.1 M NaCl04 (-----) 및 0.1 M 슈크로스 (줄-점선). 스캔 속도 1.0℃/분.
본 발명은 하기 실시예들을 들어 더욱 상세하게 설명하지만, 아래 실시예들은 어떠한 방식으로도 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1 - 방사광 원편광 이색성 분광학 (SRCD: Synchrotron Radiation Circular Dichroism Spectroscopy) 방법
덴마크 오르후스 대학의 방사광 시설을 이용하여 원편광 이색성 분광학을 수행하였다. 모든 CD 스펙트럼은, 180 - 270 nm 파장 범위에서 1 nm 간격으로, 파장 당 3초의 지속 시간으로, 0.1 mm 통로 길이의 석영 suprasil 셀 (Hellma GmbH, Germany)을 이용하여 기록하였다. rFSH 및 비교 (위약) 실험 둘다 각 실험 당 3번의 동일한 CD 스캔을 기록하였다. 본 리포터에 제시되는 rFSH의 CD 스펙트럼은, 평균 단백질 스캔에서 대응되는 평균 위약 스캔을 추출하여, 수득하였다. 각 CD 스캔 세트에서, 약 120 ㎕의 용액 (rFSH 약 112 g에 해당됨)을 사용하였다.
rFSH 스펙트럼에 대한 온도 효과를 조사하던 중에, 가열 챔버의 온도를 5℃ 간격 및 평균 시간 5분으로 25℃에서 85℃로 변경하였다. 보정 파일로부터 실제 실험 온도(석영 suparsil 셀내 온도)를 구하였다.
CD는 구조 대칭성으로 인해 발생하는, 좌선회 및 우선회 타원 편광의 흡광 차이를 측정한다.
단백질의 2차 구조는 원자외선 영역 (약 180 - 250 nm)에서의 CD 분광측정으로 조사할 수 있다. 일반적으로, 고차원 구조는 CD 신호 세기 (파지티브 또는 네거티브)가 더 강해진다. 그러나, 다른 이차 구조는 다른 CD 스펙트럼을 나타내며, 알파-나선은 베타-구조 보다 CD 신호가 더 강하여, 구조의 질서도르 확인하기 위한 다른 단백질 간의 직접 비교는 수행할 수 없다.
구조 변화에 대한 높은 민감성으로 인해, CD 분광법은 단백질의 물리적 안정성을 평가하는 강력한 도구이다. 이러한 실험은, 외부 요소, 예컨대 온도, pH, 변성제, 계면활성제 또는 안정화제의 농도에 변화에 대하여 CD 스펙트럼을 구함으로써, 일반적으로 수행한다. 본 실험에서는, rFSH의 CD 스펙트럼을 온도에 따라 조사하였다. 부가적으로, rFSH 2차 구조에 대한 벤질 알코올과 황산 나트륨(Na2SO4)의 효과를 조사하였다.
본 실시예와 실시예 2 및 3에서 사용되는 고나도트로핀은 인간 PER.C6? 세포주로부터 재조합 DNA 기법으로 발현시킨 인간 호르몬 재조합 여포 자극 호르몬 (rFSH)이다. rFSH는 2개의 당화된 단량체들로 구성된 이형이량체 단백질로, FSH, 황체 형성 호르몬 (LH), 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG) 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH)에서 공통적인 92개의 아미노산과, FSH에 특이적인 111개의 아미노산으로 구성된 베타-서브유닛으로 이루어져 있다. FSH를 포함하는, 당단백질 호르몬들은, 모두 비공유적으로 결합된 단량체들이 해리되었을 때 그 생활성도 잃게 된다. 이전의 결과들은, rFSH의 불안정성이 주로 이량체의 해리 (3차 구조의 분해 및 동시적인 면역결합 반응성 감소)로 인한 것임을 나타내고 있다.
의도한 용도에 따라, 현재 시판되는 rFSH 제형들은 37.5 IU/ml (Gonal-f의 경우 약 2.8 μg/ml에 해당됨)에서 적어도 최대 833 IU/ml (Puregon의 경우 약 83.3 μg/ml에 해당됨) 범위의 여러가지 농도로 공급되고 있다.
본 실험들에서 사용된 rFSH는 피하 주사를 위한 600 IU rFSH/ml 액체 약물 제품 제형이다. 이 제품은 다회 투약 주사를 위한 것으로, 보존제가 필수적으로 첨가된다.
조사한 제형은, 여러가지 성분들로 구성된 스톡 용액을 혼합하여 제조하였다. 단백질과 부형제 둘다 테스트한 농도 간격은 사용하는 방법에 의해 한정되며, 즉, 단백질 농도는 부형제 농도 보다 상대적으로 높게 유지되어야 한다. 실험한 파장 범위에서는 방향족 화합물의 UV 흡광으로 인해, 벤질 알코올 농도를 낮게 유지하여야 했다. 하기 표는 본 발명자들이 1차 실험 설계로 조사한 3종의 제형들을 개략적으로 나타낸다.
표 1
표는 rFSH에 대한 온도 효과에 대한 SRCD 실험에 사용된 3종의 제형의 내용물을 열거한다.
| 샘플 | 내용물 |
| 1 | rFSH 0.93 mg/ml, 폴리소르베이트 203.6 ㎍/ml, 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3 |
| 2 | rFSH 0.93 mg/ml, 폴리소르베이트 203.6 ㎍/ml, Na2SO4 8.6 mg/ml, 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3 |
| 3 | rFSH 0.93 mg/ml, 폴리소르베이트 203.6 ㎍/ml, 벤질 알코올 0.17 mg/ml, 3.57 mM 포스페이트 완충액 pH 6.3 |
샘플 1
24℃ - 77℃에서 13가지 온도에서 rFSH 샘플 1 (표 1 참조)에 대한 CD 스펙트럼을 구하였다. 명확한 도시를 위해, 스펙트럼들 중 7개만 도 1에 나타낸다. 표 1에서 유래된 샘플 1은 염이나 보존제를 포함하지 않는 것이다. 스펙트럼들을 도 1에 나타내었다. 그 결과, CD 신호 세기는 온도에 따라 감소되는 것으로 명확하게 나타났으며, 이는 고온 (>50℃)에서 이차 구조가 분해됨을 의미한다. 24.0℃ -> 45.9℃에서의 스펙트럼 상의 유의한 차이는 검출되지 않았으며, 이는 측정한 기간 동안 (약 20분), 단백질의 2차 구조가 약 46℃로 가열시 손상되지 않는다는 것을 의미한다. 가열시 FSH의 SRCD 스펙트럼에서, 약 193 nm에서 이소다이크로익 포인트(isodichroic point)가 나타났으며, 이는 또한 샘플 2의 스펙트럼에서도 나타났다 (도 2 참조).
샘플 2
Na2S04를 포함하는 rFSH 샘플 2 (표 1)에 대해 CD 스펙트럼을 기록하였다. 스펙트럼은 24℃ - 77℃에서 13가지 온도에서 입수하였고, 도 2에 나타내었다. 명확힌 도시를 위해, 스펙트럼들 중 5개만 도 2에 나타낸다. 그 결과, 온도에 따른 이차 구조의 분해가 확인되었다. 이러한 데이타는, 약 46℃ (실험 내내)로 가열시, 샘플 2의 rFSH 이차 구조는 손상되지 않는 것으로 나타났다. 중요하게도, 이 데이타에서, 변성된 형태가 Na2S04의 존재 중에서 상대적으로 구조화된 것으로 나타났다.
샘플 3
벤질 알코올 (BA)을 포함하는 rFSH 샘플 3 (표 1)에 대해 CD 스펙트럼을 구하였다. 벤질 알코올은 FSH 액체 제형화에 매우 일반적으로 선택되는 항균 보존제이다. 이는 예컨대 m-크레졸에 비해 상대적으로 보존력이 약하기 때문에, BA는 고농도 (약 10-15 mg/ml)로 사용하여야 한다. rFSH의 의도한 용도가 최대 1달간 여러번 주사하기 위한 것이며, rFSH는 일반적으로 실온 보관하기 때문에, 보존제는 필수적이다.
0.17 mg/ml BA 존재 중에서 rFSH의 스펙트럼을 24℃ - 77℃에서 13가지 온도에서 입수하였고, 도 3에 나타내었다. 명확한 도시를 위해, 스펙트럼들 중 8개만 도 3에 나타낸다. 벤질 알코올의 매우 높은 UV 흡광 (및 동시적인 낮은 CD 신호)으로 인해, 실험한 BA 농도를 높일 수 없었으며, 그래서 rFSH 제형을 보존하기 위해 사용하게 될 농도에는 근접조차 할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, BA의 명백한 불안정화 효과가 관찰되었다. CD 결과들은, 샘플 3에서의 rFSH 이차 구조가, 샘플 1과 2에서 rFSH의 변성 개시 온도 보다 약간 낮은, 42℃로 가열시 손상되지 않는 것으로 나타났다.
부가적으로, 그리고, 중요하게도, 데이타에서, 변성된 형태에는, 보존제가 무첨가된 경우의 FSH 보다 고차원 구조가 현저하게 높은 수준으로 결핍된 것으로 나타났다.
온도 유발성 구조 변화에 대한 부형제 효과
본원에 청구된 염에 대한 대표적인 예로서 본원에서 사용한 염 Na2S04는, 온도 변성된 단백질 구조에 대해 유의한 효과를 나타내었다. 이는 명백하게 중요한 결과이다. 변성된 (언폴딩 또는 부분 언폴딩된) 단백질은 조합하여 천연 단백질 보다 응집체를 형성하는 경향이 강하기 때문에 (Fink, A.L., 1998, Fold Des. 3 (1): R9 - R23), 이러한 결과는, 황산 나트륨이 rFSH 분자의 변성, 그래서 응집 위험성 경향을 제한할 수 있으며, 그에 따라 저장 안정성을 현저하게 높일 수 있다. 반면, 벤질 알코올 (BA)은 고온에서 유의한 구조적 분해를 유도한다. 고도화된 이차 구조들은 SRCD에 의해서는 검출되지 않았다. BA에서 관찰되는 효과(보다 언폴딩된 구조)는 벤질 알코올 첨가시 다른 단백질 시스템에서 확인되는 응집 증가에 대한 해명의 일부일 수 있다 (Maa, Y. and Hsu, C.C., 1996, Int. J. Pharm. 140:155-168; Zhang, Y. et al., 2004, J. Pharm. Sci. 93(12):3076-3089).
