MX2013000681A

MX2013000681A - Estabilizacion de fsh.

Info

Publication number: MX2013000681A
Application number: MX2013000681A
Authority: MX
Inventors: Helen Ulkira Sjoegren; Heidi Louise Bagger
Original assignee: Ferring Bv
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2013-02-27
Also published as: SA114350786B1; US8993732B2; EP2598160B1; EP3144010A1; AU2011284702C1; LT2598160T; US20170216405A1; EP2417982A1; MX341464B; CN103052398A; JP5860047B2; JP2018048188A; WO2012013742A3; EP2598160A2; IL249920A0; NZ628962A; US20130210727A1; JP2013532677A; CN103052398B; ZA201209497B

Abstract

La presente invención pertenece en general al campo de la estabilización de formulaciones de FSH, en particular formulaciones líquidas de FSH. La estabilización se logra por medio de la adición de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables, en modalidades preferidas por medio de la adición de sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales de sodio o sales de potasio. La figura más representativa de la invención es la número 1.

Description

ESTABILIZACIÓN DE FSH CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece en general al campo de la estabilización de formulaciones de FSH, . en particular formulaciones líquidas de FSH. La estabilización se logra por medio de la adición de sales, en modalidades preferidas por medio de la adición de sales con cationes de metales alcalinos de sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales de Na o K, o combinaciones de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las gonadotropinas son una familia de hormonas, las cuales están involucradas esencialmente ante todo en el ciclo de fertilidad en mujeres y hombres. Las gonadotropinas se pueden derivar de la orina, tanto para propósitos de investigación como de tratamiento, sin embargo varias gonadotropinas se pueden producir de manera recombinante .

En particular, las gonadotropinas se pueden emplear en el tratamiento de la infertilidad.

Las cuatro gonadotropinas principales las cuales están incluidas en este documento y todas las cuales pertenecen a la misma familia de glicoproteínas son la hormona estimuladora de folículos (FSH, por sus siglas en inglés) , hormona estimuladora de tiroides (TSH, por sus siglas en inglés) , hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés) y gonadotropina coriónica (hCG, por sus siglas en inglés) . Todas estas gonadotropinas consisten de una subunidad alfa y una subunidad beta; la subunidad alfa es común para todas, es decir es la misma para las cuatro gonadotropinas mencionadas anteriormente, mientras que la subunidad beta difiere, respectivamente.

Como se mencionara anteriormente, las gonadotropinas son un grupo de hormonas de glicoproteínas heterodiméricas las cuales regulan la función gonadal en hombres y mujeres. Éstas incluyen la hormona estimuladora de folículos (FSH) , hormona luteinizante (LH) , hormona estimuladora de tiroides (TSH) y gonadotropina coriónica (humana) (hCG) .

La FSH es secretada naturalmente por la glándula pituitaria anterior y su función es apoyar el desarrollo folicular y la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, la cual también es común para las otras hormonas de glicoproteínas, por ejemplo LH y hCG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos única para la FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem. , 50: 465-495). Cada subunidad es modificada de manera pos-traducción mediante la adición de residuos complejos de carbohidratos. Ambas subunidades llevan dos sitios para la unión de glicano enlazado a N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los residuos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17) : 6735-6746 ; Saxena y Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251(4): 993-1005)). De esta manera, la FSH es glicosilada a aproximadamente 30% en masa (Dias y Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519; Fox y colaboradores (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol . 15(3), 379-89).

La FSH purificada de la orina humana pos-menopáusica ha sido utilizada durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad? tanto para promover la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar oocitos para tecnologías de reproducción asistida. Dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-fMR (Merck Serono) y PuregonMR (Schering-Plough) estuvieron disponibles a mediados de la década de los 90. Éstas son expresadas ambas en células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) (Howles, C.M. (1996) , genetic engineering of human FSH (Gonal-f ) , Hum Reprod. Update, 2: 172-191). La CG se · utiliza frecuentemente en tratamientos de infertilidad debido a que este compuesto tiene una actividad de LH.

Tanto la FSH como la hCG humanas son heterodímeros compuestos de una subunidad alfa y una subunidad beta. La subunidad alfa en ambas hormonas es idéntica. Las diferencias entre las dos hormonas son conferidas por la subunidad beta . La subunidad beta madura de FSH está compuesta de 111 aminoácidos, mientras que aquella de hCG está compuesta de 145 aminoácidos, adicionalmente la secuencia de aminoácidos primaria de la subunidad beta de FSH y hCG son diferentes por toda la cadena beta completa. La cadena beta de tanto FSH como hCG contiene seis conexiones de disulfuro, debido a su secuencia de aminoácidos diferente difieren sin embargo en su estructura de orden superior, dando por resultado un plegamiento diferente y una distribución de regiones cargas, polares e hidrófobas (Fox y colaboradores (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol . 15(3), 379-89).

Aunque ambas subunidades beta de FSH y hCG son glicosiladas, la subunidad beta de FSH contiene solo una N-glicosilación (N-7 y N-24) mientras que la subunidad beta de hCG contiene tanto una N-glicosilación como una 0-glicosilación (N-13, N-30, 0-121, 0-127, 0-132 y 0-138). La glicosilación adicional en la subunidad beta de hCG hace que sea más hidrófila que aquella de FSH. Las subunidades ß proporcionan especificidad para la interacción de receptores .

Las células de CHO se utilizan comúnmente para la producción de proteínas recombinantes , farmacéuticas. El análisis estructural ha identificado que el ácido siálico es unido exclusivamente por un oc2 , 3 -enlace. Muchas glicoproteínas humanas contienen una mezcla de tanto oc2 , 3-como a2 , 6 -enlaces para residuos de ácido siálico. Por lo tanto, las proteínas recombinantes expresadas utilizando el sistema de CHO diferirán de sus contrapartes naturales en su tipo de enlaces terminales de ácido siálico.

INFERTILIDAD En el presente contexto, la "infertilidad" deberá definirse como la capacidad disminuida o la incapacidad para concebir y tener descendencia. Las mujeres quienes pueden quedar embarazadas pero luego tienen abortos repetidos también se dice que son infértiles. La infertilidad también se define en términos específicos como la incapacidad para concebir después de un año de relaciones sexuales regulares sin anticoncepción. La infertilidad puede ser debido a muchas causas. Los estudios han mostrado que un poco más de la mitad de casos de infertilidad son un resultado de condiciones femeninas. El resto son causadas por trastornos de espermas y por factores sin explicación. Actualmente existen varias posibilidades para tratar la infertilidad. Éstas son relaciones sexuales cronometradas, el uso de tecnologías reproductivas asistidas (ARTs, por sus siglas en inglés) , un manejo médico de la endometriosis , fibromas y disfunción sexual femenina (FSD, por sus siglas en inglés) y cirugía para corregir anormalidades. En la tecnología reproductiva asistida, se utilizan fármacos para estimular la ovulación. Después de LH y hCG, la FSH es uno de aquellos compuestos que se utilizan en este contexto.

Para la administración, las formulaciones líquidas de esos compuestos son adecuadas . Desafortunadamente, se ha mostrado en el pasado que los conservadores agregados a formulaciones líquidas, en particular alcohol bencílico (BA) , fenol y m-cresol, ejercen un efecto desestabilizante sobre la proteína (Maa, Y.F. y Chung, C.H. 1996, Aggregation of recombinant human growth hormone induced by phenolic compounds . Int. J. Pharm. 140:155-168; Lam, X.M., Patapoff, T.W. y Nguyen, T.H. 1997, The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma. Pharm. Res. 14 : 725 -729 ; Hoffmann, J.A. y Lu, J. 2002, FSH and FSH variant formulations comprising benzyl alcohol as a preservative . EP0974359B1, 1-50) .

Por lo tanto, es importante proporcionar una formulación estabilizada, en particular en vista del hecho de que la dosificación de la FSH a ser administrada debe reducir el riesgo de efectos colaterales de formas disociadas o agregadas como respuestas inmunógenas, si está presente una FSH no nativa. Sin embargo, los eventos desestabilizantes que resultan de conservadores disminuyen el nivel real de gonadotropina activa, es decir FSH, dentro de una formulación líquida. De esta manera, un objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones, en particular formulaciones líquidas de FSH, que sean estables, así como también un método para su estabilización .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al uso de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables para la estabilización de una formulación líquida de FSH con el fin de estabilizar una formulación líquida de FSH. La formulación líquida a ser estabilizada puede ser una formulación con o sin un conservador.

Se prefieren las siguientes modalidades: 1. El uso de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables para la estabilización de una formulación líquida de FSH, en donde la sal se selecciona del grupo que consiste de sales de Na+ y sales de K+ farmacéuticamente aceptables, o una combinación de las mismas. 2. El' uso de acuerdo con el artículo 1, en donde las sales son sales de Na+. 3. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 o 2, en donde la sal es NaCl o Na2S04. 4. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 o 2, en donde la sal es Na2S04. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de . los artículos 1 o 2, en donde la sal es una combinación de NaCl y Na2S04. 6. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 5 en donde la sal está comprendida en una cantidad de 20 a 500 mM, o en una cantidad de 30-300 mM o en una cantidad de 50-200 mM. 7. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 6 en donde la formulación de FSH es una formulación de rFSH. 8. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1 a 7 en donde la formulación comprende adicionalmente un conservador. 9. El uso de acuerdo con el artículo 8 en donde la formulación comprende alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol . 10. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1-9, en donde la formulación es una formulación inyectable . 11. Un método para la estabilización de una formulación líquida de FSH en donde el método comprende el paso que consiste en una adición de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables a la formulación, en donde las sales se seleccionan del grupo que consiste de sales de Na+ y sales de K+ o una combinación de las mismas. 12. Un método de acuerdo con el artículo 11 en donde las sales se definen como en los artículos 2 a 6 anteriores . 13. Un método de' acuerdo con los artículos 11 y/o 12 en donde la FSH a ser estabilizada es rFSH. 14. Un método de acuerdo con cualquiera de los artículos 11 a 13 en donde la formulación comprende adicionalmente un conservador. 15. Un método, de acuerdo con el articulo 14 en donde el conservador se selecciona del grupo que consiste de alcohol bencílico, fenol y m-cresol. 16. El uso de acuerdo con cualquiera de los artículos 1-10, en donde la formulación líquida es una formulación líquida reconstituida, la cual ha sido obtenida a partir de una formulación secada por congelamiento. 17. El método de cualquiera de los artículos 11-15, en donde el paso que consiste en agregar la sal se conduce antes de un paso de secado por congelamiento. 18. El método del artículo 17, en donde un paso de reconstitución se lleva a cabo después del paso de secado por congelamiento. 19. El método del artículo 17 y/o 18 en donde la sal está comprendida en la formulación secada por congelamiento o en donde la sal está comprendida en un líquido de reconstitución.

De esta manera, en una modalidad alternativa, la formulación la cual ha sido dotada con la sal estabilizante se almacena en estado secado por congelamiento. El secado por congelamiento se .lleva a cabo como es conocido generalmente para, una persona experta en el campo. La formulación secada por congelamiento entonces puede ser almacenada hasta el uso final con el paciente. Antes de la administración, la formulación secada por congelamiento entonces se reconstituye con cualquiera de los medios de reconstitución conocidos, por ejemplo agua esterilizada. La sal está comprendida ya sea en la formulación secada por congelamiento o en el líquido de reconstitución. 20. El uso o el método de cualquiera de los artículos anteriores en donde la formulación líquida es una formulación de uso individual o una formulación de múltiples dosis, preferiblemente para inyección.

En una modalidad preferida, la sal está comprendida en la formulación líquida per se la cual no es secada por congelamiento pero se mantiene como un líquido en almacenamiento .

En particular, en una modalidad preferida, la presente invención pertenece a la estabilización de una formulación líquida de FSH en donde el catión de metal alcalino se selecciona del grupo que consiste de Na+ y K+. De manera particularmente preferida, la sal es NaCl o Na2S04.

Como se describiera anteriormente, las formulaciones líquidas de FSH son adecuadas para el tratamiento de la infertilidad. En ese respecto, se ha vuelto claro que las formulaciones líquidas de FSH pueden ser inestables; esto es cierto para todas las formulaciones líquidas de FSH inclusive aquellas destinadas para el uso individual. La inestabilidad puede ser aún más pronunciada si las formulaciones líquidas de FSH comprenden un conservador, el cual es necesario por ejemplo para todas las formulaciones de múltiples dosis. Este conservador puede ser cada conservador útil para la conservación de una formulación de FSH; de esta manera, el conservador podría ser un conservador aprobado por la FDA para formulaciones de FSH, en particular, por ejemplo un conservador aprobado por la FDA, aprobado para formulaciones parenterales de FSH, como por ejemplo alcohol, bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservador no está limitado de ninguna manera a esos ejemplos. La estabilidad de la FSH es disminuida por ejemplo por alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol .

Por consiguiente, las sales actualmente reclamadas y descritas que comprenden cationes farmacéuticamente aceptables, se utilizan para la estabilización de formulaciones de FSH de uso individual.

Adicionalmente , las sales actualmente reclamadas y descritas que comprenden cationes farmacéuticamente aceptables, se utilizan para la estabilización de formulaciones de FSH de múltiples dosis; tales formulaciones no necesitan comprender un conservador pero también pueden comprender un conservador.

