JP2008519010A - Fshの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の対象は、組換えFSH又は組換えFSH変異体を精製するための新規な方法を供することである。
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;及び
(3)逆相クロマトグラフィー;
を含んで成る方法を供する。
以下の略語が発明の記載において使用される。
DF:ダイアフィルトレーション;
FSH:卵胞刺激ホルモン;
r−FSH:組換えFSH;
hFSH:ヒトFSH;
r−hFSH:組換えヒトFSH
BV:総容積
DEAE:ジエチルアミノエチル
ELISA:酵素結合免疫測定法
DAC:色素アフィニティークロマトグラフィー
IMAC: 固定化金属イオンアフィニティー
OD:吸光度
HIC:疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
IRMA:免疫放射線測定法
KD又はkD:キロダルトン
HCP:宿主細胞タンパク質、FSHの発現のために使用される宿主細胞由来のタンパク質
IPC:工程管理
IEF:等電点電気泳動
PES:ポリエーテルスルホン
RP−HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
Q FF:Q Sepharose FFにおける陰イオン交換
RT :室温
UF:限外濾過
WFI:注射用水
本発明は、粗FSHを含有する液体から出発する組換えヒトFSH又は組換えFSH変異体の精製方法であって、以下の工程(いずれの順番で行ってもよい):
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;及び
(3)逆相クロマトグラフィー;
を含んで成る方法を供する。
本発明の方法は、色素アフィニティークロマトグラフィー(1)の工程を含む。好ましい態様において、色素アフィニティークロマトグラフィーの工程は、固定化リガンドとして、当業者に周知な染色化合物、すなわちCibacron Blue F3G−Aを有する樹脂を使用して行うことができる。「固定化」の語は、当業者にはよく理解され、そして樹脂に化学的に結合するという意味においてリガンドが誘導化されることを意味する。特に好ましい樹脂は、Blue Sepharose FFである(Amersham Biosciences Inc.から得られる)。Blue Sepharose FFの技術的特長は以下のとおりである:
該方法はまた、疎水性相互作用クロマトグラフィー(2)の工程を含む。好ましい態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、例えば、Toyopearl Butyl 650M(Tosoh Biosep Inc.から得ることができる)等の樹脂で行われる。
本発明の方法はまた、逆相クロマトグラフィー(RPC)(3)の工程を含んで成る。該RPCは、好ましくは、例えば、SOURCE 30RPC(Amersham Biosciencesから得ることができる) 等の樹脂を使用して行われる。工程(3)は、類似する特性を有する当業者に周知な他の樹脂を使用して行うことができるものと理解される。
上に概要した3つの主要な精製工程に加えて、本発明は追加的な精製工程を含んでよい。
イオン交換体のタイプ: 強陰イオン
総容量(mmol/ml): 0.18〜0.25
排除限界(球状タンパク質): 4×106
ビーズ形態: 球状、直径45〜165μm
ビーズ構造: 架橋型アガロース、6%
操作上のpH安定性: 2〜12
洗浄pH安定性: 1〜14
25℃、1bar、15cmベッド高、XK 50/30カラムにおける線流速:
400〜700cm/h
(0)好ましくは強陰イオン交換樹脂[好ましくは第四級アンモニウム樹脂、例えば、Q Sepharose FF、又はFractogel EMD TMAE]における陰イオン交換クロマトグラフィー;
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー[好ましくはBlue Sepharose FFにおける];
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー[好ましくはToyopearl Butyl 650Mにおける];及び
(3)逆相クロマトグラフィー[好ましくはSource 30 RPCにおける]、
を含んで成る。
イオン交換クロマトグラフィー(0)の工程の前に、粗FSHを濃縮するために限外濾過の工程を行うことが望ましい。限外濾過(又はダイアフィルトレーション)は、好ましくは約3〜10kD、最も好ましくは約8kDのカットオフを有する膜を使用して行われる。
