BR112013002312B1 - Método para limitar a tendência de fsh em dissociar em uma formulação líquida de fsh, bem como uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis para tal finalidade - Google Patents
Método para limitar a tendência de fsh em dissociar em uma formulação líquida de fsh, bem como uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis para tal finalidade Download PDFInfo
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Abstract
método para limitar a tendência de fsh em dissociar em uma formulação líquida de fsh, bem como uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis para tal finalidade. a presente invenção refere-se ao campo de estabilização de formulações de fsh, em particular formulações de fsh líquidas. a estabilização é obtida pela adição de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis, em formas de realização preferidas pela adição de sais farmaceuticamente aceitáveis, isto é, sais de sódio ou sais de potássio.
Description
A presente invenção refere-se ao campo de estabilização de formulações de FSH, em particular formulações de FSH líquidas. A estabilização é obtida pela adição de sais, em formas de realização preferidas pela adição de sais com cátions de metal alcalino de sais farmaceuticamente aceitáveis, isto é, sais de Na ou K, ou combinações destes.
Gonadotrofinas é uma família de hormônios, que são essencialmente principalmente envolvidos no ciclo de fertilidade em fêmeas e machos. As gonadotrofinas podem ser derivadas da urina, tanto para propósitos de pesquisa quanto de tratamento, entretanto várias gonadotrofinas podem ser produzidas recombinantemente.
Em particular, as gonadotrofinas podem ser utilizadas no tratamento de infertilidade.
As quatro gonadotrofinas principais que são envolvidas aqui e que todas pertencem à mesma família de glicoproteína são hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), hormônio luteini- zante (LH) e gonadotrofina coriônica (hCG). Todas estas gonadotrofinas consistem em uma subunidade alfa e uma beta; a subunidade alfa é comum a todas, isto é, a mesma para todas as quatro gonadotrofinas mencionadas acima, enquanto a subunidade beta difere, respectivamente.
Como mencionado acima, as gonadotrofinas são um grupo de hormônios de glicoproteína heterodimérica que regulam a função gonadal no macho e na fêmea. Eles incluem hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), hormônio estimulante da tireoide (TSH) e gonadotro- fina coriônica (humana) (hCG). FSH é naturalmente secretado pela glândula pituitária anterior e funciona para suportar o desenvolvimento folicular e a ovulação. FSH com- preende uma subunidade alfa de 92 aminoácidos, também comum aos ou- beta de 111 aminoácidos única ao FSH que confere a especificidade biológica do hormônio (Pierce e Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495). Cada subunidade é pós- traducionalmente modificada pela adição de resíduos de carboidrato complexos. Ambas as subunidades carregam dois sítios para fixação de glicano N-ligado, a subunidade alfa nos aminoácidos 52 e 78 e a subunidade beta nos resíduos de aminoácido 7 e 24 (Rathnam e Saxena, (1975) Primary a- mino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem. 250 (17):6735-6746; Saxena e Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, 7 Biol Chem. 251(4): 993-1005)). FSH é assim glicosilado a cerca de 30 % em massa (Dias e Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6): 510-519; Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle- stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89). FSH purificado da urina humana pós-menopáusica foi usado por muitos anos no tratamento da infertilidade; tanto para promover a ovulação na reprodução natural quanto para fornecer oócitos para tecnologias de reprodução assistida. Duas versões recombinantes de FSH, Gonal-f (Merck Serono) e Puregon (Schering-Plough) tornaram-se disponíveis em meados de 1990. Estas são ambas expressadas em células de ovário de hamster chinês (CHO) (Howies, C.M. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191). CG é frequentemente usada em tratamentos de infertilidade por causa deste composto tendo uma atividade de LH.
Tanto FSH humano quanto hCG são heterodímeros compostos de uma subunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa em ambos os hormônios é idêntica. Diferenças entre os dois hormônios são conferidas pela subunidade beta. A subunidade beta madura de FSH é composta de 111 aminoácidos, enquanto aquela de hCG é composta de 145 aminoácidos, adicionalmente a sequência de aminoácido primária da subunidade beta de FSH e hCG são diferentes por toda a cadeia beta integral. A cadeia beta tan- to de FSH quanto de hCG contém seis pontes de dissulfeto, devido à sua sequência de aminoácido diferente, elas entretanto diferem em sua estrutura de ordem superior, resultando em uma dobra diferente e distribuição de regiões carregadas, polares e hidrofóbicas (Fox et al. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 379-89).
Embora tanto as subunidades beta de FSH quanto de hCG sejam glicosiladas, a subunidade beta de FSH contém apenas N-glicosilação (N-7 e N-24) enquanto a subunidade beta de hCG contém tanto N- quanto O-glicosilação (N-13, N-30, 0-121, 0-127, 0-132 e 0-138). A glicosilação extra na subunidade beta de hCG a torna mais hidrofilica do que aquela de FSH. Subunidades β fornecem especificidade para a interação do receptor.
Células CHO são comumente usadas para a produção de proteínas recombinantes farmacêuticas. A análise estrutural identificou que o ácido siálico é exclusivamente ligado por uma ligação 02,3, Muitas glicoproteí- nas humanas contêm uma mistura tanto de ligações α2,3 e a2,6 para resíduos de ácido siálico. Portanto, proteínas recombinantes expressadas usando o sistema de CHO diferirão de suas contrapartes naturais em seu tipo de ligações de ácido siálico terminais.
No presente contexto, "infertilidade" deve ser definida como a capacidade diminuída ou a incapacidade para engravidar e ter descendentes. Mulheres que são capazes de engravidar, mas depois têm abortos repetidos também são ditas serem inférteis. A infertilidade também é definida em termos específicos como a deficiência para engravidar depois de um ano de relações sexuais regulares sem contracepção. A infertilidade pode ser devido a muitas causas. Estudos mostraram que um pouco mais do que metade dos casos de infertilidade são um resultado de condições femininas. O res-tante é causado por distúrbios de esperma e por fatores inexplicados. Existem correntemente várias possibilidades para tratar a infertilidade.
Estas são uma relação sexual programada, o uso de tecnologias de reprodução assistida (ARTS), um manejo médico de endometriose, mio- mas e disfunção sexual feminina (FSD), e cirurgia para corrigir anormalidades.
Na tecnologia de reprodução assistida, medicamentos para estimular a ovulação são usados. Junto a LH e hCG, FSH é um destes compostos que é usado neste contexto.
Para a administração, formulações líquidas destes compostos são adequadas. Infelizmente, foi mostrado no passado que os conservantes adicionados às formulações líquidas, em particular álcool benzílico (BA), fe- nol e m-cresol, exercem um efeito desestabilizante sobre a proteína (Maa, Y.F. e Chung, C.H. 1996, Aggregation of recombinant human growth hormone induced by fenolic compounds. Int. J. Pharm. 140:155-168; Lam, X.M., Patapoff, T.W., e Nguyen, T.H. 1997, The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma. Pharm. Res. 14:725-729; Hoffmann, J.A. e Lu, J. 2002, FSH and FSH variant formulations comprising benzyl alcohol as a preservative. EP0974359B1, 1-50).
Portanto é importante fornecer uma formulação estabilizada, em particular devido ao fato de que a dosagem do FSH a ser administrado deve reduzir o risco de efeitos colaterais de formas dissociadas ou agregadas como respostas imunogênicas, se FSH não nativo estiver presente. Os eventos desestabilizantes resultantes dos conservantes, entretanto diminuem o nível real de gonadotrofina ativa, isto é, FSH, dentro de uma formulação líquida. Assim, é um objetivo da presente invenção fornecer formulações, em particular formulações líquidas de FSH, que são estáveis, assim como um método para sua estabilização.
A presente invenção pertence ao uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis para a estabilização de uma formulação de FSH líquida de modo a estabilizar uma formulação de FSH líquida. A formulação líquida a ser estabilizada pode ser uma formulação com ou sem conservante.
As seguintes formas de realização são preferidas:
1. Uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farma- ceuticamente aceitáveis para a estabilização de uma formulação de FSH líquida, em que o sal é selecionado do grupo consistindo em sais de Na+ e sais de K+ farmaceuticamente aceitáveis,, ou uma combinação destes.
2. Uso de acordo com o item 1, em que os sais são sais de Na+.
3. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 ou 2, em que o sal é NaCI ou Na2SO4.
4. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 ou 2, em que o sal é Na2SO4.
5. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 ou 2, em que o sal é uma combinação de NaCI e Na2SO4.
6. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5 em que o sal é compreendido em uma quantidade de 20 a 500 mM, ou em uma quantidade de 30 a 300 mM ou em uma quantidade de 50 a 200 mM.
7. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6 em que a formulação de FSH é uma formulação de rFSH.
8. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7 em que a formulação adicionalmente compreende um conservante.
9. Uso de acordo com o item 8 em que a formulação compreende álcool benzílico, fenol e/ou m-cresol.
10. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 a 9, em que a formulação é uma formulação injetável.
11. Método para a estabilização de uma formulação de FSH líquida em que o método compreende a etapa de uma adição de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis à dita formulação, em que os ditos sais são selecionados do grupo consistindo em sais de Na+ e sais de K+ ou uma combinação destes.
12. Método de acordo com o item 11 em que os sais são definidos como nos itens 2 a 6 acima.
13. Método de acordo com os itens 11 e/ou 12 em que o FSH a ser estabilizado é rFSH.
14. Método de acordo com qualquer um dos itens 11 a 13 em que a formulação adicionalmente compreende um conservante.
15. Método de acordo com o item 14 em que o conservante é selecionado do grupo consistindo em álcool benzílico, fenol e m-cresol.
16. Uso de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, em que a formulação líquida é uma formulação líquida reconstituída, que foi obtida de uma formulação seca por congelamento.
17. O método de qualquer um dos itens 11 a 15, em que a etapa de adicionar o sal é conduzida antes de uma etapa de secagem por congelamento.
18. O método do item 17, em que uma etapa de reconstituição é realizada depois da etapa de secagem por congelamento.
19. O método do item 17 e/ou 18 em que o sal é compreendido na formulação seca por congelamento ou em que o sal é compreendido em um líquido de reconstituição. A formulação que foi fornecida com o sal estabilizante é assim em uma forma de realização alternativa armazenada em um estado seco por congelamento. A secagem por congelamento é realizada como geralmente conhecido a uma pessoa habilitada na técnica. A formulação seca por congelamento depois pode ser armazenada até o uso final com o paciente. Antes da administração, a formulação seca por congelamento é depois reconstituída com qualquer um dos meios de reconstituição conhecidos, por exemplo, água esterilizada. O sal é compreendido na formulação seca por congelamento ou no líquido de reconstituição.
20. Uso ou método de qualquer um dos itens acima em que a formulação líquida é uma formulação de uso único ou uma formulação de dose múltipla, preferivelmente para injeção.
Em uma forma de realização preferida, o sal é compreendido na formulação líquida por si que não é seco por congelamento, mas mantido como um líquido em armazenamento.
Em particular, em uma forma de realização preferida, a presente invenção pertence à estabilização de uma formulação de FSH líquida em que o cátion de metal alcalino é selecionado do grupo consistindo em Na+ e K+. Particularmente preferido, o sal é NaCI ou Na2SO4.
Como descrito acima, formulações de FSH líquidas são adequadas para o tratamento de infertilidade. Sob este aspecto, tornou-se claro que formulações de FSH líquidas podem ser instáveis; isto é verdade para todas as formulações de FSH líquidas incluindo aquelas destinadas para uso único. A instabilidade pode ser ainda mais pronunciada se as formulações de FSH líquidas compreendem um conservante, que é.por exemplo, necessário para todas as formulações de dose múltipla. Este conservante pode ser todo conservante útil para conservar uma formulação de FSH; assim, o conservante pode ser um conservante como aprovado pela FDA para formulações de FSH, em particular,por exemplo, um conservante aprovado pela FDA, aprovado para formulações de FSH parenterais, como por exemplo álcool benzílico, fenol e/ou m-cresol; o conservante é entretanto de modo algum limitado a estes exemplos. A estabilidade de FSH é diminuída ,por exemplo, por álcool benzílico, fenol e/ou m-cresol.
Consequentemente, os sais presentemente reivindicados e descritos compreendendo cátions farmaceuticamente aceitáveis, são usados para a estabilização de formulações de FSH de uso único.