그러나, 보존제 첨가는 다회 투약용 제형의 개발에 중요하며, 시장에 rFSH 제품 출시로, 벤질 알코올이 상대적으로 높은 함량으로 첨가된, 보다 안정적인 제형의 개발이 필요하다는 것이 확인되었다 (Puregon?은 벤질 알코올 10 mg/ml을 함유함).
벤질 알코올이 rFSH의 안정성을 낮추고, 가열시 고도화된 이차 구조물의 소실에 우호적으로 작용하는 것으로 확인되었다. 그러나, 보존제의 첨가는 중요한 일이다. 본 실험에서, 본 발명의 염이 가열한 rFSH 제형내 고차원 구조체의 농도를 증가시키는 것으로 확인되었다. 따라서, 이들 염은, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 기타 페놀성 보존제의 효과를 보상하기 위한, rFSH 액체 제형의 안정화제(들)로서 매우 적합하다.
실시예 2 - 시차 주사 열량법 (DSC)
본 실시예에서 각각 사용되는 FSH는 실시예 1에서와 동일하다. 일반적으로, 단백질의 천연 (생활성) 구조는 이의 주변, 예컨대 제형의 조성, 용기 시스템, pH 및 온도에 매우 민감하다. 본 실시예에서, rFSH 변성 온도, Tm을 액체 시차 주사 열량법 (DSC)로 조사하였다. rFSH 변성 온도는 용액 중의 단백질의 안정성에 지표이며, Tm이 높을수록 단백질의 안정성은 높아진다.
단백질의 3차 및 4차 구조는 주로 비-공유적 상호작용에 의해 안정화된다. 다수의 이들 분자간 상호작용들은 언폴딩된 동안에는 물 분자와의 비-공유 상호작용으로 치환되기 때문에, 다른 구조 형태들 (즉, 천연 및 변성형) 간의 열역학적 균형에 미묘한 차이가 있다. 일반적으로, 이는, 천연 단백질의 안정성을 제한한다는 것을 의미한다. 많은 단백질들이 약 70℃에서 열에 의해 폴딩되지 않는다. 단백질 폴딩 또는 변성은 DSC를 이용하여 직접 실험 및 정량할 수 있는 열역학적 파라미터로 나타낼 수 있다. 그래서, DSC는 단백질 안정성에 대한 부형제 효과를 실험하고, 단백질 치료제의 최적 제형을 동정하기 위한 중요한 도구이다.
액체 시차 주사 열량법 (DSC)
이론
액체 DSC에서 단백질 샘플 열처리시 (즉, 샘플 농도 증가), 단순히 약간 베이스라인이 증가하고, 열처리를 지속하면(즉, 온도를 지속적으로 증가시킴), 단백질이 열을 흡수하여, 실험한 단백질의 특징적인 온도 범위에서의 열에 의해 언폴딩이 유발된다. 이로써 흡열 피크가 생긴다. 단백질이 폴딩되지 않는 동안에, 단백질을 둘러싼 물 분자는, 더 많은 수의 소수성 체인이 노출되도록 재조직화된다. 완전이 폴딩되지 않은 상태가 되면, 열 흡수는 감소되어, 새로운 베이스라인이 형성된다.
샘플의 열 용량의 인테그레이션(Integration of the heat capacity), Cp는, 등식 (1)의 언폴딩 공정과 관련된 엔탈피 변화 ΔΗ를 나타낸다. 관찰되는 엔탈피 변화는 수소 결합 파괴와 같은 흡열 과정과 단백질과 주변 매질 간의 수소 결합 형성과 같은 발열 과정으로부터 기원한다. 열 전이의 미드포인트(midpoint of the thermal transition) 또는 전이 미드포인트(transition midpoint), Tm (흔히 단백질 변성 온도로 함)은, 단백질 분자들 중 절반이 폴딩되고, 나머지 절반이 폴딩되지 않았을 때의 온도이다.
DSC 측정을 통한 원 데이타, 즉, 온도에 따른 비열(W)은, 사용된 단백질의 몰 중량과 농도를 알면, 부분 몰 열 용량(partial molar heat capacity) (J/mol K)으로 쉽게 다시 계산할 수 있다.
검사 방법
단백질 변성 온도, Tm은 300 ㎕ 듀얼-카필러리 셀이 장착된 TA Instruments 사의 액체 DSC, Nano DSC를 이용하여, 아래 파라미터로 측정하였다.
스캔 속도: 0.5-2.0℃/min, 아무도 언급되지 않은 경우, 스캔 속도 1.0℃/min으로 사용함 (2.0℃/min, ex. 4)
개시 온도: 20 ℃
최종 온도: 100 ℃
평형: 900 s (또는 900 s (1차 스캔) 600 s (2차 스캔), ex 4)
정압: 3 atm
샘플들 모두 측정하기 전에 15분간 탈기하였다. 각 단백질 샘플 사용 후, 샘플 셀을 50% 포름산으로 세척하였다. 또한, 각 샘플을 분석한 후, 셀을 1000 ml 정제수로 헹구었다. 샘플들은 모두 기준 셀에서 대응되는 위약과 함께 측정하였다. 기준 셀과 샘플 셀 둘다에 충진시킨 위약 용액을 이용한 각 스캔의 결과를, 평가하기 전에 데이타에서 추출, 즉 블랭크 추출하였다.
MALDX-TOF MS
효소 시알리다제 처리 전과 후에 rFSH 샘플을 MALDI-ToF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry)로 분석하여, 탈시일화 반응도를 평가하였다. 스펙트럼을 Autoflex II MALDI ToF Mass Spectrometer {Bruker Daltonics)에서 획득하였다. 시납산을 매트릭스로 사용하였다. 분석은 파지티브 선형 이온 모드에서 지연형 추출(delayed extraction)로 수행하였다. 외부 보정와 더불어 스캔 범위 4000-20893 Da을 사용하였다.
본 실험의 목적
본 실시예의 목적은 액체 시차 주사 열량법 (DSC)을 이용하여 rFSH의 열 안정성을 조사하고, 보존제 (페놀 또는 벤질 알코올) 첨가 및 무첨가시의 rFSH에 대한 다양한 염들의 안정화 효과를 평가하기 위한 것이었다.
이전의 CD(Circular Dichroism) 분광학 실험(실시예 1)과 실시간 안정성 실험(실시예 3)과 더불어, 본 실험은, 용액 중에서 rFSH 안정성에 대한 염 및 보존제의 효과를 조사하기 위한 것이다.
실험 제품
rFSH 배치 정보
rFSH, 약물 물질 배치 번호 08800020 및 배치 번호 09PD80010는 이스라엘 Bio-Technology General (BTG)에서 제조하였다.
rFSH의 생물 활성 측정은 Ph. Eur에 따라 수행하였다. 사용한 2가지 rFSH 배치들의 경우, 각각 배치 08800020의 농도는 13.223 lU/mg (9,256 IU/ml)으로, 배치 09PD80010의 농도는 15,109 IU/mg (10,576 IU/ml)으로 측정되었다.
재료
부형제
본 실험에서 rFSH 용액에 사용한 부형제 리스트를 표 2에 열거한다.
표 2: 부형제 리스트
| 명칭 | 공급사 |
| 디-소듐 하이드로겐 포스페이트 x 2H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 포스포르산 85%, Ph. Eur. | Merck |
| 소듐 클로라이드,Ph. Eur. | Merck |
| 디-소듐 설페이트, x 10 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 마그네슘 클로라이드, x 6 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 포타슘 클로라이드, p.a. | Merck |
| 소듐 요오드화물, Ph. Eur. | Merck |
| 암모늄 설페이트, Ph. Eur. | Merck |
| 포타슘 요오드화물, Ph. Eur. | Merck |
| 아연 클로라이드, Ph. Eur. | Riedel-de Haen |
| 트리-소듐 사이트레이트, x 2 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 암모늄 아세테이트, Ultra >99.0% | Fluka |
| 소듐 아세테이트, x 3 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 소듐 퍼클로레이트, x H2O, p.a. | Merck |
| 아연 요오드화물, p.a. | Merck |
| 아연 설페이트, Ph. Eur. | Merck |
| 디-포타슘 설페이트 | Merck |
| 디-소듐 타르트레이트, x 2 H2O, p.a. | Merck |
| 암모늄 요오드화물, p.a. | Merck |
| 슈크로스, Ph. Eur. | Merck |
| 디-포타슘 하이드로겐 포스페이트 x 3 H2O, p.a. | Merck |
| 마그네슘 설페이트 x 7 H2O, Ph. Eur. | Fluka |
| 폴리소르베이트 20(트윈 20) Ph. Eur. | Merck |
| 페놀, Ph. Eur. | Merck |
| 벤질 알코올, Ph. Eur. | Merck |
| L-메티오닌, Ph. Eur. | Sigma |
| milli-Q 물 | Millipore |
시험 용액의 조성
시험 rFSH 및 위약 용액의 조성을 표 3, 4 및 5에 열거한다. 보존제의 시험 농도는 Ph. Eur. 비경구 용도로 제조한 제형의 보존 효능에 맞추는데 필요한 농도를 토대로 선정하였다.
시험한 염 농도는 시험 용액에서 등장성을 달성하는데 필요한 소듐 설페이트의 농도를 기준, 즉, 0.1 M 소듐 설페이트를 기준으로 한다. 다른 염들은 모두 소듐 설페이트와 동일한 몰 농도로 실험하였다. 아울러, 고농도 및 저농도로 소듐 클로라이드를 조사하여, rFSH 변성 온도, Tm에 대한 염 농도 효과를 평가하였다. 시험 용액내 소듐 포스페이트 완충액 농도는 완충액 염의 안정화/불안정화 효과가 발생할 위험성을 최소화하도록 낮게 유지한다.