更に好ましい態様において、本発明の方法はまた、陰イオン交換クロマトグラフィー(4)の第二工程を含んで成る。好ましい樹脂は、上述のとおり、Fractogel EMD TMAE HICAP(Merck KGaA, Darmstadt Germanyから得ることができる)、又は類似する特性を有する樹脂である。あるいは、陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程は、上述のとおり、Q Sepharose FF、又は類似する特性を有する他の樹脂において行うことができる。
(0)陰イオン交換クロマトグラフィー、(1)色素アフィニティークロマトグラフィー、(2)相互作用クロマトグラフィー(HIC)、(3)逆相クロマトグラフィーRPC;そして(4)第二陰イオン交換クロマトグラフィー。
更に好ましい態様において、いずれかのクロマトグラフィーの工程後(特に、逆相クロマトグラフィーの工程後)、FSH試料を濃縮工程にかける。好ましくは、該工程は所望の組成を有するバルクを得るために、ダイアフィルトレーションと併用した限外濾過を使用して行われる。該限外濾過(ダイアフィルトレーション)は、好ましくは約3〜10kD、最も好ましくは約5kDのカットオフを有する膜を使用して行われる。
(−1) 限外濾過(好ましくは約8kDのカットオフを有する膜を伴う)、
(0) 陰イオン交換クロマトグラフィー(好ましくは、Q Sepharose FFカラムを使用する);
(1) 色素アフィニティークロマトグラフィー(好ましくは、Blue Sepharose FFカラムを使用する);
(2) 相互作用クロマトグラフィー(HIC)(好ましくは、Butyl 650Mカラムを使用する);
(3) 逆相クロマトグラフィー(好ましくは、Source 30 RPCカラムを使用する);
(4) 強塩基性陰イオン交換樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィー(好ましくはTMAE hicup 樹脂を使用する);及び
(5) 限外濾過(好ましくは5kDのカットオフを有する膜を伴う)。
(−1) 限外濾過(好ましくは約8kDのカットオフを有する膜を伴う)、
(0) 陰イオン交換クロマトグラフィー(好ましくは、Q Sepharose FFカラムによる);
(1) 色素アフィニティークロマトグラフィー(好ましくは、Blue Sepharose FFカラムによる);
(2) 相互作用クロマトグラフィー(HIC)(好ましくは、Butyl 650Mカラムによる);
(3) 逆相クロマトグラフィー(RPC)(好ましくは、Source 30RPCカラムによる);
(4) 強塩基性陰イオン交換樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィー(好ましくはTMAEハイカップ樹脂による);
(4’) ナノ濾過
(5) 限外濾過(好ましくは5kDのカットオフを有する膜を伴う)。
上述のとおり精製処理からもたらされ、そして精製されたFSHを含有する液体組成物は、そのまま、又は精製後凍結させることができ、溶媒を除去するために溶出物を凍結乾燥(フリーズドライ)にかけてもよい。生じる液体又は凍結乾燥生成物は、「FSHバルク」と名づけられる。
本発明のFSH又はFSH変異体、あるいは本発明の方法に従う精製物は、筋肉内又は皮下における、好ましくは皮下における注射用に処方することができる。FSH製剤はフリーズドライすることがき、この場合、注射の直前にこれを注射用水に溶解させる。FSH製剤はまた、液体製剤でもよく、この場合、これをあらかじめ溶解することなく、直接注射することができる。
本発明のFSHは、FSHが示される場合の全ての処理における用途に適当である。これは補助生殖医療のための排卵誘発、過排卵誘発、及び精子減少症の治療における皮下投与に特に適当である。これは他のゴナドトロピン、例えば、LH、及びhCGと組み合わせて使用することができる。これはまた、FSHに対する応答を増大する更なる化合物、例えば、クエン酸クロミフェン、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ファドロゾール、及びYM−511と共に使用することができる。
上述のとおり、FSHは、α−及びβ−サブユニットから構成されるヘテロ二量体糖タンパク質である。いくらかのサブユニットの解離が起こり、これは試料中に存在する遊離αサブユニットの量に着目することによりモニターできる。更にFSHサブユニットは酸化し得る。酸化混入物はRP−HPLCを使用して定量化することができ、一方遊離サブユニットはSDS−PAGEを使用して評価することができる。
試料中のFSH含有量は、FSHに特異的なイムノアッセイ、例えば、DELFIA FSHイムノアッセイを使用して測定することができる。
いずれかのタンパク質調製と同様に、総タンパク質含有量は、例えば、Bradfordアッセイ、Lowryアッセイといった技術を使用して、あるいは280nmにおける吸光度により測定することができる。
上述のとおり、FSHは、両サブユニットにおける多様な場所において付着する複数のオリゴ糖残基を有する糖タンパク質である。該オリゴ糖残基は、異なる程度の分岐を有し、そしてシアル酸残基でキャップされてよい。シアル酸は負に帯電している(中性pHにおいて)。キャッピングにおける違いは、異なる等電点(pI)を有する種類の混合物を伴う不均一性に導く。これは例えば、等電点電気泳動(IEF)のような電荷に基づき分離する技術を使用して評価することができる。
