CN105189743B - 用于生产重组兴趣蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于生产重组兴趣蛋白的方法,所述方法特征在于如下步骤:(a)提供包涵体中的包含Npro自我蛋白酶部分和兴趣蛋白部分的融合蛋白,(b)溶解所述包涵体,(c)允许所述Npro自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白,其中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来,以及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或同时复性,以及(d)回收所述兴趣蛋白,任选地包括兴趣蛋白的复性步骤。
Description
技术领域
本发明涉及通过使用瘟病毒技术的自我蛋白酶Npro来重组生产所需的兴趣异源多肽的方法。
背景技术
大肠杆菌(E.coli)被广泛用于大量表达治疗性蛋白。对于医疗应用,同源(homogeneous)N端是重要的,但是通过甲硫氨酸氨肽酶对N-甲酰甲硫氨酸去除不全的话可能导致不希望的微观不均一性(microheterogeneity)。此外,基因融合技术通常用于重组蛋白的表达。一些常用的融合标签(例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或者硫氧还蛋白)介导溶解度,而其它的(例如聚-His、FLAG、Strep II或者钙调蛋白结合肽(CBP))则作为亲和标签使得易于纯化。基因融合技术需要通过具有不同切割效率和特异性的酶或者化学切割,将标签从最终蛋白产物中去除。自我切割标签(如内含肽、分选酶A(SrtA)、FrpC蛋白或者半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)以及Npro自我蛋白酶)为制药相关蛋白的表达提供了一种有用的替代方案。Li,Biotech.Let.33(2011):869-881中公开了用于重组蛋白生产的自我切割融合标签;Xing等人,Microb.Cell Fact.10(2011):42报道了使用可切割的自聚集标签进行的流线型(streamlined)蛋白表达和纯化。
异源蛋白在大肠杆菌中的过度表达经常导致致密的聚集和沉积、不溶性的颗粒,也被称为包涵体。在包涵体中表达的优点是所需产物为高纯度,以及在细胞破碎后容易通过离心进行纯化。然而,关键的步骤是溶解蛋白并将其再折叠成其天然结构。溶解通常在高浓度的离液序列高的试剂(如尿素或者盐酸胍)中进行,以达到完全的展开。加入还原剂(如2-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)或者1-硫代甘油(MTG))以减少非天然的分子间和分子内二硫键,并使得半胱氨酸保持其还原状态。再折叠时启动自我蛋白酶解的切割和随后融合配偶体(partner)的释放,其遵循单分子反应,且反应速率只依赖于离液剂浓度(Ueberbacher等人,Process Biochem.44(2009),1217-1224)。
瓶颈步骤是蛋白的复性。在再折叠的第一步,消除疏水分子间的相互作用对于在高蛋白浓度中成功复性是关键的,并防止聚集(Vallejo等人,Microb.Cell Fact.3(2004),11)。多种复性技术是已知的。通过稀释进行再折叠,由于其简单性,而优于压力处理或者色谱技术,尤其是在规模生产时。在单一步骤中减少蛋白浓度以及离液剂浓度,防止通过分子间的相互作用而聚集。然而,大体积和低蛋白浓度给下游加工步骤带来负担(Jungbauer等人,J.Biotech.128(2007),587-596)。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供包涵体的复性改善,包涵体必须是复性的,尤其是对于方法下游的自我蛋白酶解切割和重组蛋白的制备。优选地,本发明应当实现小体积和高的蛋白浓度以获得兴趣蛋白,并提供一种适于在工业生产规模建立的方法,特别是对于医药用途的蛋白。此外,将自我蛋白酶的复性步骤和兴趣蛋白的复性步骤分开也是有益的,将有助于实现高度特异性的复性条件。
因此,本发明提供一种用于生产重组兴趣蛋白的方法,特征在于如下步骤:
(a)提供包涵体中的包含Npro自我蛋白酶部分(moiety)和兴趣蛋白部分的融合蛋白,
(b)溶解所述包涵体,
(c)允许所述Npro自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白,其中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来,以及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或同时复性,以及
(d)回收所述兴趣蛋白,任选地包括所述兴趣蛋白的复性步骤。
本发明是通过使用瘟病毒技术的自我蛋白酶Npro在所需兴趣异源多肽的重组生产中的改进。这种技术通常提供在宿主细胞(通常是原核宿主细胞,例如大肠杆菌)中融合多肽的重组表达,其中融合多肽包含直接或者间接源自瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶解部分以及异源兴趣多肽。异源多肽或者兴趣蛋白通过肽键与Npro分子共价偶联。通过水解Npro C端Cys168和融合多肽169位置之间的肽键,将兴趣蛋白从融合蛋白中释放,其中融合多肽169位置代表根据本发明待生产的兴趣蛋白的真实N端氨基酸。在宿主细胞中以细胞质包涵体(IB)的形式生产异源兴趣多肽,然后按照这样的方式分离并处理包涵体,即通过Npro的自我蛋白酶解活性将所需的异源多肽从融合多肽中切割下来。
因此,包含瘟病毒的自我蛋白酶Npro的融合多肽,对于生产异源重组多肽而言特别有用。Npro是长度为168个氨基酸的自我蛋白酶,并且体内表观Mr约20kD。它是瘟病毒多聚蛋白(polyprotein)中的第一蛋白,并且进行自我蛋白酶解切割从其后的核衣壳蛋白C上切割下来。在Npro序列中的最后一个氨基酸Cys168后发生这种切割。瘟病毒自我蛋白酶Npro的活性总是在这一明确的位点上切除融合配偶体,释放具有同源N端的兴趣多肽。此外,通过应用特殊的缓冲液可以在体外诱导Npro的自我蛋白酶解活性,从而通过切割IB中表达的融合多肽而获得兴趣多肽。
此技术中使用的来自传统猪瘟病毒(CSFV)的N端自我蛋白酶Npro用作尤其是在大肠杆菌中大量表达治疗性蛋白的有吸引力的工具。医药应用需要重组蛋白的真实N端,这可以通过N端融合的Npro自我蛋白酶的自我切割来实现。此外,Npro融合技术也允许表达小的或者毒性的肽,在其合成之后宿主细胞蛋白酶将立即降解小的或者毒性的肽(Achmüller等人,Nat.Methods 4(2007),1037-1043)。由于Npro融合蛋白在大肠杆菌中的表达导致不溶性聚集物(被称为包涵体)的形成,需要适当的溶解和复性操作以便获得生物活性的蛋白。
如已经提到的,在大多数情况下,溶解是在高浓度离液序列高的试剂(如尿素或者盐酸胍)中进行的,同时组合使用还原剂来消除错误形成的二硫键。通过稀释进行再折叠由于其简单性而广泛用于起始复性。因此,加入大量的缓冲液以提供允许形成正确生物活性结构的条件。因此,根据本发明,应用了在高尿素浓度时显示出切割活性的自我蛋白酶。这使得能够显著降低溶解步骤后所需缓冲液的量,从而降低成本。此外,如果靶标蛋白和自我蛋白酶需要不同的复性条件,这两个步骤可以分开,这给这种优选实施方式增加了另一优点。在高离液序列高的条件下自我蛋白酶的活性将自我蛋白酶的复性步骤和靶标蛋白的复性步骤分开,从而能够实现高度特异性的复性条件。实际上,兴趣蛋白的复性可以和自我蛋白酶的切割步骤分开,使得更好地控制兴趣蛋白的回收。在这种情况下,然后可以在随后的任何阶段和不同的地方,使兴趣蛋白获得充分的活性。在现有技术中,自我蛋白酶部分(其导致融合蛋白的切割)的活性恢复总是和包含兴趣蛋白部分的整个融合蛋白的复性直接相关。本发明优选的实施方式允许将自我蛋白酶和靶标蛋白的再折叠分开。
因此,在一个优选的方法中,在重组生产系统中,优选在原核宿主细胞中,尤其是在大肠杆菌宿主细胞中产生包涵体。
步骤(b)的优选条件对应着大于5M,优选大于6M,尤其是大于7.5M的尿素浓度。“对应着”表示尿素按照指定的量存在,或者存在某一浓度的另一种离液序列高的物质(如丁醇、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲等,或者不同离液剂的组合,如尿素和盐酸胍的混合物),使得产生了相同的离液序列高的效果(测量为系统熵的增加)。例如,优选的盐酸胍浓度大于2.5M,优选大于3M,尤其是大于3.75或者甚至大于4M。优选地,在步骤(b)中,通过让包涵体经历变性条件进行包涵体的溶解。
步骤(c)中优选的离液序列高的条件对应着1.4至5M,优选2至5M,尤其是2至4M的尿素浓度。步骤(c)中优选的盐酸胍浓度是0.7至2.5M,优选1至2.5M,尤其是1至2M。同样,也可应用不同离液剂的组合,如尿素和盐酸胍的混合物。
术语“稳液剂(kosmotrope)”(有序的制造者)以及“离液剂(chaotrope)”(无序的制造者)原初分别表示使蛋白和膜稳定或者不稳定的溶质。而后,它们分别涉及增加或减少水结构化的明显相关性质。这种性质随环境、确定的方法或所研究的溶剂化壳的不同而不同。稳液剂的替代术语是“补偿性溶质”,因为发现它们在渗透胁迫的细胞中补偿高盐含量(其破坏水的天然氢键合网络)的不利影响。氢键的程度和强度两者都可以独立地被溶质所改变,但是二者可能并且已经用作制造秩序(order making)的量度。然而,对质量氢键程度的影响是非常重要的。稳液剂的扩散转动(diffusional rotation)可能扰乱稳液剂的秩序效果,和水合程度更小的离液剂相比,扩散转动产生与周围主体水(bulk water)之间更广泛更加无序的无组织连接区(disorganized junction zones)。大多稳液剂不会引起水中大规模的网状结构。