La adición de las sales actualmente reclamadas que comprenden cationes farmacéuticamente aceptables, es decir sales de Na+ y K+, estabiliza una formulación líquida de FSH. En una modalidad particularmente preferida, las sales son sales farmacéuticamente aceptables. La estabilización se logra en las formulaciones de uso individual o de múltiples dosis, en particular durante un período de almacenamiento más prolongado y en una posible modalidad adicional, puede ser ventajosa como una contramedida para el efecto desestabilizante de los conservadores, como alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol.

Las sales, las cuales se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, incluyen, en una modalidad preferida NaCl o Na2S04.

La sal está comprendida preferiblemente en una cantidad de 20 a 500 mM, aún más preferiblemente está comprendida en una cantidad de 30-300 mM; en una modalidad preferida particular está comprendida en una cantidad de 50-200 mM.

La cantidad máxima de sal agregada está limitada a la osmolalidad de la solución. Para minimizar el dolor con la inyección, la solución debe ser preferiblemente isotónica o por lo menos no hipertónica. Puesto que todos los excipientes en la solución contribuyen a la osmolalidad, la cantidad máxima de sal que se podría agregar a una solución es dependiente de la cantidad de otros componentes presentes .

La sal está comprendida preferiblemente en una cantidad que da por resultado una osmolalidad máxima de 350 mosmól/kg, aún más preferiblemente en una cantidad que da por resultado una osmolalidad máxima de 320 mosmol/kg; en una modalidad preferida particular está comprendida en una cantidad que da por resultado una osmolalidad máxima de 300 mosmol/kg .

Teoría de osmolalidad La osmolalidad es un medio práctico para proporcionar una medida global de la contribución de los diversos solutos presentes en una solución a la presión osmótica de la solución. La osmolalidad se puede medir de acuerdo con the Ph. Eur. 2.2.35, 7a edición, suplemento 2011 (7.2), Osmolality, 01/2008:20235.

En el contexto de la presente invención, una "sal" es un compuesto químico derivado de un ácido al reemplazar hidrógeno, completa o parcialmente, por un metal o un radical electropositivo.

La definición de "sales con (o que comprenden) cationes de sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a todas aquellas sales las cuales se forman con cationes los cuales están aprobados para el suministro i.m. o s.c. de acuerdo con la lista de ingredientes inactivos de la FDA; los cationes de metales alcalinos de este grupo son sodio (Na+) y potasio (K+) .

Los inventores han descubierto sorprendentemente que dos cationes muy específicos son particularmente adecuados para la estabilización de una formulación de FSH.

De esta manera, las sales se podrían formar con los siguientes cationes farmacéuticamente aceptables: potasio (mono-, di- o tribásico) o sodio (mono- o di- o tri-básico) . Preferiblemente, las sales son sales de sodio.

Se prefieren particularmente NaCl y Na2S04.

La gonadotropina la cual se puede estabilizar de acuerdo con la presente invención es la FSH, es decir la hormona estimuladora de folículos, opcionalmente en combinación con ingredientes activos adicionales .

La FSH es FSH derivada de la orina o plasma o recombinante (rFSH) . En una modalidad preferida, la FSH es FSH de orina o rFSH; de manera particularmente preferida es rFSH.

Como se mencionara anteriormente, ahora es posible producir recombinantemente la FSH. De esta manera, en este documento la referencia a una FSH incluye siempre en general tanto la gonadotropina derivada de la orina así como también la gonadotropina recombinante (r) . De esta manera, la referencia a FSH también comprende rFSH.

En una modalidad preferida de la invención, la formulación es una formulación líquida de rFSH, más preferiblemente inyectable, la cual es estabilizada por Na2S04 o NaCl .

En una modalidad preferida de la invención, la formulación es una formulación líquida de rFSH, más preferiblemente inyectable, la cual es estabilizada por Na2S04 o NaCl.

En una modalidad alternativa, la rFSH de todas las modalidades es una FSH de acción prolongada. Las formulaciones de FSH de acción prolongada se pueden obtener como es conocido generalmente para una persona experta en el campo, por ejemplo al modificar la molécula de FSH o al modificar la formulación.

En este documento, la FSH comprende de esta manera todas las posibles formas derivadas de orina o recombinantes de la FSH mencionada anteriormente así como también todas las posibles combinaciones de formas de FSH. También está comprendida una formulación para el uso individual y una o más formulaciones adicionales (de la misma o diferente gonadotropina) para el uso de múltiples dosis.

Un posible producto puede ser una formulación que incluye FSH (opcionalmente con CG, LH, actividad de LH, etcétera), todos en diferentes frasquitos. La actividad de LH, si está presente, puede originarse de LH o CG. La LH puede ser reemplazada por una dosis equivalente de CG y viceversa; una "dosis equivalente" en ese contexto se puede calcular en base a que 1 IU de CG es equivalente a 5 - 7 IU de LH en el Bioensayo de Farmacopea de Van Hell (Van Hell, H y colaboradores Acta Endocrin. 47, 409-418, 1964).

Una combinación preferida es aquella de (r)FSH, (r) LH y (r)hCG, todas en diferentes frasquitos.

Las posibles combinaciones en diferentes frasquitos también incluyen: FSH urinaria (u) y uhCG o uFSH y uLH; además (rhCG o rLH o rFSH) y (uhCG o uLH o rhCG o rLH) y todas las posibles permutaciones de las mismas.

Otra combinación preferida es aquella de (r)FSH y (r)hCG, en diferentes frasquitos, respectivamente.

Otra combinación preferida es aquella de (r)FSH y (r)LH, en diferentes frasquitos, respectivamente.

La formulación de FSH de la presente invención es una formulación líquida. Preferiblemente, la formulación es inyectable. Las formulaciones se pueden suministrar como un producto que tiene una, dos o más composiciones farmacéuticas que incluyen FSH o FSH/hCG, para la administración por separado o conjuntamente. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier empaque apropiado. Por ejemplo, un producto puede contener una variedad de jeringas llenadas previamente cada una que incluye FSH (una composición de FSH) o adicionalmente hCG (una composición de hCG) por ejemplo en donde las jeringas se pueden empacar en un empaque tipo ampolla u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para utilizar las formulaciones de FSH.

De acuerdo con un aspecto adicional, la formulación inventiva de FSH se proporciona como una preparación de múltiples dosis. Sin embargo, la presente invención también se dirige explícitamente a formulaciones destinadas para un uso individual. La presente invención también pertenece a una estabilización de formulaciones como parte de un equipo. Este equipo comprenderá por lo menos un envase que comprende una o más dosis diarias de FSH, o por ejemplo dos envases (por ejemplo, un frasquito) , cada uno que comprende una gonadotropina diferente y por ejemplo instrucciones adicionales (por ejemplo para la administración) y por ejemplo medios adicionales para la inyección. En una modalidad preferida, se utiliza un lapicero para inyección para múltiples inyecciones, por lo cual la solución de FSH se llena en cartuchos respectivos.

En una modalidad preferida, la FSH está comprendida con 35 - 850 IU/ml, preferiblemente 50 - 800 IU/ml, aún más preferible 100 - 600 IU/ml .

Una formulación particularmente preferida para por ejemplo 600 IU/ml de rFSH tiene la siguiente composición : 600 IU/ml de rFSH 0.001 - 0.05, preferiblemente 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 de 0.1 a 10, preferiblemente 1.0 mg/ml de L-metionina de 0.5 a 50, preferiblemente 5.0 mg/ml de fenol de 1 a 100, preferiblemente 14 mg/ml de sulfato de disodio (es decir 0.1 M) de 0.1 a 10, preferiblemente amortiguador de fosfato de sodio 1 m , ( H de 6 a 8 , preferiblemente pH 6.5) .

La osmolalidad de la solución es preferiblemente 300 mosmol/kg (el pH se refiere al pH de la solución completa) .

Las formas de depósito inyectables se pueden hacer al formar matrices microencapsuladas de FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables . Las formas de depósito/sistemas de liberación sostenida basados en polímeros pueden ser, dependiendo de su carácter químico, por ejemplo micro- o nano-partículas , hidrogeles, micelas, emulsiones o implantes. Dependiendo de la relación de FSH con respecto al polímero y el carácter del polímero particular empleado, la velocidad de liberación de FSH se puede controlar. Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen sistemas de copolímeros de polilactida/poliglicólido, polivinilpirrolidona, poli (ortoésteres) , poli (anhídridos ) , poli (etilenglicol) , poliaminoácidos, polisacáridos por ejemplo hialuronato de sodio (NaHA) u otras sales de los mismos, gelatina, quitosan, etcétera. Todos los polímeros mencionados se pueden derivatizar o modificar para optimizar el suministro de fármaco proteico o su estabilidad. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el FSH en sistemas de lípidos o mezclas de lípidos poliméricos como micelas, liposomas o microemulsiones las cuales son compatibles con tejidos del cuerpo.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por medio de la filtración a través de un filtro que retiene bacterias o por medio de la incorporación de agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas, estériles las cuales se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable, estéril justo antes del uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier envase adecuado, por ejemplo un frasquito, jeringa llenada previamente, cartuchos de inyección y similares, como se describiera anteriormente.

El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con prácticas rutinarias en este campo. Véase GOODMAN and GILMAN's THE . PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES , 7a edición. En una modalidad preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para la administración parenteral . Los métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales son conocidos en el campo y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales se pueden suministrar en una formulación líquida o como un sólido el cual se mezclará con un medio inyectable, estéril justo antes de la administración. En una modalidad especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en una forma unitaria de dosificación para la facilidad de administración y uniformidad de dosificación.

La FSH de la presente invención se puede suministrar por medios convencionales a partir de la orina o se puede producir de manera recombinante . Para los posibles métodos de producción se hace referencia adicional por ejemplo al documento WO 2009/127826.

La hCG se puede obtener por cualquier medio conocido en el campo. La hCG utilizada en este documento incluye la hCG derivada de humano y recombinante. La hCG derivada de humano se puede purificar de cualquier fuente apropiada (por ejemplo orina y placenta) por cualquier método conocido en el campo. Los métodos para expresar y purificar la hCG recombinante son bien conocidos en el campo .

La LH se puede obtener por cualquier medio conocido en el campo. La LH, utilizada en este documento, incluye LH derivada de humano y recombinante. La LH derivada de humano se puede purificar de cualquier fuente apropiada (por ejemplo orina) por cualquier método conocido en el campo. Los métodos para expresar y purificar la LH recombinante son conocidos en el campo.

La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de la infertilidad, por ejemplo para el uso en por ejemplo tecnologías reproductivas asistidas (ARTs) , inducción de la ovulación (01) o inseminación intrauterina (IUI) . La composición farmacéutica se puede utilizar, por ejemplo, en indicaciones médicas donde se utilizan preparaciones conocidas de FSH. La presente invención también proporciona el uso de la preparación estabilizada de FSH descrita en este documento (de acuerdo con aspectos de la invención) para, o en la manufactura de un medicamento para, el tratamiento de la infertilidad. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier ruta de administración de fármaco, por ejemplo oral, rectal, ¦ parenteral, transdérmica (por ejemplo tecnología de parche) , intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracisternal , intravaginal , intraperitoneal , local (polvos, ungüentos o gotas) o como una pulverización bucal o nasal. Una composición típica comprende un portador farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes no tóxicos, que incluyen sales y conservadores, amortiguadores y similares, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975) , en las páginas 1405 a 1412 y 1461 a 87, y the national formulary XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros .

Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehículos farmacéuticos, acuosos y no acuosos, adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares) , carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de olivo) y ásteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo.

Las composiciones también pueden contener aditivos tales como pero no limitados a conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes amortiguadores y agentes de dispersión. Los agentes antibacteriales y antifúngicos se pueden incluir para impedir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenoles, ácido sórbico y similares. Adicionalmente, puede ser deseable incluir agentes de tonicidad.

En algunos casos, para efectuar una acción prolongada es deseable disminuir la velocidad de la absorción de FSH (y otros ingredientes activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede realizar por medio del uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción de por ejemplo FSH entonces depende de su velocidad de disolución la cual, a su vez, puede depender del tamaño de cristales y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de combinación de FSH administrada por la ruta parenteral se realiza al disolver o suspender la combinación de FSH en un vehículo oleoso.

De acuerdo con la presente invención, los inventores hicieron un esfuerzo para investigar el efecto de ciertos compuestos sobre la estabilidad de una formulación líquida de gonadotropina; en este punto, se investigaron los efectos de estabilización así como también desestabilización de ciertos compuestos.

El término "estabilidad" puede referirse a la estabilidad química, que involucra la modificación covalente en la secuencia de aminoácidos, pero en el contexto de estabilidad de proteínas también puede referirse a la estabilidad física, la cual involucra cambios del estado plegado de proteínas (es decir el estado nativo) que no incluye la escisión de enlaces covalentes.

En la presente invención el término "estabilidad" se refiere a la estabilidad física de formulaciones de gonadotropinas , en particular FSH de la presente invención. La inestabilidad física de una formulación de proteína puede ser causada por la agregación de las moléculas de proteína para formar agregados de orden más alto, por la disociación de los heterodímeros en monómeros o por cualquier otro cambio conformacional que reduce por lo menos una actividad biológica de las proteínas de FSH incluidas en la presente invención.