宿主細胞タンパク質は、ELISAアッセイを使用して分析することができる。例えば、抗体は、FSH遺伝子を有さない宿主細胞の培養液である「偽の培養液」に上げることができる。
工程(1):Blue Sepharoseにおける色素アフィニティークロマトグラフィー
精製のためのFSH出発物質は、組換えFSH、すなわち血清培地中又は無血清培地中のいずれかにおけるCHO細胞中で組換え的に産生されたFSHを含有する細胞培養液回収物から調製される。色素アフィニティークロマトグラフィーカラム(Blue Sepharose FF樹脂)を、L−メチオニンを含有するpH8.5における低伝導率緩衝液で平衡化させる。添加後、平衡緩衝液を使用して結合されていない物質を洗い流す。最後にカラムを、NaCl及びL−メチオニンを含有するpH7.0におけるリン酸ナトリウムで流すことによりFSHを溶出させる。該溶出プールを次の工程に直接処理する。該工程は2〜8℃において行う。
工程(1)由来のBlue Sepharose FF溶出物を、硫酸アンモニウム及びL−メチオニンを含有するpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液に対して平衡化したToyopearl Butyl 650Mカラムに添加する。平衡緩衝液で結合されていない物質を洗い流す。より低濃度の硫酸アンモニウムであるが、同じ緩衝液でFSHを溶出させる。溶出物を次の工程において処理する。該工程は室温で行われる。
まず、IPA(イソプロパノール)の添加により、HIC溶出物(工程(2)由来)を調整する。Source 30 RPCカラムを、調整した添加物質と同じ濃度におけるL−メチオニン及び2−プロパノールを含有するpH7.6の酢酸アンモニウム緩衝液に対して平衡化する。平衡緩衝液で結合していない物質を流した後、該樹脂を、L−メチオニン及び上昇させた濃度の2−プロパノールを含有するpH7.6の酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。更に2プロパノールの濃度を上昇させることにより、FSHを最終的に溶出させる。最後に、該溶出プールを、撹拌しながらL−メチオニンを含有する水で希釈する。該希釈したプールを次の工程において処理する。該工程は室温で行われる。
工程(−1):濃縮r−hFSHの限外濾過/ダイアフィルトレーション
全ての操作は冷却遠心条件(2〜8℃)において行った。精製のための出発材料を形成する粗FSHは、組換えFSHを含有する細胞培養液回収物に由来する。
粗r−hFSHを、0.5μmのデプスフィルター(例えば、Pall Profile IIフィルター又はこれと同等のもの)を通して濾過した。
まず、10KDポリエーテルスルホン膜を使用して、限外濾過により清澄化した未精製物を濃縮した。それから、濃縮した保持液(retentate)を、抗酸化剤としてL−メチオニンを含有するpH8.5の少なくとも5回量(diavolume)のホウ酸緩衝液でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの進行をモニターするために保持液の伝導率及びpHを測定した。それから該系を排出する更に前に、保持液を濃縮した。限外濾過ユニットは最後にダイアフィルトレーション緩衝液で流し、そしてリンス液を回収した保持液と混合した。該プールを次の工程に用いた。
濃縮した生成物を、0.2μmのポリエーテルスルホンフィルター(又はこれと同等のもの)を通して濾過した。
それから、濾過した物質を、L−メチオニンを含有するpH8.5のホウ酸ナトリム緩衝液に対して平衡化した強陰イオン交換(Q セファロース FF)樹脂に適用した。添加後、結合していない全ての物質を流すために、該カラムを平衡緩衝液でリンスした。それから該カラムを、NaCl(伝導性を増すため)及びL−メチオニン(抗酸化剤として)を含有するpH8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で溶出させた。回収した溶出プールは、色素アフィニティークロマトグラフィーにおいて処理した。
まず、色素アフィニティークロマトグラフィーカラム(Blue SepharoseFF樹脂)を、Q−セファロースFF工程由来の溶出緩衝液で平衡化した。それから捕獲溶出物を樹脂に直接適用した。添加後、平衡緩衝液を使用して結合されていない物質を洗い流した。最後に、該カラムを、NaCl及びL−メチオニンを含有するpH7.0におけるリン酸ナトリウムで流すことによりFSHを溶出させた。該溶出プールを次の工程において直接処理した。該工程は2〜8℃において行った。
Blue Sepharose FF溶出物を、硫酸アンモニウム及びL−メチオニンを含有するpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液に対して平衡化したToyopearl Butyl 650Mカラムに添加した。平衡緩衝液で結合されていない物質を洗い流した。低濃度の硫酸アンモニウムであるが、同じ緩衝液でFSHを溶出させた。溶出物を次の工程において処理した。該工程は室温で行った。