离子稳液剂(或:“抗离液剂(antichaotropes)”,用于和非离子稳液剂区分开)应该和非离子稳液剂区别处理,主要是因为周围水分子的定向和极化(polarized)排列。一般来说,离子行为和霍夫梅斯特序列(Hofmeister series)相符合(parallel)。具有低电荷密度的大单电荷离子(如SCN-、H2PO4 -、HSO4 -、HCO3 -、I-、Cl-、NO3 -、NH4 +、Cs+、K+、(NH2)3C+(胍)和(CH3)4N+(四甲基铵)离子;和水与自身的相互作用相比,呈现与水更弱的相互作用,因此较少干扰周围水的氢键)是离液剂,而具有高电荷密度的小或多电荷的离子是稳液剂(如SO4 2-、HPO4 2-、Mg2+、Ca2+、Li+、Na+、H+、OH-和HPO4 2-,和水与自身的相互作用相比,呈现出与水分子更强的相互作用,因此能够破坏水-水氢键)。单电荷离液序列高的离子的半径对于阳离子而言大于以及对于阴离子而言大于因此,在离子稳液剂附近的水分子之间的氢键比在离子离液剂附近的破坏更严重。增强这一结论,围绕卤化物离子F-、Cl-、Br-和I-的水的氢键结构拉曼光谱研究表明,水氢键的总程度随着离子大小的增加而增加,以及HDO:D2O的IR研究显示在这些卤化物离子周围缓慢的氢键重新定位(reorientation),相对于不断增加的大小变得更缓慢。溶质可能加强周围的一些氢键(构建结构;如稳液性的阳离子将加强内壳水分子所贡献的氢键)而同时破坏一些其它氢键(破坏结构;如稳液性的阳离子会削弱由内壳水分子所接纳的氢键),这并非不合理。其它等同的因素,具有净电荷的分子比没有净电荷的分子更加强烈地结合(hold)水分子;正如两性离子氨基酸和阳离子氨基酸之间的差异所示。
强烈的水-水相互作用可能将弱水合的离子(离液剂,K+、Rb+、Cs+、Br-、I-、胍+)“推”向弱水合的表面,当离子-水的水合强度大致等于主体溶液中水-水相互作用的强度时(Na+位于强的一侧的边缘而Cl-位于弱的一侧的边缘),发生强离子水合向弱离子水合的过渡。对两个重要离液剂(胍和硫氰酸根离子)的中子衍射研究表明它们的水合非常差,这支持了这样的见解,即它们优先与蛋白而不是与水相互作用。不同于稳液剂,离子和非离子离液剂属性之间有很小的显著差异,是因为前者的电荷密度低。
盐对生物大分子的最佳稳定化需要稳液性阴离子与离液序列高的阳离子的混合物。
离液剂破坏水的氢键合网络,从而使大分子结构上更自由,并有助于蛋白延伸和变性。稳液剂是稳定化溶质,其增加水的秩序(如多羟基醇、海藻糖、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、四氢嘧啶(ectoine)、脯氨酸和各种其它两性离子),而离液剂产生更弱的氢键,降低水的秩序,增加其表面张力和使大分子结构不稳定(如高浓度的盐酸胍和尿素)。最近的工作表明,尿素削弱氢键和疏水性相互作用,而葡萄糖用作稳液剂,提高这些特性。因此,当尿素分子小于最佳水合时(每摩尔尿素约6-8摩尔水),在没有足够水的情况下尿素的氢结合其自身和蛋白(显著参与肽的链接),从而变得更疏水,因此更加能够与蛋白上的其它位点相互作用,导致局部脱水引起变性。胍是平面离子,围绕其边缘可形成弱的氢键,但可以和蛋白的羧酸建立起强烈结合的氢键离子对,这类似于常见的季铵结构的精氨酸-羧酸“盐”链接。此外,胍具有相当疏水的表面,可与相似的蛋白表面相互作用使蛋白变性。通过疏水位点之间的滑动,这两种变性剂可引起蛋白膨胀并解构,以及最终拖到氢结合的水当中从而使变性完全。
一般来说,通常在必要的高浓度下,根据水的物理主体性质确定溶质的稳液/离液序列高的性质。例如使用NMR或者振动光谱,可能会发现结构化程度的变化。稳定蛋白的溶质(稳液剂)增加氢键的程度(降低质子和17O自旋-晶格弛豫时间),而NMR化学位移可能增加(显示更弱的键合,如两性离子稳液剂,三甲胺N-氧化物)或者降低(显示更强的键合,如多羟基稳液剂,海藻糖)。海藻糖显示出化学位移和弛豫时间的降低,蛋白稳定剂(NH4)2SO4程度更小,而NaCl仅显示出化学位移的降低,以及蛋白去稳定剂KSCN显示出弛豫时间的增加和化学位移的降低。振动光谱可以利用5200cm-1附近的近红外波长(v2+v3的组合),当氢键更强时向更长的波长(更小的波数)迁移。
最重要的稳液剂之一是非还原糖α,α-海藻糖。或许应当指出的是,海藻糖由于没有变旋作用,它比还原糖具有更静态的结构,或者其它常见的非还原二糖蔗糖,因为它缺失呋喃环。
因此,术语“离液序列高的条件”应单独地根据液体起始制剂(例如可以是溶液、悬液、乳液、双或三相液体系统等)的性质进行考虑,尤其是在制剂水相上包含不止一相的制剂中。根据本发明的方法步骤(c)中优选的离液序列高的条件是对应着1.4至5M尿素浓度的条件(尤其是在缓冲盐溶液中,如8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4、0.24g KH2PO4用A.dest补充至1000ml,用HCl调节至pH 7.4)。通过上述提及的方法以及通过采用霍夫梅斯特序列的教导,能够轻易地确定离液序列高的条件的对应关系(以及离液性(chaotropicity)的降低(“更低”或“更少”“离液序列高的条件”))。在各个情况下,应当核实起始液体中各种物质的添加,以便为结合提供最佳的结合/非聚集条件。例如,应优化对还原试剂的使用,以对应着0.05至50mM二硫苏糖醇(DTT)的量,尤其是0.1至10mM的DTT。此外,如上所述添加去污剂可能影响起始制剂的离液性。
在本发明的含义中术语“变性的形式“(或“非再折叠的形式”)是指作为重组生产过程的产物而获得的,通常是在溶解包涵体之后获得的表达的融合蛋白的生物非活性形式(在这样一种条件下,在此条件下融合蛋白的天然三维结构被破坏)。
术语“再折叠”(或“复性”)是指这样一种机制,在其中溶解的蛋白或者部分蛋白(如果复性的话,所述部分与该部分的特定活性有关)恢复其天然构象和生物活性(分别地,或者该部分的生物活性),即蛋白从它变性的非活性状态重建其活性形式(还参见:Kaar等人,Biotech.Bioeng.104(2009),774-784)。
术语“自我蛋白酶解功能”、“自我蛋白酶解活性”或“自我蛋白酶解”指的是融合蛋白的部分之一的自我蛋白酶解活性,融合蛋白在其变性状态时活性受到抑制,而融合蛋白部分(即自我蛋白酶部分)或完全再折叠时被激活。如本文所用,术语“自我蛋白酶”应指具有自我蛋白酶解活性并且能够将自己从多肽部分切割下来的多肽,即Npro自我蛋白酶将自身从根据本发明的融合蛋白的兴趣蛋白部分上切割下来。
如本文所用,术语“回收”应指以纯化的形式获得兴趣蛋白,即将兴趣蛋白从存在于表达/处理系统中的其它蛋白尤其是自我蛋白酶中基本上分开,还有不应存在于中间或者最终产物中的所有其它蛋白或其它成分分开。根据本发明方法回收的兴趣蛋白,可以经过商业化而成为直接获自根据本发明的切割步骤的批量(bulk)形式,或者进一步纯化和/或配制成特定的制剂,如药物制剂。
如本文所用,术语“包涵体”应指含有异源多肽(根据本发明的融合蛋白)的不溶性聚集物,异源多肽存在于转化的宿主细胞细胞质中。在显微镜下这些显示为亮点,并且可以通过分离细胞质来回收。通常使用离液序列高的试剂溶解包涵体。经过溶解,包涵体得以溶解,并且获得了(aim)具有大幅降低的分子内和分子间相互作用的单分子悬液。优选的溶剂是尿素、盐酸胍和强离子去污剂如N-月桂酰肌氨酸。在本发明的另一实施方式中,也使用含水的醇溶液在碱性pH时或者仅仅是碱性pH的水溶液来溶解包涵体。
如本文所用,术语“溶解”应指溶解包涵体必要的过程。溶解旨在产生具有最小分子内和间相互作用的多肽的单分子分散。本发明范围之内溶解包涵体的优选方式是通过如下进行的:悬于50mM Tris/HCl、8M尿素,pH 7.3中,存在氧化的半胱氨酸残基情况下添加还原剂,例如50mM DTT。必要时,可以通过例如离心去除潜在的不溶性物质。产生的失活融合蛋白可溶于细胞内的情况时,将澄清的细胞匀浆进行下述的进一步操作以便溶解包涵体。
对于本发明,在离液序列高的条件下进行步骤(c)中自我蛋白酶解活性的再折叠(复性),即在这样的条件下兴趣蛋白部分优选仍然以非-再折叠的形式而存在。如可以通过稀释、添加稳液性物质或消除离液序列高的物质,通过制造更低的离液序列高条件来实现兴趣蛋白的再折叠(切割后)。另一方面,兴趣蛋白也可以与自我蛋白酶部分在步骤(c)中同时复性,即在离液序列高的条件下。
还优选在离液序列高的条件下进行步骤(c),这仍然允许相当的切割速率,从而能够在合适的反应时间内完成过程,特别是在大规模的设定时。例如通过先在7M胍/HCl溶液中溶解分离的/纯化的包涵体,然而按1:100稀释于反应溶液中,可以确定自我蛋白酶解切割速率。孵育约24小时后,通过SDS-PAGE检验反应溶液已经发生切割。进行Western印迹来鉴定已处理和未处理的比例。可以通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的光密度分析来确定切割的材料的比例。更高的离液序列高的条件将有助于溶解过程,然而却常常降低自我蛋白酶的切割速率。切割速率太低不能实现本方法的适当工业用途,至少是大规模的设定。因此,Npro自我蛋白酶部分优选在2.5M尿素时的切割速率是至少20%,优选至少30%,尤其是至少40%。如果,例如特定融合蛋白的Npro自我蛋白酶部分在2.5M时孵育24小时导致材料50%的量被切割(通过考马斯染色的SDS-PAGE凝胶的光密度分析所确定的),则Npro自我蛋白酶部分被定义为在2.5M尿素时切割速率为50%。
在本方法中所用的优选Npro自我蛋白酶部分具有选自SEQ ID No.1或者2的序列(Δ21Npro(HoBi)或者Npro(HoBi)(UniProt数据库登陆号Q5L4B1))。
在本发明优选的实施方式中,Npro自我蛋白酶部分具有这样的序列,在所述序列中缺失干扰素调节因子3结合位点。这种缺失使得最终产物基本上不含可能干扰人的干扰素生产的杂质。