Una solución o formulación "estable" es una en donde el grado de agregación, disociación, modificación conformacional , pérdida de actividad biológica y similares de proteínas en la misma se controla de manera aceptable y no incrementa inaceptablemente con el tiempo. La estabilidad puede ser evaluada por medio de métodos bien conocidos en el campo, que incluyen la medición de la dispersión de luz de una muestra, inspección visual de claridad y/o coloración, absorbancia o densidad óptica, determinaciones del tamaño molecular (por ejemplo, por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño o el fraccionamiento de campo-flujo) , actividad biológica in vitro o in vivo y/o por medio de la calorimetría de exploración diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) . Otros métodos para evaluar la estabilidad son bien conocidos en el campo y también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención.

Se supo que varios conservadores tienen un efecto desestabilizante pronunciado sobre las formulaciones de gonadotropina y en este documento se descubrió sorprendentemente que las sales, en particular sales que comprenden cationes de metales alcalinos .farmacéuticamente aceptables, los cuales se ha mostrado en este documento que son adecuados para la estabilización de una formulación líquida de FSH, en particular Na+ o K+, tal como NaCl o Na2S04 son adicionalmente útiles para contrarrestar los efectos desestabilizantes de un conservador, como alcohol bencílico, fenol y m-cresol, los cuales es necesario que estén comprendidos en una formulación líquida de FSH de múltiples dosis para uso médico. Las sales actualmente reclamadas tienen un efecto estabilizante sobre una formulación líquida de FSH el cual es más pronunciado de una manera ventajosa y sorprendente que los efectos estabilizantes de estabilizadores conocidos, como por ejemplo sacarosa. El efecto de estabilización mejorado en comparación con los estabilizadores conocidos como sacarosa es particularmente sorprendente. Además, muy inesperadamente, los efectos estabilizantes de las sales inventivas se podrían mostrar para las formulaciones^ de FSH, aunque ningún efecto estabilizante se podría mostrar para la hCG muy similar. Fue adicionalmente sorprendente que los efectos de estabilidad observados no obedecieron .a la comúnmente llamada serie de Hofmeister (véase posteriormente) sino que realmente fueron en contra de ésta .

Se ha sabido a partir de la técnica anterior que existe una degradación de FSH que ocurre en las formulaciones farmacéuticas de FSH y ésta ha sido confirmada por el primer conjunto de los presentes ejemplos .

La FSH se degradará tanto como una función de tiempo así como también como una función de la temperatura. En particular, a temperaturas por encima de la temperatura ambiente, las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria se alterarán.

Parece que el desplegamiento conformacional de estructuras terciarias y secundarias de FSH que ocurre con el calentamiento es una transición de dos etapas (cuando la agregación de proteínas es limitada) . Este desplegamiento puede ser independiente de la disociación de subunidades (cambios en la estructura cuaternaria) .

Además, con la presente invención se aclara que la FSH, que contiene un conservador como alcohol bencílico o fenol, donde son necesarios estos conservadores, por ejemplo como agentes antimicrobianos en formulaciones líquidas de FSH, afecta claramente la estabilidad de formulaciones de múltiples dosis de FSH de una manera negativa. En este punto, la estabilidad a largo plazo de FSH se disminuye, la temperatura de desnaturalización de FSH es más baja y la forma ya desnaturalizada tiene un nivel más bajo de estructuras secundarias que las formulaciones de FSH que no contienen conservadores.

La presente invención también muestra por primera vez que las sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables para la estabilización de una formulación líquida de FSH, específicamente Na y K, tienen un efecto significativo sobre la estabilidad de formulaciones líquidas de FSH. Se podría mostrar que la estructura secundaria de FSH en formulaciones líquidas de FSH que comprenden estas sales no cambiará significativamente con el calentamiento a 76.5°C. La forma desnaturalizada es relativamente estructurada en presencia de por ejemplo Na2S04, esto hace que la desnaturalización sea más reversible, y de esta manera, incrementa significativamente la estabilidad cinética de la proteína. Esto es sustentado por los datos de estabilidad en tiempo real mostrados actualmente que muestran un efecto estabilizante pronunciado sobre la estructura heterodimérica de FSH.

Los resultados en este documento indican claramente que las sales actualmente reclamadas, por ejemplo sulfato de sodio y cloruro de sodio, pueden limitar la tendencia de las moléculas de FSH a disociarse y de esta manera incrementan significativamente la estabilidad en almacenamiento .

La presente invención también pertenece a un método para la estabilización de una formulación líquida de FSH en donde el método comprende el paso de una adición de las sales anteriores a la formulación.

Todos los estudios fueron confirmados por los datos en tiempo real conducidos adicionalmente .

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 : La señal de CD (dicroísmo circular, véase posteriormente) (mgrado) como una función de la longitud de onda (nm) se muestra para la rFSH a varias temperaturas. No se observó una diferencia significativa entre los espectros a 24.0°C -» 45.9°C pero se observó una disminución dependiente de la temperatura de la señal de CD más allá de 50°C. La proteína de rFSH (0.93 mg/ml) se disolvió en amortiguador de fosfato 3.57 mM pH 6.3 que contenía 0.0036 mg/ml de Polisorbato 20. Exploración a 24.0°C (traza sólida gruesa), 50.3°C (traza discontinua), 54.7°C (traza punteada), 59.0°C (traza discontinúa-punteada), 63.4°C (estrellas), 67.8°C (diamantes) y 76.5°C (traza sólida). Figura 2 : La señal de CD (mgrado) como una función de la longitud de onda (nm) se muestra para la rFSH que contiene Na2S04 a varias temperaturas. No se observó una diferencia significativa entre los espectros a 24.0° ? 45.9°C. La proteína de rFSH se disolvió en amortiguador de fosfato 3.57 mM pH 6.3 que contenía 0.0036 mg/ml de Polisorbato 20 y 8.6 mg/ml de sulfato de sodio (Na2S04) . Exploración a 24.0°C (traza sólida gruesa), 50.3°C (traza discontinua), 54.7°C (traza punteada), 59.0°C (traza discontinúa-punteada) y 76.5°C (traza sólida).

Figura 3 : La señal de CD (mgrado) como una función de la longitud de onda (nm) se muestra para la rFSH que contenía alcohol bencílico a varias temperaturas. No se observó una diferencia significativa entre los espectros a 24.0°C -» 45.9°C. La proteína de rFSH (0.93 mg/ml) se disolvió en amortiguador de fosfato 3.57 mM pH 6.3 que contenía 0.0036 mg/ml de Polisorbato 20 y 0.17 mg/ml de alcohol bencílico. Exploración a 24.0°C (traza sólida gruesa), 45.9°C (círculos), 50.3°C (traza discontinua), 54.7°C (traza punteada), 59.0°C (traza discontinúa-punteada), 63.4°C (estrellas), 67.8°C (diamantes) y 76.5°C (traza sólida). Figura : Exploraciones subsecuentes de DSC de hCG y rFSH. Los datos de DSC para 5 mg/ml de hCG en 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, 0.5 mg/ml de L-metionina, amortiguador de fosfato 1 mM, pH 6.5 y 2.4 mg/ml de rFSH en 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.24 M de NaCl, amortiguador de fosfato 1 mM, pH 6.5. Velocidad de exploración 2.0 °C/minuto . Primera exploración de rFSH (traza sólida) , segunda exploración de rFSH (traza discontinúa-punteada) , primera exploración de hCG (traza discontinua) y segunda exploración de hCG (traza punteada) . Después de la primera exploración, la muestra se enfrió a 20 °C antes de la segunda exploración.

Figura 5 : Exploraciones de DSC de hCG con varios azúcares o sales. Datos de DSC para 5 mg/ml de hCG en 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, 0.5 mg/ml de L-metionina y amortiguador de fosfato 1 mM, pH 6.5. No se agregó azúcar o sal (traza sólida gruesa), Na2S04 0.1 M (traza sólida), NaCl 0.1 M (traza punteada), NaC104 0.1 M (traza discontinua) y sacarosa 0.1 M (traza discontinúa-punteada). Velocidad de exploración 2.0 °C/minuto .

Figura 6 : Exploraciones de DSC de rFSH con varios azúcares y sales. Datos de DSC para 2.4 mg/ml de rFSH en 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, 0.5 mg/ml de L-metionina y amortiguador de fosfato 1 mM, pH 6.5. No se agregó azúcar o sal (traza sólida gruesa), Na2S04 0.1 M (traza sólida), NaCl 0.1 M (traza punteada), NaC104 0.1 M (traza discontinua) y sacarosa 0.1 M (traza discontinúa-punteada) . Velocidad de exploración 1.0 ° C/minuto .

La presente invención se explica adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, los cuales sin embargo de ninguna manera deberán interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Espectroscopia de Radiación Sicrotrónica-Dicroísmo Circular (SRCD) MÉTODO La espectroscopia de Dicroismo Circular se realizó mediante el uso de una instalación sincrotrónica en la Universidad de Aarhus, Dinamarca. Todos los espectros de CD se registraron utilizando una celda de cuarzo SuprasilMR de longitud de trayectoria 0.1 mm (Hellma GmbH, Alemania) sobre un intervalo de longitud de onda 180-270 nm en etapas de 1 nm y con un tiempo de permanencia de 3 segundos por longitud de onda. Tres exploraciones idénticas de CD se registraron para cada ensayo experimental tanto para ensayos de rFSH como de referencia (placebo) . El espectro de CD de rFSH presentado en este reporte se obtuvo al sustraer la exploración de placebo correspondiente, promedio de la exploración de proteína promedio. Para cada conjunto de exploraciones de CD se utilizó aproximadamente 120 µ? de solución (corresponde a aproximadamente 112 µg de rFSH) .

Durante las investigaciones de los efectos de la temperatura sobre el espectro de CD de rFSH, la temperatura en la cámara de calentamiento se varió de 25°C a 85°C con intervalos de 5°C y un tiempo de equilibrio de 5 minutos. A partir de un archivo de calibración se determinó la temperatura experimental, real (temperatura en la celda de cuarzo SuprasilMR) .

El CD mide la diferencia en la absorción de luz polarizada circularmente izquierda y derecha lo cual ocurre debido a una asimetría estructural. Las estructuras secundarias de proteínas se pueden investigar por medio de la espectroscopia de CD en la región de ultravioleta lejano (aproximadamente 180-250 nm) . En general, una estructura más ordenada sigue señales de CD más intensas (positivas o negativas) . Sin embargo, diferentes estructuras secundarias tienen diferentes espectros de CD y como las a-hélices tienen señales de CD más intensas que las ß-estructuras, no se pueden realizar comparaciones directas entre diferentes proteínas para concluirse en el grado de estructuras ordenadas .

Debido a la alta sensibilidad hacia cambios estructurales, la espectroscopia de CD es una fuerte herramienta cuando se investiga la estabilidad física de proteínas. Estos estudios se realizan usualmente al detectar un espectro de CD como una función de cambios en factores externos por ejemplo temperatura, H, concentración de desnaturalizantes, surfactantes o estabilizadores. En el presente estudio, el espectro de CD de rFSH se investiga como una función de la temperatura.

Adicionalmente, los efectos del alcohol bencílico y el sulfato de sodio (Na2S04) sobre la estructura secundaria de rFSH han sido estudiados.

La gonadotropina utilizada en este ejemplo así como también en los Ejemplos 2 y 3 es una Hormona Estimuladora de Folículos recombinante (rFSH) , una hormona humana la cual se expresa a partir de la línea de células PER.C6MR de humanó utilizando la tecnología de ADN recombinante . La rFSH es una proteína heterodimérica que consiste de dos monómeros glicosilados : una subunidad alfa de 92 aminoácidos la cual es común para la FSH, Hormona Luteinizante (LH) , Gonadotropina Coriónica Humana (hCG) y Hormona de Estimulación de Tiroides (TSH) y una subunidad beta de 111 aminoácidos la cual es específica para la FSH. Las hormonas de glicoproteínas , que comprenden la FSH, liberan todas su bioactividad con la disociación de los monómeros acoplados no covalentemente . Los resultados previos han indicado que la inestabilidad de la rFSH se basa principalmente en la disociación dimérica (descomposición de una estructura cuaternaria y disminución concomitante en la respuesta de inmunoenlace) .

Dependiendo del uso proyectado, las formulaciones de rFSH comercializadas actualmente se proporcionan en diferentes concentraciones, que varían de 37.5 IU/ml (que corresponde a aproximadamente 2.8 µg/ml para Gonal-fMR) hasta por lo menos 833 IU/ml (que corresponde a aproximadamente 83.3 µ9/p?1 para PuregonMR) . La rFSH utilizada en los estudios est hecha para una formulación de producto farmacológico líquido, 600 IU de rFSH/ml para inyección subcutánea. Puesto que el producto está dirigido a la inyección de múltiples dosis, la adición de un conservador es necesaria.

Las formulaciones investigadas se produjeron al mezclar soluciones madre de los diferentes ingredientes. El intervalo de concentración investigado para tanto la proteína como los excipientes es limitado debido al método utilizado, es decir fue necesario que la concentración de proteína se mantuviera relativamente alta en comparación con las concentraciones de excipiente. Debido a la absorción de radiación ultravioleta de los compuestos aromáticos en la región de longitud de onda investigada, fue necesario que la concentración de alcohol bencílico se mantuviera baja. La tabla posterior resume las tres formulaciones diferentes que han sido examinadas en un primer diseño experimental por los presentes inventores.

Tabla 1 La tabla muestra el contenido de las tres formulaciones las cuales se utilizaron para estudios de SRCD de los efectos de la temperatura sobre la rFSH.