Além disso, os sais presentemente reivindicados e descritos compreendendo cátions farmaceuticamente aceitáveis, são usados para a estabilização de formulações de FSH de dose múltipla; tais formulações não precisam compreender um conservante mas também podem compreender um conservante.
A adição dos sais presentemente reivindicados compreendendo cátions farmaceuticamente aceitáveis, isto é, sais de Na+ e K+, estabiliza uma formulação de FSH líquida. Em uma forma de realização particularmente preferida, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis. A estabilização é obtida em formulações de uso único ou de dose múltipla, em particular durante um período mais longo de armazenamento e pode em uma outra forma de realização possível ser vantajosa como uma contramedida para o efeito desestabilizante de conservantes, como álcool benzílico, fenol e/ou m-cresol.
Os sais,..que podem ser usados de acordo com a presente invenção, incluem, em uma forma de realização preferida NaCI ou Na2SO4.
O sal é preferivelmente compreendido em uma quantidade de 20 a 500 mM, ainda mais preferivelmente ele é compreendido em uma quantidade de 30 a 300 mM; em uma forma de realização particularmente preferida ele é compreendido em uma quantidade de 50 a 200 mM.
A quantidade máxima de sal adicionado é limitada à osmolalida- de da solução. Para minimizar a dor na injeção, a solução deve preferivelmente ser isotônica ou pelo menos não hipertônica. Visto que todos os exci- pientes na solução contribuem para a osmolalidade, a quantidade máxima de sal que pode ser adicionado a uma solução é dependente da quantidade de outros componentes presentes.
O sal é preferivelmente compreendido em uma quantidade resultando em uma osmolalidade máxima de 350 mosmol/kg, ainda mais preferivelmente em uma quantidade resultando em uma osmolalidade máxima de 320 mosmol/kg; em uma forma de realização particularmente preferida ele é compreendido em uma quantidade resultando em uma osmolalidade máxima de 300 mosmol/kg.
Osmolalidade é um meio prático de fornecer uma medida global da contribuição dos vários solutos presentes em uma solução para a pressão os- mótica da solução. A osmolalidade pode ser medida de acordo com a Ph. Eur. 2.2.35, 7a edição, suplemento 2011 (7.2), Osmolality, 01/2008:20235.
Um "sal" no contexto da presente invenção é um composto químico derivado de um ácido substituindo-se hidrogênio, inteira ou parcialmente, com um metal ou um radical eletropositivo.
A definição de "sais com (ou compreendendo) cátions de sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a todos aqueles sais que são formados com cátions que são aprovados para liberação i.m. ou s.c. de acordo com a lista de ingredientes inativos da FDA; os cátions de metal alcalino deste grupo são sódio (Na+) e potássio (K+).
Os inventores surpreendentemente descobriram que dois cátions muito específicos são particularmente adequados para a estabilização de uma formulação de FSH.
Os sais podem assim ser formados com os seguintes cátions farmaceuticamente aceitáveis: potássio (mono-, di- ou tri-básico), ou sódio (mono- ou di- ou tri-básico). Preferivelmente, os sais são sais de sódio.
Particularmente preferidos são NaCI e Na2SÜ4.
A gonadotrofina que pode ser estabilizada de acordo com a presente invenção é FSH, isto é, hormônio folículo estimulante, opcionalmente em combinação com outros ingrediente ativos.
O FSH é FSH urinário ou derivado de plasma ou recombinante (rFSH). Em uma forma de realização preferida, o FSH é urinário ou rFSH; particularmente preferido ele é rFSH.
Como mencionado acima, agora é possível produzir FSH re- combinantemente. Assim, referência aqui a um FSH em geral sempre inclui tanto a gonadotrofina derivada urinária assim como a recombinante (r). Assim, referência ao FSH também abrange rFSH.
Em uma forma de realização preferida da invenção, a formulação é uma formulação de rFSH líquida, o mais preferivelmente injetável, que é estabilizada por Na2SO4 ou NaCI.
Em uma forma de realização preferida da invenção, a formulação é uma formulação de rFSH líquida, o mais preferivelmente injetável, que é estabilizada por Na2SO4 ou NaCI.
Em uma forma de realização alternativa, o rFSH de todas as formas de realização é um FSH de ação longa. As formulações de FSH de ação longa podem ser obtidas como geralmente conhecido a uma pessoa habilitada na técnica, por exemplo modificando-se a molécula de FSH ou modificando-se a formulação.
FSH aqui assim abrange todas as formas derivadas urinárias ou recombinantes possíveis do FSH mencionado acima assim como todas as combinações possíveis de formas de FSH. Também abrangida é uma formulação para uso único e uma ou mais formulações adicionais (da mesma gonadotrofina ou uma gonadotrofina diferente) para uso de dose múltipla.
Um produto possível pode ser uma formulação incluindo FSH (opcionalmente com CG, LH, atividade de LH etc.), todos em frascos diferen- tes. A atividade de LH, se presente, pode se originar de LH ou CG. LH pode ser substituído por uma dose equivalente de CG e vice versa; uma "dose equivalente" neste contexto pode ser calculada na base de que 1 IU de CG é equivalente a 5 a 7 IU de LH na Pharmacopeia Van Hell Bioassay (Van Hell, H etal, Acta Endocrin. 47, 409-418, 1964).
Uma combinação preferida é aquela de (r)FSH, (r)LH e (r)hCG, todos em frascos diferentes.
Combinações possíveis em diferentes frascos também incluem: FSH urinário (u) e uhCG ou uFSH e uLH; ainda (rhCG ou rLH ou rFSH) e (uhCG ou uLH ou rhCG ou rLH), e todas as permutações possíveis destes.
Uma outra combinação preferida é aquela de (r)FSH e (r)hCG, em frascos diferentes, respectivamente.
Uma outra combinação preferida é aquela de (r)FSH e (r)LH, em frascos diferentes, respectivamente.
A formulação de FSH da presente invenção é uma formulação líquida. Preferivelmente, a formulação é injetável. Formulações podem ser fornecidas como um produto tendo uma, duas ou mais composições farmacêuticas incluindo FSH ou FSH/hCG, para administração separadamente ou simultaneamente. Se administrada separadamente, a administração pode ser sequencial. O produto pode ser fornecido em qualquer embalagem apropriada. Por exemplo, um produto pode conter várias seringas pré-cheias todas incluindo FSH (uma composição de FSH), ou adicionalmente hCG (uma composição de hCG) por exemplo em que as seringas podem ser empacotadas em uma carteia ou outro meio para manter a esterilidade. Um produto pode conter opcionalmente instruções para usar as formulações de FSH. De acordo com um outro aspecto, a formulação de FSH inventiva é fornecida como uma preparação de dose múltipla. A presente invenção, entretanto, explicitamente também é dirigida a formulações destinadas para um uso único. A presente invenção também pertence a uma estabilização de formulações como parte de um kit. Um tal kit compreenderá pelo menos um recipiente, compreendendo uma ou mais doses diárias de FSH, ou por exemplo dois recipientes (por exemplo um frasco), cada um compreendendo uma go- nadotrofina diferente, e por exemplo instruções adicionais (por exemplo para administração) e por exemplo meios adicionais para injeção. Em uma forma de realização preferida, uma caneta de injeção para injeções múltiplas é u- sada, por meio da qual a solução de FSH é enchida em cartuchos respectivos.
Em uma forma de realização preferida, o FSH é compreendido com 35 a 850 IU/ml, preferivelmente 50 a 800 IU/ml, ainda mais preferido 100 a 600 IU/ml.
Uma formulação particularmente preferida para rFSH de por e- xemplo 600 IU/ml tem a composição seguinte: 600 IU/ml de rFSH 0,001 a 0,05, preferivelmente 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 0,1 a 10, preferivelmente 1,0 mg/ml de L-metionina 0,5 a 50, preferivelmente 5,0 mg/ml de fenol 1 a 100, preferivelmente 14 mg/ml de sulfato de dissódio (isto é, 0,1 M) 0,1 a 10, preferivelmente 1 mM de tampão de fosfato de sódio, (pH 6 a 8, preferivelmente pH 6,5).
A osmolalidade da solução é preferivelmente 300 mosmol/kg (O pH refere-se ao pH da solução integral.)
Formas de depósito injetáveis podem ser fabricadas formando- se matrizes microencapsuladas de FSH (e outros agentes, se presente) em polímeros biodegradáveis. As formas de depósito/sistemas de liberação prolongada com base em polímero podem, dependentes de sua natureza química, ser, por exemplo, micro- ou nano partículas, hidrogéis, micelas, emul-sões ou implantes. Dependendo da razão de FSH para polímero e da natureza do polímero particular utilizado, a taxa de liberação de FSH pode ser controlada. Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem sistemas de co- polímero de polilactida/poliglicolida, polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), po- li(anidridos), polietileno glicol), poliaminoácidos, polissacarídeos por exemplo hialuronato de sódio (NaHA) ou outros sais destes, gelatina, quitosana etc. - Todos os polímeros mencionados podem ser derivados ou modificados para otimizar a liberação do medicamento proteico ou sua estabilidade. Formulações injetáveis de depósito são também preparadas capturando-se o FSH em sistemas lipídicos, ou misturas de polímero e lipídeo como micelas, li- possomas ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.
Formulações injeções podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção bacteriana, ou incorporando-se a- gentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril exatamente antes do uso. Injeções de formulações podem ser fornecidas em qualquer recipiente adequado, por exemplo frasco, seringa pré-cheia, cartuchos de injeção, e semelhantes, como descrito acima.
O pH e concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com a prática de rotina neste campo. Ver GOODMAN e OILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 1- edição. Em uma forma de realização preferida, as composições da invenção são fornecidas como composições para administração parenteral. Métodos gerais para a preparação das formulações parenterais são conhecidos na técnica e são descritos em REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, nas páginas 780 a 820. As composições parenterais podem ser fornecidas em formulação líquida ou como um sólido que será misturado com um meio injetável estéril exatamente antes da administração. Em uma forma de realização especialmente preferida, as composições parenterais são fornecidas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.
O FSH da presente invenção pode ser derivado por meios convencionais a partir da urina ou pode ser produzido recombinantemente. Para métodos de produção possíveis é referida ainda, por exemplo, a WO 2009/127826. hCG pode ser obtida por quaisquer meios conhecidos na técnica. hCG como usado aqui inclui hCG humana derivada e recombinante. hCG .. humana derivada pode ser purificada de qualquer fonte apropriada (por e- xemplo urina e placenta) por qualquer método conhecido na técnica. Méto- dos de expressar e purificar hCG recombinante são bem conhecidos na técnica. LH pode ser obtido por quaisquer meios conhecidos na técnica. LH, como usado aqui, inclui LH humano derivado e recombinante. LH humano derivado pode ser purificado de qualquer fonte apropriada (por exemplo, urina) por qualquer método conhecido na técnica. Métodos de expressar e purificar LH recombinante são conhecidos na técnica.
A composição farmacêutica pode ser para o tratamento de infertilidade, por exemplo, para uso por exemplo em tecnologias de reprodução assistida (ARTs), indução de ovulação (Gl) ou inseminação intrauterina (II). A composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em indicações médicas onde preparações de FSH conhecidas são usadas. A presente invenção também fornece o uso da preparação de FSH estabilizada descrita aqui (de acordo com os aspectos da invenção) para, ou na fabricação de um medicamento para, o tratamento da infertilidade. As composições farmacêuticas podem ser formuladas em composições bem conhecidas para qualquer via de administração de medicamento, por exemplo, oral, retal, parenteral, transdérmica (por exemplo tecnologia de emplastro), intravenosa, intramuscular, subcutânea, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, unguentos ou gotas) ou como uma pulverização bucal ou nasal. Uma composição típica compreende um carregador farmaceuticamente aceitável, tal como solução aquosa, excipientes não tóxicos, incluindo sais e conservantes, tampões e semelhantes, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, décima quinta edição (Matt Publishing Company, 1975), nas páginas 1405 a 1412 e 1461 a 87, e o formulário nacional XIV décima quarta e- dição (American Pharmaceutical Association, 1975), entre outros.
Exemplos de carregadores, diluentes, solventes ou veículos a- quosos e não aquosos farmacêutico adequados incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), carbó- xi-metilcelulose e misturas adequadas destes, óleos vegetais (tais como óleo de oliva), e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato deetila. .