原则上本方法可以应用于任何兴趣蛋白的生产,尤其是已知的可通过Npro自我蛋白酶技术生产的所有蛋白。由于根据本发明的方法适于大规模的制造和药品生产质量管理规范(pharmaceutical good manufacturing practice),优选采用本方法生产用于人治疗性用途的蛋白,优选人重组蛋白或免疫接种抗原。因此,优选的兴趣蛋白包括涉及到2009年为止被FDA或EMEA批准用于人类的151种重组药物的蛋白,参考Ferrer-Miralles等人(Microbial Cell Factories 8(2009),17doi:10.1186/1475-2859-8-17),尤其是已经在大肠杆菌宿主细胞中得以生产的基于蛋白的产物:Dukoral(口服霍乱疫苗)、派罗欣(聚乙二醇干扰素α-2a)、佩乐能(聚乙二醇干扰素α-2b)、干复津(干扰素alfacon-1)、Rebetron(干扰素α-2b)、Roferon A(干扰素α-2a)、Viraferon(干扰素α-2b)、ViraferonPeg(聚乙二醇干扰素α-2b)、内含子A(干扰素α-2b)、Beromun(Tasonermin)、Actimmune(干扰素γ-1b)、IPLEX(重组美卡舍明林菲培)、Kepivance(帕利夫明)、Neulasta(培非司亭)、Neumega(奥普瑞白介素)、优保津(非格司亭)、优泌乐(赖脯胰岛素)、Humatrope(促生长素)、优泌林(人胰岛素)、Insuman(人胰岛素)、来得时(甘精胰岛素)、Fortical(鲑鱼降钙素)、Apidra(赖谷胰岛素)、Exubera(人胰岛素)、Forcaltonin(鲑鱼降钙素),Forsteo(特立帕肽)、Forsteo/Forteo(特立帕肽)、Genotropin(促生长素)、胰高血糖素、Increlex(美卡舍明)、人胰岛素Winthrop(人胰岛素)、Norditropin(促生长素)、Nutropin(促生长素)、NutropinAQ(促生长素)、Optisulin(甘精胰岛素)、Preotact(人甲状旁腺激素)、Protropin(索吗托诺)、Somavert(培维索孟)、倍泰龙/倍泰龙(干扰素β-1b)、Lucentis(兰尼单抗)、Natrecor(奈西立肽)、Rapilysin/Retavas E(瑞替普酶)、Ontak(地尼白介素)、Kineret(阿那白滞素)以及Omnitrope(促生长素)。
优选根据所用的Npro自我蛋白酶以及待生产的兴趣蛋白,可以针对各个设定优化过程参数。例如,可在pH 5至11,优选pH 6至9.5,尤其是pH 6.5至8.5时进行步骤(b)和/或步骤(c)。在一个优选的实施方式中,采用碱性的条件,尤其是在步骤(b)中,例如存在大于5mM的NaOH或者KOH,尤其是大于25mM的NaOH或者KOH,更优选大于50mM的NaOH或者KOH,尤其是大于100mM的NaOH或者KOH(或KOH和NaOH的混合物);或者得到大于10的pH,尤其是11至14的pH的其它碱性成分(或其混合物)。步骤(b)尤其优选的实施方式对融合蛋白采用变性条件,优选通过尿素盐酸胍和NaOH的混合物。
优选地,在缓冲液中,尤其是磷酸盐、磷酸氢盐或者Tris/HCl缓冲液中进行步骤(b)和/或(c)。缓冲液还可以包含盐如NaCl,多元醇例如甘油或者碳水化合物,或者去污剂如非离子型去污剂、阴离子去污剂、阳离子去污剂、两性离子去污剂,非去污剂磺基甜菜碱例如十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LDS)或N-月桂酰肌氨酸。
也优选在缓冲液存在时进行步骤(c),所述缓冲液包含:NaCl,优选50至1000mMNaCl,尤其是100至500mM NaCl;磷酸盐离子和/或磷酸氢盐离子,优选5至500mM的磷酸盐和/或磷酸氢盐,尤其是10至200mM磷酸盐和/或磷酸氢盐;甘油,优选1至10%的甘油,尤其是2至8%的甘油;Tris/HCl,优选1mM至5M的Tris/HCl,尤其是5mM至2M的Tris/HCl。在步骤(c)中使用的缓冲液可进一步含有一种或者更多下列成分:L-精氨酸、低浓度的变性剂、去污剂、环糊精、聚乙二醇、低分子量非去污剂两性离子试剂如磺基甜菜碱、取代的吡啶和吡咯、以及酸取代的氨基环己烷。
根据一个优选的实施方式,回收兴趣蛋白之后进行兴趣蛋白的复性步骤。例如,充分纯化兴趣蛋白后进行兴趣蛋白的复性步骤。当兴趣蛋白处于这种蛋白的非复性形式时比完全复性(“活性”)的形式更稳定时,本实施方式是非常有利的。因此,兴趣蛋白甚至可以配制成药物组合物(例如干(冷冻干燥)的组合物),其在重新配制之后可立即向患者施用。在这种情况下,通过这种在施用前的即刻重新配制进行兴趣蛋白的复性。这克服了在之前损失兴趣蛋白活性的风险(例如,切割后在纯化期间、配制成药物产品期间或者这种蛋白/药物制剂的储存期间)。
可以在溶液中进行切割步骤(c);然而,根据优选的实施方式,可通过将融合蛋白固定在固体支持物上进行这种切割(即自我蛋白酶部分再折叠以获得自我蛋白酶解活性)。然后在根据本发明离液序列高的条件下,起始自我蛋白酶的再折叠(和实现蛋白酶解活性),此后在固体支持物上激活蛋白酶解活性。然后从固体支持物上释放切割的部分(自我蛋白酶C端(如果兴趣蛋白偶联至固体支持物上)或者兴趣蛋白(如果自我蛋白酶部分偶联至固体支持物上)),并可以轻易地回收。因此,根据本方法的优选实施方式,融合蛋白被固定在固体支持物上,并且进行步骤(c)使得在固体支持物上形成Npro自我蛋白酶的自我蛋白酶解活性。
作为固相材料,本领域已经应用了的所有材料都是合适的。优选,固相选自:色谱材料,尤其是基于纤维素、琼脂糖、丙烯酰胺、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)或者乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物的支持物,微量滴定板,硝酸纤维素膜,微芯片,玻璃板,或者金属涂层支持物。
根据本发明,各种类型的固相支持物都可以使用,例如基于纤维素、琼脂糖(Sepharose或Macro-Prep凝胶)、葡聚糖(Sephadex凝胶)、丙烯酰胺(Sephacryl、Trisacryl凝胶)、硅(TSK、SW凝胶)、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(Source或者Poros凝胶)、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物(Toyopearl HW、TSK、PW、fractogel EMD凝胶)或者混合物的支持物,特别是琼脂糖和葡聚糖(Superdex凝胶)。将更加特别选择美国主管机构(FDA,即食品和药物管理局)或欧盟机构批准用于人或兽医用途的支持物。此外,所选择的支持物通过键,优选通过共价键结合至亲和配体(认为支持物是官能化的)。作为基质(matrix)骨架,固相基质可包括本身已知适用于固相分离蛋白和其它生物分子的任何天然或者合成以及有机或者无机的材料,例如天然或者合成的多糖如琼脂-琼脂和琼脂糖;纤维素、纤维素醚,例如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素;淀粉;胶,例如瓜耳胶、和阿拉伯胶、茄替胶(gum ghatti)、黄蓍胶、刺槐豆胶、黄原胶;果胶;粘蛋白;葡聚糖;甲壳素;壳聚糖;藻酸盐;角叉菜胶;肝素;明胶;合成聚合物,如聚酰胺如聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺;聚酰亚胺;聚酯;聚醚;聚乙烯基化合物,如聚乙烯醇和聚苯乙烯;聚烯烃;无机材料,如含硅的材料如二氧化硅,包括无定形二氧化硅和石英;二氧化硅;金属硅酸盐,可控孔度的玻璃和陶瓷;金属氧化物和硫化物,或者这些天然或合成以及有机或无机材料的组合。
基质骨架优选选自:琼脂-琼脂、琼脂糖、纤维素、纤维素醚如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、聚酰胺如聚(甲基)丙烯酰胺、聚乙烯醇、二氧化硅和可控孔度的玻璃。
作为基质骨架,尤其感兴趣的固相材料是,例如琼脂或者琼脂糖珠,如来自瑞典Pharmacia Biotech的Sepharose凝胶和Superose珠,以及来自Biorad,USA的Biogel A;基于葡聚糖的珠,如Sephadex,Pharmacia Biotech;基于纤维素的珠和膜比如来自捷克斯洛伐克Secheza的Perloza纤维素;复合珠,如Sephacryl和Superdex,Pharmacia Biotech;合成有机聚合物的珠,比如来自Toso-Haas,USA的Fractogel;来自Perceptive Biosystems,USA的POROS介质,来自Biorad的Bio-Rex、Bio-Gel P和Macro Prep,来自TESSEK的HEMA和Separon,以及来自BioSepra,USA的Hyper D和Trisacryl介质,Enzacryl和Azlactone,3M,USA;含硅材料的珠,比如可控孔度的玻璃,来自英国Bioprocesing的PROSEP,以及Spherocil,BioSepra;以及珠或者膜形式的包被二氧化硅的复合材料,如来自ArborTechnologies,USA的ACTI-DISK、ACTI-MOD和CycloSep。
通常,固相基质骨架,以及所得到的官能化的固相基质可以是例如不规则颗粒或者球形珠、膜或者片材、模制表面、或者棒的形式。固相材料还可以是蛋白完全或部分可渗透的或者完全不能透过的。在本发明的一个特别有趣的实施方式中,基质是不规则或者球形珠的形式,具有尺寸在1-10000μm,优选10-1000μm范围内;例如对于高性能应用而言10-60μm,以及例如对于制备目的而言50-500μm,优选50-300μm。用于本发明中的优选材料(聚甲基丙烯酸酯整料(monoliths))公开于Junbauer等人(J.Chromatogr.A 1184(2008),62-79)中。
尤其有趣的基质形式是团状(conglomerate)形式的密度可控的基质,其包含密度可控的颗粒。这些团状物尤其适于流化床或膨胀床色谱的大规模操作以及非填充柱中的不同分批色谱技术,例如在搅拌罐中简单的分批吸附。
可以通过本身已知适于此目的的任何类型共价键、或者通过亲和配体与固相材料之间的直接化学反应、或者通过采用本身已知能够连接基质骨架和配体的合适试剂事先激活固相材料或者激活配体,可将根据本发明的融合蛋白的亲和配体附着到固相材料上。此类合适的激活试剂的实例是表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚;双环氧化物,如丁二醇二缩水甘油醚;卤取代的脂肪族化合物,如二氯丙醇、二乙烯基砜;羰二咪唑;醛如戊二醛;醌;溴化氰;高碘酸盐,如偏高碘酸钠;碳二亚胺;氯三嗪,如氰尿酰氯;磺酰氯如对甲苯磺酰氯和三氟代乙烷磺酰氯;N-羟基琥珀酰亚胺;2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐;噁唑酮;马来酰亚胺;二硫吡啶;和酰肼。其中,激活试剂留下不同于单键的间隔基团SP1,优选如表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚;双环氧化物;卤取代的脂肪族化合物;乙烯基砜;醛;醌;溴化氰;氯三嗪;噁唑酮;马来酰亚胺;二硫吡啶;和酰肼。