まず、IPA(イソプロパノール)の添加により、HIC溶出物(工程(2)由来)を調整した。Source 30RPCカラムを、調整した添加物質と同じ濃度における、L−メチオニン及び2−プロパノールを含有するpH7.6の酢酸アンモニウム緩衝液に対して平衡化した。平衡緩衝液で結合していない物質を流した後、該樹脂を、L−メチオニン及び上昇濃度の2−プロパノールを含有するpH7.6の酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄する。更に2プロパノールの濃度を上昇させることにより、FSHを最終的に溶出させる。最後に、該溶出プールを、撹拌しながらL−メチオニンを含有する水で希釈する。該希釈したプールを次の工程において処理する。該工程は室温で行った。
まず、Fractogel EMD TMAE hicapカラムをL−メチオニンを含有するpH8.5のホウ酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。希釈したポスト−RPC物質(工程(3)由来))を該カラムに添加した。平衡緩衝液を使用して結合していない物質を流した。FSHを、直線的に塩濃度が増加するカラムから溶出する。該工程は2〜8℃において行った。
Fractogel EMD−TMAE工程(4)由来の溶出物を、窒素雰囲気下における3barの気圧において20nmのナノ濾過装置に直接適用した。該濾液を次の工程において処理する。該操作は2〜8において行った。
ナノ濾過したFSH物質を、5KDポリエーテルスルホン膜において接線流濾過により濃縮した。保持液が初期容量のおよそ半分に達してから、該物質をWFIに対するダイアフィルトレーションにより緩衝液交換した。
精製したr−hFSHの生物活性を、Steelman−Pohley卵巣重量増加法を使用して測定した。比活性は、以下のとおりSE−HPLC法により測定したFSH含有量で割った生物活性を使用して計算した。
配列番号1:ヒト糖タンパク質α−サブユニット;
配列番号2:hFSHβ−サブユニット
配列番号3:hFSHβ−サブユニット変異体1
配列番号4:hFSHβ−サブユニット変異体2
配列番号5:hFSHβ−サブユニット変異体3
Claims (28)
- 組換えFSH又はFSH変異体を精製するための方法であって、FSHを含有する液体を:
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;そして
(3)逆相クロマトグラフィー;
にかける工程(いずれの順番で行ってもよい)を含んで成る方法。 - 工程(1)の色素アフィニティークロマトグラフィーが、固定化Cibacron Blue F3G−Aを有する樹脂で行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(1)の色素アフィニティークロマトグラフィーに使用される樹脂が、Blue Sepharose FFである、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(1)の色素アフィニティークロマトグラフィーが、溶出剤として、約6.5〜11.5のpHにおけるリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)の疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)が、Toyopearl Butyl 650M、又はこれと同様の特性を有する樹脂を使用して行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(2)の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、溶出剤として、リン酸ナトリウム/硫酸アンモニウムを使用して行われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(3)の逆相クロマトグラフィーの工程が、樹脂として、SOURCE 30 RPCを使用して行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(3)の逆相クロマトグラフィーの工程が、溶出剤として、2−プロパノールを伴う酢酸アンモニウムを使用して行われる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程が、以下の順番:
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;その後
(3)逆相クロマトグラフィー;
