JP5865839B2 - 粘膜アジュバント組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物を少なくとも含有する粘膜アジュバント組成物及びその使用、その粘膜アジュバント組成物を含有する経粘膜感染症予防用ワクチン製剤、非ヒト動物経粘膜感染症予防方法、粘膜アジュバント組成物製造方法などに関連する。

感染症などの疾患の予防にワクチンが広く用いられている。ワクチンは、生体に免疫を与える抗原を含む生物学的製剤である。ヒトなどの動物に無毒化又は弱毒化した抗原を予め人為的に接種などし、特定の疾患に対する免疫を高めておくことにより、その疾患への罹患を予防する。

ワクチンは、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイドなどに大別できる。生ワクチンは、病原体の毒性・病原性を弱めてつくった弱毒化ワクチンで、接種した動物の体内でワクチンが増殖しうる。不活化ワクチンは、ホルマリンや紫外線などで処理をし、感染力・毒性・病原性をなくした病原体、又はその成分から調製されたワクチンで、接種した動物の体内で増殖することがない。トキソイドは、細菌のもつ毒素を取り出し、毒性をなくして免疫原性だけを残したもので、不活化ワクチンの一種である。

生ワクチンは、一般に良好な免疫応答を惹起できる場合が多いが、毒性復帰などを起こす危険性は不活化ワクチンよりも高い。一方、不活化ワクチンなどは、生ワクチンと比較して安全性が高い半面、免疫原性が弱く、単回の投与では充分な免疫効果が得られないことが多い。そのため、充分な免疫効果を得るため、不活化ワクチンでは、反復投与を行ったり、アジュバントを併用したりすることがある。

アジュバントは、抗原と混合して生体に投与することにより、その抗原に対する免疫応答を増強する物質である。不活化ワクチンなどにアジュバントを加えることにより、免疫効果を増進でき、かつ、免疫持続期間を延長できる。また、ワクチンの投与量・投与回数を減らすことができ、結果として製造量を減量できる。

最もよく知られたアジュバントとして、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバントがある。完全フロイントアジュバントは、流動パラフィン・界面活性剤・結核菌の菌体成分の混合物であり、不完全フロイントアジュバントは流動パラフィン・界面活性剤の混合物である。これらのアジュバントは、実験動物などではよく用いられるが、接種部位における強い局所反応があるため、ヒトや動物では使用されていない。その他、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、流動パラフィンなどの油性アジュバント、殺菌微生物などが知られている。なお、現時点で、ヒトで使用が許可されているのは水酸化アルミニウムゲルだけである。

呼吸器感染症など経粘膜感染症の場合、注射によるワクチン接種では、感染箇所（粘膜面）における免疫を効果的に誘導できない場合が多い。それに対し、粘膜面に確実かつ効率よく免疫応答を惹起する手段として、粘膜ワクチンが注目されている。粘膜ワクチンは、抗原を粘膜面に直接投与し、粘膜面に存在する免疫システムを誘導するワクチンである。

粘膜面の免疫システムでは、全身免疫システムにおけるＩｇＧ抗体による応答のみでなく、分泌型ＩｇＡ抗体、細胞溶解性Ｔ細胞、遅延型アレルギー反応媒介Ｔｈ１細胞などがその防御機構に関与する。その中でも、分泌型ＩｇＡ抗体は、粘膜上に分泌されて病原体を中和する機能を有し、経粘膜感染病原体に対する抵抗性に大きな役割を果たしていることが示唆されている。そのため、粘膜ワクチンは、経粘膜感染症に対し、通常の注射ワクチンよりも有効な免疫効果が得られることが期待されている。

しかし、粘膜面は常に外来異物の侵入にさらされているため、粘膜ワクチンの場合、抗原を単独で粘膜に投与しても充分な免疫を誘導できないことが多く、粘膜免疫において効果の高いアジュバント（粘膜アジュバント）の併用が必要であるとされている。ヒトでは、粘膜アジュバントとして、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの応用が試みられている。

犬に対する経粘膜感染症として、例えば、犬伝染性気管気管支炎（ケンネルコフ；Ｋｅｎｎｅｌ Ｃｏｕｇｈ）、犬ジステンパー、犬パルボウイルス感染症、犬コロナウイルス感染症、犬ヘルペスウイルス感染症などがある。犬伝染性気管気管支炎は乾咳・鼻汁・発熱などを主徴とする疾患で、犬アデノウイルス２型、犬パラインフルエンザウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（学名「Bordetella bronchiseptica」、以下同じ）などが主な病原であり、その他、犬アデノウイルス１型、犬ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューモウイルスなども病原となりうる。

猫に対する経粘膜感染症として、例えば、猫伝染性気管気管支炎、猫汎白血球減少症、猫伝染性腹膜炎・猫腸コロナウイルス感染症、猫白血病、猫免疫不全ウイルス感染症などがある。猫伝染性気管気管支炎は発熱・鼻汁・くしゃみなどを主徴とする疾患で、猫カリシウイルス、猫ヘルペスウイルスが主な病原であり、その他、クラミドフィラ・フェリス（学名「Chlamydophila felis」、以下同じ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカなども病原となりうる。