认为尤其感兴趣的激活试剂是环氧化合物,如表氯醇、烯丙基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。
本发明的范围之内,对于肽亲和色谱,可以使用任何可用于肽配体固定化的基质。优选Fractogel的环氧物(epoxy)(M)(来自德国达姆施塔特Merck)或者同样优选使用“整体的(monolithic)色谱介质”CIM-环氧物。可以将配体直接、或者通过间隔物或者接头,固定到色谱基质化学激活的骨架上。在后一种情况下,间隔物偶联至色谱基质,然后化学激活所述间隔物以便允许配体的结合。优选,Fractogel的环氧基质和间隔物组合使用。
在本发明一个特别优选的实施方式中,通过色谱基质与二胺基二丙胺(DADPA)的反应,随后与琥珀酸酐(SA)反应而生成间隔物。将所得的间隔物上的末端羧基基团进行化学激活,并优选连接至末端氨基基团。配体经由它所包含的反应性基团被固定在基质或者间隔物上。在肽配体的情况下,这样的反应性基团可以是氨基、羧基或者巯基。本发明内,特别优选通过氨基键将肽锚定在基质或者间隔物上。
优选地,根据本发明所用的固相被作为亲和色谱材料而提供,并显示出WO 2006/113958 A2所公开的寡肽配体。
优选地,固体支持物是色谱柱。原则上,在本发明框架内可以使用能够选择性结合融合多肽(包含Npro和兴趣蛋白)的任何色谱材料。在优选的实施方式中,色谱基质可能是柱的形式,但是它也可以是其它形式,如珠或者有机材料,如亲和肽改性的聚乙二醇。
适于本发明范围内使用的色谱材料可以基于纤维素结合结构域,它们可以是使用多阳离子标签(如聚精氨酸或者聚赖氨酸)的阳离子交换色谱材料以及带有聚阴离子标签(如聚天冬酰胺)的阴离子交换色谱。因此,本发明范围内,作为固体支持物使用的亲和色谱材料优选选自:固定化的金属离子色谱(IMAC)、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、纤维素结合结构域色谱和肽亲和色谱。
更优选,使用的亲和色谱是阳离子交换色谱,其中所述融合多肽包含聚阳离子标签。甚至更优选,使用聚精氨酸或者聚赖氨酸亲和标签。
对于阳离子交换色谱,表达的多肽优选包含N端聚阳离子标签,例如聚精氨酸或者赖氨酸标签。含有提取自宿主细胞的所表达的多肽的溶液是(过滤的),并且加载至填有适合阳离子交换色谱的任何介质的柱上,其中介质例如SP Sepharose FF、CM Sepharose FF、Fractogel EMD SO3-。优选,采用具有低导电性的缓冲液。加载之后,可冲掉未结合的材料,并且可以启动再折叠。
本发明另一个优选的实施方式是,其中固体支持物是亲和色谱或者阴离子交换色谱,并且其中待结合至柱上的多肽包含聚阴离子标签。更优选,聚天冬酰胺被用作亲和标签。
再一个以实现期望的结合特性的优选实施方式是固定化的金属离子亲和色谱(IMAC)。因此,在本发明优选的实施方式中,固体支持物是固定化的金属离子亲和色谱(IMAC)材料,并且待结合的多肽(尤其是包含Npro第二部分和兴趣蛋白的融合蛋白)包含金属螯合亲和标签。在这种情况下,通过多肽所包含的金属螯合亲和标签检测并结合多肽。在本发明更优选的实施方式中,金属螯合亲和标签是聚组氨酸亲和标签。IMAC基于组氨酸或(天然存在于蛋白表面或通过重组DNA技术接枝的)其它合适的独特氨基酸与各种固定化金属离子(如铜、镍、锌、或者铁)之间特定的配位共价结合。本领域中已知用于IMAC的色谱材料也可用在本发明中。在本发明优选的实施方式中,Ni2+螯合的Sepharose Fast flow(GEHealthcare,Uppsala,SE)被用作基质。
或者,固相支持物可以是免疫亲和色谱材料,其采用了上述表位标签,所述表位标签存在于多肽N端并且通过识别所述标签的抗体与色谱基质相结合。另一优选的亲和色谱材料是公开于WO2006/113958 A的使用寡肽配体的亲和色谱。
本发明优选的实施方式特征在于融合蛋白包含其它部分,优选亲和标签或者辅助再折叠的部分,尤其是His-标签、SlyD(或SlyD的部分)、由正电或者负电部分组成的寡聚氨基酸延伸片段、Strep-标签和/或FLAG-标签。
根据优选的实施方式,融合蛋白是纯化或者部分纯化的,尤其是在步骤(b)和步骤(c)之间。优选,通过亲和纯化,优选通过亲和色谱或者亲和沉淀(尤其在步骤(b)和步骤(c)之间)纯化或者部分纯化所述融合蛋白。
采用Npro技术进行本发明。这种技术公开在例如WO 01/11057A、WO 01/11056A、WO2006/113957A、WO 2006/113958A、WO 2006/113959 A、Cheng等人,Amino Acids39(5)(2010):1545-1552;Dürauer等人,Sep.Sci.Technol.45(2010):2194-2209;Schmoeger等人,J.Chromatog.1217(2010):5950-5956;Hahn等人,J.Chromatog.1217(2010):6203-6213;以及Achmüller等人,Nat.Meth.4(2007),1037-1043中。概括地说,Npro技术涉及用于重组生产异源兴趣蛋白的方法,其包括(i)培养转化有表达载体的细菌宿主细胞,所述表达载体包含编码融合蛋白的核酸分子,其中融合蛋白包含显示出瘟病毒自我蛋白酶Npro自我蛋白酶解功能的第一多肽、以及在所述第一多肽C端连接到所述第一多肽的第二多肽,其中所述第二多肽以第二多肽能够被所述第一多肽的自我蛋白酶解活性从所述融合蛋白上切割下来的方式和所述第一多肽连接,并且所述第二多肽是异源兴趣蛋白,其中在引起所述融合蛋白表达和形成相应细胞质包涵体的条件下进行培养,(ii)从所述宿主细胞中分离包涵体,(ⅲ)溶解所述分离的包涵体,(ⅳ)稀释溶解物(solubilisate)从而提供反应溶液,在溶液中进行异源兴趣蛋白从融合蛋白的自我蛋白酶解切割,以及(v)切割的异源兴趣蛋白的分离(“回收”)。
这种技术适用于多种兴趣蛋白。对于本发明的目的,术语“异源蛋白”、“靶标蛋白”、“兴趣多肽”或者“兴趣蛋白”(等)是指不是天然地由瘟病毒自我蛋白酶Npro从天然存在的融合蛋白或多蛋白上切割下来的多肽(即,多肽不是天然地位于编码结构蛋白C和随后病毒蛋白的瘟病毒多蛋白的氨基酸169ff之后)。这种异源兴趣蛋白的实例是工业酶(处理酶)或具有药物活性尤其是人类药物活性的多肽。
由于其自我蛋白酶解切割,其能够合成具有真实N端的蛋白,这对于制药应用尤其重要。此外,不仅大的蛋白(“兴趣蛋白”)而且小的肽都可以通过C端连接至Npro而得以稳定表达。高的表达速率迫使融合蛋白形成包涵体。纯化之后,Npro进行重折叠并将自身切割下来。
重要的是,可通过本发明生产的兴趣蛋白C端附着于Npro自我蛋白酶的Cys168后,因为这是切割位点,在此处Npro部分的C端(位于Cys168)和兴趣蛋白之间的肽键在根据本发明的步骤(c)中被切割。
具有人类药物活性的优选兴趣蛋白的实例是细胞因子,如白细胞介素,例如IL-6,干扰素如白细胞干扰素,例如干扰素α2B,生长因子,特别是造血或者伤口愈合生长因子,如G-CSF、促红细胞生成素、或者IGF,激素如人生长激素(hGH),抗体或者疫苗。仅具有5至30个氨基酸残基的很短多肽也可以作为兴趣蛋白通过本技术进行生产。Npro技术在利用包涵体的表达系统当中具有特定的优势,因为融合的自我蛋白酶强烈聚集的倾向有助于形成惰性包涵体,几乎不依赖于融合配偶体。因此,几乎任何兴趣蛋白能够采用本系统进行大量和高产量的生产。例如报道适用于合成的干扰素-α1;毒性促旋酶抑制剂CcdB,一种被称为pep6His的短16个残基的模型肽(SVDKLAAALEHHHHHH(SEQ ID No.3))、人胰岛素原、合成的葡萄球菌蛋白A的双结构域D(sSpA-D2)、角蛋白相关蛋白10-4(KRTAP10-4)、合成的绿色荧光蛋白变体(sGFPmut3.1)、带有N端半胱氨酸的衰老逃避因子(senescence evasionfactor)的合成抑制肽(C-sSNEVi)、带有随机氨基酸序列和C端半胱氨酸的衰老逃避因子的合成抑制肽(sSNEVscr-C);重组人单核细胞趋化蛋白1(rhMCP-1)。到目前为止,就高产量而言,唯一的限制被认为是伴侣分子和具有支持蛋白折叠相当特性的蛋白。这种蛋白作为融合配偶体可以抑制Npro分子的聚集倾向,由于较少的聚集而导致产量降低。然而,本技术甚至能够用于表达这种抗聚集作用的蛋白。
根据本发明的融合蛋白可另外包含辅助序列,如亲和标签或者再折叠辅助部分;它也可含有一种以上的兴趣蛋白(例如它可以包含两个或者三个或者四个或者甚至更多的兴趣蛋白,其可以在稍后的阶段、或者甚至在与Npro自我蛋白酶切割相同的阶段彼此分离)。
根据另一个方面,本发明还涉及Npro自我蛋白酶部分(以分离的形式、或者和兴趣蛋白一起以融合多肽的形式),相较于野生型Npro或其它已知的Npro变体(如根据WO2006/113957 A的EDDIE变体),其具有改善的离液序列高的特性。本发明提供的Npro部分具有不寻常的高的β聚集倾向。这已经见于“HoBi”形式(UniProt数据库登录号Q5L4B1)。这种高的β聚集倾向与这些自我蛋白酶的特定特性相关,即高的生产能力和在高的离液序列高的条件下复性。采用本发明,提供了和酶活性兼容的天然存在的Npro变体中的疏水区域(patches)。在原始的HoBi支架上组合这种疏水区域,提供了新型的活性Npro变体,所述变体具有表达过程中β聚集、包涵体形成和复性相关的改善特性。因此,这些Npro变体特别适合用于重组表达。在根据本发明的新型分子当中,单独或者组合地提供如下HoBi蛋白序列(SEQ.ID.No.2)中的氨基酸交换:
N28至V、L或者I;A30至T;T39至V或者I;L81至V,F82至Y,V83至I,K84至E,P85至L,P87至A,V88至I,Q91至K;S94至I、L或者V;Q105至L;P110至V;N127至K,M131至I,T135至V,V141至L。在根据本发明优选的Npro变体实施方式中,存在至少两个这样的交换,更优选,至少三个交换,尤其是至少四个交换。
这些氨基酸交换显著影响经优化的HoBi-Npro的β聚集特性,并且在瘟病毒物种的进化过程中所有这些交换是耐受的,因为这些交换已见于酶促活性的Npro变体。
因此,本发明提供了一种Npro自我蛋白酶部分,其具有这样的序列,和SEQ IN No.2相比所述序列包含至少一个氨基酸交换,其中所述氨基酸交换选自:N28至V、L或者I;A30至T;T39至V或者I;L81至V,F82至Y,V83至I,K84至E,P85至L,P87至A,V88至I,Q91至K;S94至I、L或者V;Q105至L;P110至V;N127至K,M131至I,T135至V,V141至L。
根据本发明的Npro自我蛋白酶部分可包含至少两个,优选至少三个,尤其是至少四个氨基酸交换,其中所述氨基酸交换选自:N28至V、L或者I;A30至T;T39至V或者I;L81至V,F82至Y,V83至I,K84至E,P85至L,P87至A,V88至I,Q91至K;S94至I、L或者V;Q105至L;P110至V;N127至K,M131至I,T135至V,V141至L。
优选地,缺失SEQ ID No.2的氨基酸2至21。这允许实现蛋白表达系统中甚至更加改善的结果。
根据本发明的Npro自我蛋白酶部分中,另一优选的交换是SEQ ID No.2的A166交换为T。
这种Npro自我蛋白酶部分(包括根据SEQ ID No.2的Npro自我蛋白酶部分)尤其用于蛋白的重组表达。
本发明还涉及融合蛋白,其包含重组兴趣蛋白和根据本发明的Npro自我蛋白酶部分(包括根据SEQ ID No.2的Npro自我蛋白酶部分)。本发明还涉及核酸分子,其包含编码这种Npro自我蛋白酶部分的序列、或者编码融合蛋白的序列,尤其是(带有例如合适的启动子、标记基因(抗性标记物等)等)用于重组表达的表达载体。
和上述教导一致,本发明尤其提供了一种Npro自我蛋白酶部分,其具有选自SEQ IDNo.1或者2的序列(Δ21Npro(HoBi)或者Npro(HoBi))。另一方面,也可以应用已知的Npro自我蛋白酶序列,如瘟病毒株D32/00_HoBi的N端蛋白酶(GenBank登录号AAS68353.1)。
根据优选的实施方式,本发明涉及使用瘟病毒Npro自我蛋白酶的变体D32/00_“HoBi”(SEQ.ID.No.1)来生产具有确切N端的重组蛋白(意指在蛋白产物中所有分子具有相同的N端;大肠杆菌中的标准蛋白生产部分地导致蛋白在N端具有N-甲酰基,以及蛋白缺乏N端甲硫氨酸),其中所述变体在C端不是具有天然存在的“ASC”基序而是具有i.a.“TSC”基序(SEQ.ID.No.2;也称为“Npro(HoBi)”),在高的离液序列高的条件下其显示自我蛋白酶解活性,从而允许自我蛋白酶和靶标蛋白再折叠之间尤其高效的分离。
本发明还涉及一种表达载体,其编码包含根据SEQ ID No.1和2的Npro自我编码蛋白酶的融合蛋白。在根据本发明方法待使用的表达载体中,融合多肽可操作地连接到至少一个表达控制序列。表达控制序列特别是启动子(例如lac、tac、T3、T7、trp、gac、vhb、lambda pL或者phoA启动子)、核糖体结合位点(例如属于上述启动子的天然核糖体结合位点、cro或者合成的核糖体结合位点)、或者转录终止子(例如rrnB T1T2或者bla)。
如下面所述,载体还可以包含编码融合结构域的序列,融合结构域存在于融合多肽的N端并且是其结合亲和色谱系统所需的,例如聚氨基酸如聚赖氨酸或者,对于免疫亲和色谱而言所谓的“表位标签”,其通常是特异性抗体可利用的短肽序列。熟知的特异性单克隆抗体所容易利用的表位标签,包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。
在本发明优选的实施方式中,表达载体是质粒。
本发明的另一个方面涉及一种含有根据本发明表达载体的宿主细胞,优选原核宿主细胞,尤其是大肠杆菌宿主细胞。根据本身已知的微生物操作培养转化的细菌宿主细胞,即表达株。通常在营养介质中从单个菌落开始来培养宿主株,但是也可以采用低温保存的细胞悬液(细胞库)。一般在多阶段的方法中培养株,以便获得足够的生物质以供进一步使用。
在小规模时,可以在摇瓶中进行,在大多数情况下可以采用复合介质(例如LB肉汤)。然而,也可以使用特定的介质(例如柠檬酸盐介质)。由于在本发明优选的实施方式中,所表达的融合多肽意图处于不溶性包涵体的形式,在这些情况下将在相对高的温度(例如30或者37℃)时进行培养。可诱导系统特别适合于生产包涵体(例如带有trp、lac、tac或者phoA启动子)。
在更大的规模时,多阶段的系统由多个生物反应器(发酵罐)组成,它优选采用特定的营养介质。此外,通过尤其是计量营养物(补料分批),有可能大大增加生物质和产物的形成。否则,过程类似于摇瓶。在根据本发明的方法中,以本身已知的方式从宿主细胞中分离包涵体。例如,已经进行发酵之后,通过离心、微量过滤、絮凝或者其组合,优选通过离心来收获宿主细胞。通过机械、化学或者物理手段,如高压匀浆器、珠磨机、弗氏压碎器、Hughes压碎器、渗透压冲击、去污剂、酶裂解或其组合,来崩解湿的细胞块(mass)。优选,通过高压匀浆进行细胞的破坏。在优选的实施方式中,其中重组融合多肽作为包涵体的形式沉积,例如通过高压分散或优选通过低转速下的简单离心而得到所述包涵体。通过离心或者微量过滤或其组合分离包涵体。然后,通过将包涵体多次重悬于各种缓冲液中,例如NaCl(例如0.5、1.0M)和/或去污剂(例如Triton X 100)存在时,来改善所需兴趣多肽的相关纯度。优选,通过使用各种缓冲液(例如,0.5%脱氧胆酸盐,随后是两次1M的NaCl溶液,最后是蒸馏水)的几个洗涤步骤来改善包涵体制剂的纯度。这通常会导致大部分外源多肽从包涵体中去除。
通过以下实施例和附图进一步描述本发明,但不限制于此。
附图说明
图1:Δ21Npro(HoBi)-pep6His在含2.5M尿素的五种不同再折叠缓冲液中的再折叠SDS-PAGE。在20,000xg时离心100μl的再折叠批次(c=200μg/ml)。通过TCA沉淀上清。沉淀和上清重悬于10μl的1x Magic Mix样本缓冲液中,并加载至Bis-Tris4-12%凝胶。作为对照,沉淀并分析相同量的包涵体。M…PageRulerTM预染蛋白标记(PrestainedProtein Ladder)、P…沉淀、S…上清、co…对照、b…缓冲液。PAGE样本中蛋白的量:P和S总共20μg。
图2:在2.5M尿素存在时,D21Npro(HoBi)-pep6His在五种不同缓冲液中的再折叠效率。凝胶扫描,用AlphaDigDoc 1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
图3:Δ21Npro(HoBi)-pep6His在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中的再折叠,其中的尿素浓度递增至4.5M。在20,000x g时离心100μl的再折叠批次(c=200μg/ml)。通过TCA沉淀上清。沉淀和上清重悬于10μl的1x Magic Mix样本缓冲液中,并加载至Bis-Tris 4-12%凝胶。作为对照,沉淀并分析相同量的包涵体。M…PageRulerTM预染蛋白标记、P…沉淀、S…上清、co…对照。PAGE样本中蛋白的量:P和S总共20μg。
图4:Δ21Npro(HoBi)-pep6His在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中的再折叠效率,其中的尿素浓度递增至4.5M。凝胶拍照,使用AlphaDigDoc 1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
图5:Δ21Npro(HoBi)-pep6His在含3M(A)、3.5M(B)和4M(C)尿素的500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中的再折叠。各个时间点,从再折叠批次(c=200μg/ml)中取100μl的样本,并通过TCA沉淀。重悬于10μl的1x Magic Mix样本缓冲液后,样本加载至Bis-Tris 4-12%凝胶。M…PageRulerTM预染的蛋白标记、P…沉淀、S…上清、co…对照、b…缓冲液。各个PAGE样本中蛋白的量:10μg(A和C)和5μg(B)。
图6:存在3M、3.5M和4M尿素时,在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中确定Δ21Npro(HoBi)-pep6His的再折叠动力学。凝胶拍照,使用AlphaDigDoc1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
图7:Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His在含2.5M尿素的五种不同再折叠缓冲液中的再折叠的SDS-PAGE。在20,000x g时离心100μl的再折叠批次(c=200μg/ml)。通过TCA沉淀上清。沉淀和上清重悬于10μl的1x Magic Mix样本缓冲液中,并加载至Bis-Tris 4-12%凝胶。作为对照,沉淀并分析相同量的包涵体。M…PageRulerTM预染蛋白标记、P…沉淀、S…上清、co…对照、b…缓冲液。PAGE样本中蛋白的量:P和S总共20μg。
图8:Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中的再折叠,其中的尿素浓度递增至4.5M。在20,000xg时离心100μl的再折叠批次(c=200μg/ml)。通过TCA沉淀上清。沉淀和上清重悬于10μl的1x Magic Mix样本缓冲液中,并加载至Bis-Tris 4-12%凝胶。作为对照,沉淀并分析相同量的包涵体。M…PageRulerTM预染蛋白标记、P…沉淀、S…上清、co…对照。PAGE样本中蛋白的量:P和S总共20μg。