As composições também podem conter aditivos tais como mas não limitados a conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes tamponantes, e agentes dispersantes. Agentes antibacterianos e antifúngicos podem ser incluídos para impedir o crescimento de micróbios e incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenóis, ácido sórbico, e se- 5 melhantes. Além disso, pode ser desejável incluir agentes de tonicidade.
Em alguns casos, para efetuar a ação prolongada é desejável reduzir a absorção de FSH (e outros ingrediente ativos, se presentes) da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser realizado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade em água deficiente. A taxa de absorção, por exemplo, de FSH depois depende de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de combinação de FSH parentaralmente administrada é realizada dissolvendo-se ou colocando-se em suspensão a combinação de FSH em um 15 veículo oleoso.
De acordo com a presente invenção, um esforço foi feito pelos inventores para investigar o efeito de certos compostos sobre a estabilidade de uma formulação de gonadotrofina líquida; aqui, efeitos estabilizantes assim como desestabilizantes de certos compostos foram investigados.
O termo "estabilidade" pode referir-se à estabilidade química, envolvendo a modificação covalente na sequência de aminoácido, mas no contexto da estabilidade proteica ele também pode referir-se à estabilidade física, que envolve mudanças do estado dobrado da proteína (isto é, o estado nativo) não incluindo clivagem de ligação covalente.
Na presente invenção o termo "estabilidade" refere-se à estabili dade física de formulações de gonadotrofinas, em particular FSH da presente invenção. A instabilidade física de uma formulação de proteína pode ser causada por agregação das moléculas de proteína para formar agregados de ordem superior, por dissociação dos heterodímeros em monômeros, ou 30 por qualquer outra mudança conformacional que reduz pelo menos uma ati-vidade biológica de proteínas de FSH incluídas na presente invenção.
Uma solução ou formulação "estável" é uma em que o grau de, agregação, dissociação, modificação conformacional, perda de atividade biológica e semelhantes, de proteínas nesta é aceitavelmente controlada, e não aumenta inaceitavelmente com o tempo. A estabilidade pode ser avaliada por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo medição da dispersão de luz de uma amostra, inspeção visual de claridade e/ou coloração, absor- bância, ou densidade óptica, determinações do tamanho molecular (por e- xemplo, por cromatografia de exclusão por tamanho ou fracionamento de fluxo por campo), atividade biológica in vitroou in vivo e/ou por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Outros métodos para avaliar a estabilidade são bem conhecidos na técnica e também podem ser usados de acordo com a presente invenção. Foi conhecido que vários conservantes têm um efeito desestabi- lizante pronunciado sobre formulações de gonadotrofina e foi descoberto surpreendentemente aqui que sais, em particular sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis, que foram mostrados aqui serem adequados para a estabilização de uma formulação de FSH líquida, em particular Na+ ou K+, tais como NaCI ou Na2SO4 são adicionalmente úteis para contrariar os efeitos desestabilizantes de um conservante, como álcool benzílico, fenol e m-cresol, que precisam ser compreendidos em uma formulação de FSH líquida de dose múltipla para uso médico. Os sais presentemente reivindicados têm um efeito estabilizante sobre uma formulação de FSH líquida que é em uma maneira vantajosa e surpreendente ainda mais pronunciado do que os efeitos estabilizantes de estabilizadores conhecidos, como, por exemplo, sacarose. O efeito de estabilização melhorado comparado aos estabilizadores conhecidos como sacarose é particularmente surpreendente. Além disso, totalmente inesperado, os efeitos estabilizantes dos sais inventivos podem ser mostrados para formulações de FSH, embora nenhum efeito estabilizante possa ser mostrado para a hCG muito similar. Foi surpreendente ainda que os efeitos de estabilidade como observado não obedeceram a assim chamada série de Hofmeister (ver também abaixo), mas realmente concorreram com ela. Foi conhecido da técnica anterior que existe degradação de FSH ocorrendo em formulações de FSH farmacêuticas e isto foi confirmado pelo primeiro conjunto dos exemplos presentes. FSH degradará tanto como uma função do tempo quanto como uma função da temperatura. Em particular, em temperaturas acima da temperatura ambiente, as estruturas secundárias, terciárias e quaternárias serão alteradas.
Parece que a desdobra conformacional de estruturas de FSH terciárias e secundárias ocorrendo no aquecimento é uma transição de estágio duplo (quando a agregação da proteína é limitada). Esta desdobra pode ser independente da dissociação de subunidade (mudanças na estrutura quaternária).
Além disso, torna-se claro com a presente invenção que FSH, contendo um conservante como álcool benzílico ou fenol, onde tais conservantes são necessários, por exemplo, como agentes antimicrobianos em formulações de FSH líquidas, claramente afetam a estabilidade de formulações de FSH de dose múltipla em uma maneira negativa. Aqui, a estabilidade a longo prazo, de FSH é diminuída, a temperatura de desnaturação de FSH é mais baixa, e as formas já desnaturadas têm um nível mais baixo de estruturas secundárias do que formulações de FSH não contendo conservantes.
A presente invenção também mostra pela primeira vez que sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis para a estabilização de uma formulação de FSH líquida, isto é Na e K, têm um efeito significante sobre a estabilidade de formulações de FSH líquidas. Pode ser mostrado que a estrutura secundária de FSH em formulações de FSH líquidas compreendendo estes sais não mudará significativamente no aquecimento até 76,5°C. A forma desnaturada é relativamente estruturada na presença de por exemplo, Na2SC>4, isto torna a desnaturação mais reversível, e assim, significativamente aumenta a estabilidade cinética da proteína. Isto é sustentado pelos dados de estabilidade em tempo real presentemente mostrados mostrando um efeito estabilizante pronunciado sobre a estrutura heterodimérica de FSH.
Os resultados aqui claramente indicam que os sais presente- mente reivindicados, por exemplo, sulfato de sódio e cloreto de sódio, podem limitar a tendência de moléculas de FSH a dissociar e assim aumentam significativamente a estabilidade em armazenamento.
A presente invenção também pertence a um método para a estabilização de uma formulação de FSH líquida em que o método compreende a etapa de uma adição dos sais acima à dita formulação.
Todos os estudos foram confirmados pelos dados em tempo real adicionalmente conduzidos.
O sinal de CD (dicroísmo circular, ver abaixo) (m-grau) como função do comprimento de onda (nm) é mostrado para rFSH em várias temperaturas. Nenhuma diferença significante entre os espectros de 24,0°C -> 45,9°C foi observada, mas uma diminuição dependente da temperatura do sinal de CD além de 50°C foi observada. A proteína de rFSH (0,93 mg/ml) foi dissolvida em 3,57 mM de tampão de fosfato no pH 6,3 contendo 0,0036 mg/ml de Polissorbato 20. Varrer a 24,0°C (traço sólido em negrito), 50,3°C (traço tracejado), 54,7°C (traço ponteado), 59,0°C (traço tracejado-ponteado), 63,4°C (estrelas), 67,8°C (losangos) e 76,5°C (traço sólido).
O sinal de CD (m-grau) como uma função do comprimento de onda (nm) é mostrado para rFSH contendo Na2SC>4 em várias temperaturas. Nenhuma diferença significante entre os espectros de 24,0°C —> 45,9°C foi observada. A proteína de rFSH foi dissolvida em 3,57 mM de tampão de fosfato no pH 6,3 contendo 0,0036 mg/ml de Polissorbato 20 e 8,6 mg/ml de sulfato de sódio (Na2SO4). Varrer a 24,0°C (traço sólido em negrito), 50,3°C (traço tracejado), 54,7°C (traço ponteado), 59,0°C (traço tracejado-ponteado) e 76,5°C (traço sólido).
O sinal de CD (m-grau) como uma função do comprimento de onda (nm) é mostrado para rFSH contendo álcool benzílico em várias temperaturas. Nenhuma diferença significante entre os espectros de 24,0°C —> 45,9°C foi observada. A proteína de rFSH (0,93 mg/ml) foi dissolvida em 3,57 mM de tampão de fosfato no pH 6,3 contendo 0,0036 mg/ml de Polis- sorbato 20 e 0,17 mg/ml de álcool benzílico. Varrer a 24,0°C (traço sólido em negrito), 45,9°C (círculos), 50,3°C (traço tracejado), 54,7°C (traço ponteado), 59,0°C (traço tracejado-ponteado), 63,4°C (estrelas), 67,8°C (losangos) e 76,5°C (traço sólido).
Varreduras de DSC subsequentes de hCG e rFSH. Dados de DSC para 5 mg/ml de hCG em 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 0,5 mg/ml de L-metionina, 1 mM de tampão de fosfato, pH 6,5 e 2,4 mg/ml de rFSH em 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,24 M de NaCI, 1 mM de tampão de fosfato, pH 6,5. Taxa de varredura a 2,0°C/min. Primeira varredura de rFSH (traço sólido), segunda varredura de rFSH (traço tracejado-ponteado), primeira varredura de hCG (traço tracejado) e segunda varredura de hCG (traço ponteado). Depois da primeira varredura a amostra foi resfriada a 20°C antes da segunda varredura.
Varreduras de DSC de hCG com vários açúcares ou sais. Dados de DSC para 5 mg/ml de hCG em 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 0,5 mg/ml de L-metionina e 1 mM de tampão de fosfato, pH 6,5. Nenhum açúcar ou sal adicionado (traço sólido em negrito), 0,1 M de Na2SÜ4 (traço sólido), 0,1 M de NaCI (traço ponteado), 0,1 M de NaCIÜ4 (traço tracejado) e 0,1 M de sacarose (traço tracejado-ponteado). Taxa de varredura de 2,0°C/min.
Varreduras de DSC de rFSH com vários açúcares e sais. Dados de DSC para 2,4 mg/ml de rFSH em 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 0,5 mg/ml de L-metionina e 1 mM de tampão de fosfato, pH 6,5. Nenhum açúcar ou sal adicionado (traço sólido em negrito), 0,1 M de NaaSCU (traço sólido), 0,1 M de NaCI (traço ponteado), 0,1 M de NaCIO4 (traço tracejado) e 0,1 M de sacarose (traço tracejado-ponteado). Taxa de varredura de 1,0°C/min.
A presente invenção-é.explicada ainda por via dos exemplos seguintes, que não devem, entretanto, de modo algum serem interpretados a serem limitantes do escopo desta.
Exemplo 1 - Espectroscopia de dicroísmo circular de radiação sincrotrônica (SRCD) MÉTODO
Espectroscopia de dicroísmo circular foi realizada usando-se uma instalação sincrotrônica na University of Aarhus, Dinamarca. Todos os espectros de CD foram registrados usando uma célula suprasil de quartzo de comprimento de percurso de 0,1 mm (Hellma GmbH, Alemanha) em uma faixa de comprimento de onda de 180 a 270 nm em etapas de 1 nm, e com um tempo de espera de 3 segundos por comprimento de onda. Três varreduras de CD idênticas foram registradas para cada ensaio experimental tanto para ensaios de rFSH quanto de referência (placebo). O espectro de CD de rFSH apresentado neste relatório foi obtido subtraindo-se a varredura de placebo correspondente média da varredura de proteína média. Para cada conjunto de varreduras de CD aproximadamente 120 μl de solução (corresponde a aproximadamente 112 μg de rFSH) foram usados.
Durante as investigações de efeitos de temperatura sobre o espectro de CD de rFSH, a temperatura na câmara de aquecimento variou de 25°C a 85°C com intervalos de 5°C, e um tempo de equilíbrio de 5 minutos. A partir de um arquivo de calibração a temperatura experimental real (temperatura na célula suprasil de quartzo) foi determinada. CD mede a diferença na absorção da luz circularmente polarizada esquerda e direita que ocorre devido à assimetria estrutural. Estruturas secundárias de proteínas podem ser investigadas por espectroscopia de CD na região longe do UV (aproximadamente 180 a 250 nm). Em geral, a estrutura mais ordenada segue sinais de CD mais intensos (positivos ou negativos). Entretanto, estruturas secundárias diferentes têm espectros de CD diferentes, e como a-hélices têm sinais de CD mais intensos do que estruturas β, nenhuma comparação direta pode ser realizada entre proteínas diferentes a ser concluída no grau de estruturas.ordenadas.