표 3: rFSH 용액의 조성
| rFSH | 완충액 | 계면활성제 | 보존제 | 항산화제 | 안정화제 |
| 2.4 mg/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 5.5, 6.5 또는 7.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 또는 15 mg/ml 벤질 알코올 또는 생략 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M Na2S04, 0.24 M NaCl, 0.1 M NaCl, 0.07 M NaCl, 0.1 M Na-아세테이트, 0.1 M Na3-사이트레이트, 0.1 M Na2-타이트레이트, 0.1 M NaI, 0.1 M NaClO4, 0.1 M K2SO4, 0.1 M K2HPO4, 0.1 M KCl, 0.1 M KI, 100 mM (NH4)2S04, 0.1 M NH4-아세테이트, 0.1 M NH4I, 0.1 M MgS04, 0.1 M MgCl2, 0.1 M ZnS04, 0.1 M ZnCl2, 0.1 M ZnI2, 0.1 M 슈크로스, 또는 생략 |
표 4: 탈시알화된 rFSH 용액의 조성
| 탈시알화된 rFSH | 완충액 | 계면활성제 | 항산화제 | 안정화제 |
| 2.4 mg/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M Na2SO4 또는 0.1 M NaClO4 또는 생략 |
표 5: 위약 용액의 조성
| 완충액 | 계면활성제 | 보존제 | 항산화제 | 안정화제 |
| 1 mM 포스페이트 완충액 pH 5.5, 6.5 또는 7.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 또는 15 mg/ml 벤질 알코올 또는 생략 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M Na2S04, 0.24 M NaCl, 0.1 M NaCl, 0.07 M NaCl, 0.1 M Na-아세테이트, 0.1 M Na3-사이트레이트, 0.1 M Na2-타이트레이트, 0.1 M NaI, 0.1 M NaClO4, 0.1 M K2SO4, 0.1 M K2HPO4, 0.1 M KCl, 0.1 M KI, 100 mM (NH4)2S04, 0.1 M NH4-아세테이트, 0.1 M NH4I, 0.1 M MgS04, 0.1 M MgCl2, 0.1 M ZnS04, 0.1 M ZnCl2, 0.1 M ZnI2, 0.1 M 슈크로스, 또는 생략 |
제조 공정
용액들 모두 (표 3, 4 및 5) 덴마크 코펜하겐에 위치한 패링 파마슈티컬스 A/S에서 랩-스케일로 제조하였다. 제조 공정은 아래에 요약 개시한다.
rFSH 스톡 용액 제조
출발물질로서 rFSH 배치 08800020 또는 배치 09PD80010 약물 물질 용액을 이용하여 농축 단계에 부가함으로써, 포스페이트 완충액 중의 rFSH 스톡 용액을 제조한다. 상향 농축은 Vivaspin 20 장치와 Vivascience사의 10 kDa 분자량 막 컷 오프 (MWCO)를 이용하여 수행한다. 1 mM 포스페이트 완충액 pH 5.5, 6.5 또는 7.5 중의 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는 대응되는 위약 용액 15 ml을 필터를 통해 원심분리함으로써, 막을 미리 세척한다. 원심분리는 스윙-아웃 로터(swing-out rotor)를 이용하여 20분간 3000 x g로 수행한다.
농축 공정을 수행하기 위해, rFSH 샘플 총 80 ml을 사용하여 Vivaspin 20 디바이스 4개 (디바이스 당 20 ml)에 넣고, 15분간 3000 x g로 원심분리한다. 각 체류물은 20 ml 용량의 플라스크에 옮긴다. 필터는 바람직한 위약 용액 소량으로 세척한다. 세척 용액을 상기 용량의 플라스크로 옮기고, 동일한 위약 용액을 이용하여 최종적으로 희석하였다. 그 결과, 1 mM 포스페이트 완충액 pH 5.5, 6.5 또는 7.5 중에 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는 2.8 mg/ml rFSH 스톡 용액이 만들어진다.
rFSH 용액과 위약 용액의 제조
보존제를 제외한 모든 부용제들로 이루어진 스톡 용액을 Milli-Q 물 중에서 제조한다.
rFSH 용액과 위약 용액을 제조하기 위해, 각 부형제의 스톡 용액들을 혼합하여, 표 3, 4, 및 5에 나타낸 원하는 농도를 수득한다. 보존제는 용액에 직접 첨가한다.
rFSH의 탈시알화
1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 중에 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는 rFSH 농도 2.8 mg/ml의 농축된 rFSH 용액을 사용하여, rFSH에 부착된 당 모이어티에서 시알산을 제거한다. 제거는 시그마사의 알파 (2->3, 6,8,9) 뉴라미니다제 (시알리다제)를 이용하여 효소적으로 수행한다. rFSH를 밤새 37℃에서 교반하면서 뉴라미니다제를 처리한다. 이후 상기 rFSH 농축에서 기술한 바와 같이 Vivaspin 디바이스를 이용하여 시약을 제거한다. 효소를 포함하는 rFSH 용액을 미리 세척한 Vivaspin 디바이스로 옮긴다. 이 디바이스를 원심분리하고, 여과물을 버리고, 체류물을 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 중의 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는 위약 용액에 재현탁한다. 이 용액을 다시 원심분리한다. 이러한 과정을 최종 체류물을 용량 플라스크로 이동하여 위약 용액으로 용량 희석하기 전까지 3번 반복 수행한다. 그 결과, 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 중에 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는, 2.8 mg/ml의 탈시알화된 rFSH 스톡 용액이 수득된다.
결과 및 고찰
rFSH T
m
에 대한 DSC 스캔 속도 효과
rFSH 변성에 대한 DSC 스캔 속도 효과를 조사하기 위해, Tm 측정을 3가지 다른 스캔 속도로 수행한다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, rFSH Tm은 측정시에 사용한 DSC 스캔 속도에 따라 달라진다.
동일한 스캔 속도에서 수행한 측정들에서 수득되는 변성 온도들이 비슷한한, 스캔 속도에 따라 Tm이 달라진다는 점은 데이타의 해석에 영향을 주지 않는다. 예로 표 7을 참조한다.
표 6: 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5 중에 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20을 포함하는 rFSH 샘플의, 스캔 속도에 따른, 변성 온도, Tm
| 스캔 속도 | Tm | |
| 0.5℃/분 | 71.9℃ | |
| 1.0℃/분 | 72.9℃ | |
| 2.0℃/분* | 74.9℃ | 평균 = 74.6℃ |
| 2.0℃/분* | 74.3℃ | |
* 동일한 샘플 2개를 제조 및 분석함
최대 100℃까지의 반복적인 DSC 스캔을 통해, rFSH 변성이 실험 조건에서 부분적으로 비가역적인 것으로 나타났다 (도 4 참조). 이는, 리폴딩이 2가지 DSC 스캔들 사이의 평형 시간 보다 느리거나, 또는 언폴딩이 등식 2에 나타낸 바와 같이 비가역적인 공정이라는 것을 의미한다.
천연 ↔ 언폴딩 → 비가역적인 변성 (2)
rFSH T
m
에 대한 보존제의 첨가 효과
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, rFSH 용액에 보존제의 첨가는 변성 온도 Tm을 사용한 보존제에 따라 2-6℃ 낮춘다. 이는, 다른 재조합 단백질들과 뇨 유래 FSH에서 기존에 보고된 데이타와 매우 일치한다. 벤질 알코올이 첨가된 사용한 보존제에 따라 용액에서 수득되는 Tm이, 페놀이 첨가된 rFSH 용액에 비해 큰폭으로 감소하는 것은 (표 7), 벤질 알코올 (15 mg/ml)이 실험에서 사용된 페놀 (5 mg/ml) 보다 더 농도가 높다는 것으로 설명될 수 있다.
표 7: 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5 및 표에 열거된 부형제를 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 보존제 첨가 여부에 따른 변성 온도, Tm (보존제) 및 Tm (보존제 무첨가). ΔTm (보존제) = Tm (보존제) - Tm (보존제 무첨가)
| 보존제 | 염 | Tm (보존제 무첨가) | Tm (보존제) |
| 5 mg/ml 페놀 | 염 무첨가 | 72.9℃* 74.9℃** |
70.2℃* 72.3℃** |
| 15 mg/ml 벤질 알코올 | 염 무첨가 | 74.9℃** | 70.1℃** |
| 5 mg/ml 페놀 | 0.1 M Na2SO4 | 78.0℃ | 75.1℃* |
| 15 mg/ml 벤질 알코올 | 0.1 M Na2SO4 | 78.9℃** | 73.3℃ |
* 스캔 속도 1.0℃/분으로 수행한 DSC 측정에서 계산됨
** 스캔 속도 2.0℃/분으로 수행한 DSC 측정에서 계산됨
rFSH T
m
에 대한 다양한 염 첨가 효과
단백질 수용성 및 안정성에 대한 일반적인 효과에 따른 염 순위는 하기 등식 (3)의, 호프마이스터 시리즈 또는 이액 순위로 알려져 있다. 좌측의 염석제, 이른바 코스모트로픽(kosmotropic) 이온은 단백질을 안정화하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 반면, 우측의 카오트로픽(chaotropic) 또는 염해 이온은 단백질을 불안정하게 하는 것으로 알려져 있다.
보존제 무첨가 용액에 다양한 염 첨가시 rFSH T
m
에 대한 효과
rFSH Tm에 대한 다양한 소듐 염 효과를 측정하였을 때, 매우 놀랍게도, 전술한 호르마이스터 시리즈에 따라 예상된 안정화/불안정화 효과가, 다양한 양이온을 사용하였을 때에도, 관찰되지 않았다. 표 8과 9를 참조한다. 대부분의 코스모트로픽 이온, 설페이트 또는 카오트로픽 이온, 퍼클로레이트이 사용되었는지와 무관하게, 변성 온도의 증가는 대략적으로 동일하였다. 실제, rFSH Tm의 가장 큰 증가 폭은 rFSH에 대한 불안정화 효과가 예상된 퍼클로레이트 이온 염의 경우에서 관찰되었다. 설페이트, 클로라이드 및 퍼클로레이트 등의 다양한 무기 음이온들 뿐만 아니라, 사이트레이트, 아세테이트 및 타르트레이트와 같은 유기 음이온들 모두, Tm 증가는 동일한 수준이었다.
표 8: 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5 및 0.1 M 염을 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 염 음이온과 양이온의 조합물과 관련된, 변성 온도, Tm.