图9:D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)和D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)的发酵:生物质(DCW)形成的过程、融合蛋白的滴度以及融合蛋白内MCP-1(SEQO ID.NO.10)的滴度
x轴代表按[h]计的进料时间
左y轴代表按[g/L]计的滴度
右y轴代表按[g/L]计的DCW(细胞干重)
A:生产D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)的细胞的DCW
B:生产D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)的细胞的DCW
C:D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)的滴度
D:D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)的滴度
E:D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)内MCP-1的滴度
F:D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)内MCP-1的滴度。
图10:D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)和D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)的发酵:融合蛋白的滴度、融合蛋白内MCP-1的滴度以及MCP-1的特定滴度的比较
左y轴代表按[g/L]计的滴度
右y轴代表按[mg/g DCW]计的特定滴度
EDDIE代表D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)
HoBi代表D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)
a:融合蛋白的滴度
b:融合蛋白内MCP-1的滴度
c:MCP-1的特定滴度。
图11:Npro-融合蛋白D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6)、D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)、D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO.7)和D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9)的表达:孵育后三小时,可溶(S)和不可溶(IB)馏分的SDS-PAGE(20μmolIPTG/g CDM)。
道1:分子量标记
道2:D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6),S
道3:D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6),IB
道4:D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8),S
道5:D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8),IB
道6:D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9),S
道7:D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9),IB
图12:以c=0.1mg/L的蛋白浓度,在浓度递增的残余尿素存在时,在8M尿素中溶解以及在Tris缓冲液中再折叠之后,D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)(A)和D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9)(B)的再折叠和切割动力学。
x轴代表按[min]计的时间
y轴代表按[%]计的切割产率
A:在0.4M尿素时以[%]计的切割产率
B:在1M尿素时以[%]计的切割产率
C:在2M尿素时以[%]计的切割产率
D:在3M尿素时以[%]计的切割产率。
具体实施方式
实施例
材料和方法
蛋白表达
采用NdeI和SpeI,将Δ21Npro(HoBi(SEQ.ID.NO.1);(SEQ.ID.NO.2)的氨基酸2至21缺失)克隆至带有pep6His以及SDD-diUbi-pep6His作为靶标蛋白的pET30a载体中。通过电穿孔将载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),细胞在37℃生长过夜。按1:100稀释细胞,并在37℃孵育直至OD600达到0.5。添加1M的IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)至1mM IPTG的终浓度,随后在37℃孵育四小时,来诱导蛋白表达。通过离心收获细胞。使用弗氏压碎器进行裂解。通过另一离心步骤收获包涵体。
Δ21NPro(HoBi)自我蛋白酶部分(SEQ.ID.NO.1)
SVDKLAAALEHHHHHH基序(SEQ.ID.NO.3)是附着至自我蛋白酶部分的模型肽。
NPro(HoBi)自我蛋白酶部分(SEQ.ID.NO.2)
存在2.5M尿素时在不同缓冲液中的再折叠
包涵体溶解在8M尿素/50mM(NH4)2HPO4pH7.5/10mM MTG中,并且在如下中进行再折叠:
a)缓冲液1:500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油
b)缓冲液2:1M Tris/HClpH 7.5、5%甘油
c)缓冲液13:300mM Arg/HCl、500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 9.0、5%甘油
d)缓冲液17:100mM NaCl、100mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油
e)缓冲液19:150mM NaCl、50mM磷酸钠pH 7.5、5%甘油
d)缓冲液23:150mM NaCl、20mM Tris/HCl pH 7.5、5%甘油
加入8M尿素/50mM(NH4)2HPO4pH7.5直至2.5M的终浓度。在20℃下68小时后,通过20,000xg时进行离心以终止再折叠。通过TCA沉淀上清。沉淀和上清重悬于含有8M尿素的凝胶上样缓冲液中,以防止在样本缓冲液中进一步的再折叠,并且使用Bis-Tris凝胶通过凝胶电泳进行分析。染色和脱色后,凝胶拍照,使用AlphaDigDoc 1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在各种尿素浓度下的再折叠
包涵体溶解于8M尿素/50mM(NH4)2HPO4pH7.5/10mM MTG(甲基硫代甘油)中,并且在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中再折叠。向再折叠批次中加入8M尿素/500mMNaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油至获得2.5、3、3.5、4和4.5M的尿素终浓度。在20℃下持续44小时之后,通过20,000xg于室温下离心15分钟以终止再折叠,然后重悬于含有8M尿素的凝胶上样缓冲液中,以防止在样本缓冲液中进一步的再折叠,并且使用Bis-Tris凝胶通过凝胶电泳进行分析。染色和脱色后,凝胶拍照,使用AlphaDigDoc 1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在三种不同尿素浓度下确定再折叠动力学
包涵体溶解于8M尿素/500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH7.5、5%甘油/10mM MTG中,并且于20℃在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中再折叠。向再折叠批次中加入8M尿素/500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油至3、3.5和4M的尿素的终浓度。在确定的时间点(0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9和30小时)提取样本,通过TCA(三氯乙酸)沉淀并重悬于含有8M尿素的凝胶上样缓冲液中,以消除在样本缓冲液中的进一步再折叠。样本加载至Bis-Tris凝胶。染色和脱色后,凝胶拍照,使用AlphaDigDoc 1200仪器通过光密度测定法确定带的强度。
实施例1:Δ21Npro(HoBi)-pep6His
存在2.5M尿素时在不同缓冲液中的再折叠
再折叠研究显示,在2.5M尿素存在时在所有缓冲液中,Δ21Npro(HoBi)能够以不同的效率切割掉pep6His(图1和图2)。
在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在各种尿素浓度下的再折叠
SDS-PAGE显示,在4.5M尿素时Δ21Npro(HoBi)能够切割掉pep6His(图3)。图4中的图像显示,在不同的尿素浓度下Δ21Npro(HoBi)-pep6His的溶解度和再折叠效率。可以假设尿素浓度越高,再折叠效率越低。
在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在三种不同尿素浓度下确定再折叠动力学
图5显示在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在3、3.5和4M尿素时,Δ21Npro(HoBi)-pep6His的再折叠动力学。尿素浓度越高,切割反应发生越慢(图6)。
实施例2:Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His