Devido à sensibilidade alta para mudanças estruturais, a espec- troscopia de CD é uma ferramenta forte quando da investigação da estabilidade física das proteínas. Tais estudos são usualmente realizados detectando-se um espectro de CD como função das mudanças em fatores externos, por exemplo, temperatura, pH, concentração de desnaturantes, tensoativos ou estabilizadores. No presente estudo o espectro de CD de rFSH é investigado como função da temperatura. Adicionalmente os efeitos do álcool ben- zílico e sulfato de sódio (NaaSO^ sobre a estrutura secundária de rFSH foram estudados.
A gonadotrofina usada neste exemplo assim como nos Exemplos 2 e 3 é um hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH), um hormônio humano que é expressado da linhagem de célula PER.C6® humana usando tecnologia de DNA recombinante. rFSH é uma proteína heterodimé- rica consistindo em dois monômeros glicosilados: uma subunidade alfa de 92 aminoácidos que é comum para FSH, Hormônio Luteinizante (LH), Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) e Hormônio Estimulante da Tireoide (T- SH), e uma subunidade beta de 11T.-aminoácidos que é específica para F- SH. Os hormônios de glicoproteína, compreendendo FSH, todos perdem sua bioatividade em dissociação dos monômeros não covalentemente ligados. Resultados prévios indicaram que a instabilidade de rFSH é principalmente fundamentada em dissociação de dímero (decomposição da estrutura quaternária, e diminuição concomitante na resposta de imunoligação).
Dependente do uso intencionado, formulações de rFSH correntemente comercializadas são fornecidas em concentrações diferentes, variando de 37,5 IU/ml (correspondendo a aproximadamente 2,8 μg/ml para Gonal-f) até pelo menos 833 IU/ml (correspondendo a aproximadamente 83,3 μg/ml para Puregon). O rFSH usado nos estudos é intencionado para uma formulação de produto medicamentoso líquida, 600 ID de rFSH/ml para injeção subcutânea. Visto que o produto é intencionado para injeção de dose múltipla, a adição de um conservante é de necessidade.
As formulações investigadas foram produzidas misturando-se soluções de estoque dos ingredientes diferentes. O intervalo de concentração investigado tanto da proteína quanto dos excipientes é limitado devido ao método usado, isto é, a concentração de proteína necessária para ser mantida relativamente alta em comparação às concentrações do excipiente. Devido à absorção UV de compostos aromáticos na região do comprimento de onda investigada, a concentração de álcool benzílico precisa ser mantida baixa. A tabela abaixo esboça as três formulações diferentes que foram e- xaminadas em um primeiro projeto experimental pelos presentes inventores. Tabela 1
A tabela mostra o teor das três formulações que foram usadas para estudos de SRCD dos efeitos da temperatura sobre rFSH
O espectro de CD foi registrado para rFSH, amostra 1 (ver a tabela 1) em treze temperaturas diferentes entre 24°C e 77°C. Para clareza apenas sete destes espectros são mostrados na figura 1. A amostra 1, como derivável da Tabela 1, não compreendeu nem um sal, nem um conservante. Os espectros são mostrados na figura 1. Os resultados mostram claramente que a intensidade do sinal de CD diminui como uma função da temperatura, indicando a decomposição de estruturas secundárias em temperatura alta (> 50°C). Nenhuma diferença significante entre os espectros de 24,0°C —> 45,9°C foi detectada, que mostra que durante o período de tempo das medições (cerca de 20 minutos) a estrutura secundária da proteína é intacta em aquecimento até aproximadamente 46°C. Os espectros de SRCD de FSH em aquecimento mostram um ponto isodicróico em aproximadamente 193 nm, que também é encontrado para os espectros da Amostra 2, ver a figura 2.
O espectro de CD foi registrado para rFSH, amostra 2 (tabela 1) contendo Na2SO4. Os espectros são obtidos em treze temperaturas diferentes entre 24°C e 77°C, e apresentadas na figura 2. Para clareza apenas cinco destes espectros são mostrados na figura 2. Os resultados mostram a decomposição de estruturas secundárias como uma função da temperatura. Os dados revelam que à estrutura secundária de rFSH na amostra 2 é intacta no aquecimento a aproximadamente 46°C (na duração do experimento). Importantemente, os dados também mostram que a forma desnaturada é relativamente estruturada na presença de NazSO^
O espectro de CD foi registrado para rFSH, amostra 3 (tabela 1) contendo álcool benzílico (BA). Álcool benzílico é um conservante antimicro- biano que muito comumente é selecionado para uma formulação líquida de FSH. Devido à capacidade de conservação fraca relativa comparada a por exemplo m-cresol, BA tem que ser usado em concentrações altas (cerca de 10 a 15 mg/ml). Um conservante é necessário visto que o uso intencionado de rFSH é para várias injeções durante um período de tempo até 1 mês, e como rFSH é comumente armazenado na temperatura ambiente.
Os espectros de rFSH na presença de 0,17 mg/ml de BA são obtidos em treze temperaturas diferentes entre 24°C e 77°C, e apresentados na Figura 3. Para clareza apenas oito destes espectros são mostrados na figura 3. Devido à absorbância UV muito alta de álcool benzílico (e sinal de CD baixo concomitante) a concentração de BA investigada pode não ser aumentada, e assim pode não equilibrar-se próximo à concentração que será usada para conservar formulações de rFSH. Não obstante, um efeito de- sestabilizante claro de BA foi observado. Os resultados de CD indicam que a estrutura secundária de rFSH na amostra 3 é intacta no aquecimento a 42°C, que é levemente mais baixo do que a temperatura de desnaturação de início de rFSH nas amostras 1 e 2. Adicionalmente, e importantemente, os dados mostram que as formas desnaturadas carecem de estrutura ordenada a um grau acentuadamente mais alto do que FSH na ausência de conservante.
Os efeitos dos excipientes sobre a temperatura induziram mudanças estruturais
O sal NaaSO4 que foi usado aqui como um exemplo representativo para os sais presentemente reivindicados mostrou um efeito significante sobre a estrutura de proteínas desnaturadas por temperatura. Isto é claramente uma descoberta importante. Conforme proteínas desnaturadas (desdobradas ou parcialmente desdobradas) são mais propensas a associar para formar agregados do que proteínas nativas (Fink, A.L., 1998, Fold Des. 3(1):R9-R23), os resultados indicam que sulfato de sódio pode limitar a tendência de moléculas de rFSH a desnaturar e consequentemente o risco para agregação e deste modo significativamente aumenta a estabilidade em armazenamento. Álcool benzílico (BA) por outro lado induz decomposição estrutural significante em temperatura altas. Nenhuma estrutura ordenada secundária foi detectada por SRCD. Os efeitos observados de BA (estruturas mais desdobradas) podem ser parte da explicação para a agregação aumentada encontrada em outros sistemas de proteína na adição de álcool benzílico (Maa, Y. e Hsu, C.C., 1996, Int. J. Pharm. 140:155-168; Mang, Y. et al., 2004, J. Pharm. Sei. ^3(12):3076-3089).
Entretanto, a adição de conservantes é crucial para o desenvolvimento de formulações de dose múltipla, e a partir da existência de produtos de rFSH no mercado é conhecido que formulações mais estáveis precisam ser desenvolvidas mesmo com teor relativamente alto de álcool benzílico (Puregon® contém 10 mg/ml de álcool benzílico).
Álcool benzílico foi descoberto diminuir a estabilidade de rFSH e favorecer a perda de estruturas ordenadas secundárias no aquecimento. Entretanto, uma adição de conservantes é importante. Este estudo mostrou que os sais presentemente reivindicados aumentam o nível de estruturas ordenadas em formulações de rFSH aquecidas. Assim, estes sais são bem adequados como estabilizador(es) em uma formulação de rFSH líquida, por exemplo para compensar pelos efeitos de álcool benzílico ou outros conservantes fenólicos.
O FSH usado representativamente neste exemplo é o mesmo, como no Exemplo 1. Em geral a estrutura nativa (bioativa) de proteínas é muito sensível para suas adjacências, por exemplo, a composição da formulação, os sistemas do recipiente, pH e temperatura. No presente exemplo a temperatura de desnaturação de rFSH, Tm, foi investigada por calorimetria diferencial de varredura líquida (DSC). A temperatura de desnaturação de rFSH fornece uma indicação da estabilidade da proteína em solução, onde uma Tmmais alta indica uma proteína mais estável.
A estrutura terciária e quaternária de proteínas é estabilizada principalmente por interações não covalentes. Visto que muitas destas interações intramoleculares são substituídas por interações não covalentes com moléculas de água durante a desdobra do equilíbrio termodinâmico entre as diferentes formas estruturais (isto é, nativa e desnaturada) é sutil. Em geral isto significa que a estabilidade das proteínas nativas é limitada. Muitas proteínas termicamente desdobram em torno de 70°C. A dobra ou desnaturação da proteína pode ser descrita por parâmetros termodinâmicos que podem ser diretamente estudados e quantificados usando DSC. Consequentemente, DSC é uma ferramenta importante para estudar os efeitos dos excipien- tes sobre a estabilidade proteica, e assim para identificar as formulações ideais para a terapêutica da proteína.
Quando do aquecimento de uma amostra de proteína (isto é, aumentando a temperatura da amostra) em um DSC líquida, apenas um valor de referência levemente crescente é obtido, mas quando o aquecimento continua (isto é, aumento contínuo na temperatura), calor é absorvido pela proteína fazendo com que ela desdobre termicamente em uma faixa de tem-peratura característica da proteína estudada. Isto dá origem a um pico endo- térmico. Durante a desdobra da proteína, moléculas de água que circundam a proteína reorganizam visto que cadeias mais hidrofóbicas são expostas. Quando a desdobra é completa, a absorção de calor diminui e um novo valor de referência é formado.
A integração da capacidade térmica, Cp, da amostra fornece a mudança de entalpia, ΔH, associada com o processo de desdobra da equa- ção (1). A mudança de entalpia observada origina-se de processos endotér- micos tais como quebra de ligações de hidrogênio e processos exotérmicos tais como formação de ligações de hidrogênio entre a proteína e o meio adjacente. O ponto central da transição térmica ou ponto central de transição, 5 Tm (frequentemente chamada a temperatura de desnaturação da proteína), é a temperatura quando metade das moléculas de proteína são dobradas e metade das moléculas de proteína são desdobradas.
Os dados brutos das medições de DSC, isto é, taxa de calor (em W) como uma função da temperatura podem ser facilmente recalculados em parte, à capacidade térmica molar (em J/mol K), conhecendo a massa molar e a concentração da proteína usada.
A temperatura de desnaturação da proteína, Tm, foi medida u- sando uma DSC líquido, Nano DSC da TA Instruments, equipada com 300 μl 15 de células capilares duplas e usando os parâmetros seguintes: Taxa de varredura: 0,5 a 2,0°C/min, se nada mais for estabelecido, uma taxa de varredura de 1,0°C/min é usada (2,0°C/min para o ex. 4) Temperatura inicial: 20°C Temperatura final: 100°C
Equilíbrio: 900 s (ou 900 s (primeira varredura) 600 s (segunda varredura) para o ex 4) Pressão constante: 3 atm
Todas as amostras foram desgaseificadas por 15 min antes das medições. As células da amostra foram limpas com 50 % de ácido fórmico depois de todas as amostras de proteína. Adicionalmente as células foram enxaguadas com 1000 ml de água purificada depois de cada rodada de a- mostra. Todas as amostras foram medidas com o placebo correspondente na célula de referência. Os resultados de uma varredura separada com a solução de placebo enchida tanto na célula de referência quanto dê amostra foram subtraídos dos dados antes da avaliação, isto é, uma subtração em branco.
Amostras de rFSH, antes e depois do tratamento com a enzima sialidase, foram analisadas por Espectrometria de Massa por Tempo de Vôo por Ionização e Desorção a Laser Assistida por Matriz (MALDI-ToF MS) para avaliar a extensão da reação de desialilação. Espectros foram adquiridos em um Espectrômetro de Massa MALDI ToF Autoflex II (Bruker Daltonics). Ácido sinápico foi usado como matriz.
A análise foi realizada no modo de íon linear positivo, com extração retardada. Uma faixa de varredura de 4000-20893 Da foi usada com calibração externa.
O objetivo deste exemplo foi investigar a estabilidade térmica de rFSH por meio de calorimetria diferencial de varredura líquida (DSC), e estudar o efeito de estabilização de vários sais sobre rFSH com e sem a adição de um conservante (fenol ou álcool benzílico).