염 무 첨가: Tm = 72.9℃, 표의 표제에 따른 기타 부형제들
0.1 M 슈크로스: Tm = 73.3℃, 표의 표제에 따른 기타 부형제들
표 9: 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 0.1 M 염 첨가시, 염 음이온과 양이온의 조합물과 관련된, 변성 온도의 변화, ΔTm (염). ΔTm (염) = Tm (염) - Tm (염 무첨가)
0.1 M 슈크로스: 0.4℃, 표의 표제에 따른 기타 부형제들
관찰한 결과, 호프마이스터 시리즈의 음이온 위치가 여러가지 소듐 염 첨가에 따른 rFSH Tm 증가에 영향을 미치지 않으며, 또한, 포타슘에서도 동일하게 나타났다 (표 8 및 9 참조). 동일한 양이온을 가지는, 음이온은 일반적으로 rFSH Tm 변화에 약간의 영향을 미치지만 호프마이스터 시리즈엔 부합되지 않는다.
매우 놀라운 점은, 양이온이 rFSH Tm에 영향을 미친다는 것이다. 보다 구체적으로, 1가 양이온을 구비한 염은 일반적으로 2가 이온 보다 높은 rFSH Tm을 나타낸다 (표 8). 특히, 1가 알칼리 금속 이온은 rFSH Tm을 높인다. 즉, 염 첨가시 관찰되는 안정화 효과 (즉, rFSH Tm 증가)는 테스트한 음이온과는 상당히 무관하지만 (표 8 및 9 참조), 양이온은 안정화 정도에 큰 영향을 미친다. 포타슘 염과 소듐 염은 매우 현저한 안정화 효과를 나타낸다.
상기에서 실험한 용액들 모두 염 농도 0.1 M이다. rFSH Tm에 대한 염 농도 효과를 조사하기 위해, 소듐 클로라이드를 3가지 다른 농도로 포함하는 rFSH 용액에 대한 DSC 측정을 수행하였다. rFSH 용액에 염 첨가시 안정화 효과는 실험한 염 농도 전 범위에서 관찰되었다 (표 10).
표 10: 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 여러가지 농도의 소듐 클로라이드 첨가시, 변성 온도의 변화, ΔTm (염). ΔTm (염) = Tm (염) - Tm (염 무첨가)
* 스캔 속도 1.0℃/분으로 수행한 DSC 측정에서 계산됨
** 스캔 속도 2.0℃/분으로 수행한 DSC 측정에서 계산됨
FSH 제형에 대한 기존 특허들은 FSH에 대한 안정화제로서 예컨대 슈크로스를 사용한다. rFSH 용액에 0.1 M 슈크로스를 첨가하면 rFSH Tm에 약간의 변화가 생기는데 (표 8 및 9 참조), 이는 포타슘 또는 소듐 염 첨가시의 rFSH의 안정화 효과가 슈크로스 첨가하였을 때 수득되는 효과 보다 상당히 크다는 것을 의미한다.
보존제 첨가된 용액에 다양한 염 첨가에 따른 rFSH T
m
에 대한 효과
단백질 용액에 보존제를 첨가하면 용액 중에서의 단백질 안정성이 감소된다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다. 그러나, 비경구 목적의 다회 투약용 수성 제형의 경우, 보존제가 필요하다. 따라서, rFSH 용액에 염과 같은 안정화제를 첨가함으로써, 보존제 첨가시의 단백질 안정성 감소를 상쇄하는 것이 매우 중요하다.
표 11: 표에 열거된, 2.4 mg/ml rFSH, 5 mg/ml 페놀, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5 및 0.1 M 염을 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 변성 온도, Tm 및 변성 온도의 변화, ΔTm (보존제) 및 ΔTm (염). ΔTm (보존제) = Tm (보존제) - Tm (보존제 무첨가), ΔTm (염) = Tm (염) - Tm (염 무첨가)
* rFSH 용액에 5 mg/ml 페놀 함유
표 11에서 알 수 있는 바와 같이, rFSH 용액에 보존제를 첨가하면 rFSH 변성 온도가 2-3℃ 낮아진다. 보존제가 첨가된 rFSH 용액에 염을 첨가하면 rFSH 변성 온도는 약 5℃ 증가한다. 즉, rFSH 용액에 보존제 첨가시 관찰되는 불안정화 효과가 본 발명에 따른 염 첨가에 의해 충분히 보상된다. 실제, 페놀을 포함하는 rFSH 용액에 염을 첨가하면, rFSH Tm에 대한 보존제 효과를 중화할 뿐만 아니라, 보존제 또는 염을 첨가하지 않은 수용액 중의 rFSH와 비교하여 Tm을 상승시킨다 (표 11).
rFSH T
m
에 대한 pH 변동 효과
안정화 염이 첨가된 경우와 첨가되지 않은 경우에, rFSH Tm에 대한 pH 효과를 조사하기 위해, 3종의 소듐 염을 첨가 및 무첨가한 조건에서, pH 5.5, 6.5 및 7.5에서 rFSH 변성 온도를 측정하였다 (표 12).
표 12: 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 및 0.1 M 염을 포함하는 rFSH 샘플에 대한, 여러가지 pH에서의 변성 온도 Tm. ΔTm (염) = Tm (염) - Tm (염 무첨가)
표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 여러가지 소듐 염 첨가시 rFSH Tm의 일반적인 추세는, pH 5.5 - 7.5 전 범위에서 동일하며, 즉, 호프마이스터 시리즈에 따른 염의 안정화/불안정화 효과에서 벗어낫 결과가 모든 실험한 pH에서 관찰되었다.
실험한 pH 범위에서 관찰되는 rFSH 변성 온도는, 염을 첨가한 경우나 무첨가한 경우 둘다에서 용액의 pH 증가에 따라 증가하였다 (표 12). 염 첨가시, rFSH 변성 온도, ΔTm (염) 실제 증가율은 더 높은 pH에서 약간 작았다 (표 12).
rFSH T
m
에 대한 rFSH 시알화 효과
상기에서 입증된 바와 같이, rFSH 용액에 대한 염 첨가 효과는, 전술한, 퍼클로레이트 이온 염이 단백질을 불안정하게 만들 것으로 예상되고 (단백질 Tm 낮춤), 설페이트 이온이 단백질을 안정하게 만들 것으로 예상되는 (단백질 Tm 높임), 호프마이스터 시리즈와는 전혀 일치되지 않는다.
rFSH는 많은 수의 시알산 잔기가 당 모이어티에 결합되어 있는 당화된 단백질이며, 그래서 총 음 전하가 매우 강하므로, 염의 예상치못한 안정화시키는 작용에 대한 시알산 효과를 조사하였다.
여러가지 염 첨가시 rFSH Tm에 대한 시알산 효과를 평가하기 위해, 시알산을 효소적으로 제거하였다. 그런 후, 탈시알화된 rFSH를 염을 첨가 및 무첨가한 조건에서 DSC로 분석하였다.
시알산 잔기가 성공적으로 제거되었는지를 검증하기 위해, 시알산을 효소적으로 제거하기 전과 후의 rFSH 샘플을 MALDI-ToF MS로 분석하였다.
MALDI-ToF MS 산성 샘플 조건에서, 알파 서브유닛과 베타 서브유닛들은 해리되어, 각각 측정된다. 시알리다제 처리 전의 알파 서브유닛의 평균 분자량은 15000 Da이다. 시알리다제 처리한 후의 평균 분자량은 14000 Da이다. 베타 서브유닛의 경우, 시알리다제 처리 전의 평균 분자량은 18000 Da이고, 시알리다제 처리 후에는 17000 Da이다. 이들 2가지 서브유닛의 중량 변동은 시알산 제거로 인한 중량 감소로 인한 것이다. 실제, 시알산 잔기들 모두 탈시알화 과정 중에 rFSH에서 제거되었다.
소듐 설페이트 또는 소듐 퍼클로레이트를 첨가한 경우, rFSH Tm 증가는, 비변형된 rFSH와 탈시알화된 rFSH에서 동일한 추세로 나타났으며, 즉, 안정화 효과 (rFSH Tm 증가)는 전술한 호프마이스터 시리즈에 따르지 않았다. 일반적으로, 관찰되는 Tm은 탈시알화된 rFSH가 비변형된 rFSH 보다 2-6℃ 낮았다 (표 13). 또한, 염 첨가시에 관찰되는 안정화 효과 역시 탈시알화된 rFSH가 비변형된 rFSH 보다 낮았다 (표 13).
rFSH의 당 모이어티에 시알산의 존재가 rFSH 안정성을 높이는 것으로 생각되므로, 탈시알화된 rFSH가 비변형된 rFSH 보다 Tm이 낮게 관찰되는 것으로 생각된다.
비변형된 rFSH와 탈시알화된 rFSH 둘다가 다양한 염 첨가시에 동일한 경향을 보인다는 점은 (호르마이스터 시리브에 따른 안정화/불안정화 효과에 일치되지 않음), 이러한 효과를 발생시키는 것이 rFSH 자체의 시알산의 존재가 아니라는 것을 입증해준다.
표 13: 2.4 mg/ml rFSH 또는 2.4 mg/ml 탈시알화된 rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5 및 0.1 M 염을 포함하는 rFSH 및 탈시알화된 rFSH 샘플에 대한, 변성 온도 Tm. ΔTm (염) = Tm (염) - Tm (염 무첨가)
결론
보존제 첨가시 rFSH에서 관찰되는 불안정화 효과 (rFSH Tm 감소)는 당해 기술 분야에서의 이해 수준과 매우 일치된다.
그러나, 여러가지 음이온을 구비한 염 첨가시 rFSH 변성 온도에 대한 관찰 결과가 호프마이스터 시리즈에서 벗어난다는 점은 예상치 못한 일이다. 호프마이스터 시리즈(단백질 수용성 및 안정성에 대한 일반적인 효과를 표시한 염 순위)에 따르면, 설페이트와 같은 코스모트로픽 음이온은 통상 단백질을 안정화시키며 (Tm을 높임), 퍼클로레이트와 같은 카오트로픽 음이온은 단백질을 불안정하게 한다 (Tm 낮춤). 본 실험에서, 동일한 양이온을 가진 테스트한 음이온들 모두 비슷한 rFSH 변성 온도 증가를 나타내었다. 호프마이스터 시리즈에서 예상되는 결과와는 극히 반대로, 퍼클로레이트 이온의 염은 rFSH 변성 온도를 가장 큰 폭으로 증가시켰다. 즉, 염 첨가시 관찰되는 안정화 효과 (즉 rFSH Tm 증가)는 테스트한 음이온과는 매우 무관하였다. 소듐염과 포타슘염들이 특히 안정화 효과가 우수하였다. 특히, rFSH 용액에 소듐 퍼클로레이트를 첨가하면 rFSH 변성 온도가 가장 큰 폭으로 증가하였다. 그러나, 퍼클로레이트는 일반적으로 반응성이 높고, 산화제이므로, 퍼클로레이트는 약학 제형의 비활성 성분으로서 허용되지 않는다.