存在2.5M尿素时在不同缓冲液中的再折叠
通过SDS-PAGE进行的Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His再折叠分析显示,在大部分缓冲液中(缓冲液2和缓冲液13除外)在2.5M尿素存在时,Δ21Npro(HoBi)能够以不同的效率切割掉SDD-diUbi-pep6His(图7)。N端测序确定,在分子量大约18kD的位置,Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His对照泳道中已经可见的条带源自体内切割的Δ21Npro(HoBi)。由于SDD-diUbi-pep6His的条带相当宽,未能考虑确定再折叠效率。
在500mM NaCl、20mM(NH4)2HPO4pH 7.5、5%甘油中在各种尿素浓度下的再折叠
图8中的SDS-PAGE表明Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His在4.5M尿素时仍然表现出切割活性。由于靶标蛋白SDD-diUbi-pep6His的条带相当宽,没有计算Δ21Npro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His的再折叠效率,但是可以看出再折叠效率随着尿素浓度的增加而降低。
实施例3:D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)和D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)的表达,其中大肠杆菌为补料分批模式
细菌株的产生和重组蛋白的描述
分子量
MCP-1(SEQ.ID.NO.10):8.7kD
D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4):25.2kD
D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5):25.3kD
序列
D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4):
MEPLYDKNGAVLFGEPSDTHPQSTLKLPHPRGEDEVEVGIRDLPRKGDCRTGNRLGPVSGLFVKPGPVFYQDYSGPVYHRAPLEQFKQTPMEETTKRIGRVTGSDGNLYHMYVETDGEILVKQAKREGQDVLKWTYNTLDSPIWVTSCQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5):
MEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
MCP-1(SEQ.ID.NO.10):
QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
表1:生成的表达株的列表
密码子优化的兴趣基因(GOI)得以合成(Geneart AG,德国),并在Geneart质粒中进行提供,所述质粒带有NdeⅠ限制性位点和EcoRI限制性位点以及两个TAA终止密码子。所得到的GOI DNA用NdeI和EcoRI进行消化,并连接到用相同酶限制消化的pET30a载体(Novagen,Merck Millipore)中。
为了表达Npro片段,使用大肠杆菌株BL21(DE3)。在37℃时,转化养大肠杆菌BL21(DE3)并培养o/n。
挑取3个克隆,各自分开地重悬于Luria-Bertani(LB)介质中(Bertani等人1951),在37℃生长直到光密度(OD550nm)为0.2-0.5,并作为甘油储液的形式冷冻。
为了评价表达,进行了克隆筛选:从甘油储液中接种LB介质,并在37℃下过夜生长。为了进行克隆筛选,用种子培养物接种生产培养LB介质,直至0.2的OD,生长直到OD为1。随后,通过向悬液中添加1mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达。在37℃孵育4小时后,通过离心收获细胞沉淀物,保存在-20℃,并且通过SDS(十二烷基硫酸钠)Page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析生产能力,如下:
-样本制备:BugBuster提取试剂((Novagen-Merck)加Lysonase Bioprocessing试剂混合物(Novagen-Merck)
-凝胶:NuPage 12%Bis Tris,1.0mm(Invitrogen)
-样本缓冲液:NuPAGE LDS样本缓冲液(Invitrogen)
-还原剂:2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)
-电泳缓冲液:NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen)
-检测:SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)
培养模式和过程分析
预培养
在玻璃摇瓶中,从甘油储液中接种300mL预培养介质(如实施例4所述的介质组成)中,并生长至达到1.25至2.75的光密度(OD550nm)。
主要培养
细胞生长于7L(5L净容积;3L批体积)配有标准控制单元的计算机控制的生物反应器(Sartorius Stedim Biotech AG,德国)中。批介质描述于实施例4的“介质组成”中。通过加入25%氨水溶液(Merck)将pH维持在6.8±0.2的设定点,温度设置为37℃±0.5℃,通气速率固定在每分钟5升。为了避免氧的限制,通过搅拌器的速度和富集纯氧,将溶解氧的水平稳定在20%饱和度以上。通过光声多气体分析仪(Innova)确定出口空气中O2和CO2的含量。加入消泡剂悬液(PPG 2000,Dow)抑制泡沫。为了进行接种,将30ml预培养物无菌转移至生物反应器。当培养物进入稳定期时,开始补料。采用具有指数型底物补料(exponentialsubstrate feed)的补料-分批方案来提供持续8.5小时的0.25h-1恒定生长速率,之后补料改变为以实际补料速率的恒定模式进行。补料介质描述于实施例4的“介质组成”中。
诱导
在常规模式下通过单脉冲直接进入生物反应器中来进行诱导。计算异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)的供给量,以便在过程结束时设定为1mM IPTG的浓度,从而获得充分诱导的系统。
离线分析
用来自Spectronic Instruments,USA的Genesis 10分光光度计在550nm处确定光密度(OD)。在0.2-0.6的范围内测量OD550nm。0.6以上的消光,用OD缓冲液(20.7g/LNa2HPO4*12H20、5.7g/L KH2PO4和11.6g/L NaCl)适当稀释样本。将和所测量的OD样本相当的培养肉汤稀释物进行过滤(0.2μm孔径)以产生空白值。
通过离心10ml的细胞悬液、重悬于蒸馏水、随后离心、并且再重悬来确定细菌干物质(细胞干重,DCW)。然后使用水分测定仪(SartoriusStedim Biotech AG,德国)确定细胞干重。
离心35g培养肉汤的样本。弃去上清液,除去残余的液体,并确定生物质沉淀的重量。
用葡萄糖分析仪YSI 2700Select(Yellow Springs)测量培养物上清中的葡萄糖。
通过还原SDS Page确定重组蛋白的含量,如下:
-样本制备:BugBuster提取试剂((Novagen-Merck)加Lysonase Bioprocessing试剂混合物(Novagen-Merck)
-凝胶:NuPage 12%Bis Tris,1.0mm(Invitrogen)
-样本缓冲液:NuPAGE LDS样本缓冲液(Invitrogen)
-还原剂:2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)
-电泳缓冲液:NuPAGE MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen)
-检测:SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)
结果
两个融合蛋白D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4)和D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)以不溶性包涵体(IB)的形式表达(图9和10)。
总结:
图9和10清楚地显示,和D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO.5)相比,通过表达D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO.4),仅MCP-1(SEQ.ID.NO.10)的滴度显著提高。体积滴度(每升培养肉汤的MCP-1g)和特定滴度(每g细胞干重DCW的MCP-1mg)分别提高1.5和1.4倍。
实施例4:和带有pep6His(SEQ.ID.NO.11)以及SOD-FLS(SEQ.ID.NO.12)作为融合配偶体的EDDIE融合蛋白相比,Npro(HoBi)融合蛋白的再折叠和切割
细菌株的产生和重组蛋白的描述
用Novagen提供的B-株BL21(DE3)进行实验。指定(DE3)表明,宿主是λDE3原噬菌体的溶原性细菌(lysogen),其在lacUV5启动子的控制下携带T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝,使得这些株适用于使用T7或者T7lac启动子的蛋白表达(Studier和Moffat,1986;Studier等人,1990)。使用来自Novagen的pET30a质粒(pET系统手册,11th版)进行靶标蛋白的表达。
表2:所产生的表达株的列表
蛋白 | 株 | 质粒 | 启动子 |