Muestra 1 El espectro de CD se registró para la rFSH, muestra 1 (véase la tabla 1) a trece diferentes temperaturas entre 24°C y 77°C. Por claridad, solo siete de esos espectros se muestran en la figura 1. La muestra 1, como se puede deducir a partir de la Tabla 1, no comprendió sal ni conservador. Los espectros se muestran en la figura 1. Los resultados muestran claramente que la intensidad de la señal de CD disminuye como una función de la temperatura, lo que indica la descomposición de estructuras secundarias a una temperatura elevada (> 50°C) . No se detectaron diferencias significativas entre los espectros a 24.0°C ? 45.9°C, lo cual muestra que durante el período de tiempo de las mediciones (aproximadamente 20 minutos) la estructura secundaria de la proteína está intacta con el calentamiento a aproximadamente 46°C. Los espectros de SRCD de la FSH con el calentamiento muestran un punto isodicróico a aproximadamente 193 nm, el cual también se encuentra para los espectros de la Muestra 2, véase la figura 2.

Muestra 2 El espectro de CD se registró para la rFSH, muestra 2 (tabla 1) que contenia Na2S04. Los espectros se obtienen a trece diferentes temperaturas entre 24 °C y 77 °C y se presentan en la figura 2. Por claridad, solo cinco de esos espectros se muestran en la figura 2. Los resultados muestran la descomposición de estructuras secundarias como una función de la temperatura. Los datos revelan que la estructura secundaria de la rFSH en la muestra 2 está intacta con el calentamiento a aproximadamente 46 °C (por la duración del experimento) . Notablemente, los datos también muestran que la forma desnaturalizada es estructurada relativamente en presencia de Na2S04.

Muestra 3 El espectro de CD se registró para la rFSH, muestra 3 (tabla 1) que contenía alcohol bencílico (BA) . El alcohol bencílico es un conservador antimicrobiano el cual se selecciona muy comúnmente para una formulación líquida de FSH. Debido a la capacidad de conservación relativamente débil en comparación con por ejemplo el m-cresol, el BA tiene que ser utilizado en altas concentraciones (aproximadamente 10-15 mg/ml) . Es necesario un conservador puesto que el uso proyectado de la rFSH es para varias inyecciones durante un período de tiempo de hasta 1 mes y ya que la rFSH se almacena comúnmente a temperatura ambiente .

Los espectros de la rFSH en presencia de 0.17 mg/ml de BA se obtienen a trece diferentes temperaturas entre 24 °C y 77 °C y se presentan en la Figura 3. Por claridad, solo ocho de esos espectros se muestran en la figura 3. Debido a la absorbancia de radiación ultravioleta muy alta del alcohol bencílico (y una baja señal de CD concomitante) , la concentración de BA investigada no pudo ser incrementada y de esta manera no pudo incluso acercarse a la concentración la cual se utilizará para conservar formulaciones de rFSH. No obstante, se observó un claro efecto desestabilizante de BA. Los resultados de CD indican que la estructura secundaria de rFSH en la muestra 3 está intacta con el calentamiento a 42 °C, lo cual es ligeramente más bajo que la temperatura de desnaturalización de inicio de la rFSH en las muestras 1 y 2.

Adicionalmente , y notablemente, los datos muestran que las formas desnaturalizadas carecen de una estructura ordenada a un grado apreciablemente más alto que la FSH en ausencia de un conservador.

Los efectos de excipientes sobre cambios estructurales inducidos por la temperatura La sal de Na2S04 la cual se utilizó en este documento como un ejemplo representativo para las sales actualmente reclamadas mostró un efecto significativo sobre la estructura de proteínas desnaturalizadas por la temperatura. Esto es claramente un descubrimiento importante. Como las proteínas desnaturalizadas (desplegadas o parcialmente desplegadas) son más propensas a asociarse para formar agregados que las proteínas nativas (Fink, A.L., 1998, Fold Des. 3 (1) :R9-R23 ) , los resultados indican que el sulfato de sodio puede limitar la tendencia de moléculas de rFSH a desnaturalizarse y por lo tanto el riesgo para la agregación y en consecuencia incrementa significativamente la estabilidad en almacenamiento. Por otra parte, el alcohol bencílico (BA) induce una descomposición estructural significativa a altas temperaturas. No se detectaron estructuras secundarias, ordenadas por medio SRCD. Los efectos observados del BA (más estructuras desplegadas) pueden ser parte de la explicación para la agregación incrementada que se encuentra en otros sistemas de proteínas con la adición de. alcohol bencílico (Maa, Y. y Hsu, C.C., 1996, Int. J. Pharm. 140:155-168; Zhang, Y. y colaboradores, 2004, J. Pharm. Sci. 93 (12) : 3076-3089) .

Sin embargo, la adición de conservadores es crucial para el desarrollo de formulaciones de múltiples dosis y a partir de la existencia de productos de rFSH en el mercado se sabe que es necesario que se desarrollen más formulaciones estables incluso con un contenido relativamente alto de alcohol bencílico (PuregonMR contiene 10 mg/ml de alcohol bencílico) .

Se descubrió que el alcohol bencílico disminuye la estabilidad de la rFSH y favorece la' pérdida de estructuras secundarias, ordenadas con el calentamiento. Sin embargo, la adición de conservadores es importante. Este estudio mostró que las sales actualmente reclamadas incrementan el nivel · de estructuras ordenadas en formulaciones calentadas de rFSH. De esta manera, estas sales son muy adecuadas como estabilizador (es) en una formulación líquida de rFSH, por ejemplo para compensar los efectos del alcohol bencílico u otros conservadores fenólicos .

Ejemplo 2 - Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) La FSH utilizada representativamente en este ejemplo es la misma que aquella del Ejemplo 1. En general, la estructura nativa (bioactiva) de proteínas es muy sensible a sus entornos por ejemplo la composición de la formulación, los sistemas de envases, pH y temperatura. En el presente ejemplo, la temperatura de desnaturalización de rFSH, Tm, ha sido investigada por medio de la Calorimetría de Exploración Diferencial líquida (DSC) . La temperatura de desnaturalización de rFSH proporciona una indicación de la estabilidad de la proteína en solución, donde una Tm más alta indica una proteína más estable.

La estructura terciaria y cuaternaria de proteínas se estabiliza principalmente por medio de interacciones no covalentes . Puesto que muchas de estas interacciones intramoleculares son reemplazadas por interacciones no covalentes con moléculas de agua durante el despliegue, el balance termodinámico entre las diferentes formas estructurales (es decir nativas y desnaturalizadas) es sutil. En general, esto significa que la estabilidad de proteínas nativas es limitada. Muchas proteínas se despliegan térmicamente alrededor de 70 °C. El plegamiento o desnaturalización de proteínas se puede describir por medio de parámetros termodinámicos los cuales se pueden estudiar y cuantificar directamente utilizando DSC. Por lo tanto, la DSC es una herramienta importante para estudiar los efectos de excipientes sobre la estabilidad de proteínas y de esta manera para identificar formulaciones óptimas para productos terapéuticos proteicos .

CALORIMETRÍA DE EXPLORACIÓN DIFERENCIAL LÍQUIDA (DSC) Teoría Cuando se calienta una muestra de proteínas (es decir incrementado la temperatura de la muestra) en una DSC líquida, solo se obtiene un ligero incremento de la línea de referencia, pero cuando el calentamiento continúa (es decir incremento continuo en la temperatura) , el calor es absorbido por la proteína causando que se despliegue térmicamente sobre un intervalo de temperatura característico de la proteína estudiada. Esto da origen a un pico endotérmico. Durante el despliegue de proteínas, las moléculas de agua que rodean la proteína se reorganizan puesto que se exponen más cadenas hidrófobas . Cuando se completa el despliegue, la absorción de calor disminuye y se forma una nueva línea de referencia.

La integración de la capacidad de calor, Cp, de la muestra da el cambio de entalpia, ??, asociado con el proceso de despliegue de la ecuación (1) . El cambio de entalpia observado se origina de procesos endotérmicos tal como el rompimiento de enlaces de hidrógeno y procesos exotérmicos tal como la formación de enlaces de hidrógeno entre la proteína y los medios circundantes . El punto medio de la transición térmica o punto medio de transición, Tm (llamado frecuentemente la temperatura de desnaturalización de proteínas) , es la temperatura cuando la mitad de moléculas de proteína se pliegan y la mitad de moléculas de proteína se despliegan.

AH = CpdT (l) Los datos sin procesar de las mediciones de DSC, es decir, el consumo de calor (en W) como una función de la temperatura se podría calcular de nuevo fácilmente para la capacidad térmica molar, parcial (en J/mol K) , conociendo la masa molar y la concentración de la proteína utilizada. Método de Prueba La temperatura de desnaturalización de proteínas, Tm, se midió utilizando una DSC líquida, Nano DSCR de TA Instruments, equipada con células capilares dobles de 300 µ? y utilizando los siguientes parámetros: Velocidad de exploración: 0.5-2.0°C/minuto, si nada además de eso se estableció, se utiliza una velocidad de exploración de 1.0°C/minuto (2.0 °C/minuto para el ejemplo 4) Temperatura inicial: 20°C Temperatura final: 100 °C Equilibrio: 900 s (o 900 s (primera exploración) 600 s (segunda exploración) para el ejemplo 4) Presión constante: 3 atmósferas Todas las muestras se desgasificaron durante 15 minutos antes de las mediciones. Las células de muestra se limpiaron con ácido fórmico al 50% después de cada muestra de proteína. Adicionalmente, las celdas se enjuagaron con 1000 mi de agua purificada después de cada corrida de muestra. Todas las muestras se midieron con el placebo correspondiente, en la celda de referencia. Los resultados de una exploración separada con la solución de placebo vertida en la celda tanto de referencia como de muestra se sustrajeron de los datos antes de la evaluación, es decir una sustracción de valores en blanco.

MALDI-TOF MS Las muestras de rFSH, antes y después del tratamiento con la enzima sialidasa, se analizaron por medio de la Espectrometría de Masas de Ionización/Desorción por Láser Asistida por Matriz y Analizador de Tiempo de Vuelo (MALDI-ToF MS , por sus siglas en inglés) para evaluar el grado de la reacción de desialilación . Los espectros se adquirieron en un Espectrómetro de Masas de MALDI TOF Autoflex IIMR (Bruker Daltonics) . El ácido sinápico se utilizó como matriz. El análisis se realizó en el modo de ión lineal positivo, con extracción retardada. Un intervalo de exploración de 4000-20893 Da se utilizó con calibración externa .

EL OBJETIVO DE ESTE EJEMPLO El propósito de ejemplo fue investigar la estabilidad térmica de la rFSH por medio de la Calorimetría de Exploración Diferencial líquida (DSC) y estudiar la estabilización del efecto de varias sales sobre la rFSH con y sin la adición de un conservador (fenol o alcohol bencílico) .

Este estudio junto con estudios previos de espectroscopia de Dicroismo Circular (CD) (Ejemplo 1 anterior) y estudios de estabilidad en tiempo real (Ejemplo 3 posterior) se dirigen todos a estudiar el efecto de sales y conservadores sobre la estabilidad de la rFSH en soluciones .

PRODUCTOS A SER ESTUDIADOS INFORMACIÓN DEL LOTE DE rFSH La rFSH, el lote de sustancia farmacológica no. 08800020 y lote no. 09PD80010 fueron manufacturados por Bio-Technology General (BTG) ,. Israel.

La determinación de la actividad biológica de rFSH se realiza de acuerdo con Ph. Eur. La concentración se determinó que era 13,223 IU/mg (que da por resultando 9,256 IU/ml) para el lote 08800020 y 15,109 IU/mg (que da por resultado 10,576 IU/ml) para el lote 09PD80010, respectivamente para los dos lotes de rFSH utilizados.

MATERIALES Excipientes Una lista de los excipientes utilizados en las soluciones de rFSH en este estudio se lista en la Tabla 2. Tabla 2: Lista de excipientes COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES SOMETIDAS A PRUEBA La composición de las soluciones sometidas a prueba de rFSH y placebo se lista en la Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5. La concentración sometida a prueba de los conservadores se selecciona con base en la concentración requerida para satisfacer la Ph. Eur. Un criterio concerniente a la eficacia de conservación de una formulación dirigida al uso parenteral .

Las concentraciones de sal sometidas a prueba se basan en la concentración de sulfato de sodio necesaria para obtener isotonicidad en las soluciones sometidas a prueba, es decir, sulfato de sodio 0.1 M. Todas las otras sales se someten a prueba a la misma concentración molar que el sulfato de sodio. Adicionalmente , una concentración más alta y más baja de cloruro de sodio se somete a prueba, para evaluar el efecto de la concentración de sal sobre la temperatura.de desnaturalización de rFSH, Tm.

La concentración de amortiguador de fosfato de sodio en las soluciones sometidas a prueba se mantiene baja para minimizar el riesgo de efectos de estabilización/desestabilización de las sales amortiguadoras como tales.