その他、ミンク、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、マウスなどにも各種経粘膜感染症が存在する。

犬の呼吸器感染症に対するワクチンとして、例えば、犬パルボウイルスの生ワクチン及び不活化ワクチン、犬ジステンパー・犬アデノウイルス・犬パラインフルエンザウイルス・犬コロナウイルスなどの混合生ワクチン及び混合不活化ワクチンなどが、それぞれ実用化されている。また、猫の呼吸器感染症に対するワクチンとして、例えば、猫ウイルス性鼻気管炎・猫カリシウイルス・猫汎白血球減少症の混合生ワクチン、アルミニウムゲルアジュバント加不活化ワクチン、油性アジュバント加不活化ワクチンなどが、それぞれ実用化されている。

ボルデテラ・ブロンキセプティカは、グラム陰性・偏性好気性の桿菌で、豚萎縮性鼻炎、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、猫、犬、豚、猿などの気管支敗血症菌病の原因菌である。また、上述の通り、犬伝染性気管気管支炎、猫伝染性気管気管支炎の原因菌の一つである。なお、ボルデテラ属の他の細菌として、百日咳菌（学名「Bordetella pertussis」）、七面鳥コリーザの原因菌（学名「Bordetella avium」）などが存在する。

豚萎縮性鼻炎に対するワクチンとして、例えば、豚ボルデテラ感染症の不活化ワクチン、精製不活化ワクチン、豚パスツレラ症との油性アジュバント加混合不活化ワクチン、パスツレラ・ムルトシダとの混合トキソイドなどが、実用化されている。

例えば、特許文献１には、ボルデテラ属菌及び毒素原性パスツレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソイドを主成分とする豚萎縮性鼻炎の予防に有効な混合トキソイドが記載されている。特許文献２には、ボルデテラ・ブロンキセプティカｐ６８抗原からなるケンネルコフに対するワクチン組成物が、特許文献３には、犬ジステンパーウイルス、犬アデノウイルス２、犬パラインフルエンザウイルス、犬コロナウイルス、犬パルボウイルス、レプトスピラのいずれか又は複数と、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ ｐ６８抗原とを含むケンネルコフに対する犬多価ワクチンが、それぞれ記載されている。特許文献４及び特許文献５には、豚由来ボルデテーラ・ブロンヒセプチイカの菌体及び菌体成分よりなる免疫増強剤が記載されている。
国際公開ＷＯ９５／３４３２２ 国際公開ＷＯ２００６／１０６４２４ 国際公開ＷＯ２００６／３８１１５ 特開昭５８−８３６２９号公報 特開昭５９−１５７０２９号公報

本発明は、経粘膜感染症などに対するワクチンの新規粘膜アジュバントを提供することなどを目的とする。

本発明者らは、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物が、経粘膜感染症などに対するワクチンによる、粘膜面における免疫反応を有効に増強することを新規に見出した。

そこで、本発明では、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物を少なくとも含有する粘膜アジュバント組成物を提供する。

この粘膜アジュバント組成物を非ヒト動物などの粘膜面に投与することにより、粘膜面における免疫を増強できる。従って、例えば、経粘膜感染症に対するワクチンとこの粘膜アジュバント組成物とを非ヒト動物に投与することにより、経粘膜感染症に対する予防効果を増大できる。

上述の通り、粘膜ワクチンの場合、ＩｇＧ抗体による応答のみでなく、分泌型ＩｇＡ抗体などによる免疫応答も誘導するため、経粘膜感染症に対し、通常の注射ワクチンよりも有効な免疫効果が得られる場合がある一方、抗原を単独で粘膜に投与しても充分な免疫を誘導できないことが多いという課題があった。それに対し、本発明では、単独で粘膜へ投与した場合には疾患予防効果が低かったワクチンにこの粘膜アジュバント組成物を混合することにより、それらの疾患を有効に予防できた。従って、本発明は、それらのワクチンを粘膜ワクチンとして利用できるようにするという点で有利性がある。

また、これにより、例えば、不活化ワクチンなどでも有効に粘膜免疫を行うことができるようになるので、弱毒生ワクチンを投与する場合よりも、毒性復帰などの危険性を回避でき、安全性をより高くできる。その他、本発明に係る免疫増強効果により、ワクチン自体の投与量を少なくでき、製造コスト・販売コストなどを低く抑えることができる。

本発明により、粘膜面における免疫を増強できる。従って、例えば、経粘膜感染症などに対するワクチンの粘膜アジュバントとして有効である。

＜本発明に係る粘膜アジュバント組成物及びその製造方法について＞
本発明は、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量３０〜５００ｋＤａの組成物であり、粘膜アジュバント活性を有するものを少なくとも含有する粘膜アジュバント組成物を全て包含する。