Este estudo junto com estudos de espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) prévios (Exemplo 1 acima) e estudos de estabilidade em tempo real (Exemplo 3 abaixo) todos apontam para estudar o efeito de sais e conservantes sobre a estabilidade de rFSH em soluções.
INFORMAÇÃO DO LOTE DE rFSH rFSH, substância medicamentosa lote n° 08800020 e lote ns 09PD80010 foram fabricados pela Bio-Technology General (BTG), Israel.
A determinação da atividade biológica de rFSH é realizada de acordo com Ph. Eur. A concentração foi determinada ser 13.223 IU/mg (resultando em 9.256 IU/ml) para o lote 08800020 e 15.109 IU/mg (resultando em 10.576 IU/ml) para o lote 09PD80010, respectivamente para os dois lotes de rFSH usados.
Uma lista dos excipientes usados nas soluções de rFSH neste estudo é listada na Tabela 2. Tabela 2: Lista de excipientes
AS
A composição das soluções de rFSH e placebo testadas são listadas na Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5. A concentração testada dos conservantes é escolhida com base na concentração necessária para satisfazer os critérios de Ph. Eur. A com referência a eficácia de conservação de uma formulação intencionada para uso parenteral.
As concentrações de sal testadas são fundamentadas na concentração de sulfato de sódio necessária para obter isotonicamente nas soluções testadas, isto é, sulfato de sódio a 0,1 M. Todos os outros sais são testados na mesma concentração molar como sulfato de sódio. Adicionalmente uma concentração mais alta e mais baixa de cloreto de sódio é testada, para avaliar o efeito da concentração de sal sobre a temperatura de desnaturação de rFSH, Tm.
A concentração do tampão de fosfato de sódio nas soluções tes- tadas é mantida baixa para minimizar o risco de efeitos de estabiliza- ção/desestabilização dos sais de tampão como tal. Tabela 3: Composição das soluções de rFSH
Tabela 4: Composição de soluções de rFSH desialilado 
Tabela 5: Composição das soluções de placebo 
Todas as soluções (Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5) são fabricadas em escala laboratorial em Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca. O procedimento de fabricação é resumido abaixo:
As soluções de estoque de rFSH em tampão de fosfato são preparadas adicionando-se uma etapa de concentração usando a solução de substância medicamentosa de rFSH lote 08800020 ou lote 09PD80010 como o material de partida. A elevação da concentração é realizada usando um dispositivo Vivaspin 20 com um corte de membrana de peso molecular de 10 kDa (MWCO) da Vivascience. A membrana é pré-lavada centrifugando-se 15 ml da solução de placebo correspondente, contendo 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 em 1 mM de tampão de fosfato no pH 5,5, 6,5 ou 7,5 através do filtro. A centrifugação é realizada a 3000 x g por 20 minutos usando um rotor basculante.
Para realizar a etapa de concentração, um total de 80 ml de a- mostra de rFSH é usado para encher quatro dispositivos Vivaspin 20 (20 ml por dispositivo) e centrifugado a 3000 x g por 15 min. Cada retentado é transferido para um frasco volumétrico de 20 ml. Os filtros são lavados com alíquotas pequenas da solução de placebo desejada. A solução de lavagem é transferida para o frasco volumétrico, que é finalmente diluída até o volume usando a mesma solução de placebo. Isto resulta em uma solução de esto-que de rFSH de 2,8 mg/ml contendo 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 em um tampão de fosfato a 1 mM no pH 5,5, 6,5 ou 7,5, respectivamente.
Soluções de estoque de todos os excipientes, exceto os conservantes, são preparadas em água Milli-Q.
Para a preparação de soluções de rFSH e placebo, soluções de estoque de cada excipiente são misturadas para obter as concentrações desejadas fornecidas na Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5. O conservante é adicionado diretamente às soluções.
A solução de rFSH concentrada tendo uma concentração de rFSH de 2,8 mg/ml contendo 0,5 mg/ml de L metionina, 0,005 mg/ml de Polis- sorbato 20 em um tampão de fosfato a 1 mM no pH 6,5 é usada para remover o ácido siálico das porções de açúcar ligadas a rFSH. A remoção é feita enzimaticamente, usando uma α(2-*3,6,8,9) Neuraminidase (uma sialidase) da Sigma. O rFSH é tratado com a Neuraminidase durante a noite agitando a 37°C. Os reagentes são removidos usando dispositivos Vivaspin como descrito acima para a concentração de rFSH. A solução de rFSH contendo as enzimas é transferida para um dispositivo Vivaspin pré-lavado. O dispositivo é centrifugado, o filtrado é descarregado e o retentado é recolocado em suspensão em uma solução de placebo contendo 0,5 mg/ml L de metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 em um tampão de fosfato a 1 mM no pH 6,5. A solução é centrifugada novamente. Este procedimento é repetido três vezes antes que o retentado final seja transferido para um frasco volumétrico e diluído ao volume com a solução de placebo. Isto produz uma solução de estoque de rFSH desialilado de 2,8 mg/ml contendo 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 em um tampão de fosfato a 1 mM no pH 6,5. RESULTADOS E DEBATE
Para investigar o efeito da Velocidade da Varredura por DSC sobre a temperatura de desnaturação de rFSH, Tm, medições são realizadas com três velocidades de varredura diferentes. Como pode ser observado na Tabela 6, a Tm de rFSH varia com a taxa de varredura por DSC usada durante as medições.
Contanto que as temperaturas de desnaturação obtidas das medições realizadas com taxas de varredura idênticas sejam comparadas, o fato de que Tm varia com a taxa de varredura não afeta a interpretação dos dados, ver,por exemplo, a Tabela 7. Tabela 6: Temperatura de desnaturação, Tm, em relação à taxa de varredura para amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L- metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20 em um tampão de fosfato de sódio a 1 mM no pH 6,5.
*Preparação da amostra em duplicata e análises
Varreduras por DSC de repetição até 100°C mostraram que a desnaturação de rFSH é parcialmente irreversível sob as condições experimentais (ver a figura 4). Isto significa que a redobra é mais lenta do que o tempo de equilíbrio entre duas varreduras por DSC, ou que a desdobra é associada com uma etapa irreversível como indicado na equação 2. Nativa «-> Desdobrada —>Irreversivelmente Desnaturada(2)
Como pode ser observado na Tabela 7, a adição de um conservante a uma solução de rFSH, reduz a temperatura de desnaturação, Tm com 2 a 6°C, dependendo do conservante usado. Isto corresponde bem aos dados previamente relatados tanto para outras proteínas recombinantes quanto para FSH derivado urinário.
A maior diminuição em Tm obtida para soluções de rFSH com álcool benzílico em comparação a soluções de rFSH com fenol (ver a Tabela 7) pode ser explicada a partir da concentração mais alta de álcool benzílico (15 mg/ml) do que fenol (5 mg/ml) usada nos experimentos. Tabela 7: Temperatura de desnaturação com e sem adição de um conservante, Tm(conservante) θ Tm(nenhum conservante)>pSfa afTIOStraS dβ fFSH COntβndO 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 e os excipientes listados na tabela. ΔTm(conservante) = Tm(conservante) - Tm(nenhum conservante)
*Calculado a partir de medições de DSC realizadas com uma taxa de varredura de 1,0°C/min. **Calculado a partir de medições de DSC realizadas com uma taxa de varredura de 2,07min.
A classificação de sais de acordo com seus efeitos gerais sobre a solubilidade e a estabilidade da proteína é conhecida como a série de Hofmeister ou série liotrópica, equação (3) abaixo. Os agentes de precipitação por sais para o lado esquerdo, os assim chamados íons cosmotrópicos são conhecidos produzir um efeito de estabilização sobre as proteínas. Ao passo que os íons caotrópicos ou de solubilização por sais para o lado direito, são conhecidos desestabilizar proteínas.
Quando da medição do efeito de vários sais de sódio sobre Tm de rFSH, muito surpreendentemente, o efeito de estabilização/desestabili- zação esperado de acordo com a série de Hofmeister como descrito acima não foi observado, quando da variação de cátions ver a Tabela 8 e Tabela 9. Independente de se o íon mais cosmotrópico, sulfato, ou o íon caotrópico, perclorato, fossem usados, o aumento na temperatura de desnaturação foi aproximadamente o mesmo. De fato, o maior aumento em Tm de rFSH foi obtido para sais de íons perclorato, onde um efeito de desestabilização sobre rFSH é esperado. O aumento em Tm estava na mesma faixa tanto para uma variedade de ânions inorgânicos como sulfato, cloreto e perclorato mas também para ânions orgânicos como citrato, acetato e tartarato. Tabela 8: Temperatura de desnaturação, Tm, em relação á combinação do ânion e cátion de sal para as amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 e sal a 0,1 M.
Nenhum sal adicionado: Tm = 72,9°C, outros excipientes de acordo com o cabeçalho da tabela Sacarose a 0,1 M: Tm = 73,3°C, outros excipientes de acordo com o cabeçalho da tabela Tabela 9: Mudança na temperatura de desnaturação, ΔTm(Sai), em relação à combinação do ânion e cátion de sal para as amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 na adição de sal a 0,1 M. ΔTm(sal)= Tm(sal) " Tm(nenhum sal)
Sacarose a 0,1 M: 0,4°C, outros excipientes de acordo com o cabeçalho da tabela
A tendência observada, de que a posição dos ânions na série de Hofmeister não afeta o aumento de Tm de rFSH na adição de sais de sódio diferentes, também é encontrada para potássio (ver Tabela 8 e Tabela 9). Tendo o mesmo cátion, o ânion em geral apenas influencia a mudança em Tm de rFSH um grau menor e nunca de acordo com a série de Hofmeister.
Muito surpreendentemente, os cátions, por outro lado, influenciam a Tm de rFSH. Mais especificamente, sais com cátion monovalente exibem em geral uma Tm de rFSH mais alta do que íons bivalentes (ver a Tabela 8). Especialmente, os íons de metal alcalino monovalentes dão origem a uma Tm de rFSH alta. Em outras palavras, os efeitos de estabilização observados (isto é, o aumento na Tm de rFSH) na adição de sal é totalmente independente dos ânions testados (ver as Tabelas 8 e 9), ao passo que os cátions têm uma influência grande sobre o grau de estabilização. Sais de potássio e sódio exibem um efeito de estabilização particularmente grande. Todas as soluções testadas acima têm uma concentração de sal de 0,1 M. Para investigar o efeito da concentração de sal sobre a Tm de rFSH, medições de DSC de soluções de rFSH contendo três concentrações de cloreto de sódio diferentes foram investigadas. O efeito de estabilização na adição de sal a uma solução de rFSH é observado na faixa integral da con-centração de sal testado (ver a Tabela 10). Tabela 10: Mudança na temperatura de desnaturação, ΔTm(Sai) para amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 na adição de concentrações de cloreto de sódio diferentes. ΔTm(Sai) = Tm(sai) - Tm(nenhum sal)
dura de 2,0°C/min.
Patentes existentes sobre formulações de FSH usam, por exemplo, sacarose como estabilizadores para FSH. A adição de sacarose a 0,1 M a uma solução de rFSH produz uma mudança minúscula em Tm de rFSH (ver a Tabela 8 e Tabela 9), indicando que o efeito de estabilização de rFSH na adição de sais de potássio ou sódio é acentuadamente mais alto do que o efeito obtido na adição de sacarose.
Efeito da Adição de Vários Sais a Soluções com Conservante Adicionado sobre Tm de rFSH
É bem conhecido que a adição de conservantes a soluções de proteína diminui a estabilidade proteica na solução. Entretanto, para uma formulação de dose múltipla aquosa intencionada para uso parenteral, um conservante é uma exigência. Portanto é de vasta importância compensar pela diminuição na estabilidade proteica na adição de conservante pela adição de estabilizadores, como sais, às soluções de rFSH.
Tabela 11: Temperatura de desnaturação, Tm, e mudanças na temperatura de desnaturação, ΔTm(conservante) θ ΔTm(sai) para amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 5 mg/ml de fenol, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 e sal a 0,1 M COmO fornecido na tabela. Aqui ΔTm(conservante) = Tm(COnservante) " Tm(nenhum conservante) θ ΔTm(sal) = Tm(sal) " Tm(nenhum sal)-
ção de um conservante a uma solução de rFSH é bem compensado pela adição de um sal como definido pela invenção. Realmente, a adição de sal a soluções de rFSH contendo fenol não apenas neutraliza o efeito do conservante sobre a Tm de rFSH, ela realmente aumenta a Tm comparado a rFSH em solução aquosa sem adição de conservante ou sal (ver a Tabela 11).