Tabla 3 : Composición de soluciones de rFSH Tabla 4 : Composición de soluciones de rFSH desialilada Tabla 5: Composición de soluciones de placebo PROCEDIMIENTO DE MANUFACTURA Todas las soluciones (Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5) son manufacturadas a escala de laboratorio en Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca. El procedimiento de manufactura se resume a continuación: Preparación de la Solución Madre de rFSH Las soluciones madre de rFSH en amortiguador de fosfato se preparan al agregar una etapa de concentración utilizando el lote de rFSH 08800020 o la solución de sustancia farmacológica del lote 09PD80010 como material de inicio. La concentración elevada se realiza utilizando un dispositivo Vivaspin 20MR con un corte de membrana de peso molecular 10 kDa (MWCO) de Vivascience. La membrana se lava previamente al centrifugar 15 mi de la solución de placebo correspondiente, que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en amortiguador de fosfato 1 mM pH 5.5, 6.5 o 7.5 a través del filtro. La centrifugación se realiza a 3000 x g durante 20 minutos utilizando un rotor basculante.

Para realizar la etapa de concentración, se utiliza un total de 80 mi de muestra de rFSH para llenar cuatro dispositivos Vivaspin 20MR (20 mi por dispositivo) y se centrifuga a 3000 x g durante 15 minutos. Cada porción retenida se transfiere a un matraz volumétrico de 20 mi. Los filtros se lavan con alícuotas pequeñas de la solución de placebo deseada. La solución de lavado se transfiere al matraz volumétrico, el cual se diluye finalmente a un volumen utilizando la misma solución de placebo. Esto da por resultado 2.8 mg/ml de solución madre de rFSH que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en un amortiguador de fosfato 1 mM pH 5.5, 6.5 o 7.5, respectivamente.

Preparación de soluciones de rFSH y placebo Las soluciones madre de todos los excipientes, excepto los conservadores, se preparan en agua Milli-QMR.

Para la preparación de soluciones de rFSH y placebo, las soluciones madre de cada excipiente se mezclan para obtener las concentraciones deseadas que se proporcionan en la Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5. El conservador se agrega directamente a las soluciones.

Desialilación de rFSH La solución concentrada de rFSH que tiene una concentración de rFSH de 2.8 mg/ml que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en un amortiguador de fosfato 1 mM pH 6.5 se utiliza para retirar el ácido siálico de las porciones de azúcar unidas a la rFSH. La remoción se realiza enzimáticamente , utilizando una a (2->3 , 6 , 8 , 9) Neuraminidasa (una sialidasa) de Sigma. La rFSH se trata con la Neuraminidasa durante toda la noche agitando a 37°C. Los reactivos se retiran utilizando dispositivos VivaspinMR como se describiera anteriormente para la concentración de la rFSH. La solución de rFSH que contiene la enzima se transfiere a un dispositivo VivaspinMR lavado previamente. El dispositivo se centrifuga, el producto filtrado se descarga y la porción retenida se suspende de nuevo en solución de placebo que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en un amortiguador de fosfato 1 mM pH 6.5. La solución se centrifuga nuevamente. Este procedimiento se repite tres veces antes de que la porción retenida final se transfiera a un matraz volumétrico y se diluya a un volumen con la solución de placebo. Esto produce 2.8 mg/ml de solución madre de rFSH desialilada que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en un amortiguador de fosfato 1 mM pH 6.5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN EFECTO DE LA VELOCIDAD DE EXPLORACIÓN DE DSC SOBRE LA Tm DE rFSH Para investigar el efecto de la velocidad de exploración de DSC sobre la temperatura de desnaturalización de rFSH, Tm, se realizan mediciones con tres diferentes velocidades de exploración. Como se puede observar en la Tabla 6 , la rm de rFSH varía con la velocidad de exploración DSC utilizada durante las mediciones.

Siempre y cuando se comparen las temperaturas de desnaturalización obtenidas a partir de mediciones realizadas con velocidades de exploración idénticas, el hecho de que la Tm varíe con la velocidad de exploración no afecta la interpretación de los datos, véase por ejemplo la Tabla 7 .

Tabla 6: Temperatura de desnaturalización, Tm, en relación con la velocidad de exploración para las muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en un amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 ?Preparación y análisis de muestras por. duplicado Las exploraciones de DSC repetitivas hasta 100 °C han mostrado que la desnaturalización de la rFSH es parcialmente irreversible bajo las condiciones experimentales (véase la figura 4) . Esto significa que el replegamiento es más lento que el tiempo de equilibrio entre dos exploraciones de DSC o que el despliegue está asociado con una etapa irreversible como se indica en la ecuación 2.

Nativo <-» Desplegado ? Desnaturalizado Irreversiblemente (2) EFECTO DE LA ADICIÓN DE UN CONSERVADOR SOBRE LA Tm DE rFSH Como se puede observar en la Tabla 7, la adición de un conservador a una solución de rFSH disminuye la temperatura de desnaturalización, Tm con 2-6 °C, dependiendo del conservador utilizado. Esto corresponde bien a los datos previamente reportados tanto para otras proteínas recombinantes como para la FSH derivada de la orina.

La disminución más grande en la Tm obtenida para las soluciones de rFSH con alcohol bencílico en comparación con las soluciones de rFSH con fenol (véase la Tabla 7) se podría explicar a partir de la concentración más alta de alcohol bencílico (15 mg/ml) que de fenol (5 mg/ml) utilizada en los experimentos.

Tabla 7: Temperatura de desnaturalización con y sin adición de un conservador, Tm (conservador) y Tm <ß-.? conservador)» para las muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 y los excipientes listados ^- 3. t bl . ? ?? (conservador) = Tm (conservador) ~ Tm (sin conservador) ?Calculado a partir de mediciones de DSC realizadas con una velocidad de exploración de 1 . 0°C/min.

**Calculado a partir de mediciones de DSC realizadas con una velocidad de exploración de 2 . 0°/min.

EFECTO DE LA ADICIÓN DE VARIAS SALES SOBRE LA Tm DE rFSH La clasificación de sales de acuerdo con sus efectos generales sobre la solubilidad y estabilidad de proteínas se conoce como la serie de Hofmeister o la serie liotrófica, ecuación ( 3 ) posterior. Los agentes de precipitación por sales al lado izquierdo, los comúnmente llamados iones cosmotrópicos se sabe que producen un efecto estabilizante sobre las proteínas. Mientras que los iones caotrópicos o de solubilización salina al lado derecho, se sabe que desestabilizan proteínas.

S< ~4 > HPCf'4 > F~ > ?G > Br" > NO' 3 > G > CIO' 4 > SCIST (3) Efecto de la Adición de Varias Sales a Soluciones sin Conservador Sobre la Tm de rFSH Cuando se mide el efecto de varias sales sódicas sobre la Tm de rFSH, muy sorprendentemente, el efecto estabilizante/desestabilizante esperado de acuerdo con la serie de Hofmeister como se describiera anteriormente no se observó, cuando se varían los cationes, véase la Tabla 8 y la Tabla 9. Sin tener en cuenta si se utiliza el ión más cosmotrópico, sulfato o el ión caotrópico, perclorato, el incremento en la temperatura de desnaturalización fue aproximadamente el mismo. De hecho, el incremento más grande en la Tra de rFSH se obtuvo para las sales de iones de perclorato, donde se espera un efecto desestabilizante sobre la rFSH. El incremento en la Tm estuvo en el mismo intervalo tanto para una variedad de aniones inorgánicos como sulfato, cloruro y perclorato pero también para aniones orgánicos como citrato, acetato y tartrato.

Tabla 8: Temperatura de desnaturalización, Tm, en relación con la combinación del anión y catión de sal para las muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 y sal 0.1 M.

Sin sal agregada: Tm = 72.9°C, otros excipientes de acuerdo con el encabezado de la tabla Sacarosa 0.1 M : Tm = 73.3°C, otros excipientes de acuerdo con el encabezado de la tabla Tabla 9: Cambio en la temperatura de desnaturalización, ATm (sai) , en relación con la combinación del anión y catión de sal para las muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 con la adición de sal 0.1 M. ATm (sal) = Tm (sal) - rm(sin sal) Sacarosa 0.1 M: 0.4°C, otros excipientes de acuerdo con el encabezado de la tabla.

La tendencia observada, que la posición de los aniones en la serie de Hofmeister no afecta el incremento de la Tm de rFSH con la adición de diferentes sales de sodio, también se encuentra para el potasio (véase la Tabla 8 y la Tabla 9) . Teniendo la misma precaución, en general el anión influye solo en el cambio en la Tm de rFSH a un grado menor y nunca de acuerdo con la serie de Hofmeister.

Muy sorprendentemente, los cationes, por otra parte, influyen en la Tm de rFSH. Más específicamente, la sales con un catión monovalente exhiben en general una Tm de rFSH más alta que los iones divalentes (véase la Tabla 8) . Especialmente, los iones de metales alcalinos monovalentes dan origen a una Tm de rFSH alta. En otras palabras, los efectos estabilizantes observados (es decir, el incremento en la Tm de rFSH) con la adición de sal son muy independientes de los aniones sometidos a prueba (véase las Tablas 8 y 9) , mientras que los cationes tienen una gran influencia sobre el grado de estabilización. Las sales de potasio y sodio exhiben un efecto estabilizante particularmente grande.

Todas las soluciones anteriores sometidas a prueba tienen una concentración de sal de 0.1 M. Para investigar el efecto de la concentración de sal sobre la Tm de rFSH, las mediciones de DSC de soluciones de rFSH que contenían tres diferentes concentraciones de cloruro de sodio se investigaron. El efecto estabilizante con la adición de sal a una solución de rFSH se observa en el intervalo completo de la concentración de sal sometida a prueba (véase la Tabla 10) .

Tabla 10: Cambio en la temperatura de desnaturalización, ??p, (Sai) , para muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 con la adición de diferentes concentraciones de cloruro de sodio. ??p? (Sai) = Tm (sal) - Tm (sin sai) *Calculado a partir de mediciones de DSC realizadas con una velocidad de exploración de 1.0°C/min.

** Calculado a partir de mediciones de DSC realizadas con una velocidad de exploración de 2.0°C/min.

Las patentes existentes sobre formulaciones de FSH utilizan por ejemplo sacarosa como estabilizadores para FSH. La adición de sacarosa 0.1 M a una solución de rFSH produce un pequeño cambio en la Tm de rFSH (véase la Tabla 8 y la Tabla 9) , lo que indica que el efecto estabilizante de la rFSH con la adición de sales de potasio o sodio es notablemente más alto que el efecto obtenido con la adición de sacarosa.

Efecto de la Adición de Varias Sales a Soluciones con un Conservador agregado sobre la Tm de rFSH Es bien sabido que la adición de conservadores a soluciones proteicas disminuye la estabilidad de proteínas en solución. Sin embargo, para una formulación acuosa de múltiples dosis dirigida al uso parenteral, un conservador es un requerimiento. Por lo tanto, es de gran importancia compensar la disminución en la estabilidad de proteínas con la adición de un conservador mediante la adición de estabilizadores, como sales, a las soluciones de rFSH.

Tabla 11: Temperatura de desnaturalización, Tm, y cambios en la temperatura de desnaturalización, ATm (conservador) y &Tm (sai) para la muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 5 mg/ml de fenol, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 y sal 0.1 M como se proporciona en la tabla. este docume to ATm (conservador) = (conservador) ~ Tm (sin conservador) ??p, (sal)* = m (sal) - Tm (sin sal) *Para las soluciones de rFSH que contienen 5 mg/ml de fenol Como se puede observar en la Tabla 11, la adición de un conservador a una solución de rFSH da por resultado la disminución de la temperatura de desnaturalización de rFSH con 2-3°C. La adición de sal a soluciones conservadas de rFSH incrementa la temperatura de desnaturalización de rFSH con alrededor de 5°C. En otras palabras, el efecto desestabilizante observado con la adición de un conservador a una solución de rFSH es bien compensado por la adición de una sal definida por la invención. Realmente, la adición de sal a soluciones de rFSH que contienen fenol no solo neutraliza el efecto del conservador sobre la Tm de rFSH, realmente incrementa la Tm en comparación con la rFSH en solución acuosa sin la adición de un conservador o sal (véase la Tabla 11) .

EFECTO DE LA ALTERACIÓN DEL pH SOBRE LA Tm DE rFSH Para estudiar el efecto del pH sobre la Tm de rFSH con y sin la adición de sales estabilizadoras, la temperatura de desnaturalización de rFSH se determinó a un pH de 5.5, 6.5 y 7.5 con y sin la adición de tres diferentes sales de sodio (véase la Tabla 12) .

Tabla 12: Temperatura de desnaturalización, Tm, a diferentes pHs para muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM y sal 0.1 M. En este documento ATm (sal) = Tm (sal) - Tm <sin 3£a) Como se puede observar en la Tabla 12 , las tendencias generales en la Tra de rFSH con la adición de diferentes sales de sodio es la misma sobre el intervalo completo de pH de 5.5 a 7.5, es decir, la desviación del efecto estabilizante/desestabilizante de sales de acuerdo con la serie de Hofmeister se observa en todos los pHs sometidos a prueba.

En el intervalo de pH investigado, las temperaturas de desnaturalización de las rFSH observadas son crecientes con el incremento del pH en soluciones, con y sin la adición de sal (véase la Tabla 12) . El incremento real en la temperatura de desnaturalización de rFSH con la adición de sales, A m(sal) , es ligeramente más bajo a pH más alto (véase la Tabla 12) .

EFECTO DE LA SIALILACION DE rFSH SOBRE LA Tm DE rFSH Como se ha mostrado anteriormente, la influencia de la adición de sales a una solución de rFSH no sigue del todo la serie de Hofmeister descrita anteriormente, donde se espera que las sales de iones de perclorato desestabilicen proteínas (produzcan una Tm más baja de proteínas) y se espera que los iones de sulfato estabilicen proteínas (produzcan una Tm más alta de proteínas) .