本発明に係る粘膜アジュバント組成物の製造方法は特に限定されない。この粘膜アジュバント組成物は、例えば、ボルデテラ・ブロンキセプティカを培養し、その培養上清から限外ろ過などにより３０〜５００ｋＤａの組成物を精製することにより取得できる。

ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌株については、特に限定されないが、例えば、ＫＲ００１−Ａ０１株（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、所在地：日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４１５、受託日：２０１０年７月９日、日本において採取された菌株）を好適に用いることができる。

ボルデテラ・ブロンキセプティカの培養方法については、液体培地を用いた公知の培養手段を採用できる。

例えば、ボルデテラ・ブロンキセプティカの公知の増殖用培養液を用いて、３０〜４０℃（好適には３７℃）で１〜７日間培養した後、その培養液を遠心分離・ろ過などし、培養上清を取得する。その培養上清を、例えば、分画分子量３０〜５００ｋＤａの限外ろ過フィルターで精製し、粘膜アジュバント組成物の原液を得る。

この原液のタンパク質濃度は０．０５〜５．０ｍｇ／ｍＬが好適である。また、ＨＡ価は１６〜２，０４８倍が好適である。

この原液を適宜希釈・調製し、アジュバントとして用いる。この粘膜アジュバント組成物の希釈倍率は特に限定されないが、例えば、一回一頭当たりの投与量をタンパク質重量で１〜５００μｇ（好適には１２〜１６０μｇ）、ＨＡ単位で１〜４００単位（好適には８〜１２０単位）になるように希釈する。

本発明に係る粘膜アジュバント組成物は、分子量３０〜５００ｋＤａの複数成分の混合物であるが、その中にＨＡ（Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ヘマグルチニン又は赤血球凝集素、約１８０ｋＤａ、以下同じ）を含み、これがアジュバント効果の有効成分の一つであると推測する。従って、この粘膜アジュバント組成物は、ＨＡを主な有効成分として含有することが好ましい。即ち、分子量１００〜３００ｋＤａであることが好適であり、分子量１５０〜２２０ｋＤａであることがより好適である。ＨＡのみを精製する場合は、公知の精製手段により行う。

その他、目的・用途などに応じて、この粘膜アジュバント組成物に、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加してもよい。

緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などを用いることができる。

等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどを用いることができる。

無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。

防腐剤の好適な例として、例えば、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル類、フェノキシエタノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などを用いることができる。

抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。

その他、この薬剤には、補助成分、例えば、保存・効能の助剤となる光吸収色素（リボフラビン、アデニン、アデノシンなど）、安定化のためのキレート剤・還元剤（ビタミンＣ、クエン酸など）、炭水化物（ソルビトール、ラクトース、マンニトール、澱粉、シュークロース、グルコース、デキストランなど）、カゼイン消化物、各種ビタミンなどを含有させてもよい。

また、目的・用途などに応じて、この粘膜アジュバント組成物に他の既知のアジュバントを適宜添加してもよい。

添加アジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、水酸化ナトリウムなどの沈降性アジュバント、流動パラフィンなどの油性アジュバント、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素などの殺菌微生物などが挙げられる。

なお、本発明は、上述の組成物の粘膜アジュバント組成物製造のための使用、及び、該組成物を調製する手順を少なくとも含む粘膜アジュバント組成物製造方法についても、全て包含する。

＜本発明に係る経粘膜感染症予防用ワクチン製剤などについて＞
本発明に係る経粘膜感染症予防用ワクチン製剤は、経粘膜感染症に対するワクチンと、上述の粘膜アジュバント組成物とを少なくとも含有するものをすべて包含する。

ワクチンは、経粘膜感染症に対するワクチンであればよく、特に限定されない。例えば、生ワクチン、不活化ワクチン、トキソイドなどと上述の粘膜アジュバント組成物を併用できる。安全性の観点、及び、本発明により免疫効果を増進できる点などから不活化ワクチンが好適である。また、ワクチンは、単独の疾患に対するものでもよく、複数の疾患に対する混合ワクチンであってもよい。

本発明に係るアジュバント組成物が特に粘膜面において免疫効果を増進することなどから、ワクチンとしては、経粘膜投与の可能なワクチン（粘膜ワクチン）が好適であり、上述の安全性の観点などを加味すると、不活化粘膜ワクチンが最も好適である。但し、本発明に係る粘膜アジュバント組成物を用いることにより免疫効果を増進できるので、例えば、従来、経粘膜投与では免疫効果が不充分であったワクチンであっても、この粘膜アジュバント組成物と併用することにより、充分な免疫効果が得られる可能性がある。従って、本発明における「粘膜ワクチン」には、粘膜面へ投与可能なワクチンがすべて包含され、粘膜アジュバント組成物との併用により初めて粘膜ワクチンとして有効になるワクチンも広く包含される（以下同じ）。

その他、ワクチンとこの粘膜アジュバント組成物を併用することにより、免疫持続期間を延長でき、また、ワクチンの投与量・投与回数を減らすことができるため、結果としてワクチンの製造量を減量できる。