염 첨가시 rFSH에서 달성되는 예상치못한 안정화 효과는 rFSH의 당 모이어티에 존재하는 시알산으로는 설명할 수 없다. 탈시알화된 rFSH에서의 rFSH 변성 온도 측정시, 염 첨가에 따른 rFSH에 대한 안정화 효과가, 비변형된 rFSH에서와 동일한 추세로 나타났다.
실시예 3 - rFSH 용액의 실시간 안정성
연구 목적
본 실험의 목적은 다양한 제형 중에서의 rFSH의 실시간 안정성이 실시예 2에 기술된 액체 DSC를 이용한 rFSH 변성 온도 측정과, 실시예 1에 기술된 CD 분광법으로 측정한 가열시의 rFSH 이차 구조 변화에서 보여지는 바와 같이, 동일한 경향을 따르는지를, 확인하기 위한 것이었다. rFSH의 단량체로의 해리 경향을 측정하는, 보관 중의 rFSH의 구조 안정성을 본 실험에서 확인하였다.
2달간 2가지의 다른 보관 온도에 둔 후, rFSH 600 IU/ml 제형의 안정성을 장기간 5 ± 3℃/주변 RH에서 조사하고, 6-12개월간 30 ± 2℃/65 ± 5% RH 가속화 조건에서 조사하였다. 바이얼 모두 뒤집어 보관하였다. 대응되는 제형을 포함하나 rFSH는 포함하지 않는 위약 대조군도 활성 rFSH에서와 동일한 조건에서 보관하였다.
실험 제품
배치 정보
rFSH, 약물 물질 배치 번호 08800060 및 배치 번호 09P800020은 이스라엘 Bio-Technology General (BTG)에서 제조하였다.
rFSH 배치에 대한 생물 활성 측정은 Ph. Eur에 따라 수행하였다.
재료
부형제
본 실험에서 사용한 부형제 리스트를 표 14에 열거한다.
표 14: 부형제 리스트
| 명칭 | 공급사 |
| 디-소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트, Ph. Eur. | Merck |
| 포스포르산 85%, Ph. Eur. | Merck |
| 슈크로스, Ph. Eur. | Merck |
| 폴리소르베이트 20 Ph. Eur. | Merck |
| 페놀, Ph. Eur. | Merck |
| L-메티오닌, Ph. Eur. | Sigma |
| 소듐 클로라이드,Ph. Eur. | Merck |
| 디-소듐 설페이트, x 10 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| milli-Q 물 | Millipore |
용기 및 밀봉 시스템
사용한 1차 패킹 물질들을 표 15에 열거한다.
표 15: 용기/밀봉 시스템
| 항목 | 설명 | 공급사 |
| 용기 | 타입 1 Ph. Eur. 무색 보로실리케이트 유리 바이얼, 2R | ISO-GmbH |
| Rubber | 13 mm 클로로부틸 스토퍼 4432/50 B2-40 코팅됨, FluoroTec | West Pharmaceutical Services |
| Cap | 알루미늄 캡 및 플라스틱 캡 (플립 오프형) | West Pharmaceutical Services |
rFSH 스톡 용액과 여러가지 제형들 (rFSH 및 위약)의 조성을 표 16, 17 및 18에 나타낸다. 어떠한 안정화제, 긴장성 제제도 함유되지 않은 제형들을 제외한 제형들은 등장성 용액이 제조되도록 안정화제/긴장성 제제의 농도를 조정한다.
표 16: rFSH 스톡 용액의 조성
| 배치 | rFSH 농도 | 비히클 |
| 08800060 | 16235 IU/mg 0.7 mg/ml |
1 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 6.7 - 6.8 중의 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 |
| 09800020 | 13223 IU/mg 0.7 mg/ml |
1 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 6.7 - 6.8 중의 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 |
표 17: rFSH 제형의 조성
| rFSH | 완충액 | 계면활성제 | 보존제 | 항산화제 | 안정화제/긴장성 제제 |
| 600 IU/ml | 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | - | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 15 mg/ml Na2SO4 |
| 600 IU/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 14 mg/ml Na2SO4 |
| 600 IU/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 7 mg/ml NaCl |
| 600 IU/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 75 mg/ml 슈크로스 |
| 600 IU/ml | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | - |
* pH는 최종 용액의 pH임.
표 18: 위약 제형의 조성
| 완충액 | 계면활성제 | 보존제 | 항산화제 | 안정화제/긴장성 제제 |
| 20 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | - | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 15 mg/ml Na2SO4 |
| 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 14 mg/ml Na2SO4 |
| 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 7 mg/ml NaCl |
| 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | 75 mg/ml 슈크로스 |
| 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5* | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 5 mg/ml 페놀 | 1 mg/ml L-메티오닌 | - |
* pH는 최종 용액의 pH임.
제조 공정
용액들 모두 (표 17 및 18) 덴마크 코펜하겐에 위치한 패링 파마슈티컬스 A/S에서 랩-스케일로 제조하였다. 제조 공정은 아래에 요약 개시한다.
rFSH 및 위약 제형들의 제조
모든 부형제의 스톡 용액은 Milli-Q 물을 이용하여 제조한다.
위약 제형의 제조를 위해, 각 부형제의 스톡 용액을 혼합하여 표 18에 나타낸 농도를 만든다. 부피 희석하기 전에, 각 제형의 pH를 필요에 따라 조정한다.
rFSH 제형의 제조를 위해, 희석 용액을 각 부형제의 스톡 용액으로부터 준비한다. 희석 용액의 pH를 조정한다. 희석 용액을 rFSH 스톡 용액과 혼합하여(표 16 참조), 표 17에 열거된 최종 농도로 만든다.
멸균 여과 및 무균 충전
최종 제형들을 0.22 ㎛ PVDF 필터 (Millipore)를 이용하여 멸균 여과한다. 위약 제형은 Stericup 필터를 이용하여 자동살균된 유리병에 무균 충전한다. rFSH 제형은 Sterivex-GV 필터와 멸균된 20 ml Luer Lock syringes (Braun)를 이용하여 자동멸균한 유리 비이커에 무균 충전한다. 멸균 여과, 충전 및 바이얼 밀봉은 자동멸균한 바이얼과 고무 마개를 이용하여 LAF 벤치에서 수행한다. 충전 전과 후에, 바이얼에 질소 가스를 통기시키고, 적어도 6초간 0.20 ㎛ Millex-FG PFTE 필터 (Millipore)를 통과시킨다. 바이얼들에 바이얼 당 샘플 1.5 ml을 충전한다. 바이얼 모두 무균 충전하고, 즉시 고무 마개와 알루미늄 플립-오프형 캡으로 밀봉한다.
보관 조건
rFSH 600 IU/ml을 포함하는 샘플과 위약을 5 ± 3℃/ 주위 RH에서 6-18개월간 보관한다. 또한, 샘플을 가속 조건 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6-18개월간 보관한다. 각 보관 온도에서, 바이얼들은 역상으로 보관한다. 바이얼 모두 광 차단한다.
안정성 프로그램
rFSH 600 IU/ml 및 위약에 대한 안정성 프로그램을 아래 표 19에 나타낸다.
표 19: 뒤집어 보관한 rFSH 액체 제형 600 IU/ml과 위약에 대한 안정성 프로그램
| 보관 조건 | 보관 시간 (개월) | |||||
| 0 | 1 | 3 | 6 | 12* | 18* | |
| 5 ± 3℃/ 주위 RH | X | - | - | X | X | X |
| 30 ± 2℃/65 ± 5% RH | X | X | X | X | X | X |
- 안정성 프로그램에 따른 계획으로 검사 안함
* 일부 제형들만 검사함
분석 방법
본 실험에서 사용한 분석 방법을 아래에 설명한다. 각 검사시, 각 제형에 대해 rFSH 바이얼 2개와 해당 위약 바이얼 1개를 분석한다.
저분자량 (LMW) 형태
rFSH의 LMW 형태들은 크기 배제 (SEC) 컬럼에서 LC-UV를 이용한 등용매 용리에 의해 확인한다. 본 분석은 실리카계 컬럼에서 이동상으로서 트리스 완충액을 이용하고, UV 검출기를 이용하여, 수행한다. rFSH의 LMW 형태들은 rFSH 주 피크 보다 (늦게) 낮은 분자량으로 용리되는 피크들이다. LMW 형태들은 전체 피크 면적에 대한 피크 면적%로 표시된다.
보존제를 포함하는 샘플의 경우, 보존제는 크기 배제 컬럼에 넣기 전에 샘플 용액에서 제거한다.
결과 및 고찰
보관 중의 rFSH의 해리
rFSH는 비-공유적으로 결합된 단량체들이 해리되면 그 생활성을 잃게 되므로, 단량체 해리로 인한 rFSH 활성 소실을 추적하는 직접 방식은 용액내 rFSH LMW의 양을 측정하는 것이다. 이 정보를, rFSH 주 피크 이후에 용리되는 LMW 형태들의 피크가 해리된 rFSH로부터 기원하는 것으로 알려져 있는, SEC 크로마토그래피로부터 구하였다.