で行われる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 更に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程(0)の工程を含んで成る、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換クロマトグラフィーの工程が、工程(1)、(2)及び(3)の前に行われる、請求項10に記載の方法。
- 前記工程が、以下の順番:
(0)陰イオン交換クロマトグラフィー;
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;そして
(3)逆相クロマトグラフィー;
で行われる、請求項11に記載の方法。 - 工程(0)の陰イオン交換クロマトグラフィーが、Q Sepharose FF樹脂、又はFractogel EMD TMAE HiCap樹脂で行われる、請求項10、11又は12に記載の方法。
- 工程(0)のイオン交換クロマトグラフィーが、溶出剤として、ホウ酸緩衝液を使用して行われる、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ホウ酸緩衝液が、約8.5のpHである、請求項14に記載の方法。
- 更に、陰イオン交換クロマトグラフィー工程(4)の第二工程を含んで成る、請求項10〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(4)の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、工程(1)、(2)及び(3)の後に行われる、請求項16に記載の方法。
- 前記工程が、以下の順番:
(0)陰イオン交換クロマトグラフィー;
(1)色素アフィニティークロマトグラフィー;
(2)疎水性相互作用クロマトグラフィー;
(3)逆相クロマトグラフィー;そして
(4)陰イオン交換クロマトグラフィー;
で行われる、請求項17に記載の方法。 - 工程(4)の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、Fractogel EMD TMAE HiCap樹脂、又はQ Sepharose FF樹脂を使用して行われる、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(4)の陰イオン交換クロマトグラフィーの第二工程が、ホウ酸緩衝液及び増加性NaCl濃度の勾配を使用して行われる、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ナノ濾過工程(4’)の工程を含んで成り、陰イオン交換クロマトグラフィー工程(4)の第二工程が行われる、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ナノ濾過(4’)の工程後に、限外濾過(5)の工程を含んで成る、請求項21に記載の方法。
- いずれかの溶出剤及び/又は緩衝液が、抗酸化剤、特にL−メチオニンを含んでよい、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト組換えFSHを精製するための方法であって、FSHを以下の工程:
(−1) 限外濾過;
(0) 溶出剤として約8.5のpHにおけるホウ酸塩/NaCl、L−メチオニンでのQ Sepharose FFにおける陰イオン交換クロマトグラフィー;
(1) 工程(0)の溶出物を、Blue Sepharose FF、及び溶出剤として約7のpHにおけるリン酸塩、NaCl、L−メチオニンにおける色素アフィニティークロマトグラフィーにかける工程;
(2) 工程(1)の溶出物を、溶出剤として約7のpHにおけるリン酸塩、硫酸アンモニウム、L−メチオニンによるToyopearl Butyl 650Mにおける相互作用クロマトグラフィーにかける工程;
(3) 工程(2)の溶出物を、溶出剤として約7.6のpHにおける2−プロパノールを伴う、酢酸アンモニウム、L−メチオニンによるSource 30 RPCにおける逆相クロマトグラフィーの工程にかける工程;
(4) 工程(3)の溶出物を、約8.5のpHにおけるホウ酸塩、L−メチオニン、及びNaClによる、Fractogel EMD TMAE hicap樹脂における陰イオン交換クロマトグラフィーの工程にかける工程;
(4’) 工程(4)の溶出物を、ナノ濾過の工程にかける工程;そして
(5) 工程(4’)の透過液を、限外濾過の工程にかける工程、
を含んで成る方法。 - 請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、組換えヒトFSH又はFSH変異体。
- 請求項25に記載のヒトFSH又はFSH変異体、並びに医薬的に許容される賦形剤を含んで成る、医薬組成物。
- 請求項25に記載のFSH、プルロニックF68、ショ糖、メチオニン、m−クレゾール、及びpH約7.0における水性リン酸緩衝液を含んで成る、請求項26に記載の医薬組成物。
- 妊娠障害の治療のための医薬の調製のための請求項25に記載の組換えヒトFSH又はFSH変異体の使用。
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