このワクチン製剤の剤型などについては、公知のものを採用でき、特に限定されない。例えば、ワクチンと粘膜アジュバント組成物を含有する液体製剤として用いてもよいし、凍結乾燥などにより両者をペレット状にし、使用時に精製水などで溶解する形態を採用してもよい。その他、目的・用途などに応じて、上記と同様、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜添加してもよい。

＜本発明に係る経粘膜感染症予防方法について＞
例えば、経粘膜感染症に対する単独又は混合のワクチンと、上述の粘膜アジュバント組成物とを同時に又は個別に投与することにより、非ヒト動物経粘膜感染症を有効に予防できる。

ワクチン及び粘膜アジュバント組成物は、上記と同様のものを用いることができる。また、ワクチン及び粘膜アジュバント組成物の投与タイミング・投与方法などは、動物の種類、年齢、体重などに応じて、適宜設定でき、特に限定されない。

例えば、経粘膜感染症に対するワクチンと上述の粘膜アジュバント組成物とを少なくとも含有する経粘膜感染症予防用ワクチン製剤を、単数回又は１〜６０日間隔を開けて複数回、動物の粘膜面に投与し、免疫してもよい。

また、ワクチン投与の１〜３０日前に粘膜アジュバント組成物を動物の粘膜面に単数回又は複数回投与して粘膜面における免疫を増強してから、ワクチンを単数回又は複数回投与して免疫してもよい。

ワクチンと粘膜アジュバント組成物を個別に投与する場合、ワクチンの投与方法は、目的・種類などにあわせ、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経粘膜投与などから適宜選択でき、経粘膜投与の場合のみにせまく限定されない。但し、本発明に係る粘膜アジュバント組成物が、特に粘膜面において免疫効果を増進するため、経粘膜投与の可能なワクチン（粘膜ワクチン）を投与することが最も好適であると考える。

粘膜面への投与は、公知の方法を採用できる。例えば、鼻粘膜へ投与する場合は、スポイトや注射筒などを用いて鼻腔の粘膜面に直接投与してもよいし、また、鼻腔の粘膜面に噴霧して投与してもよい。その他の粘膜面についても同様である。

ワクチンの投与量は、種類などに応じて、また、粘膜アジュバント組成物を併用することを考慮して投与量を適宜設定する。例えば、一般的なワクチンの投与量として、１０^６〜１０^９ＴＣＩＤ_５０／ｍＬのウイルスを含むワクチンを０．０５〜３．０ｍＬ投与してもよい。

一方、粘膜アジュバント組成物の投与量は、例えば、一回一頭当たりの投与量をタンパク質重量で１〜５００μｇ（好適には１２〜１６０μｇ）、ＨＡ単位で１〜４００単位（好適には８〜１２０単位）に設定することができる。粘膜面への投与量は、例えば犬に鼻腔投与する場合、０．０５〜３．０ｍＬ（好適には０．２〜１．０ｍＬ）が適量である。他の動物の場合も、動物の大きさなどを考慮して適宜設定できる。

本発明の適用動物は、ヒト以外であればよく、特に限定されない。例えば、犬、猫、ミンク、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、マウスなどの感染症予防に適用でき、犬及び猫が好適である。

適用疾患については、粘膜を介して侵入する感染症であればよく、特に限定されない。粘膜を介した病原微生物の侵入経路としては、例えば、経鼻・経気道、経口、経泌尿生殖器などがある。なお、本発明に係る粘膜アジュバント組成物は、経鼻・経気道から侵入する病原微生物に対するワクチンと併用するのが、最も好適である。

犬の経粘膜感染症として、例えば、犬伝染性気管気管支炎（ケンネルコフ；Ｋｅｎｎｅｌ Ｃｏｕｇｈ）、犬ジステンパー、犬パルボウイルス感染症、犬コロナウイルス感染症、犬ヘルペスウイルス感染症などがある。犬伝染性気管気管支炎は、犬アデノウイルス２型、犬パラインフルエンザウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプティカなどが主な病原であり、犬アデノウイルス１型、犬ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューモウイルスなども病原となりうる。

本発明では、犬パラインフルエンザウイルス、犬アデノウイルス、犬コロナウイルス、犬パルボウイルス、犬ジステンパーウイルス、犬ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューモウイルスのいずれか又は複数の感染を少なくとも含む犬の経粘膜感染症への適用が最も好適である。

猫の経粘膜感染症として、例えば、猫伝染性気管気管支炎、猫汎白血球減少症、猫伝染性腹膜炎・猫腸コロナウイルス感染症、猫白血病、猫免疫不全ウイルス感染症などがある。猫伝染性気管気管支炎は、猫カリシウイルス、猫ヘルペスウイルスが主な病原であり、クラミドフィラ・フェリス、ボルデテラ・ブロンキセプティカなども病原となりうる。