표 20: 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 보관한 후 SEC로 측정한 상대적인 rFSH LMW 형태들의 양%. 모든 제형의 상세 내용은 표 17에 열거되어 있다.
| 안정화제 | 보존제 | 보관 기간 (개월) | |||||
| 0 | 1 | 3 | 6 | 12 | 18 | ||
| 15 mg/ml Na2SO4 | - | 1.5 | 2.5 | 1.7 | 2.4 | 3.0 | 2.7 |
| 14 mg/ml Na2SO4 | 5 mg/ml 페놀 | 1.7 | 3.5 | 3.1 | 3.9 | 6.5 | 6.0 |
| 7 mg/ml NaCl | 5 mg/ml 페놀 | 1.8 | 1.7 | 3.1 | 3.1 | 4.4 | N.P. |
| 75 mg/ml 슈크로스 | 5 mg/ml 페놀 | 1.9 | 6.2 | 7.3 | 10.1 | N.P. | N.P. |
| - | 5 mg/ml 페놀 | 2.0 | 7.7 | 16.9 | 23.4 | 32.2 | N.P. |
N.P. 수행 안함
표 21: 5 ± 3℃/주위 RH에서 보관한 후 SEC로 측정한 상대적인 rFSH LMW 형태들의 양%. 모든 제형의 상세 내용은 표 17에 열거되어 있다.
| 안정화제 | 보존제 | 보관 기간 (개월) | ||||
| 0 | 6 | 12 | 18 | |||
| 15 mg/ml Na2SO4 | - | 1.5 | 1.5 | 1.0 | 0.8 | |
| 14 mg/ml Na2SO4 | 5 mg/ml 페놀 | 1.7 | 2.0 | 1.6 | 1.3 | |
| 7 mg/ml NaCl | 5 mg/ml 페놀 | 1.8 | 1.1 | 1.3 | N.P. | |
| 75 mg/ml 슈크로스 | 5 mg/ml 페놀 | 1.9 | 1.9 | N.P. | N.P. | |
| - | 5 mg/ml 페놀 | 2.0 | 1.1 | 1.7 | N.P. | |
N.P. 수행 안함
표 20에서 알 수 있는 바와 같이, 여러가지 안정화제가 함유된 갓 준비한 rFSH 용액은, 보존제 첨가 및 무첨가한 경우, 해리된 rFSH(LMW 형태)의 상대적인 양이 유사하게 나타났다. SEC 방법의 정량 한계는 3%이므로, 이러한 한계 미만에서는 제형들 간의 명백한 차이를 확인할 수 없었는데, 이는 최초 시점에 관찰되는 LMW 형태의 차이가 방법 편차의 한계내에 있다는 것을 의미한다.
30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 1달 보관한 후, 해리된 rFSH의 상대적인 양은 페놀을 슈크로스와 함께 포함하거나 안정화제가 첨가되지 않은 샘플들에서 이미 증가된 반면, 소듐 설페이트나 소듐 클로라이드가 함유된 샘플에서는 해리된 rFSH에 대한 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다 (표 20).
30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6개월 보관한 후, 안정화제는 무첨가되나 페놀이 포함된 rFSH 샘플의 경우, 해리된 rFSH(LMW 형태)의 양이 20% 보다 높아졌다. 안정화제로서 슈크로스를 포함하는 페놀이 포함된 rFSH 샘플 역시 해리된 rFSH의 양이 크게 증가되었지만 (rFSH 해리율이 10% 보다 높음), 소듐 클로라이드 또는 소듐 설페이트 중 어느 한가지로 안정화한 페놀 함유성 샘플들에서는 rFSH의 해리율 증가는 매우 미미하였다(표 20). 어떠한 보존제도 포함되지 않는 샘플의 경우, 보관하는 동안에 해리로부터 매우 안정적이었지만, 비경구용 다회 투약용 수성 제형의 경우 보존제의 첨가가 필요하므로, 따라서 이 제형은 단순 비교군으로만 사용하였다.
5 ± 3℃/ 주위 RH에서 6개월 보관한 후, 테스트한 rFSH 제형들 모두, 해리된 rFSH의 상대적인 양적 증가는 나타나지 않았다 (표 21). 그렇지만, 시판 rFSH 제품의 성공을 위해서는, 5℃에서 24개월 이상 및 동시에 1달, 바람직하게는 실온에서 3-4개월이 요구된다.
rFSH 변성 온도, 2차 구조 변화 및 해리율
본 실시예의 목적은 실시간 안정성 실험 데이타, DSC를 이용하여 측정한 rFSH 변성 온도 및 CD 분광법에 의해 측정된 rFSH 이차 구조 데이타 간의 관련성을 확인하기 위한 것이므로, DSC 데이타 일부(실시예 2 참조) 및 CD 데이타 일부 (실시예 1)를 아래에 나타낸다. 나타낸 DSC 결과들에 대한 모든 상세한 내용은 실시예 2에 기술되어 있으며, CD 데이타에 대한 상세 내용은 실시예 1에 기술되어 있다.
표 22: 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6개월 보관한 후 SEC로 측정한 rFSH LMW 형태들의 상대적인 양%과, DSC로 측정된 rFSH 변성 온도, Tm. DSC 실험에서는 안정화제의 농도를 0.1 M로 유지하였지만, 실시간 안정성 실험에서 사용한 양은 표에 나타낸다.
| 안정화제 | 보존제 | 0 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6개월 보관시, SEC LMW | DSC Tm |
| 15 mg/ml Na2SO4 | - | 2.3 | 78.0℃ |
| 14 mg/ml Na2SO4 | 5 mg/ml 페놀 | 3.9 | 75.1℃ |
| 7 mg/ml NaCl | 5 mg/ml 페놀 | 3.1 | 74.7℃ |
| 75 mg/ml 슈크로스 | 5 mg/ml 페놀 | 10.1 | - |
| - | 5 mg/ml 페놀 | 23.4 | 70.2℃ |
표 22에서 알 수 있는 바와 같이, DSC로 수득한 rFSH 변성 온도는 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6개월 보관한 후 실시간 안정성 데이타와 상관성이 높았으며, DSC와, SEC로 분석한 실시간 안정성 간의 비슷한 상관성은, 재조합 항체와 재조합 당단백질에서 이미 확인된 바 있다 (예, Burton et al (2007), Pharm, Dev. Technol. 12:265-273 and Remmele et al (1998), Pharm. Res. 15:200-208). 소듐 설페이트로 안정화된 보존제 무첨가 rFSH 용액의 경우, 6개월 보관 후, rFSH 해리율은 낮을 뿐만 아니라, 보존제 함유 용액 보다 변성 온도가 현저하게 높다. 아울러, 소듐 클로라이드 또는 소듐 설페이트 중 한가지 염이 첨가된 보존제(페놀) 함유 용액의 경우, 6개월 보관 후, rFSH 해리율이 슈크로스 함유 또는 안정화제 무첨가 용액들 보다 현저하게 낮다. 안정화제 무첨가한 경우, rFSH의 변성 온도는 염 함유 용액에서의 rFSH Tm 보다 현저하게 낮다. 페놀이 포함된 슈크로스 함유 용액에서는, 표 23에서 알 수 있는 바와 같이, rFSH 변성 온도를 측정하지 않았고, 보존제 무첨가 용액에서의 rFSH Tm 측정 결과는 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 6개월 보관한 후의 실시간 안정성 데이타와 동일한 경향을 나타내었다 (표 22). 결론적으로, NaCl와 Na2SO4는 슈크로스에 비해 구조적 분해를 방지하는 안정화 효과가 훨씬 더 양호하다. 이는, Tm 측정 (표 23)과 실시간 안정성 데이타 (표 22)에서 확인된다.
표 23: 보존제 무첨가 용액에서의, DSC로 측정한, rFSH 변성 온도, Tm; 상세 내용은 실시예 2를 참조함
| 안정화제 | DSC, Tm |
| 0.1 M Na2SO4 | 78.0℃ |
| 0.1 M NaCl | 77.7℃ |
| 0.1 M 슈크로스 | 73.3℃ |
표 24: 표에 열거된 보존제 또는 염을 첨가한 경우, 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 M 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 포함하는 rFSH 용액에서의, 변성 온도 변화, ΔTm. 스캔 속도 2℃/분. ΔTm = Tm (보존제/염) - Tm (무첨가)
| 보존제 | 염 | ΔTm |
| 15 mg/ml 벤질 알코올 | 염 무첨가 | -4.7℃ |
| 15 mg/ml 벤질 알코올 | 0.1 M Na2SO4 | -1.6℃ |
| 보존제 무첨가 | 0.1 M Na2SO4 | +4.1℃ |
| 보존제 무첨가 | 염 무첨가 | 0℃ |
보존제로서 벤질 알코올을 함유하는 용액에 대한 실시간 안정성 데이타는 확인되지 않았지만, DSC로 측정한 rFSH 변성 온도 및 CD 분광법으로 측정한 가열시 rFSH 이차 구조 변화와 비교하면, 동일한 추세가 관찰된다 (표 24). 여러가지 단백질 샘플들에서 rFSH 이차 구조들을 확인하였고; 24℃에서 확인한 이차 구조는 천연 구조로 볼 수 있었으며, 벤질 알코올 (0.17 mg/ml) 또는 소듐 설페이트 중 한가지를 첨가하는 경우, rFSH 용액에서의 rFSH 이차 구조의 변화를 관찰할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 76.5℃로 용액을 가열하는 경우, 부형제 첨가에 따라 관찰되는 rFSH 이차 구조 소실 정도가 달라진다. 보존제 (벤질 알코올)의 첨가는 어떠한 보존제도 포함하지 않는 rFSH 용액에 비해 rFSH 이차 구조의 소실 정도가 크지만, 염 (소듐 설페이트)의 첨가가 염이 무첨가된 rFSH 용액에 비해 rFSH 이차 구조의 소실 정도를 낮춘다. rFSH의 구조화된 이차 구조의 소실은 단백질의 일부 또는 전체 변성으로 해석할 수 있다.
실시예 4 - hCG에 대한 시차 주사 열량법 (DSC)
인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)은, hCG, 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체화 호르몬 (LH) 및 갑상선 자극 호르몬 (TSH)에서 공통되는 92개의 아미노산으로 이루어진 알파-서브유닛과, hCG에 특이적인 145개의 아미노산으로 이루어진 베타-서브유닛인, 2개의 당화된 단량체로 구성되는, 이형이량체 단백질이다. FSH 및 hCG를 비롯하여 당단백질 호르몬은 비공유적으로 결합된 단량체들이 해리되면 생활성을 잃게 된다. 안정성 분석 결과는, 재조합 FSH (rFSH)의 불안정성이 주로 이량체 해리 (4차 구조의 분해, 및 동시적인 면역결합 반응 감소)로 인한 것으로 나타났다.