Para estudar o efeito do pH sobre a Tm de rFSH com e sem adição de sais de estabilização, a temperatura de desnaturação de rFSH foi determinada em um pH de 5,5, 6,5 e 7,5 com e sem adição de três sais de sódio diferentes (ver a Tabela 12). Tabela 12: Temperatura de desnaturação, Tm, em pHs diferentes para amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio e sal a 0,1 M. Aqui ΔTm(sal) = Tm(sal) " Tm(nenhum sal)
Como pode ser observado na Tabela 12, as tendências gerais na Tm de rFSH na adição de sais de sódio diferentes são as mesmas na faixa de pH integral de 5,5 a 7,5, isto é, o desvio do efeito de estabilização/desesta- bilização de sais de acordo com a série de Hofmeister é observado em todo pH testado.
Na faixa de pH investigada, as temperaturas de desnaturação de rFSH observadas estão aumentando com o aumento do pH em soluções, tanto com quanto sem a adição de sal (ver a Tabela 12). O aumento real na temperatura de desnaturação de rFSH na adição de sais, ΔTm(Sai), é levemente mais baixo no pH mais alto (ver a Tabela 12).
Como foi mostrado acima, a influência da adição de sais a uma solução de rFSH de jeito nenhum segue a série de Hofmeister, descrita acima, onde sais de ions perclorato são esperados desestabilizar proteínas (produzem uma Tm de proteína mais baixa) e íons sulfato são esperados estabilizar proteínas (produzem uma Tm de proteína mais alta).
Visto que rFSH é uma proteína glicosilada, tendo numerosos resíduos de ácido siálico ligados às porções de açúcar, e consequentemente uma carga líquida negativa regularmente alta, o efeito do ácido siálico sobre o comportamento de estabilização inesperado dos sais foi investigado.
Para estudar o efeito do ácido siálico sobre Tm de rFSH na adição de sais diferentes, o ácido siálico foi removido enzimaticamente. O rFSH desialilado foi depois analisado por meio de DSC, com e sem adição de sal.
Para verificar que os resíduos de ácido siálico foram removidos com êxito, a amostra de rFSH antes e depois da remoção enzimática de ácido siálico foi analisada por meio de MALDI-ToF MS.
Sob condições de amostra ácida de MALDI-ToF MS as subunidade alfa e beta são dissociadas e portanto medidas separadamente. O peso molecular médio da subunidade alfa antes do tratamento com sialidase é 15000 Da. Depois do tratamento com sialidase o peso molecular médio é 14000 Da. O peso molecular médio da subunidade beta antes do tratamento com sialidase é 18000 Da, e 17000 Da depois do tratamento com sialidase. A substituição em massa para ambas as subunidades é um resultado da remoção de ácidos siálicos que resulta na redução de massa. Praticamente todos os resíduos de ácido siálico foram removidos de rFSH durante a desialilação.
O aumento de Tm de rFSH na adição de sulfato de sódio ou perclorato de sódio segue a mesma tendência para rFSH não modificado e rFSH desialilado, isto é, o efeito de estabilização (aumento em Tm de rFSH) observado não segue a série de Hofmeister descrita acima. Em geral a Tm observada é 2 a 6°C mais baixa para rFSH desialilado do que para rFSH não modificado (ver a Tabela 13). O efeito de estabilização observado na adição de sal também é mais baixo para rFSH desialilado do que para rFSH não modificado (ver a Tabela 13).
A Tmmais baixa obtida para rFSH desialilado do que para rFSH não modificado é esperada, visto que acredita-se que a presença de ácido siálico nas porções de açúcar em rFSH aumente a estabilidade de rFSH.
O fato de que tanto rFSH não modificado quanto rFSH desialilado seguem a mesma tendência (desviando do efeito de estabilização/deses- tabilização de acordo com a série de Hofmeister) na adição de vários sais, prova que não é a presença de ácido siálicos em rFSH por si que dá origem a este efeito. Tabela 13: Temperatura de desnaturação, Tm, para amostras de rFSH e rFSH desialilado contendo 2,4 mg/ml de rFSH ou 2,4 mg/ml de rFSH desialilado, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 e sal a 0,1 M. Aqui, ΔTm(sai) = Tm(Sai) - Tm(nenhum sal)-
O efeito de desestabilização (redução de Tm de rFSH) observado para rFSH na adição de conservante corresponde bem ao estado do conhecimento da técnica dentro da área.
O desvio observado da série de Hofmeister na temperatura de desnaturação de rFSH na adição de sais com ânions diferentes, é entretanto inesperado. De acordo com a série de Hofmeister, (que classifica sais de acordo com seus efeitos gerais sobre a solubilidade e estabilidade da proteína), ânions cosmotrópicos como sulfato normalmente estabilizam proteínas (produzem uma Tm mais alta) ao passo que ânions caotrópicos como perclo- rato desestabilizam proteínas (produzem uma Tm mais baixa). Neste estudo todos os ânions testados tendo o mesmo cátion, exibem um aumento similar na temperatura de desnaturação de rFSH. Totalmente oposto a predição da série de Hofmeister, sais de íons perclorato exibem o maior aumento na temperatura de desnaturação de rFSH.
Em outras palavras, o efeito de estabilização observado (isto é, o aumento na Tm de rFSH) na adição de sal é totalmente independente dos ânions testados. Sais de sódio e potássio exibem efeito de estabilização particularmente grande. Especialmente a adição de perclorato de sódio a uma solução de rFSH dá origem a um aumento grande na temperatura de desnaturação de rFSH. Entretanto, percloratos são geralmente altamente reativos e são agentes oxidantes e percloratos são portanto não aprovados como ingredientes ativos em formulações farmacêuticas.
O efeito de estabilização inesperado obtido para rFSH na adição de sais não pode ser explicado pela presença de ácido siálico nas porções de açúcar de rFSH. Determinações da temperatura de desnaturação de rFSH em rFSH desialilado exibem as mesmas tendências no efeito de estabilização sobre rFSH na adição de sais como rFSH não modificado.
Exemplo 3 - Estabilidade em tempo real nas soluções de rFSH OBJETIVO DO ESTUDO
O objetivo deste estudo foi estabelecer se a estabilidade em tempo real de rFSH em várias formulações segue a mesma tendência como observado nas medições da temperatura de desnaturação de rFSH por meio de DSC líquida como descrito no Exemplo 2 e também as mudanças na estrutura secundária de rFSH no aquecimento como medido com a espectroscopia de CD, como descrito no Exemplo 1. A estabilidade estrutural de rFSH durante o armazenamento, medida como propenso o rFSH deve dissociar em seus monômeros é determinada neste estudo.
A estabilidade de formulações de rFSH de 600 IU/ml depois do armazenamento em duas temperaturas de armazenamento diferentes foi estudada em condições de 5 ± 3°C/RH ambiente a longo prazo e 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH acelerada por 6 a 12 meses. Todos os frascos foram armazenados em posição invertida. Controles de placebo contendo as formulações correspondentes, mas sem nenhum rFSH adicionado foram armazenados sob as mesmas condições como descrito para rFSH ativo.
PRODUTO A SER ESTUDADO INFORMAÇÃO DO LOTE rFSH, substância medicamentosa lote nenhum 08800060 e lote nenhum 09800020 foi fabricado pela Bio-Technology General (BTG), Israel
Determinação da atividade biológica dos lotes de rFSH acima fo ram realizadas de acordo com Ph. Eur.
Uma lista dos excipientes usados neste estudo é descrita na Ta- bela 14.
Tabela 14: Lista de excipientes
Os materiais de embalagem primária usados são listados na Ta bela 15. Tabela 15: Recipiente/Sistema de fechamento
A composição das soluções de estoque de rFSH e das formulações diferentes (rFSH e placebo) são listadas na Tabela 16, Tabela 17 e Tabe- la 18. Exceto para a formulação não contendo nenhum estabilizador/agente de tonicidade, a concentração do estabilizador/agente de tonicidade é ajustada para fornecer soluções isotônicas. Tabela 16: Composição das soluções de estoque de rFSH
Tabela 17: Composição das soluções de estoque de rFSH 
Tabela 18: Composição das soluções de placebo rFSH 
Todas as soluções (Tabela 17 e Tabela 18) são fabricadas em escala laboratorial na Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca. O procedimento de fabricação é resumido abaixo.
Soluções de estoque de todos os excipientes são preparadas em água Milli-Q.
Para a preparação de formulações de placebo, soluções de estoque de cada excipiente são misturadas para obter as concentrações fornecidas na Tabela 18. Antes da diluição ao volume, o pH de cada formulação é ajustado, quando necessário.
Para a preparação de formulações de rFSH, uma solução de diluição é preparada a partir da solução de estoque de cada excipiente. O pH das soluções de diluição é ajustado. Soluções de diluição são misturadas com a solução de estoque de rFSH (ver a Tabela 16) para produzir as concentrações finais listadas na Tabela 17.
As formulações finais são filtradas estéreis usando filtros de PVDF de 0,22 μm (Millipore). Formulações de placebo são filtradas estéreis em frascos de vidro esterilizados usando filtros Stericup. As formulações de rFSH são filtradas estéreis em béqueres de vidro esterilizados usando filtros Sterivex-GV e seringas Luer Lock de 20 ml estéreis (Braun). Filtração estéril, enchimento e selagem dos frascos são realizados em uma bancada LAF usando frascos esterilizados e tampões de borracha. Antes e depois do enchimento, os frascos são purgados com gás nitrogênio, passando através de um filtro de PFTE Millex-FG de 0,20 μm (Millipore) por pelo menos 6 segundos. Os frascos são enchidos com 1,5 ml de amostra por frasco. Todos os frascos são assepticamente enchidos e imediatamente fechados com tampões de borracha e tampas flip-offde alumínio.
Amostras contendo rFSH de 600 IU/ml e placebo são armazenadas por 6 a 18 meses a 5 ± 3°C/RH ambiente. Além disso, amostras são armazenadas por 6 a 18 meses em condições aceleradas, 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH. Em cada temperatura de armazenamento, os frascos são armazenados em posições invertidas. Todos os frascos são protegidos da luz.
Os programas de estabilidade para rFSH de 600 IU/ml e placebo são descritos na Tabela 19 abaixo. Tabela 19: Programa de estabilidade para a formulação de rFSH líquida de 600 IU/ml e placebo, armazenada em posição invertida
- Nenhum teste planejado de acordo com o programa de estabilidade * Apenas testado para algumas formulações
O método analítico usado neste estudo é descrito abaixo. Em cada ocasião de teste, 2 frascos de rFSH e 1 frasco de placebo correspon-dente será analisado para cada formulação.
As formas de LMW de rFSH são determinadas por LC-UV utili-zando eluição isocrática em uma coluna de exclusão por tamanho (SEC). A análise é realizada usando uma coluna com base em sílica com tampão de TRIS como fase móvel e detecção UV. As formas de LMW de rFSH são pi-cos eluindo com peso molecular mais baixo (posterior) do que aquele do pi-co principal de rFSH. As formas de LMW são determinadas como porcenta-gem de área de pico da área de pico total.
Para amostras contendo conservante, o conservante é removido da solução de amostra antes de entrar na coluna de exclusão por tamanho.
Visto que rFSH perde sua bioatividade na dissociação dos mo-nômeros não covalentemente ligados, um modo direto para seguir a perda de atividade de rFSH devido à dissociação de monômero é medir a quanti-dade de forma de LMW de rFSH na solução. Esta informação pode ser re-cuperada da cromatografia por SEC, onde o pico de formas de LMW eluindo depois do pico principal de rFSH é conhecido originar-se do rFSH dissocia- 5 do. Tabela 20: A quantidade relativa de rFSH de formas de LMW (%) como de-terminado por SEC depois do armazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH. A descrição completa de todas as formulações é listada na Tabela 17.
10 N.P. Não realizado. Tabela 21: A quantidade relativa de rFSH de formas de LW (%) como deter-minado por SEC depois do armazenamento a 5 ± 3°C/RH ambiente. A descrição completa de todas as formulações é listada na Tabela 17.