ミンクの経粘膜感染症として、例えば、ミンクアリューシャン病、ミンクウイルス性腸炎などがある。

ラットの経粘膜感染症として、例えば、センダイウイルス病、唾液腺涙腺炎、パルボウイルス病、肺炎球菌病、パスツレラ症などが、モルモットの経粘膜感染症として、例えば、パスツレラ症、レンサ球菌病などが、ウサギの経粘膜感染症として、例えば、センダイウイルス病、パスツレラ症などが、それぞれある。その他、フェレット、マウスなどにも各種経粘膜感染症が存在する。

実施例１では、本発明に係る粘膜アジュバント組成物の調製を行った。

ボルデテラ・ブロンキセプティカ ＫＲ００１−Ａ０１株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９８４、以下同じ）を３７℃で３日間培養した。増殖用培地には、ボルデテラ・ブロンキセプティカ用の公知の増殖用液体培地を用いた。

培養液を遠心分離（１６，０００×ｇ、３０分、４℃）して培養上清を取得し、その培養上清を分画分子量３０〜５００ｋＤａの限外ろ過フィルターで精製し、粘膜アジュバント組成物の原液を得た。

この原液のタンパク質濃度は１．２ｍｇ／ｍＬ、ＨＡ価は２５６倍であった。

この原液について、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下同じ）を行った。

結果を図１に示す。図１は、粘膜アジュバント組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表わす写真である。図１中、レーン１及びレーン４は分子量マーカーを、レーン２は培養上清を電気泳動した場合の結果を、レーン３は得られた粘膜アジュバント組成物の原液を電気泳動した場合の結果である。図１中、各数字は分子量（単位：ｋＤａ）を表す。

図１に示す通り、粘膜アジュバント組成物の原液を電気泳動した場合（レーン３）、１８０ｋＤａ付近にバンドが観察された（図中、矢印参照）。このバンドは、ＨＡのバンドであると推測される。

実施例２では、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンと本発明に係るアジュバントを犬の鼻粘膜に投与し、その疾患に対する予防効果を調べた。

供試ワクチンとして、犬パラインフルエンザウイルス由来の不活化抗原（不活化前力価：１０^７．５、ＴＣＩＤ_５０）を用いた。アジュバントとして、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物を用いた。

犬パラインフルエンザウイルス抗体陰性のビーグル犬（ｎ＝３）の鼻腔内に、ワクチンとアジュバントを混合したものを０．６ｍＬ投与し、その２週間後に同様に追加投与した。次に、その１週間後に、各個体の鼻腔に、犬パラインフルエンザウイルス攻撃株のウイルス液（１０^８．６、ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を０．６ｍＬ投与し、犬パラインフルエンザウイルスを感染させた。犬パラインフルエンザウイルス攻撃株投与の３、５、６、７日後に、各個体からそれぞれ鼻腔スワブを採取した。

鼻腔スワブ液をＭＤＣＫ細胞に接種・培養した後、モルモット血球に対する赤血球凝集反応でウイルス感染を判定し、ウイルス力価を測定した。

結果を図２に示す。図２は、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンと実施例１で調製したアジュバントを投与した場合における犬パラインフルエンザウイルスの感染抑制効果を示すグラフである。図２のグラフ中、縦軸はウイルス力価（単位：Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０）を、横軸は犬パラインフルエンザウイルスによる攻撃（感染）後の日数を、それぞれ表わす。グラフ中の３種類のバーは、左からそれぞれ、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンと実施例１で調製したアジュバントを投与した群（ＣＰＩＶ＋Ｂｂ）、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンのみを同量投与した群（ＣＰＩＶ、ｎ＝３）、無投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝３）におけるウイルス力価を表わす。

図２に示す通り、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンと実施例１で調製したアジュバントを投与した場合、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンのみを投与した場合と比較して、犬パラインフルエンザウイルスによる攻撃の５日後でウイルス力価が減少し、６日後ではウイルス力価がほぼ０になった。一方、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンのみを投与した場合、投与しなかった場合（対照群）と比較して、ほとんど差はみられず、犬パラインフルエンザに対する免疫効果はほとんど観察されなかった。

この結果は、犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンに本発明に係るアジュバントを混合して粘膜投与することにより、顕著な免疫効果が発揮されること、即ち、本発明に係る粘膜アジュバント組成物が、特に、粘膜アジュバントとして、顕著な免疫増強作用を有することを示す。

なお、実施例１及び本実施例の結果を勘案すると、粘膜アジュバント組成物にはＨＡが多く含有しており、これがアジュバント効果の主要な有効成分の一つであると推測する。従って、この粘膜アジュバント組成物は、ＨＡを主な有効成分として含有することが好ましい。即ち、この粘膜アジュバント組成物は、分子量１００〜３００ｋＤａであることが好適であり、分子量１５０〜２２０ｋＤａであることがより好適である（以下同じ）。

実施例３では、犬アデノウイルス不活化ワクチンと本発明に係るアジュバントを犬の鼻粘膜に投与し、その疾患に対する予防効果を調べた。

供試ワクチンとして、犬アデノウイルス２型由来の不活化抗原（不活化前力価：１０^８．４、ＴＣＩＤ_５０）を用いた。アジュバントとして、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物を用いた。