본 실시예의 목적은, 앞에서 DSC로 결정되고, 실시예 1-3에서 기술된 바와 같이, rFSH 변성 온도가 다양한 당 및 염에 의존적인 것으로 확인된 결과들이, 또한 단백질 hCG에서도 매우 유사하게 확인되는지를 보기 위한 것이다. 아울러, 본 실험에서 측정한 hCG의 DSC 변성 온도를 기존에 공개된 실시간 안정성 데이타와 비교한다 (Samaritani, F. 1995, hCG liquid formulations. EP 0 814, 841).
hCG의 변성 온도는 0.5 mg/ml L-메티오닌 및 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20이 포함된 1 mM 포스페이트 완충액 중에서 0.1 M의 다양한 소듐염 또는 슈크로스의 존재 및 부재 조건에서, 평가하였다. 4종의 당과 염을 조사하였다: 슈크로스, 소듐 설페이트, 소듐 클로라이드 및 소듐 퍼클로레이트.
뇨 유래 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)
아르헨티나 Massone S.A.사의 인간 뇨로부터 정제한 형태인, hCG, 약물 물질, 배치 번호 2823287510 (7059 IU/mg)을 사용하였다. 이 물질은 2-8℃에서 냉장 보관하였다.
상기 hCG 배치에 대한 생물 활성 측정은 Ph. Eur.에 따라 수행하였다.
실시예 2-3에 기술된 바와 같이, rFSH와 추가적인 물질들을 사용하였다.
표 25: 부형제 리스트
| 명칭 | 공급사 |
| 디-소듐 하이드로겐 포스페이트 x 2H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 포스포르산 85%, Ph. Eur. | Merck |
| L-메티오닌, Ph. Eur. | sigma |
| 폴리소르베이트 20(트윈 20) Ph. Eur. | Merck |
| 슈크로스, Ph. Eur. | Merck |
| 소듐 설페이트, x 10 H2O, Ph. Eur. | Merck |
| 소듐 클로라이드,Ph. Eur. | Merck |
| 소듐 퍼클로레이트, x H2O, p.a. | Merck |
| milli-Q 물 | Millipore |
여러가지 hCG 제형들의 조성을 표 26에 열거한다.
표 26: hCG 제형의 조성
| hCGH | 완충액 | 계면활성제 | 항산화제 | 당/염 |
| 0.5 mg/ml* | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M Na2SO4 |
| 0.5 mg/ml* | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M NaCl |
| 0.5 mg/ml* | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M NaClO4 |
| 0.5 mg/ml* | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | 0.1 M 슈크로스 |
| 0.5 mg/ml* | 1 mM 포스페이트 완충액 pH 6.5 | 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20 | 0.5 mg/ml L-메티오닌 | - |
* 이 배치는 35 300 IU/ml에 해당됨.
제조 공정
용액들 모두 (표 26) 덴마크 코펜하겐에 위치한 패링 파마슈티컬스 A/S에서 랩-스케일로 제조하였다.
hCG 제형의 제조
모든 부용제들의 스톡 용액은 Milli-Q 물 중에서 제조한다. 다양한 부형제가 첨가된 위약 용액을 스톡 용액으로부터 제조한다. hCG 약물 물질을 상기 위약 용액에 용해하여, 표 26에 나타낸 농도로 제조한다. 이들 제형에 대한 안정성 데이타는 이용할 수 없으므로, DSC 분석을 샘플 제조 후 1시간 이내에 갓 제조한 샘플을 대상으로 항상 수행한다.
도 4와 표 27에서 알 수 있는 바와 같이, hCG의 변성 온도 Tm은 rFSH의 Tm 보다 낮다. 또한, 변성 공정의 엔탈피 (즉, 변성 피크의 크기)도 hCG가 rFSH 보다 훨씬 작다. 변성 공정이 rFSH 샘플을 100℃로 가열한 후 거의 완전히 비가역적이게 되는 rFSH의 경우와는 다르게, hCG는 100℃로 가열한 후에도 변성 공정은 거의 대부분 가역적이었다 (2)
천연 ↔ 언폴딩 → 비가역적으로 변성됨 (2)
hCG 변성 공정이 거의 대부분 DSC 측정 시간대에서 가역적이지만, rFSH의 경우에는 그렇지 않다는 점에 대한 설명은, hCG의 2개의 서브유닛들이 rFSH 보다 해리 경향이 낮을 수 있다는 것이다. hCG 샘플에 열처리가 가해지는 동안 서브유닛들이 해리되지 않는다면, 실온으로 냉각시 천연 구조로 보다 쉽게 재구조화될 수 있다. 100℃로 가열시 전이에 대한 ΔH 크기는 rFSH가 hCG 보다 현저하게 높지만, 부차적인 스캔(즉, 샘플을 100℃로 가열, 25℃로 냉각, 및 100℃에서 2차 스캔 수행)에서의 전이에 대한 ΔΗ 크기는 rFSH와 hCG 둘다 동일한 범위이다.
hCG와 rFSH TM에 대한 당 또는 염의 첨가 효과
단백질 수용액에 염을 첨가하면 용액에서의 단백질 안정성에 영향이 가해져, 단백질 변성 온도에 영향을 미칠 것으로 예상된다.
hCG와 rFSH Tm에 대한 다양한 소듐염 효과를 측정하였을 때, 매우 놀랍게도, 호프마이스터 시리즈에 따라 예상되는 안정화/불안정화 효과가 다양한 음이온을 사용한 경우에서 관찰되지 않았다. 도 5, 6 및 표 27을 참조한다. hCG의 경우, 소듐 설페이트와 소듐 클로라이드 둘다 단백질을 실질적으로 불안정하게 하였지만, rFSH의 경우에는 이들 염들은 단백질을 안정하게 하였다. hCG 및 rFSH 둘다에서, 단백질에 대해 불안정한 효과를 나타낼 것으로 예상되는 소듐 퍼클로레이트가, 테스트한 당과 염들 중, Tm 증가율이 가장 높았다.
표 27: 5 mg/ml hCG, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 포함하는 hCG 용액에, 0.1 M 당 또는 염 첨가시, 그리고, 2.4 mg/ml rFSH, 0.5 mg/ml L 메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 포함하는 rFSH 샘플에, 0.1 M 당 또는 염 첨가시, 변성 온도, Tm 및 변성 온도 변화, ΔTm (당/염). ΔTm (당/염) = Tm (당/염) - Tm (당/염 무첨가).
hCG 및 rFSH 순도에 대한 당 또는 염의 첨가 효과
rFSH 서브유닛 해리, 보관 중의 rFSH 순도
rFSH는 비-공유적으로 결합된 단량체들이 해리되면 그 생활성을 잃게 되므로, 단량체 해리로 인한 rFSH 활성 소실을 추적하는 직접 방식은 용액내 rFSH LMW의 양을 측정하기 위한 것이다. 이 정보를, rFSH 주 피크 이후에 용리되는 LMW 형태들의 피크가 해리된 rFSH로부터 기원하는 것으로 알려져 있는, SEC 크로마토그래피로부터 구할 수 있다.
실험 제형들에서 rFSH 응집체와 같이 다른 단백질 관련 화합물들은 관찰되지 않았다. 그래서, rFSH 단백질 순도는 하기와 같이 계산할 수 있다.
순도 (%) = 100% - LMW 형태(%) (4)
표 28: 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 보관한 후 SEC로 측정한 rFSH 순도 (%)
표 28에서 알 수 있는 바와 같이, 여러가지 당 또는 염이 함유되어 있으며, 보존제가 첨가 또는 무첨가된, 갓 제조한 rFSH 용액들은, 순도가 비슷하며, 즉, 해리된 rFSH (LMW 형태)의 상대적인 양이 비슷하다.
30℃에서 1달간 보관한 후, 이미 rFSH 순도는 슈크로스와 페놀을 포함하거나 당 또는 염을 포함하지 않는 샘플에서 감소되었지만, 페놀 + 소듐 설페이트 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 샘플은, 페놀 무첨가 샘플과 더불어, rFSH 순도에 어떠한 유의한 수준의 감소도 관찰되지 않았다 (표 28). 30℃에서 6개월 보관한 후, 페놀만 포함하고 당 또는 염은 첨가되지 않은 rFSH 샘플의 경우, rFSH 순도가 80% 미만이었다. 페놀과, 안정화제로서 슈크로스를 포함하는 rFSH 샘플 역시 rFSH 순도가 상당히 감소되었지만, 페놀과 안정화제로서 소듐 클로라이드 또는 소듐 설페이트가 첨가된 샘플은 rFSH 순도가 매우 약간 감소되었다 (표 28). 어떠한 보존제도 함유하지 않는 샘플의 경우, 보관하는 동안 해리에 대해 가장 안정적이었으며, 즉, 이 샘플이 가장 높은 순도를 나타내었지만, 비경구용으로 다회 투약용 수성 제형의 경우에는, 보존제의 첨가가 필수적이다.
보관 중의 hCG 순도
이전에 공개된 보관 중의 hCG 순도 변화에 대한 데이타를 상기에서 제시한 rFSH 안정성 데이타에 대한 비교로서 사용하였다 (Samaritani, supra). 50℃에서 1달간 보관한 후, hCG 순도는 이미 상당히 감소되었다. 소듐 클로라이드가 포함된 샘플이 슈크로스가 포함된 샘플 보다 감소율이 현저하게 높았다 (표 29 참조). 50℃에서 6개월 보관한 후, 소듐 클로라이드가 포함된 샘플의 hCG 순도 (5)는 슈크로스가 포함된 샘플에 비해 10% 이상 낮았다.