N.P. Não realizado.
Como pode ser observado na Tabela 20, a solução de rFSH re centemente preparada contendo estabilizador diferente, com e sem conser-vante adicionado revela quantidade relativa similar de rFSH dissociado (for-mas de LMW). Visto que o limite de quantificação do método de SEC é 3 % nenhuma diferenciação clara entre formulações pode ser realizada abaixo deste limite, significando que as diferenças observadas em formas de LMW no ponto de tempo inicial estão dentro dos limites da variação do método.
Já depois de armazenamento de um mês a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH, a quantidade relativa de rFSH dissociado aumentou para amostras contendo fenol junto com sacarose ou nenhum estabilizador, ao passo que amostras contendo sulfato de sódio ou cloreto de sódio não exibiram nenhum aumento significante em rFSH dissociado (ver a Tabela 20).
Depois de seis meses armazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH, a amostra de rFSH contendo fenol sem estabilizador adicionado contém mais do que 20 % de rFSH dissociado (formas de LMW). As amostras de rFSH contendo fenol tendo sacarose como estabilizador também exibem um aumento acentuado de rFSH dissociado (mais do que 10 % de rFSH disso-ciado), ao passo que amostras contendo fenol estabilizado com cloreto de sódio ou sulfato de sódio apenas exibem um aumento minúsculo em rFSH dissociado (ver a Tabela 20). Amostras não contendo nenhum conservante são mais estáveis com respeito à dissociação durante o armazenamento; entretanto, para uma formulação de dose múltipla aquosa intencionada no uso parenteral, a adição de um conservante é necessária, portanto esta formulação é unicamente adicionada como uma comparação.
Depois de seis meses de armazenamento a 5 ± 3°C/RH ambiente, nenhuma das formulações de rFSH testadas revela um aumento na quantidade relativa de rFSH dissociado (ver a Tabela 21). Não obstante, pelo menos 24 meses de armazenamento a 5°C e concomitantemente um mês, preferivelmente 3 a 4 meses de armazenamento na temperatura ambiente, são necessários para que um produto comercial de rFSH seja bem sucedido.
Visto que o objetivo deste exemplo foi determinar a correlação entre dados de estudo de estabilidade em tempo real, determinações da temperatura de desnaturação de rFSH por meio de DSC e dados de estrutu- ra secundária rFSH determinados por espectroscopia de CD, parte dos dados de DSC (ver o Exemplo 2) e parte dos dados de CD (ver o Exemplo 1) são apresentados abaixo. Todos os detalhes sobre resultados de DSC apre-sentados são fornecidos no Exemplo 2 e detalhes sobre os dados de CD são fornecidos no Exemplo 1. Tabela 22: A quantidade relativa de rFSH (%) de formas de LMW como de-terminado por SEC depois de 6 meses de armazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH e a temperatura de desnaturação de rFSH, Tm, como determinado por DSC. No estudo de DSC a concentração dos estabilizadores é mantida em 0,1 M para todas as soluções testadas quando comparado à quantidade usada no estudo de estabilidade em tempo real fornecido na tabela.
Como pode ser observado na Tabela 22, a temperatura de des naturação de rFSH obtida por DSC correlaciona-se bem com os dados de estabilidade em tempo real depois de seis meses de armazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH, uma correlação similar entre DSC e estabilidade em tempo real como analisada por SEC foi apresentada previamente para anti-corpos recombinantes e glicoproteínas recombinantes (ver por exemplo Burton et al (2007), Pharm. Dev. Technol. 12:265-273 e Remmele et al (1998), Pharm. Res. 15:200-208). A solução de rFSH sem conservante adicionado estabilizada com sulfato de sódio exibe apenas um grau baixo de rFSH dis-sociado depois do armazenamento por seis meses, ela também exibe uma temperatura de desnaturação significativamente mais alta do que soluções contendo um conservante. Pode ser observado ainda que para soluções contendo um conservante (fenol) a adição de um sal, cloreto de sódio ou sulfato de sódio, produz um grau de rFSH dissociado significativamente mais baixo depois de seis meses de armazenamento, do que soluções contendo sacarose ou nenhum estabilizador. A temperatura de desnaturação para rFSH sem estabilizador adicionado também é significativamente mais baixa do que Tm de rFSH para soluções contendo sal. A temperatura de desnaturação de rFSH para soluções contendo sacarose com adição de fenol não foi de-terminada, entretanto, como pode ser observado na Tabela 23, medições de Tm de rFSH para soluções sem conservante adicionado, exibe a mesma tendência como dados de estabilidade em tempo real depois de seis meses de armazenamento a 30 ± 2°C/65 + 5 % de RH (ver a Tabela 22). Em conclusão, NaCI e Na2SO4 são estabilizadores significativamente melhores do que sacarose com respeito à degradação estrutural. Isto é mostrado tanto por medições de Tm (ver a Tabela 23) quanto por dados de estabilidade em tempo real (ver a Tabela 22). Tabela 23: A temperatura de desnaturação de rFSH, Tm, para soluções sem nenhum conservante adicionado foi determinada por DSC; para mais detalhes ver o exemplo 2.
Tabela 24: Mudança na temperatura de desnaturação, ΔTm, para amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 quando da adição de conservante ou sal como listado na tabela. Taxa de varredura de 2°C /min. m — Tm(conservante/sal) “ Tm(nenhuma adição) 
Nenhum dado de estabilidade em tempo real para soluções con-tendo álcool benzílico como conservante foi determinado, entretanto, quando da comparação da temperatura de desnaturação de rFSH como determinado por DSC e das mudanças na estrutura secundária de rFSH no aquecimento como determinado com espectroscopia de CD, a mesma tendência é observada (ver a Tabela 24). A estrutura secundária de rFSH para amostras de proteína diferentes foi determinada; a estrutura secundária determinada a 24°C pode ser considerada como a estrutura nativa, e aqui nenhuma diferença na estrutura secundária de rFSH pode ser observada para soluções de rFSH na adição de álcool benzílico (em 0,17 mg/ml) ou sulfato de sódio. Não obstante, quando do aquecimento das soluções a 76,5°C, a perda observada na estrutura secundária de rFSH varia com os excipientes adicionados. A adição de conservante (álcool benzílico) dá origem a uma perda maior de estrutura secundária de rFSH do que para soluções de rFSH não contendo nenhum conservante, enquanto a adição de sal (sulfato de sódio) produz uma perda menor de estrutura secundária de rFSH do que para soluções de rFSH sem sal adicionado. Uma perda de estrutura secundária de rFSH ordenada pode ser interpretada como uma desnaturação parcial ou completa da proteína. Exemplo 4 - Dados de Calorimetria diferencial de varredura (DSC) para hCG Gonadotrofina Coriônica Humana (hCG) é uma proteína hetero- dimérica consistindo em dois monômeros glicosilados: uma subunidade α de 92 aminoácidos que é comum para hCG, Hormônio Folículo Estimulante (F- SH), Hormônio Luteinizante (LH) e Hormônio Estimulante da Tireoide (TSH), e uma subunidade β de 145 aminoácidos que é específica para hCG. Os hormônios de glicoproteína, compreendendo FSH e hCG, todos perdem sua bioatividade na dissociação dos monômeros não covalentemente ligados. Resultados das análises de estabilidade indicaram que a instabilidade de FSH recombinante (rFSH) é principalmente fundamentada na dissociação de dímero (decomposição da estrutura quaternária, e diminuição concomitante na resposta de imunoligação).
O objetivo deste exemplo é estabelecer se a dependência previ- amente observada de vários açúcares e sais sobre a temperatura de desna-turação de rFSH, como determinado com DSC, e como descrito nos exemplos 1 a 3 acima, também é observado para a hCG proteica muito similar. Adicionalmente, a temperatura de desnaturação de DSC para hCG determinada neste estudo é comparada com os dados de estabilidade em tempo real previamente publicados (Samaritani, F. 1995, hCG liquid formulations. EP 0 814. 841).
A temperatura de desnaturação de hCG foi estudada na presença e ausência de 0,1 M de vários sais de sódio ou sacarose em um tampão de fosfato a 1 mM contendo 0,5 mg/ml de L-metionina e 0,005 mg/ml de polissorbato 20. Quatro tipos de açúcar e sais diferentes são investigados; sacarose, sulfato de sódio, cloreto de sódio e perclorato de sódio.
Gonadotrofina coriônica humana derivada urinária (hCG) hCG, substância medicamentosa, lote n2 2823287510 (7059 IU/mg) como purificada da urina humana de Massone S.A., Argentina foi u- sada. © material foi armazenado refrigerado a 2 a 8°C.
Determinação da atividade biológica do lote de hCG acima foi realizada de acordo com Ph. Eur.
O rFSH e outros materiais foram usados como descrito nos E- xemplos 2 a 3. Tabela 25: Lista de excipientes
A composição das formulações de hCG diferentes são listadas na Tabela 26. Tabela 26: Composição de formulações de hCG
‘Corresponde a 35 300 IU/ml para este lote.
Todas as soluções (Tabela 26) são fabricadas em escala laboratorial na Ferring Pharmaceuticals A/S, Copenhagen, Dinamarca.
Soluções de estoque de todos os excipientes são preparadas em água Milli-Q. Soluções de placebo com os vários excipientes são preparadas a partir da solução de estoque. A substância medicamentosa de hCG é dissolvida nas soluções de placebo para obter as concentrações fornecidas na Tabela 26. Visto que dados de estabilidade para estas formulações não foram disponíveis, as análises de DSC são sempre realizadas em amostras recentemente preparadas; dentro de uma hora a partir da preparação da amostra.
Como pode ser observado na Figura 4 e Tabela 27, a temperatura de desnaturação, Tm, para hCG é mais baixa do que a Tm para rFSH. Adi-cionalmente, a entalpia do processo de desnaturação (isto é, o tamanho do pico de desnaturação) é acentuadamente menor para hCG do que para rFSH. De modo diferente para rFSH onde o processo de desnaturação é qua- se completamente irreversível depois de aquecer as amostras de rFSH a 100°C, o processo de desnaturação depois de aquecer hCG a 100°C é, em maior grau, reversível (2). Nativa «-> Desdobrada ->Irreversivelmente Desnaturada(2)
Uma explicação para o fato de que o processo de desnaturação de hCG é, em grande medida, reversível no prazo das medições de DSC, enquanto isto não é verdade para rFSH, pode ser se as duas subunidades em hCG são menos propensas a dissociar do que em rFSH. Se as subunidades não dissociam enquanto aquecendo as amostras de hCG a estrutura nativa pode ser mais facilmente reformada novamente no resfriamento até a temperatura ambiente. A magnitude do ΔH para a transição no aquecimento a 100°C é acentuadamente maior para rFSH do que hCG, enquanto a magnitude de ΔH para a transição em uma varredura concomitante (isto é, aquecer a amostra a 100°C, resfriar a 25°C e realizar uma segunda varredura a 100°C) está na mesma faixa de tamanho para rFSH e hCG.
A adição de sal a soluções de proteína aquosas é esperada in-fluenciar a estabilidade da proteína na solução e consequentemente afetar a temperatura de desnaturação da proteína.
Quando da medição do efeito de vários sais de sódio sobre Tm de hCG e rFSH muito surpreendentemente, o efeito de estabiliza- ção/desestabilização esperado de acordo com a série de Hofmeister não é observado quando da variação dos ânions, ver a Figura 5, Figura 6 e Tabela 27. Para hCG tanto sulfato de sódio quanto cloreto de sódio estão realmente desestabilizando a proteína, enquanto para rFSH estes sais estabilizam a proteína. Tanto para hCG quanto para rFSH perclorato de sódio, que é esperado ter um efeito de desestabilização sobre proteínas realmente aumentou a Tm na maioria de todos os açúcares e sais testados. Tabela 27: Temperatura de desnaturação, Tm, e mudança na temperatura de desnaturação, ΔTm(açúcar/sal), para amostras de hCG contendo 5 mg/ml de hCG, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 na adição de açúcar ou sal a 0,1 Me amostras de rFSH contendo 2,4 mg/ml de rFSH, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5 na adição de açúcar OU sal a 0,1 M. ATm(açúcar/sal) = Tm(açúcar/sal) " Tm(nenhum açúcar/sal)-
Dissociação de Subunidades de rFSH, Pureza de rFSH Durante o Armazenamento
Visto que rFSH perde sua bioatividade na dissociação dos mo-nômeros não covalentemente ligados, um modo direto para seguir a perda de atividade de rFSH devido à dissociação de monômero é medir a quantidade de formas de LMW de rFSH na solução. Esta informação pode ser recuperada da cromatografia por SEC, onde formas de LMW eluindo depois do pico principal de rFSH são conhecidas originar-se de rFSH dissociado.