犬アデノウイルス抗体陰性のビーグル犬（ｎ＝３）の鼻腔内に、ワクチンとアジュバントを混合したものを０．６ｍＬ投与し、その２週間後に同様に追加投与した。次に、その１週間後に、各個体の鼻腔に、犬アデノウイルス２型攻撃株のウイルス液（１０^８．５、ＴＣＩＤ_５０／ｍＬ）を０．２５ｍＬ投与し、犬アデノウイルス２型を感染させた。犬アデノウイルス２型攻撃株投与の３、４、５、６日後に、各個体からそれぞれ鼻腔スワブを採取した。

鼻腔スワブ液をＭＤＣＫ細胞に接種し、培養した後、細胞変性効果（ＣＰＥ：Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）でウイルス感染を判定し、ウイルス力価を測定した。

結果を図３に示す。図３は、犬アデノウイルス２型不活化ワクチンと実施例１で調製したアジュバントを投与した場合における犬アデノウイルス２型感染症の感染抑制効果を示すグラフである。図３中、縦軸はウイルス力価（単位：Ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０）を、横軸は犬アデノウイルスによる攻撃（感染）後の日数を、それぞれ表わす。グラフ中の３種類のバーは、左からそれぞれ、犬アデノウイルス不活化ワクチンと本発明に係るアジュバントを投与した群（ＣＡＶ＋Ｂｂ）、犬アデノウイルス不活化ワクチンのみを同量投与した群（ＣＡＶ、ｎ＝３）、無投与群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝３）のウイルス力価を表わす。

図３に示す通り、犬アデノウイルス２型不活化ワクチンと実施例１で調製したアジュバントを投与した場合、犬アデノウイルス２型不活化ワクチンのみを投与した場合と比較して、犬アデノウイルス２型による攻撃の４日後からウイルス力価が顕著に減少した。一方、犬アデノウイルス２型不活化ワクチンのみを投与した場合、投与しなかった場合（無処置群）と比較して、６日後以外ではあまり差はみられなかった。

この結果は、犬アデノウイルス２型不活化ワクチンに本発明に係るアジュバントを混合して粘膜投与することにより、顕著な免疫効果が発揮されること、即ち、実施例２と同様、本発明に係る粘膜アジュバント組成物が、特に、粘膜アジュバントとして、顕著な免疫増強作用を有することを示す。

以上のように、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物は、動物などの呼吸器疾患に対する粘膜ワクチン予防接種を行う際に、アジュバントとして用いることにより、顕著な免疫増強効果を奏する。また、この粘膜アジュバント組成物は、複数の呼吸器疾患に対するワクチンに対しアジュバント効果を奏するので、犬伝染性気管気管支炎など、混合呼吸器感染症に対するワクチン製剤にも有効である。

実施例４では、ボルデテラ・ブロンキセプティカのワクチンとしての効果を調べた。

供試ワクチンとして、実施例１で調製したアジュバント組成物の原液をＰＢＳ（リン酸緩衝液、以下同じ）で希釈したものを用いた。供試ワクチンの濃度を、０．５ｍＬ中１６ＨＡ単位になるように調製した。

供試犬として、ボルデテラ赤血球凝集阻止抗体陰性の４週齢のビーグル犬を、４頭用いた。供試犬は、アイソレーター内で、餌に市販のドライフードを与え、自由給水で飼育した。

供試犬（ｎ＝２）の鼻腔内にワクチンを０．５ｍＬ投与し、その２週間後に同様に追加投与した。次に、その１週間後に、各個体の鼻腔に、攻撃菌として、ボルデテラ・ブロンキセプティカ ＫＲ００１−Ａ０１株の菌液を１ｍＬ投与し、ボルデテラ・ブロンキセプティカを感染させた。同菌の生菌数は、ボルデ・ジャング培地を用いて測定した場合、１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬであった。なお、対照群（ｎ＝２）では、ワクチン投与の際に、代わりにＰＢＳ０．５ｍＬを経鼻投与した。

ボルデテラ・ブロンキセプティカによる攻撃後、２１日間、各犬の一般臨床観察を行い、その臨床症状をスコア化した。臨床スコアは、観察期間中、毎日、下記の基準で症状を点数化し、それらを加算して算出した。（１）体温（直腸温）が４０．０℃以上の場合３点、３９．６〜３９．９℃の場合２点、３９．２〜３９．５℃の場合１点、（２）元気消失が観察された場合１点、（３）重度の食欲減退が観察された場合２点、軽度の食欲減退が観察された場合１点、（４）下痢が観察された場合１点、（５）嘔吐が観察された場合１点、（６）脱水症状が観察された場合１点、（７）眼部に流涙又は眼脂が観察された場合１点、（８）重度の膿性鼻汁が観察された場合３点、軽度の膿性鼻汁が観察された場合２点、水様性鼻汁が観察された場合１点、（９）重度の頻発性発咳が観察された場合３点、軽度の頻発性発咳が観察された場合２点、発咳が時々観察された場合１点、（１０）くしゃみが頻発する場合２点、くしゃみが時々観察された場合１点、（１１）呼吸音異常が観察された場合１点、（１２）死亡した場合１００点。