표 29: 50℃에서 보관한 후 SEC로 측정한 hCG 순도 (%). 제형들의 상세한 설명은 EP 0814841에 기술되어 있다.
| 당/염 | 보존제 | 보관 기간 (주) | |||
| 0 | 1 | 2 | 6 | ||
| 7 mg/ml NaCl | 5 mg/ml 페놀 | 100% | 89.7% | 85.6% | 71.7% |
| 75 mg/ml 슈크로스 | 5 mg/ml 페놀 | 100% | 94.1% | 90.3% | 83.0% |
hCG 및 rFSH T
m
및 순도 비교
표 30에서 알 수 있는 바와 같이, DSC에 의해 수득되는 rFSH와 hCG의 변성 온도는 실시간 안정성 데이타로부터 수득되는 rFSH 및 hCG 순도와 상관성이 있다. DSC와, SEC로 분석한 실시간 안정성 간의 비슷한 상관성은, 재조합 항체와 재조합 당단백질에서 이미 확인된 바 있다.
rFSH의 실시간 안정성 데이타는 30℃에서 측정하였다. rFSH 산물은 장기간 냉장 보관하기 위한 것이므로, 25-30℃는 가속화된 안정성 실험에 적정 범위이다. hCG에 대한 실시간 안정성 데이타는 50℃에서 최대 12주간, 25℃에서 11주간, 그리고 50℃에서 6주간 보관한 경우의 데이타만 이용가능하다. hCG 순도는, 40℃ 이하의 온도에서, 슈크로스 및 소듐 클로라이드가 첨가된 제형 둘다, 보관하는 동안의 감소율이 6% 미만이었으므로, 11-12주간 보관한 이후의 다양한 당과 염들 간의 효과를 구분하기 어렵다. 저온에서 관찰되는 추세가 50℃에서와 동일하였지만, 50℃에서만, 다양한 제형들을 명확하게 구분할 수 있었다.
표 30: hCG 및 rFSH의, SEC로 측정한 순도, 및 DSC로 측정한 변성 온도. hCG 순도는 50℃에서 6주 보관 후 측정하였고, rFSH 순도는 30℃에서 6개월간 보관한 후 측정하였다.
* 샘플은 10000 IU/ml hCG, 154 mM NaCl 또는 300 mM 슈크로스, 10 mM 포스페이트 완충액 pH 7을 함유함.
** 샘플은 5 mg/ml (35300 IU/ml) hCG, 0.1 M 당 또는 염, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 함유함.
# 샘플은 600 IU/ml rFSH, 43 mM Na2S04 또는 120 mM NaCl 또는 219 mM 슈크로스, 1.0 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 5 mg/ml 페놀, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 함유함.
## 샘플은 2.4 mg/ml (36 300 IU/ml) rFSH, 0.1 M 당 또는 염, 0.5 mg/ml L-메티오닌, 0.005 mg/ml 폴리소르베이트 20, 1 mM 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.5를 함유함.
결론
rFSH와 hCG의 변성 온도와, 고온에서 보관한 후 hCG와 rFSH 순도를 이용한, 다양한 용액 중에서의 hCG와 rFSH의 안정성 연구를 통해, 용액내에서의 hCG 및 rFSH 안정성에 대한 여러가지 당과 염의 명백한 효과 증거를 확보하게 되었다. 사용한 2가지 기법, 즉 액체 DSC와 SEC 크로마토그래피는 둘다 일치되는 결과를 나타내었다. 이들 결과는 본원의 실시간 안정성 데이타에 의해 명확하게 검증되었다.
rFSH 이차 구조 변화(CD 분광학, 실시예 1), rFSH 변성 온도 (DSC에 의한 3차 및 4차 구조 변화 - 실시예 2) 또는 30 ± 2℃/65 ± 5% RH에서 보관한 후 형성된 rFSH 해리형의 상대적인 양 (SEC에 의한 4차 구조 변화 - 실시예 3)을 이용한, 다양한 용액 중에서의 rFSH 안정성 연구를 통해, 용액 중에서의 rFSH 안정성에 대한 보존제와 안정화제의 명백한 효과 증거를 확보하게 되었다. 사용한 3가지 기법, 즉 CD, DSC 및 SEC 크로마토그래피는 모두 일치되는 결과를 나타내었다.
실시예 1-3의 결과들로부터, 보존제, 페놀 또는 벤질 알코올의 첨가가, 용액 중에서의 rFSH 안정성을 낮춘다는 것이 명확하게 확인되었다. m-크레졸 및 클로로크레졸과 같은 기타 페놀성 보존제들은 비슷한 불안정하게 하는 효과를 발휘할 것으로 예상된다. 보존제 첨가시 rFSH에서 관찰되는 불안정화 효과는 당해 기술 분야의 통상의 지식과 매우 일치된다.
약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 Na+ 또는 K+-염을 rFSH 용액에 첨가하며, rFSH에 대한 보존제의 불안정화 유발 효과가 중화되며, - 가장 유익하게는 - 보존제나 염이 첨가되지 않은 rFSH 용액에 비해 용액 중의 rFSH 안정성을 증가시킨다. 테스트한 소듐염 및 포타슘염들 모두 사용한 음이온과 무관하게 rFSH 안정성을 증가시킨다: 예, 설페이트, 클로라이드 및 퍼클로레이트 등의 무기 음이온 및 사이트레이트, 아세테이트 및 타르트레이트 등의 유기 음이온. 다양한 양이온성 염들이 rFSH 안정화도에 상당한 영향을 미치며, 1가 양이온, 특히 소듐 양이온 또는 포타슘 양이온을 구비한 염들이 rFSH에 대해 강력한 안정화 효과를 나타낸다. rFSH 용액에 소듐 퍼클로레이트를 첨가한 경우 가장 안정한 rFSH 용액이 만들어지지만, 퍼클로레이트는 일반적으로 반응성이 높고 산화제이기 때문에, 약학 제형의 비활성 성분으로서 승인받지 못한다. 그래서, 설페이트 및 클로라이드의 소듐염 또는 포타슘염이 가장 유익한 안정화제이다.
hCG 또는 rFSH에 슈크로스를 첨가하면 hCG 및 rFSH 둘다의 경우 단백질 안정성이 약간 증가하지만, 소듐 클로라이드의 첨가는 hCG에 대해서는 불안정화 효과를, rFSH에 대해서는 안정화 효과를 나타낸다 (실시예 4). hCG 및 rFSH에 소듐 퍼클로레이트의 첨가는 hCG와 rFSH 둘다에 대해 안정화 효과를 나타낸다 (실시예 4). 이들 염들이 rFSH 용액에 대해 나타내는 안정화 효과는 슈크로스에서 관찰되는 안정화 효과 보다 놀랍게도 확실히 우수하다.
이러한 결과들에 따른 결론은 다음과 같다:
1) 실험한 조건 하에, hCG 및 rFSH 안정성에 대한 염의 효과는 호프마이스터 시리지에 따르지 않는다.
2) hCG와 FSH는 구조적으로 매우 비슷함에도 불구하고 (즉, 둘다 동일 클래스의 단백질이며, 둘다 당화되며, 2개의 서브유닛으로 구성되며, 알파-서브유닛은 2종의 단백질에서 동일함), 단백질 안정성에 대한, 슈크로스 및 소듐 클로라이드와 같은 다양한 당과 염의 효과는 rFSH와 hCG가 다르다. 매우 놀랍게도, hCG 및 rFSH와 매우 유사한 단백질의 경우에도, 염들은 동일한 안정화 효과를 발휘하지 않는다.
3) Na+-염 및 K+-염은, 사용되는 음이온과는 독립적으로, rFSH 용액에 대해 안정화 효과를 나타낸다.
4) FSH에 대한 Na+-염 및 K+-염의 안정화 효과는 보존제로 인한 불안정화를 상쇄할 수 있다.
약어 및 정의
본 명세서와 실시예들 전반에 걸쳐 아래 약어들과 정의가 사용된다:
ΔTm 보존제 또는 염의 첨가시 변성 온도의 변화, Tm 참조
ART 보조 생식술
BA 벤질 알코올
BTG 바이오-테크놀러시 제너랄
CD 원편광 이색성
CHO 중국 햄스터 난소 세포
CoA 분석 증명서
DNA 데옥시리보뉴클레산
DSC 시차 주사 열량법
FSD 여성 성 기능장애
FSH 여포 자극 호르몬
hCG 인간 융모성 고나도트로핀
IU 국제 단위
Ph. Eur. 및 USP.에 따른 Steelman- Pohley 생분석에 따른, rFSH의 생활성 측정값
IUI 자궁내 정액 주입
LC-UV 액체 크로마토그래피 + 자외선 검출
LH 황체화 호르몬
LMW 해리된 단량체 단백질로 주로 또는 단독으로 구성된, 저분자량 형태
OI 배란 유도
p.a. pro analysis
Ph. Eur. 유럽 약전
RH 상대 습도
rFSH 재조합 인간 여포 자극 호르몬
SEC 크기 배제 크로마토그래피
SRCD 방사광 원편광 이색성
Tm 열 전이의 미드포인트 또는 전이 미드포인트 또는 변성 온도
단백질 분자의 절반이 폴딩되고, 나머지 절반이 폴딩되지 않았을 때의 온도
TRIS 2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-1,3-디올
TSH 갑상선 자극 호르몬
USP 미국 약전
UV 자외선
Claims (25)
- - 여포자극 호르몬 (FSH); 및
- FSH 액체 제형의 안정화를 위한, 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 포함하며,
상기 염은 Na2S04 이거나 NaCl과 Na2S04의 조합인 것을 특징으로 하는,
FSH 의 안정한 액체 제형. - 제1항에 있어서, 상기 염은 액체 제형 내에서 FSH 가 해리되는 경향을 제한하는 것인, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제1항에 있어서, 상기 염이 20 내지 500 mM, 30 내지 300 mM 또는 50 내지 200 mM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제2항에 있어서, 상기 염이 20 내지 500 mM, 30 내지 300 mM 또는 50 내지 200 mM 의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FSH 제형이 rFSH 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제5항에 있어서, 상기 제형이 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제6항에 있어서, 상기 제형이 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함하는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제7항에 있어서, 상기 제형이 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함하는 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제5항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제6항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제7항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제8항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- 제9항에 있어서, 상기 제형이 주사용 제형인 것을 특징으로 하는, FSH 의 안정한 액체 제형.
- FSH 액체 제형의 안정화 방법으로서,
상기 방법은, 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 상기 제형에 첨가하는 단계를 포함하며,
상기 염은 Na2S04 이거나 NaCl과 Na2S04의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 염이 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 안정화되는 FSH가 rFSH인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 안정화되는 FSH가 rFSH인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항 또는 제18항에 있어서, 상기 제형이 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 제형이 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 제형이 보존제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 보존제가 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 보존제가 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 보존제가 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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