Puesto que la rFSH es una proteína glicosilada, que tiene numerosos residuos de ácido siálico unidos a las porciones de azúcar y por lo tanto una carga negativa neta bastante alta, se investigó el efecto del ácido siálico sobre el comportamiento estabilizante inesperado de las sales .

Para estudiar el efecto del ácido siálico sobre la Tm de rFSH con la adición de diferentes sales, el ácido siálico se retiró enzimáticamente . La rFSH desialilada luego se analizó por medio de DSC, con y sin la adición de sal .

Para verificar que los residuos de ácido siálico se retiraron exitosamente, la muestra de rFSH antes y después de la remoción enzimática de ácido siálico se analizó por medio de MALDI-ToF MS .

Bajo las condiciones acidas de la muestra de MALDI-ToF MS, las subunidades alfa y beta se disocian y por lo tanto se miden por separado. El peso molecular promedio de la subunidad alfa antes del tratamiento con sialidasa es 15000 Da. Después del tratamiento con sialidasa, el peso molecular promedio es 14000 Da. El peso molecular promedio de la subunidad beta antes del tratamiento con sialidasa es 18000 Da y 17000 Da después del tratamiento con sialidasa. El cambio en la masa para ambas subunidades es un resultado de la remoción de ácidos siálicos lo cual da por resultado la reducción de masa. Prácticamente todos los residuos de ácido siálico se retiraron de la rFSH durante la desialilación.

El incremento de la Tm de rFSH con la adición de sulfato de sodio o perclorato de sodio sigue la misma tendencia para la rFSH no modificada y la rFSH desialilada, es decir, el efecto estabilizante (incremento en la Tm de rFSH) observado no sigue la serie de Hofmeister descrita anteriormente. En general la Tm observada es 2-6°C más baja para la rFSH desialilada que para la rFSH no modificada (véase la Tabla 13) . El efecto estabilizante observado con la adición de una sal también es más baja para la rFSH desialilada que para la rFSH no modificada (véase la Tabla 13) .

Se espera la Tm más baja obtenida para la rFSH desialilada que para la rFSH no modificada, puesto que se cree que la presencia de ácido siálico en las porciones de azúcar en la rFSH incrementa la estabilidad de rFSH.

El hecho de que tanto la rFSH no modificada como la rFSH desialilada siguen la misma tendencia (desviación del efecto estabilizante/desestabilizante de acuerdo con la serie de Hofmeister) con la adición de varias sales, comprueba que no es la presencia de ácidos siálicos en la rFSH per se lo que da origen a este efecto.

Tabla 13: Temperatura de desnaturalización, Tm, para muestras de rFSH y rFSH desialilada que contienen 2.4 mg/ml de rFSH o 2.4 mg/ml de rFSH desialilada, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 5.5 y sal 0.1 M. En este documento, ATm (sal) = Tm (aal) - Tm <ain sai) CONCLUSIONES El efecto desestabilizante (disminución de la Tn de rFSH) observado para la rFSH con la adición de un conservador corresponde bien con el conocimiento del estado de la técnica dentro del área.

Sin embargo, la desviación observada de la serie de Hofmeister en la temperatura de desnaturalización de rFSH con la adición de sales con diferentes aniones es inesperada. De acuerdo con la serie de Hofmeister (la cual clasifica sales de acuerdo con sus efectos generales sobre la solubilidad y estabilidad de proteínas) , los aniones cosmotrópicos como sulfato estabilizan normalmente proteínas (producen una Tm más alta) mientras que los aniones caotrópicos como perclorato desestabilizan proteínas (producen una Tm más baja) . En este estudio, todos los aniones sometidos a prueba que tienen el mismo catión, exhiben un incremento similar en la temperatura de desnaturalización de rFSH. Muy contrario a la predicción déla serie de Hofmeister, las sales de iones de perclorato exhiben el incremento más grande en la temperatura de desnaturalización de rFSH.

En otras palabras, , el efecto estabilizante observado (es decir, el incremento en la Tm de rFSH) con la adición de sal es muy independiente de los aniones sometidos a prueba. Las sales de sodio y potasio exhiben un efecto estabilizante particularmente grande. Especialmente, la adición de perclorato de sodio a una solución de rFSH da origen a un gran incremento en la temperatura de desnaturalización de rFSH. Sin embargo, los percloratos son en general sumamente reactivos y son agentes oxidantes y por lo tanto los percloratos no están aprobados como ingredientes inactivos en formulaciones farmacéuticas.

El efecto estabilizante inesperado que se obtiene para la rFSH con la adición de sales no puede ser explicado por la presencia de ácido siálico en las porciones de azúcar de rFSH. Las determinaciones de la temperatura de desnaturalización de rFSH sobre la rFSH desialilada exhiben las mismas tendencias en el efecto estabilizante sobre la rFSH con la adición de sales como rFSH no modificada.

Ejemplo 3 - Estabilidad en tiempo real en soluciones de rFSH PROPÓSITO DEL ESTUDIO El objetivo de este estudio fue establecer si la estabilidad en tiempo real de rFSH en varias formulaciones sigue la misma tendencia que aquella observada en las mediciones de la temperatura de desnaturalización de rFSH por medio de DSC líquida como se describiera en el Ejemplo 2 y también los cambios en la estructura secundaria de rFSH con el calentamiento medidos con la espectroscopia de CD, como se describiera en el Ejemplo 1.

La estabilidad estructural de la rFSH durante el almacenamiento, medida como hasta que grado la rFSH es propensa a disociarse en sus monómeros se determina en este estudio.

La estabilidad de formulaciones de 600 IU/ml de rFSH después del almacenamiento a dos diferentes temperaturas de almacenamiento se estudió en condiciones a largo plazo a 5 + 3°C/RH ambiental y aceleradas a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH durante 6-12 meses. Todos los frasquitos se almacenaron en posición invertida. Los controles de placebo que contenían las formulaciones correspondientes pero sin rFSH agregada se almacenaron bajo las mismas condiciones descritas para la rFSH activa.

PRODUCTO A SER ESTUDIADO INFORMACIÓN DEL LOTE La rFSH, lote de sustancia farmacológica no. 08800060 y lote no. 09800020 fue manufacturada por Bio-Technology General (BTG) , Israel.

La determinación de la actividad biológica de los lotes anteriores de rFSH se realizó de acuerdo con la Farmacopea Europea .

MATERIALES Excipientes Una lista de los excipientes utilizados en este estudio se describe en la Tabla 14.

Tabla 14: Lista de excipientes Sistema de Recipiente y cerramiento Los materiales de empaque primarios utilizados se listan en la Tabla 15.

Tabla 15: Sistema de Recipiente/cerramiento Artículo Descripción Proveedor Recipiente Frasquitos de vidrio de borosilicato incoloro ISO-GmbH Tipo 1 Ph. Eur., 2R Caucho Tapón de clorobutilo de 13 mm 4432/50 B2-40 West Pharmaceutical Services revestido, FluoroTecMR Tapa Tapa de aluminio y tapa de plástico (Flip off"") West Pharmaceutical Services La composición de las soluciones madre de rFSH y las diferentes formulaciones (rFSH y placebo) se listan en las Tabla 16, Tabla 17 y Tabla 18. Excepto por la formulación que no contiene ningún estabilizador/agente de tonicidad, la concentración del estabilizador/agente de tonicidad se ajusta para proporcionar soluciones isotónicas .

Tabla 16: Composición de soluciones madre de rFSH Lote Concentración de rFSH Vehículo 08800060 16235 lU/mg 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.7 mg/ml 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en Fosfato ácido de disodio 1 m pH 6.7-6.8 09800020 13223 lU/mg 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.7 mg/ml 0.005 mg/ml de Polisorbato 20 en Fosfato ácido de disodio 1 mM pH 6.7-6.8 Tabla 17 : Composición de las formulaciones de rFSH Estabilizador/ rFSH . Amortiguador Surfactante Conservador Antioxidante agente de tonicidad 600 Fosfato 20 0.005 mg/ml de - 0.5 mg/ml de 15 mg/ml de lU/ml mM pH 6.5* Polisorbato 20 L-metionina Na2S04 600 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 14 mg/ml de lU/ml pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina Na2S04 600 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 7 mg/ml de lU/ml pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina NaCI 600 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 75 mg/ml de lU/ml pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina Sacarosa 600 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- - lU/ml pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina *E1 pH : se refiere al pH de la solución final Tabla 18: Composición de las formulaciones de placebo Estabilizador/ Amortiguador Surfactante Conservador Antioxidante agente de tonicidad Fosfato 20 mM 0.005 mg/ml de - 0.5 mg/ml de L- 15 mg/ml de pH 6.5* Polisorbato 20 metionina Na2S04 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 14 mg/ml de pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina Na2S04 Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 7 mg/ml de NaCI pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- 75 mg/ml de pH 6.5* - Polisorbato 20 Fenol metionina Sacarosa Fosfato 1 mM 0.005 mg/ml de 5 mg/ml de 1 mg/ml de L- - pH 6.5* Polisorbato 20 Fenol metionina *E1 pH se refiere al pH de la solución final PROCEDIMIENTO DE MANUFACTURA Todas las soluciones (Tabla 17 y Tabla 18) son manufacturadas a escala de laboratorio en Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca. El procedimiento de manufactura se resume a continuación.

Preparación de formulaciones de rFSH y placebo Las soluciones madre de todos los excipientes se preparan en agua Milli-QMR.

Para la preparación de formulaciones de placebo, las soluciones madre de cada excipiente se mezclan para obtener las concentraciones proporcionadas en la Tabla 18. Antes de la dilución a un volumen, el pH de cada formulación se ajusta, cuando es necesario.

Para la preparación de formulaciones de rFSH, una solución de dilución se prepara a partir de la solución madre de cada experimento. El pH de las soluciones de dilución se ajusta. Las soluciones de dilución se mezclan con la solución madre de rFSH (véase la Tabla 16) para producir las concentraciones finales listadas en la Tabla 17.

Filtración en condiciones estériles y llenado aséptico Las formulaciones finales son filtradas en condiciones estériles utilizando filtros de PVDF 0.22 µp? (Millipore) . Las formulaciones de placebo se filtran en condiciones estériles en botellas de vidrio esterilizadas en autoclave utilizando filtros StericupMR. Las formulaciones de rFSH se filtran en condiciones estériles en vasos de precipitados de vidrio esterilizados en autoclave utilizando filtros Sterivex-GVMR y jeringas estériles Luer LockMR de 20 mi (Braun) . La filtración en condiciones estériles, el llenado y sellado de frasquitos se realizan en un banco LAF utilizando frasquitos esterilizados en autoclave y tapones de caucho. Antes y después del llenado, los frasquitos son purgados con nitrógeno gaseoso, pasando a través de un filtro de PFTE Millex-FGMR 0.20 µa? (Millipore) durante por lo menos 6 segundos. Los frasquitos se llenan con 1.5 mi de muestra por frasquito. Todos los frasquitos se llenan de manera aséptica y se. cierran inmediatamente con tapones de caucho y tapas de aluminio flip-offR.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Las muestras que contienen 600 IU/ml de rFSH y placebo se almacenan durante 6-18 meses a 5 ± 3°C/RH ambiental. Además, las muestras se almacenan durante 6-18 meses en condiciones aceleradas, 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH. A cada temperatura de almacenamiento, los frasquitos se almacenan en posiciones invertidas. Todos los frasquitos se protegen de la luz .

PROGRAMAS DE ESTABILIDAD Los programas de estabilidad para 600 IU/ml de rFSH y placebo se representan en la Tabla 19 a continuación.

Tabla 19: Programa de estabilidad para la formulación líquida de 600 IU/ml de rFSH y placebo, almacenada en posición invertida Tiempo de almacenamiento (meses) Condición de almacenamiento 0 1 3 6 12* 18* 5 ± 3°C/RH ambiental X X X X 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH X X X X X X - Ninguna prueba programada de acuerdo con el programa estabilidad * Sometido a prueba únicamente para algunas formulaciones MÉTODOS ANALÍTICOS El método analítico utilizado en este estudio describe a continuación. En cada ocasión de prueba , frasquitos de rFSH y 1 frasquito de placebo correspondiente se analizarán para cada formulación.

FORMAS DE BAJO PESO MOLECULAR (LMW) Las formas de LMW de rFSH se determinan por medio de LC-UV utilizando la elución isocrática en una columna de exclusión de tamaño (SEC) . El análisis se realiza utilizando una columna basada en sílice con amortiguador TRIS como fase móvil y la detección de radiación UV. Las formas de LMW de rFSH son picos que eluyen con un peso molecular más bajo (después) que aquel del pico principal dé rFSH. Las formas de LMW se determinan como el porcentaje de área de pico del área de pico total.

Para las muestras que contienen conservador, el conservador se retira de la solución de muestra antes de entrar a la columna de exclusión de tamaño.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN DISOCIACIÓN DE LA rFSH DURANTE EL ALMACENAMIENTO Puesto que la rFSH pierde su bioactividad con la disociación de los monómeros acoplados no covalentemente , una manera directa de seguir la pérdida de la actividad de rFSH debido a la disociación de monómeros es medir la cantidad de la forma de LMW de rFSH en solución. Esta información se puede recuperar de la cromatografía SEC, donde el pico de formas de LMW que se eluye después del pico principal de rFSH se sabe que se origina de la rFSH disociada .