その結果、対照群では、ボルデテラ・ブロンキセプティカによる攻撃後、観察期間中、ほぼ毎日発咳・鼻汁排出・眼脂などの異常所見が認められたのに対し、ワクチン投与群では、一過性の下痢及び体温の軽微な上昇が認められたのみで、他の臨床的な異常は観察されなかった。また、ワクチン投与群では、犬伝染性気管気管支炎に特徴的な上部呼吸器疾患症状はほぼ観察されなかった。総臨床スコアは、対照群ではそれぞれ４１点及び５１点（群平均値は４６点）であったのに対し、ワクチン投与群では４点及び３点（群平均値は３．５点）であった。

以上の通り、実施例１で調製したアジュバント組成物をワクチンとして２回経鼻投与した場合、１６ＨＡ単位と少量の投与にもかかわらず、ボルデテラ・ブロンキセプティカによる上部呼吸器疾患症状の発症を防御できた。この結果は、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物が、経粘膜感染症に対するワクチンの粘膜アジュバントとして有効であることに加え、ボルデテラ・ブロンキセプティカ感染症に対する粘膜ワクチンとしても有効であることを示す。

例えば、犬・猫などでは、上述の通り、種々のウイルスなどに加え、ボルデテラ・ブロンキセプティカ自体も経粘膜感染症の病原となる。特に、犬伝染性気管気管支炎は、上述の通り、犬アデノウイルス２型、犬パラインフルエンザウイルスに加え、ボルデテラ・ブロンキセプティカ自体が主な病原の一つである。それに対し、本結果は、例えば、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物と、犬アデノウイルス２型、犬パラインフルエンザウイルスなどの経粘膜感染症のワクチンとを混合することより、それらの経粘膜感染症に対する予防効果を増大できることに加え、ボルデテラ・ブロンキセプティカ感染症自体も予防できることを示唆する。

実施例５では、実施例１で調製した組成物の粘膜アジュバント活性を、モルモットへの経鼻免疫試験で確認した。

供試抗原として、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；卵白アルブミン、以下同じ）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに溶解したものを用いた。アジュバントとして、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物を用いた。

供試動物として、ボルデテラ赤血球凝集阻止抗体陰性のＨａｒｔｌｅｙ系モルモット（体重約３００ｇ）を用いた。供試モルモットは、自由給餌及び自由給水で群飼した。

ＯＶＡ（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）とアジュバント（終濃度ＨＡ価６４倍）を混合し、供試モルモット（ｎ＝３）の鼻腔内にその混合液を１匹当たり２００μＬずつ投与し、その１４日後に、同じ混合液を追加投与した。なお、対照群（ｎ＝３）では、ＯＶＡ及びアジュバントの代わりにＰＢＳを同量投与した。また、アジュバント未添加群（ｎ＝３）では、アジュバントの代わりにＰＢＳを同量混合したものを投与した。

初回投与時に供試モルモットから血液及び直腸スワブを採取した。また、初回投与の２８日後（試験終了時）に供試モルモットから血液、唾液、直腸スワブ、糞便を採取した。唾液採取の際には、前処置として、ピロカルピン塩酸塩４ｍｇ／ｍＬ含有溶液を１匹当たり４ｍＬ腹腔内注射した。

採取した血液については、血清分離後非働化処理を施したものを試料として用いた。採取した直腸スワブについては、採取後直ちに保存液１ｍＬに浸漬し、よく懸濁したものを試料として用いた。採取した唾液については、保存液を等量混合したものを試料として用いた。採取した糞便については、保存液で２０％懸濁液を調製した後、遠心分離により上清を回収したものを試料として用いた。なお、保存液には、１０％スキムミルク加ＰＢＳとプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ製）を等量混合したものを用いた。

調製した各試料について、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）により、抗ＯＶＡ抗体価を測定した。

９６穴マイクロプレートに固相化抗原溶液を１００μＬずつ分注し、４℃で一晩静置した。固相化抗原溶液には、ＯＶＡをＰＢＳで１０ｍｇ／ｍＬに溶解した後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で規定濃度に希釈したものを用いた。血清を試料とした場合、固相化抗原量を９６穴マイクロプレート１穴当たり０．３μｇとし、直腸スワブ、唾液、糞便を試料とした場合、同１μｇとした。

ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ、以下同じ）で３回洗浄した後、ブロックエース原液を１００μＬずつ分注し、３７℃で６０分間静置し、ブロッキングした。ブロックエース原液には、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）４ｇを精製水１００ｍＬで溶解したものを用いた。

ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、調製した試料を一次抗体として１００μＬずつ２穴に分注し、３０分間反応させた。

ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、二次抗体液を１００μＬずつ分注し、３０分間反応させた。二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＧ羊抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）又はペルオキシダーゼ標識抗モルモットＩｇＡ羊血清（イムノロジー・コンサルタンツラボラトリー社製）を用いた。血清を試料とした場合、この二次抗体をＰＢＳ−Ｔで３０，０００倍に希釈して用い、直腸スワブ又は唾液を試料とした場合、同じく３，０００倍に希釈して用い、糞便を試料とした場合、同じく１０，０００倍に希釈して用いた。

ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、基質溶液を１００μＬずつ分注し、室温又は２５℃で１５〜２０分間反応させ、２Ｍ硫酸を５０μＬ加えて反応を停止させ、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。基質溶液には、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１１ｍＬ、テトラメチルベンチジン（６ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ）１１０μＬ、３％過酸化水素水１１μＬの組成で調製した溶液を用いた。

各測定値から試料無添加（ブランク）の測定値を減じて補正した後、試料ごとに相加平均を算出し、これを抗体価とした。

結果を表１及び表２に示す。表１は抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価の群平均値を示し、表２は抗ＯＶＡ−ＩｇＡ抗体価の群平均値を示す。両表中、「血清」、「唾液」、「直腸スワブ」、「糞便」は、採取した試料の種類を、「初回投与時」は抗原とアジュバントの混合物又はその比較対照溶液の初回投与の直前に採取した試料を用いた場合における結果を、「試験終了時」は初回投与の２８日後に採取した試料を用いた場合における結果を、それぞれ表す。両表中、「対照群」はＯＶＡ及びアジュバントを投与しなかった場合における結果を、「アジュバント未添加群」はＯＶＡのみ投与し、アジュバントを投与しなかった場合における結果を、「アジュバント添加群」はＯＶＡ及びアジュバントを投与した場合における結果を、それぞれ表す。

表１に示す通り、抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価の群平均値について、対照群及びアジュバント未添加群では、試験終了時においても抗体価の上昇はほとんど認められなかった。それに対し、アジュバント添加群では試験終了時における値が１．５２１であり、初回投与時の０．００２の値と比較して明らかな抗体価の上昇が確認された。

また、表２に示す通り、抗ＯＶＡ−ＩｇＡ抗体価の群平均値についても、対照群及びアジュバント未添加群では、ほとんど抗体価の上昇が認められなかったのに対し、アジュバント添加群では、唾液中の抗ＯＶＡ−ＩｇＡ抗体価が０．６７８、試験終了時における直腸スワブ中の同抗体価が０．５９５、糞便中における同抗体価が１．２２８と、いずれの試料においても明らかな抗体価の上昇が確認された。

これらの結果は、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物が、経粘膜投与した抗原に対する免疫応答を増強し、抗体誘導能を高めること、即ち、その組成物が粘膜アジュバント活性を有することを示す。

表１では、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物を経鼻投与することにより、血中における抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価が上昇した。この結果は、この組成物が、全身的な免疫応答の誘導を惹起できることを示す。

表２では、実施例１で調製した粘膜アジュバント組成物を経鼻投与することにより、唾液、直腸スワブ、糞便の抗ＯＶＡ−ＩｇＡ抗体価が上昇した。この結果は、この組成物が、口腔・直腸など、投与部位以外の粘膜部位における分泌型ＩｇＡ抗体の誘導を惹起できることを示す。

以上の通り、本実施例の結果は、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物が、粘膜免疫の活性化作用を有し、かつ異所粘膜及び全身における免疫増強作用をも有することを示す。

粘膜アジュバント組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表わす写真。 犬パラインフルエンザウイルス不活化ワクチンと本発明に係るアジュバントを投与した場合における犬パラインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を示すグラフ。 犬アデノウイルス２型不活化ワクチンと本発明に係るアジュバントを投与した場合における犬アデノウイルス２型感染症に対する免疫増強効果を示すグラフ。

Claims (8)

1. ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物を少なくとも含有する粘膜アジュバント組成物。
2. 前記組成物が赤血球凝集素を有効成分として含有する請求項１記載の粘膜アジュバント組成物。
3. 経粘膜感染症に対するワクチンと、請求項１記載の粘膜アジュバント組成物とを少なくとも含有する経粘膜感染症予防用の粘膜ワクチン製剤。
4. 前記経粘膜感染症が犬パラインフルエンザウイルス、犬アデノウイルス、犬コロナウイルス、犬パルボウイルス、犬ジステンパーウイルス、犬ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューモウイルスのいずれか又は複数の感染を少なくとも含むものである請求項３記載の経粘膜感染症予防用の粘膜ワクチン製剤。
5. 前記経粘膜感染症が犬伝染性気管気管支炎である請求項３記載の経粘膜感染症予防用の粘膜ワクチン製剤。
6. 経粘膜感染症に対する単独又は混合のワクチンと、ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物を少なくとも含有する粘膜アジュバント組成物とを投与する非ヒト動物経粘膜感染症予防方法。
7. ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物の、粘膜アジュバント組成物製造のための使用。
8. ボルデテラ・ブロンキセプティカの菌体又はその培養液から得られた分子量１００〜３００ｋＤａの組成物を調製する手順を少なくとも含む粘膜アジュバント組成物製造方法。