Na formulação estudada, nenhum outro composto relacionado à proteína, tais como agregados de rFSH é observado. Consequentemente, a pureza de proteína de rFSH pode ser calculada como
Pureza (%) = 100%- formas de LMW (%) (4) Tabela 28: A pureza de rFSH (%) como determinado por SEC depois do ar-mazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH.
Como pode ser observado na Tabela 28, soluções de rFSH re centemente preparadas contendo açúcar ou sais diferentes, com e sem con-servante adicionado revelam pureza similar, isto é, quantidades relativas similares de rFSH dissociado (formas de LMW).
Já depois de armazenamento de um mês a 30°C, a pureza de rFSH diminui para amostras contendo fenol junto com sacarose ou nenhum açúcar ou sal, ao passo que amostras contendo fenol e sulfato de sódio ou cloreto de sódio junto com amostras sem fenol adicionado não exibiram nenhuma diminuição significante na pureza de rFSH (ver a Tabela 28). Depois de seis meses de armazenamento a 30°C, as amostras de rFSH contendo fenol sem açúcar ou sal adicionado produzem uma pureza de rFSH de menos do que 80 %. As amostras de rFSH contendo fenol tendo sacarose como estabilizador também exibem uma diminuição acentuada na pureza de rFSH, ao passo que amostras contendo fenol estabilizadas com cloreto de sódio ou sulfato de sódio apenas exibem uma diminuição minúscula na pureza de rFSH (ver a Tabela 28). Amostras não contendo nenhum conservante são mais estáveis com respeito à dissociação durante o armazenamento, isto é, elas exibem a pureza mais alta, entretanto, para uma formulação de dose múltipla aquosa intencionada para uso parenteral, a adição de um conservante é necessária.
Dados previamente publicados sobre mudanças na pureza de hCG no armazenamento são usados como comparação aos dados de estabilidade de rFSH apresentados acima (Samaritani, supra). Já depois do armazenamento de um mês a 50°C, a pureza de hCG diminui acentuadamen- te. A diminuição é significativamente mais-alta para amostras contendo cloreto de sódio do que para amostras contendo sacarose (ver a Tabela 29).
Depois de seis semanas de armazenamento a 50°C, a pureza de hCG de amostras contendo cloreto de sódio é mais do que 10 % mais baixa do que para amostras contendo sacarose. Tabela 29: A pureza de hCG (%) como determinado por SEC depois do ar-mazenamento a 50°C. A descrição completa das formulações é listada na página 11 na patente EP 0814841.
Como pode ser observado na Tabela 30, a temperatura de des naturação tanto de rFSH quanto de hCG obtida por DSC correlaciona-se bem com a pureza de rFSH e hCG como obtido a partir de dados de estabilidade em tempo real. A correlação similar entre DSC e estabilidade em tempo real como analisado por SEC foi apresentada previamente para anticorpos recombinantes e glicoproteínas recombinantes.
Dados de estabilidade em tempo real para rFSH são determinados a 30°C. Visto que o produto de rFSH é intencionado para armazenamento refrigerado a longo prazo, 25 a 30°C é uma faixa adequada para estudos de estabilidade acelerados. Dados de estabilidade em tempo real para hCG estão apenas disponíveis por até 12 semanas de armazenamento a 50°C, 11 semanas de armazenamento a 25°C e 40°C e 6 semanas de armazenamento a 50°C.5 Para temperaturas de 40°C ou mais baixas, a diminuição na pureza de hCG é menos do que 6 % durante o armazenamento tanto para formulações com sacarose quanto com cloreto de sódio e portanto é difícil diferenciar entre o efeito de vários açúcares e sais já depois de 11 a 12 semanas de armazenamento. Apenas a 50°C, as várias formulações podem ser diferenciadas claramente, ainda que a tendência observada em temperaturas mais baixas sejam as mesmas como a 50°C. Tabela 30: A pureza como determinado por SEC e a temperatura de desna-turação como determinado com DSC para hCG e rFSH. A pureza para hCG é determinada depois de 6 semanas de armazenamento a 50°C e a pureza para rFSH é determinada depois de 6 meses de armazenamento a 30°C.
*Amostras contendo 10 000 IU/ml de hCG, 154 mM de NaCI ou 300 mM de sacarose, 10 mM de tampão de fosfato no pH 7. **Amostras contendo 5 mg/ml (35 300 IU/ml) de hCG, açúcar ou sal a 0,1 M, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5.
#Amostras contendo 600 IU/ml de rFSH, 43 mM de Na2SO4 ou 120 mM de NaCI ou 219 mM de sacarose, 1,0 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de
Polissorbato 20, 5 mg/ml de fenol, 1 mM de tampão de fosfato de sódio no pH 6,5. ##Amostras contendo 2,4 mg/ml (36 300 IU/ml) de rFSH, açúcar ou sal a 0,1 M, 0,5 mg/ml de L-metionina, 0,005 mg/ml de Polissorbato 20, 1 mM de tam-pão de fosfato de sódio no pH 6,5.
Estudos da estabilidade de hCG e rFSH em várias soluções por meio de temperaturas de desnaturação de hCG e rFSH assim como purezas de hCG e rFSH depois do armazenamento em temperaturas elevadas pro-duzem evidência clara para a influência de açúcares e sais diferentes sobre a estabilidade de hCG e rFSH na solução. As duas técnicas usadas, DSC líquida e cromatografia por SEC, ambas exibem resultados harmoniosos. Estes resultados foram claramente confirmados pelos presentes dados de estabilidade em tempo real.
Estudos da estabilidade de rFSH em várias soluções por meio de mudanças na estrutura secundária de rFSH (por espectroscopia de CD - Exemplo 1), temperatura de desnaturação de rFSH (mudanças na estrutura terciária e quaternária por DSC - Exemplo 2) ou a quantidade relativa de rF- SH dissociado formado depois do armazenamento a 30 ± 2°C/65 ± 5 % de RH (mudanças na estrutura quaternária por SEC - Exemplo 3) produzem evidência clara para a influência de conservantes e estabilizadores sobre a estabilidade de rFSH em solução. As três técnicas usadas, CD, DSC e cro- 5 matografia por SEC todas exibem resultados harmoniosos.
Concluindo os resultados de todos os Exemplos 1 a 3, é claramente observado que a adição de um conservante, fenol ou álcool benzílico, diminui a estabilidade de rFSH na solução. Outros conservantes fenólicos, como m-cresol e clorocresol são esperados dar origem a efeitos de desesta- 10 bilização similares. O efeito de desestabilização observado para rFSH na adição de conservante corresponde bem ao estado do conhecimento da técnica dentro da área.
A adição de um sal de Na+ ou K+ de metal alcalino farmaceuti-camente aceitável a soluções de rFSH neutraliza o efeito de desestabiliza- 15 ção de conservantes sobre rFSH e - o mais vantajosamente - aumenta a estabilidade de rFSH em solução quando comparado com soluções de rFSH não contendo nem um conservante nem um sal. Todos os sais de sódio e potássio testados dão origem à estabilidade de rFSH aumentada independente dos ânions usados; por exemplo, ânions inorgânicos como sulfato, 20 cloreto e perclorato e também usando ânions orgânicos como citrato, acetato e tartarato. A variação do cátion dos sais produz um impacto grande sobre o grau de estabilização de rFSH; cátions monovalentes, especificamente sais com os cátions sódio ou potássio dão origem a um efeito de estabilização pronunciado sobre rFSH. A adição de perclorato de sódio a uma solução de 25 rFSH dá origem às soluções de rFSH mais estáveis, entretanto, percloratos são geralmente altamente reativos e agentes oxidantes e percloratos são portanto não aprovados como ingredientes ativos em formulações farmacêuticas. Consequentemente, sais de sódio ou sais de potássio de sulfato e cloreto, são os agentes estabilizantes mais favoráveis. A adição de sacarose a 30 soluções de hCG ou rFSH produzem um aumento leve na estabilidade proteica, tanto para hCG quanto para rFSH, enquanto a adição de cloreto de sódio tem um efeito de desestabilização sobre hCG e um efeito de estabiliza- ção sobre rFSH (ver o exemplo 4). A adição de perclorato de sódio a soluções de hCG e rFSH tem um efeito de estabilização tanto sobre hCG quanto sobre rFSH (exemplo 4). O efeito estabilizante destes sais sobre soluções de rFSH é surpreendentemente claramente melhor do que o efeito estabilizante observado para sacarose.
As conclusões destes resultados são as seguintes: 1) sob as condições estudadas, os efeitos do sal sobre a estabi-lidade de hCG e rFSH não segue a série de Hoffmeister 2) apesar do fato de que hCG e FSH são estruturalmente muito similares (isto é, eles pertencem à mesma classe de proteínas, eles são ambos glicosilados e eles ambos consistem em duas subunidades das quais a subunidade α é idêntica nas duas proteínas), o efeito de vários açúcares e sais como sacarose e cloreto de sódio sobre a estabilidade proteica é diferente para hCG e rFSH. Muito surpreendentemente, para as proteínas muito similares como hCG e rFSH, sais não exibem o mesmo efeito de estabilização. 3) sais de Na+ e K+ exibem seu efeito estabilizante sobre soluções de FSH, independente dos ânions usados. 4) o efeito estabilizante de sais de Na+ e K+ sobre as soluções de FSH pode contrariar o efeito desestabilizante dos conservantes.
As seguintes abreviações e definições são usadas por todo o texto e Exemplos: ΔTmMudança na temperatura de desnaturação na adição de um conservante ou sal, ver ainda Tm ARTs Tecnologias de reprodução assistida BA álcool benzílico BTG Bio-Technology General CD Dicroísmo circular CHO Ovário de hamster chinês CoA Certificado de Análise DNA Ácido Desoxirribonucleico DSC Calorimetria diferencial de varredura FSD Disfunção sexual feminina FSH Hormônio folículo estimulante hCG Gonadotrofina Coriônica Humana IU Unidades Internacionais
Uma medida da bioatividade de rFSH como determinado por um Bioensaio de Steelman-Pohley de acordo com Ph. Eur. e USP. IUI Inseminação intrauterina LC-UV Cromatografia Líquida com Detecção Ultravioleta LH Hormônio luteinizante LMW Forma de peso molecular baixo, consiste principalmente ou unica mente em proteína monomérica dissociada. OI Indução da ovulação p.a. Pró-análise Ph. Eur. Farmacopeia Europeia RH Umidade relativa rFSH Hormônio folículo estimulante humano recombinante SEC Cromatografia de exclusão por tamanho SRCD Dicroísmo circular com radiação sincrotrônica Tm Ponto central da transição térmica ou Ponto central de transição ou Temperatura de desnaturação
A temperatura quando metade das moléculas de proteína são dobradas e metade das moléculas de proteína são desdobradas. TRIS 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol TSH Hormônio estimulante da tireoide USP Farmacopeia dos Estados Unidos UV Ultravioleta
Claims (10)
1. Uso de sais compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de ser para limitar a tendência de FSH em dissociar em uma formulação líquida de FSH, em que o sal é Na2SO4 ou uma combinação de NaCl e Na2SO4.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sal é compreendido em uma quantidade de 20 a 500 mM, ou em uma quantidade de 30 a 300 mM ou em uma quantidade de 50 a 200 mM.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a formulação de FSH é uma formulação de rFSH.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a formulação adicionalmente compreende um conservante.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende álcool benzílico, fenol e/ou m- cresol.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a formulação é uma formulação injetável.
7. Método para limitar a tendência de FSH em dissociar em uma formulação líquida de FSH, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de uma adição de sal compreendendo cátions de metal alcalino farmaceuticamente aceitáveis à dita formulação, em que o dito sal é Na2SO4 ou uma combinação de NaCl e Na2SO4.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o FSH é rFSH.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a formulação adicionalmente compreende um conservante.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o conservante é selecionado do grupo consistindo em álcool benzílico, fenol e m-cresol.
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