Tabla 20: La cantidad relativa de rFSH de formas de LMW (%) determinada por medio de SEC después del almacenamiento a 30 ± 2°C/65 + 5% de RH. La descripción completa de todas las formulaciones se lista en la Tabla 17 .P. No realizado Tabla 21: La cantidad relativa de rFSH de formas de LMW (%) determinada por medio de SEC después del almacenamiento a 5 + 3°C/RH ambiental. La descripción completa de todas las formulaciones se lista en la Tabla 17 N.P. No se realizó Como se puede observar en la Tabla 20, la solución de rFSH recientemente preparada que contiene un estabilizador diferente, con y sin un conservador agregado revela una cantidad relativa, similar de rFSH disociada (formas de LMW) . Puesto que el límite de cuantificación del método de SEC es 3% ninguna diferenciación clara entre las formulaciones se puede realizar por debajo de este límite, lo que significa que las diferencias observadas en las formas de LMW en el punto de tiempo inicial están dentro de los límites de la variación del método.

Ya después del almacenamiento durante un mes a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH, la cantidad relativa de rFSH disociada ha incrementado para las muestras que contienen fenol junto con sacarosa o sin estabilizador, mientras que las muestras que contienen sulfato de sodio o cloruro de sodio no exhibieron ningún incremento significativo en la rFSH disociada (véase la Tabla 20) .

Después del almacenamiento durante seis meses a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH, las muestras de rFSH que contienen fenol sin estabilizador agregado contienen más de 20% de rFSH disociada (formas .de LMW) . Las muestras de rFSH que contienen fenol que tienen sacarosa como estabilizador también exhiben un incremento notable de rFSH disociada (más de 10% de rFSH disociada) , mientras que las muestras que contienen fenol estabilizadas con ya sea cloruro de sodio o sulfato de sodio solo exhiben un pequeño incremento en la rFSH disociada (véase la Tabla 20) . Las muestras que no contienen ningún conservador son más estables hacia la disociación durante el almacenamiento; sin embargo, para una formulación acuosa de múltiples dosis dirigida al uso parenteral, se requiere la adición de un conservador, por lo tanto esta formulación solamente se agrega como una comparación .

Después del almacenamiento durante seis meses a 5 ± 3°C/RH ambiental, ninguna de las formulaciones de rFSH sometidas a prueba revela un incremento en la cantidad relativa de rFSH disociada (véase la Tabla 21) . Sin embargo, el almacenamiento durante por lo menos 24 meses a 5°C y un mes concomitante, preferiblemente el almacenamiento durante 3-4 meses a temperatura ambiente, se requiere para que un producto comercial de rFSH sea exitoso .

TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN DE rFSH, CAMBIOS EN LA ESTRUCTURA SECUNDARIA Y GRADO DE DISOCIACIÓN Puesto que el propósito de este ejemplo fue determinar la correlación entre los datos de estudio de estabilidad en tiempo real, determinaciones de la temperatura de desnaturalización de rFSH por medio de DSC y datos de estructuras secundarias de rFSH determinados por medio de la espectroscopia de CD, parte de los datos de DSC (véase el Ejemplo 2) y parte de los datos de CD (véase el Ejemplo 1) se presentan a continuación. Todos los detalles sobre los resultados presentados de DSC se proporcionan en el Ejemplo 2 y los detalles sobre los datos de CD se proporcionan en el Ejemplo 1.

Tabla 22: La cantidad relativa de rFSH (%) de formas de LMW determinada por medio de SEC después del almacenamiento durante 6 meses a 30 + 2°C/65 + 5% de RH y la temperatura de desnaturalización de rFSH, Tm, determinada por medio de DSC. En el estudio de DSC, la concentración de los estabilizadores se mantiene a 0 . 1 M para todas las soluciones sometidas a prueba en comparación con la cantidad utilizada en el estudio de estabilidad en tiempo real proporcionada en la tabla Como se puede observar en la Tabla 22, , la temperatura de desnaturalización de rFSH obtenida por medio de DSC se correlaciona bien con los datos de estabilidad en tiempo real después del almacenamiento durante seis meses a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH, una correlación similar entre DSC y estabilidad en tiempo real analizada por medio de SEC ha sido presentada previamente para anticuerpos recombinantes y glicoproteínas recombinantes (véase por ejemplo Burton y colaboradores (2007), Pharm, Dev. Technol . 12:265-273 y Remmele y colaboradores (1998), Pharm. Res. 15:200-208). La solución de rFSH sin conservador agregado estabilizada con sulfato de sodio exhibe solo un bajo grado de rFSH disociada después del almacenamiento durante seis meses, también exhibe una temperatura de desnaturalización significativamente más alta que las soluciones que contienen un conservador. Se¦ puede observar además que para las soluciones que contienen un conservador (fenol) la adición de una sal, ya sea cloruro de sodio o sulfato de sodio, produce un grado significativamente más bajo de rFSH disociada después del almacenamiento durante seis meses que las soluciones que contienen sacarosa o no contienen estabilizador. La temperatura de desnaturalización para la rFSH sin estabilizador agregado también es significativamente más baja que la Tm de rFSH para soluciones que contienen sal. La temperatura de desnaturalización de rFSH para soluciones que contienen sacarosa con la adición de fenol no ha sido determinada, sin embargo, como se puede observar en la Tabla 23, las mediciones de la rm de rFSH para soluciones sin conservador agregado exhiben la misma tendencia que los datos de estabilidad en tiempo real después del almacenamiento durante seis meses a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH (véase la Tabla 22) . En conclusión, el NaCl y el Na2S04 son estabilizadores significativamente mejores que la sacarosa hacia la degradación estructural. Esto se muestra tanto por las mediciones de Tm (véase la Tabla 23) como los datos de estabilidad en tiempo real (véase la Tabla 22) .

Tabla 23: La temperatura de desnaturalización de rFSH, Tm/ para soluciones sin conservadores agregados determinada por medio de DSC; para más detalles véase el Ejemplo 2 Tabla 24: Cambio en la temperatura de desnaturalización, ATm para las muestras de rFSH que contienen 2.4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 cuando se agrega conservador o sal como se lista en la tabla. Velocidad de exploración 2°C/min. ATm = Tm <Conservador/eai> - m (sin adición) No se han determinado los datos de estabilidad en tiempo real para soluciones que contienen alcohol bencílico como conservador, sin embargo, cuando se compara la temperatura de desnaturalización de rFSH determinada por medio de DSC y los cambios en la estructura secundaria de rFSH con el calentamiento determinados con la espectroscopia de CD, se observa la misma tendencia (véase la Tabla 24) . La estructura secundaria de rFSH para diferentes muestras de proteínas ha sido determinada; la estructura secundaria determinada a 24 °C se puede considerar como la estructura nativa y en este documento no se pueden observar diferencias en la estructura secundaria de rFSH para soluciones de rFSH con la adición de ya sea alcohol bencílico (a 0.17 mg/ml) o sulfato de sodio. Sin embargo, cuando se calientan las soluciones a 76.5°C, la pérdida observada en la estructura secundaria de rFSH varía con los excipientes agregados. La adición de un conservador (alcohol bencílico) da origen a una pérdida más grande de estructura secundaria de rFSH que para las soluciones de rFSH que no contienen ningún conservador, mientras que la adición de una sal (sulfato de sodio) produce una pérdida similar de la estructura secundaria de rFSH que para las soluciones de rFSH sin una sal agregada. Una pérdida de la estructura secundaria de rFSH ordenada se puede interpretar como una desnaturalización parcial o completa de la proteína .

Ejemplo 4 - Datos de Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) para hCG La Gonadotropina Coriónica Humana (hCG) es una proteína heterodimérica que consiste de dos monómeros glicosilados : una subunidad a de 92 aminoácidos la cual es común para la hCG, Hormona Estimuladora de Folículos (FSH) , • Hormona Luteinizante (LH) y Hormona de Estimulación de Tiroides (TSH) y una subunidad ß de 145 aminoácidos la cual es específica para la hCG. Las hormonas de glicoproteínas , que comprenden la FSH y la hCG, liberan todas su bioactividad con la disociación de los monómeros acoplados no covalentemente . Los resultados de análisis de estabilidad han indicado que la inestabilidad de FSH recombinante (rFSH) se basa principalmente en la disociación de dímeros (descomposición de la estructura cuaternaria y disminución concomitante en la respuesta de inmunoenlace) .

El objetivo de este ejemplo es establecer si la dependencia observada previamente de varios azúcares y sales en la temperatura de desnaturalización de rFSH, determinada con la DSC, y descrita en los ejemplos 1 - 3 anteriores, también se observa para la proteína muy similar hCG. Adicionalmente , la temperatura de desnaturalización de DSC para la hCG determinada en este estudio se compara con los datos de estabilidad en tiempo real publicados previamente (Samaritani, F. 1995, hCG liquid formulations . EP 0 814, 841) .

La temperatura de desnaturalización de la hCG se estudió en presencia y ausencia de 0.1 M de varias sales sódicas o sacarosa en un amortiguador de fosfato 1 mM que contiene 0.5 mg/ml de L-metionina y 0.005 mg/ml de Polisorbato 20. Cuatro diferentes azúcares y sales se investigan; sacarosa, sulfato de sodio, cloruro de sodio y perclorato de sodio.

Gonadotropina Coriónica humana derivada de la orina (hCG) Se utilizó la hCG, sustancia farmacológica, lote no. 2823287510 (7059 IU/mg) purificada de orina humana de Massone S.A., Argentina. El material se almacenó refrigerado a 2-8°C.

La determinación de la actividad biológica del lote anterior de hCG se realizó de acuerdo con la Farmacopea Europea.

La rFSH y materiales adicionales se utilizaron como se describiera en los Ejemplos 2-3.

Tabla 25: Lista de excipientes La composición de las diferentes formulaciones de hCG se lista en la Tabla 26.

Tabla 26: Composición de las formulaciones de hCG *Corresponde a 35 300 IU/ml para este lote.

PROCEDIMIENTO DE MANUFACTURA Todas las soluciones (Tabla 26) son manufacturadas a escala de laboratorio en Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca.

Preparación de formulaciones de hCG Las soluciones madre de todos los excipientes se preparan en agua Milli-QMR. Las soluciones de placebo con los diversos excipientes se preparan a partir de la solución madre. La sustancia farmacológica de hCG se disuelve en las soluciones de placebo para obtener las concentraciones proporcionadas en la Tabla 26. Puesto que los datos de estabilidad para esas formulaciones no estuvieron disponibles, los análisis de DSC se realizan siempre en muestras preparadas recientemente; dentro de una hora desde la preparación de la muestra.

Como se puede observar en la Figura 4 y la Tabla 27, la temperatura de desnaturalización, Tm, para la hCG es más baja que la Tm para la rFSH. Adicionalmente, la entalpia del proceso de desnaturalización (es decir el tamaño del pico de desnaturalización) es notablemente más pequeña para la hCG que para la rFSH. A diferencia de la rFSH donde el proceso de desnaturalización es casi completamente irreversible después de calentar las muestras de rFSH a 100 °C, el proceso de desnaturalización después de calentar la hCG a 100 °C es reversible, a un grado mayor (2)..

Nativo <-> Desplegado ? Desnaturalizado Irreversiblemente (2) Una explicación para el hecho de que el proceso de desnaturalización de hCG es reversible, a un grado mayor, en el período de tiempo de las mediciones de DSC, mientras que esto no es cierto para la rFSH, podría ser si las dos subunidades en la hCG son menos propensas a disociarse que en la rFSH. Si las subunidades no se disocian mientras se calientan las muestras de hCG, podría ser más fácil que la estructura nativa se reformara nuevamente con el enfriamiento a temperatura ambiente. La magnitud de ?? para la transición con el calentamiento a 100 °C es notablemente más grande para la rFSH que para la hCG, mientras que la magnitud de ?? para la transición en una exploración concomitante (es decir el calentamiento de la muestra a 100 °C, el enfriamiento a 25 "C y la realización de una segunda exploración a 100 °C) está en el mismo intervalo de tamaño para la rFSH y la hCG.

EFECTO DE LA ADICIÓN DE AZÚCAR O SAL SOBRE LA TM DE hCG Y rFSH Se espera que la adición de sal a soluciones proteicas, acuosas influya en la estabilidad de la proteína en solución y por lo tanto afecte la temperatura de desnaturalización de proteína.

Cuando se mide el efecto de varias sales de sodio sobre la Tm de hCG y rFSH, muy sorprendentemente, el efecto estabilizante/desestabilizante esperado de acuerdo con la serie de Hofmeister no se observa cuando se varían los aniones, véase la Figura 5 , Figura 6 y Tabla 27. Para la hCG, tanto el sulfato de sodio como el cloruro de sodio son realmente desestabilizadores de la proteína, mientras que para la rFSH estas sales estabilizan la proteína. Para tanto la hCG como la rFSH, el perclorato de sodio, el cual se espera que tenga un efecto desestabilizante sobre proteínas, incrementó realmente la Tm de la mayoría de los azúcares y sales sometidos a prueba.

Tabla 27: Temperatura de desnaturalización, Tm, y cambio en la temperatura de desnaturalización, ÁTm (azúcar/sal) , para las muestras de hCG que contienen 5 mg/ml de hCG, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 M pH 6.5 con la adición de azúcar o sal 0.1 M y muestras de rFSH que contienen 2. 4 mg/ml de rFSH, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5 con la adición de azúcar o sal 0.1 M. ATm (azúcar/sal) = (azücar sai) - Tltl (sin azúcar/sal) EFECTO DE LA ADICIÓN DE AZÚCAR O SAL SOBRE LA PUREZA DE HCG RFSH Disociación de Subunidades de rFSH, Pureza de rFSH Durante el Almacenamiento Puesto que la rFSH libera su bioactividad con la disociación de los monómeros acoplados no covalentemente, una manera directa para seguir la pérdida de actividad de rFSH debido a la disociación de monómeros es medir la cantidad de formas de LMW de rFSH en solución. Esta información se puede recuperar de la cromatografía SEC, donde se sabe que la elución de formas de LMW después del pico principal de rFSH se origina de la rFSH disociada.

En la formulación estudiada, no se observan otros compuestos relacionados con proteínas, tales como agregados de rFSH. Por lo tanto, la pureza de proteínas de rFSH se puede calcular como Pureza(%) = 100% - formas de LMW (%) ( 4 ) Tabla 28: Pureza de rFSH (%) determinada por medio de SEC después del almacenamiento a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH Como se puede observar en la Tabla 28, las soluciones de rFSH preparadas recientemente que contienen diferentes azúcares o sales, con y sin un conservador agregado, revelan una pureza similar, es decir, cantidades relativamente similares de rFSH disociada (formas de LMW) .

Ya después del almacenamiento durante un mes a 30°C, la pureza de rFSH disminuye para las muestras que contienen fenol junto con sacarosa o sin azúcar o sal, mientras que las muestras que contienen fenol y sulfato de sodio o cloruro de sodio junto con las muestras sin fenol agregado no exhiben ninguna disminución significativa en la pureza de rFSH (véase la Tabla 28) . Después del almacenamiento durante seis meses a 30 °C, las muestras de rFSH que contienen fenol sin azúcar o sal agregado producen una pureza de rFSH menor que 80%. Las muestras de rFSH que contienen fenol que tienen sacarosa como estabilizador también exhiben una disminución notable en la pureza de rFSH, mientras que las muestras que contienen fenol estabilizado ya sea con cloruro de sodio o sulfato de sodio solo exhiben una pequeña disminución en la pureza de rFSH (véase en la tabla 28) . Las muestras que no contienen ningún conservador son más estables hacia la disociación durante el almacenamiento, es decir exhiben la pureza más alta, sin embargo, para una formulación acuosa de múltiples dosis dirigida al uso parenteral se requiere la adición de un conservador.

Pureza de la hCG Durante el Almacenamiento Los datos publicados previamente sobre cambios en la pureza de hCG en almacenamiento se utilizan como una comparación para los datos de estabilidad de rFSH presentados anteriormente (Samaritani, supra.) . Ya después del almacenamiento durante un mes a 50 °C, la pureza de hCG disminuye notablemente. La disminución es significativamente más alta para muestras que contienen cloruro de sodio que para muestras que contienen sacarosa (véase la Tabla 29) . Después del almacenamiento durante seis meses a 50 °C, la pureza de hCG de muestras que contienen cloruro de sodio es más de 10% más baja que para las muestras que contienen sacarosa.

Tabla 29: La pureza de hCG (%) determinada por medio de SEC después del almacenamiento a 50 °C. La descripción completa de las formulaciones se lista en la página 11 en la patente EP 0814841 COMPARACIÓN DE TM Y PUREZA DE hCG Y rFSH Como se puede observar en la Tabla 30, la temperatura de desnaturalización tanto de rFSH como de hCG obtenida por medio de DSC se correlaciona bien con la pureza de rFSH y hCG obtenida a partir de datos de estabilidad en tiempo real. Una correlación similar entre la DSC y la estabilidad en tiempo real analizada por medio de SEC ha sido presentada previamente para anticuerpos recombinantes y glicoproteínas recombinantes.

Los datos de estabilidad en tiempo real para la rFSH se determinan a 30°C. Puesto que el producto de rFSH está dirigido al almacenamiento refrigerado a largo plazo, 25-30°C es un intervalo adecuado para los estudios de estabilidad acelerados. Los datos de estabilidad en tiempo real para la hCG solo están disponibles para el almacenamiento durante hasta 12 semanas a 50°C, almacenamiento durante 11 semanas a 25°C y 40°C y almacenamiento durante 6 semanas a 50 °C. Para las temperaturas de 40°C o inferiores, la diminución en la pureza de hCG es menor que 6% durante el almacenamiento para las formulaciones tanto con sacarosa como con cloruro de sodio y por lo tanto es difícil diferenciar entre el efecto de varios azúcares y sales ya después del almacenamiento durante 11-12 semanas. Solo a 50°C, las diversas formulaciones se pueden diferenciar claramente, a pesar de que la tendencia observada a temperaturas más bajas es la misma que a 50°C.

Tabla 30: La pureza determinada por medio de SEC y la temperatura de desnaturalización determinada con DSC para hCG y rFSH. La pureza para hCG se determina después del almacenamiento durante 6 semanas a 50 °C y la pureza para rFSH se determina después del almacenamiento durante 6 meses a 30 °C *Muestras que contienen 10 000 IU/ml de hCG, NaCI 154 mM o sacarosa 300 mM, amortiguador de fosfato 10 mM pH 7.

**Muestras que contienen 5 mg/ml de hCG (35 300 IU/ml) , azúcar o sal 0.1 M, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5.

#Muestras que contienen 600 IU/ml de rFSH, Na2S0 43 mM o NaCI 120 mM o sacarosa 219 mM, 1.0 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, 5 mg/ml de fenol, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH 6.5.

##Muestras que contienen 2.4 mg/ml de rFSH (36 300 IU/ml), azúcar o sal 0.1 M, 0.5 mg/ml de L-metionina, 0.005 mg/ml de Polisorbato 20, amortiguador de fosfato de sodio 1 mM pH CONCLUSIONES Los estudios de la estabilidad de hCG y rFSH en varias soluciones por medio de las temperaturas de desnaturalización de hCG y rFSH asi como también las purezas de hCG y rFSH después del almacenamiento a temperaturas elevadas producen una evidencia clara para la influencia de diferentes azúcares y sales sobre la estabilidad de hCG y rFSH en solución. Las dos técnicas utilizadas, DSC líquida y cromatografía SEC, exhiben ambas resultados concordantes. Estos resultados han sido confirmados claramente por los presentes datos de estabilidad en tiempo real.

Los estudios de la estabilidad de rFSH en varias soluciones por medio de cambios en la estructura secundaria de rFSH (por medio de la espectroscopia de CD - Ejemplo 1) , la temperatura de desnaturalización de rFSH (cambios en la estructura terciaria y cuaternaria por medio de DSC Ejemplo 2) o la cantidad relativa de rFSH disociada que se forma después del almacenamiento a 30 ± 2°C/65 ± 5% de RH (cambios en la estructura cuaternaria por medio de SEC -Ejemplo 3) producen una evidencia clara para la influencia de conservadores y estabilizadores sobre la estabilidad de rFSH en solución. Las tres técnicas utilizadas, CD, DSC y cromatografía SEC exhiben resultados concordantes.

Concluyendo los resultados de lá totalidad de Ejemplos 1-3, se observa claramente que la adición de un conservador, fenol o alcohol bencílico, disminuye la estabilidad de rFSH en solución. Se espera que otros conservadores fenólicos, como m-cresol y clorocresol, den origen a efectos desestabilizantes similares. El efecto desestabilizante observado para la rFSH con la adición de un conservador corresponde bien al conocimiento del estado de la técnica dentro del área.

La adición de una sal de Na+ o K+ de metal alcalino farmacéuticamente aceptable a soluciones de rFSH neutraliza el efecto desestabilizante de conservadores sobre la rFSH y - más ventajosamente - incrementa la estabilidad de rFSH en solución en comparación con soluciones de rFSH que no contienen un conservador ni una sal. Todas las sales de sodio y potasio sometidas a prueba dan origen a una estabilidad incrementada de la rFSH independiente de los aniones utilizados; por ejemplo aniones inorgánicos como sulfato, cloruro y perclorato y también utilizando aniones orgánicos como citrato, acetato y tartrato. La variación del catión de las sales produce un gran impacto sobre el grado de estabilización de rFSH; los cationes monovalentes, específicamente sales con los cationes sodio o potasio dan origen a un efecto estabilizante pronunciado sobre la rFSH. La adición de perclorato de sodio a una solución de rFSH da origen a las soluciones de rFSH más estables, sin embargo, los percloratos son en general sumamente reactivos y por lo tanto los agentes oxidantes y percloratos no están aprobados como ingredientes inactivos en formulaciones farmacéuticas. Por lo tanto, las sales de sodio o las sales de potasio de sulfato y cloruro son los agentes estabilizadores más favorables.

La adición de sacarosa a soluciones de hCG o rFSH produce un ligero incremento en la estabilidad de proteínas, tanto para hCG como para rFSH, mientras que la adición de cloruro de sodio tiene un efecto desestabilizante sobre la hCG y un efecto estabilizante sobre la rFSH (véase el ejemplo 4). La adición de perclorato de sodio a soluciones de hCG y rFSH tiene un efecto estabilizante sobre tanto la hCG como la rFSH (ejemplo 4) . Sorprendentemente el efecto estabilizante de esas sales sobre soluciones de rFSH es claramente mejor que el efecto estabilizante observado para la sacarosa.

Las conclusiones de esos resultados son las siguientes: 1) bajo las condiciones estudiadas, los efectos de sales sobre la estabilidad de hCG y rFSH no siguen la serie de Hoffmeister. 2) a pesar del hecho de que la hCG y FSH son estructuralmente muy similares (es decir que pertenecen a la misma clase de proteínas, ambas son glicosiladas y ambas consisten de dos subunidades de las cuales la subunidad a es idéntica en las dos proteínas) , el efecto de varios azúcares y sales como sacarosa y cloruro de sodio sobre la estabilidad de proteínas es diferente para la hCG y la rFSH. Muy sorprendentemente, para las proteínas muy similares como hCG y rFSH, las sales no exhiben el mismo efecto estabilizante. 3) las sales de Na+ y K+ exhiben su efecto estabilizante sobre soluciones de FSH, independientemente de los aniones utilizados. 4) el efecto estabilizante de sales de Na+ y K+ sobre soluciones de FSH puede contrarrestar el efecto desestabilizante de los conservadores.

ABREVIACIONES Y DEFINICIONES Las siguientes abreviaciones y definiciones se utilizan por todo el texto y Ejemplos: ÁTm Cambio en la temperatura de desnaturalización con la adición de un conservador o sal, véase además Tm ARTs Tecnologías reproductivas asistidas BA alcohol bencílico BTG Bio-Technology General CD Dicroismo Circular CHO Ovario de hámster chino CoA Certificado de Análisis ADN Ácido desoxirribonucléico DSC Calorimetría de Exploración Diferencial FSD Disfunción Sexual Femenina FSH Hormona Estimuladora de Folículos hCG Gonadotropina Coriónica Humana IU Unidades Internacionales Una medida de la bioactividad de rFSH determinada por medio de un Bioensayo de ' Steelman-Pohley de acuerdo con Ph. Eur. y USP .

IUI Inseminación intrauterina LC-UV Cromatografía Líquida con detección Ultravioleta LH Hormona Luteinizante LMW forma de Bajo Peso Molecular, consiste principalmente o únicamente de una proteína monomérica disociada.

OI Inducción de Ovulación p.a. Pro-análisis Ph. Eur . Farmacopea Europea RH Humedad Relativa rFSH Hormona Estimulante de Folículos humana recombinante SEC Cromatografía de Exclusión de Tamaño SRCD Dicroismo Circular con Radiación de Sincrotrón Punto medio de la transición térmica o Punto medio de transición o Temperatura de desnaturalización La temperatura cuando la mitad de las moléculas de proteínas se pliegan y la mitad de las moléculas de proteínas se despliegan. 2-Amino-2-hidroximetil-propano-l , 3-diol Hormona Estimuladora de Tiroides Farmacopea de los Estados Unidos Ultravioleta

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables para la estabilización de una formulación líquida de FSH, en donde la sal se selecciona del grupo que consiste de sales de Na+ y sales de K+ farmacéuticamente aceptables, o una combinación de las mismas .

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde las sales son sales de Na+.

3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la sal es NaCl o Na2S04.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la sal es cloruro de sodio .

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la sal es una combinación de NaCl y Na2S04.

6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la sal está comprendida en una cantidad de 20 a 500 m , o en una cantidad de 30-300 mM o en una cantidad de 50-200 mM.

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la formulación de FSH es una formulación de rFSH.

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la formulación comprende adicionalmente un conservador.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la formulación comprende alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol.

10. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la formulación es una formulación inyectable.

11. Un método para la estabilización de una formulación líquida de FSH, caracterizado porque el método comprende el paso que consiste en una adición de sales que comprenden cationes de metales alcalinos farmacéuticamente aceptables a la formulación, en donde las sales se seleccionan del grupo que consiste de sales de Na+ y sales de K+ farmacéuticamente aceptables o una combinación de las mismas .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque las sales se definen como en las reivindicaciones 2 a 6 anteriores.

13. El método de conformidad con las reivindicaciones 11 y/o 12, caracterizado porque la FSH a ser estabilizada es rFSH.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque la formulación comprende adicionalmente un conservador.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el conservador se selecciona del grupo que consiste de alcohol bencílico, fenol y m-cresol.