D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6) | BL21(DE3) | pET30a | T7 |
D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8) | BL21(DE3) | pET30a | T7 |
D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO.7) | BL21(DE3) | pET30a | T7 |
D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9) | BL21(DE3) | pET30a | T7 |
D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6)
D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)
D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9)
D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO.7)
Pep6His(SEQ.ID.NO.11)
SV DKLAAALEHH HHHH
SOD-FLS(SEQ.ID.NO.12)
培养模式和过程分析
细胞生长于10L(5L工作体积)配有标准控制单元的计算机控制的生物反应器(MBR;Wetzikon,CH)中。通过加入25%氨水溶液(ACROS Organics)将pH维持在7.0±0.05的设定点,温度设置为37℃±0.5℃。为了避免氧的限制,通过搅拌器的速度和通气速率的控制将溶解氧的水平稳定在30%以上的饱和度。通过Hartmann and Braun Advanced Optima气体分析仪确定出口空气中O2和CO2的含量。用214M型号的生物质监测器(AberInstruments,Aberystwyth,UK)套装测量电介质容量(Dielectric capacity)和导电率。以0.5ml/l补料介质的浓度加入消泡剂悬液(PPG 2000,Bussetti,Vienna)抑制泡沫。为了进行接种,深度冷冻(-80℃)的工作细胞库小瓶进行解冻,将1ml(光密度OD600=1)无菌转移至生物反应器。当培养物(生长到4.0L批介质中7.5g的细菌干物质)进入稳定期时,开始补料。采用具有指数型底物补料的补料-分批方案来提供2个倍增时间期间内0.2h-1恒定生长速率。根据指数生长算法x=xo.eμt以及底物罐中重量损失的叠加反馈控制,通过增加泵的速度控制底物补料(Cserjan-Puschmann等人,1999)。补料介质提供足够的组分,得到129g的细菌干物质。
诱导
在常规模式下通过单脉冲直接进入生物反应器中来进行诱导。计算IPTG的供给量,以便在过程结束时设定为20μmol IPTG/g CDMat的浓度,从而获得充分诱导的系统。
介质组成(composition)
在这项研究中所用的基础介质中每升含有3g KH2PO4和6g K2HPO4*3H2O。这些浓度提供所需的缓冲容量,并且还作为P和K的来源。根据所要生产的细菌干物质克重加入其它组分:柠檬酸钠(三钠盐*2H2O;Acros organics)0.25g、MgSO4*7H2O 0.10g、CaCl2*2H2O0.02g、微量元素溶液50μl和葡萄糖*H2O 3g。为了加速群的初始生长,0.15g复合组分酵母提取物加到基础介质中,以获得批介质。对于补料期,根据补料期要生产的129g生物干物质的量制备1L基础介质,从而每升再加入P-盐。微量元素溶液:制备于5N HCl(g/L)中:FeSO4*7H2O 40.0、MnSO4*H2O 10.0、AlCl3*6H2O 10.0、CoCl2(Fluka)4.0、ZnSO4*7H2O 2.0、Na2MoO2*2H2O 2.0、CuCl2*2H2O 1.0、H3BO3 0.50。
离线分析
在600nm处测量光密度(OD)。通过离心10ml的细胞悬液、重悬于蒸馏水、随后离心、并且重悬以便转移至预先称重的烧杯中,然后在105℃下干燥24h并重新称重,来确定细菌干物质。通过计算生物量的总量来确定细菌生长的进展(总细菌干物质BDM;也称为细胞干重CDW)。
如图11所示,通过参考的线性回归曲线用SDS-PAGE进行所表达的融合蛋白的定量。因此,将溶解的IB的样本稀释到校准范围内,通过ImageQuantTL软件采用密度测量法来确定条带的蛋白含量。
表2中列出的表达系统用于生产带有pep6His(SEQ.ID.NO.11)和SOD-FLS(SEQ.ID.NO.12)作为融合配偶体的融合蛋白D21Npro(Hobi)和D21EDDIE,以便比较两种自我蛋白酶变体在不同的再折叠条件下的切割特性。当一个倍增过去补料开始时以单脉冲的形式进行诱导以获得充分诱导的系统。
表3:D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ ID No.6)、D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ IDNo.8)、D21EDDIE-pep6His(SEQ ID No.7)和D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ ID No.9)的生产
Cserjan-Puschmann,M.;Kramer,W.;Dürrschmid,E.;Striedner,G.;Bayer,K.Metabolic approaches for the optimisation of recombinant fermentation processes.Appl.Microbioi.Biotechnol,1999,53,43-50.
Studier,F.W.,and Moffatt,B.A.Use of the bacteriophage T7 RNApolymerase to direct selective high-level expression of clonedgenes.J.Mol.Biol.,1986,189,113-130.
Studier,F.W.;Rosenberg,A.L.;Dunn,J.J.;Dubendorff,J.W.Use of T7 RNApolymerase to direct expression of cloned genes.Meth.Enzym.,1990,185,60-89.
包涵体的制备(IB)
按照之前所述的(Walter等人,2013),收获上述蛋白的IB。使用盘式离心机(Pathfinder PSC 1-06-177;GEA GEAWestfalia Separator Group;Oelde德国)收获湿的细胞糊(paste),并使用ultra turrax(IKA,Staufen,德国)重悬于pH 8.0的50mM Tris、50mM NaCl和0.02%Tween中,以获得30g/L的干物质浓度。匀浆以1000bar的压力两次穿过Panda 2K匀浆机(GEA NiroSoaviS.p.A.意大利)。使用盘式离心机分离IB,用pH 8.0的20mMTris、0.5M NaCl和0.02%吐温洗涤两次得到的沉淀。离心后,使用ultra turrax将沉淀物重悬,并用0.5M的NaCl洗涤一次。每次洗涤步骤后,使用盘式离心机分离IB。将最终的沉淀重悬于水中,以获得40%的IB悬液并保存于-20℃。在实验之前,冻干IB并贮存于4℃。
C.Walther,S.Mayer,A.Trefilov,G.Sekot,R.Hahn,A.Jungbauer,A.Dürauer,(2013):Prediciton of Inclusion Body Solubilzation From Shaken to StirredReactors,Biotechnology&Bioengineering,111:84-94
包涵体(IB)的溶解
按照如前所述的(Walther等人,2013)进行IB的溶解。为了溶解IB蛋白,冻干的IB于水中重悬1小时。IB悬液以1∶10的比溶解于相应的溶解缓冲液中。考虑IB悬液的稀释因素,调节缓冲成分的浓度以分别达到8M或者4M的所得尿素浓度和5M GuHCl。此外,溶解缓冲液包含pH 7.3的50mM Tris和100mM MTG的终浓度。2小时后,通过在21℃下13,200rpm进行5分钟(离心机5415R,Eppendorf,德国)以及通过0.22-μm过滤器的连续过滤(Millipore,Billerica,MA,USA),终止反应器中的溶解。
C.Walther,S.Mayer,A.Trefilov,G.Sekot,R.Hahn,A.Jungbauer,A.Dürauer,(2013):Prediciton of Inclusion Body Solubilization From Shaken to StirredReactors,Biotechnology&Bioengineering,111:84-94
再折叠和切割
通过将溶解的IB按照1∶20的比快速稀释到再折叠缓冲液中进行再折叠,保持所有实验离液剂的残余浓度恒定而使得蛋白浓度改变,或者反之亦然。作为再折叠缓冲液,如表4中所列出的,使用两种组成。
表4:用于再折叠的缓冲液的组成
确定切割产率[%]
按照如前所述的(Walther等人,2013),进行切割产率分析。在整个复性过程随着时间通过RP-HPLC分析再折叠样本的等分试样,来确定切割产率。从切割的靶标和自我蛋白酶中分离融合蛋白,使得能够通过切割的靶标/自我蛋白酶相对于初始总融合蛋白的增加来计算切割产率。
使用TSKgel Super-Octyl柱(4.6x50/100mm,2μm,)(Tosoh Bioscience德国)进行RP-HPLC。由水中0.1%(v/v)三氟乙酸(TFA)组成的缓冲系统作为缓冲液A,乙腈中0.1%(v/v)TFA作为缓冲液B。直接注射溶解和再折叠样本。使用针对每个待分析融合蛋白所优化的不同梯度进行洗脱。在两个波长214nm和280nm处进行检测,以区分蛋白和缓冲液组分。对所有融合蛋白建立校准曲线来定量溶液中的蛋白。
C.Walther,S.Mayer,A.Trefilov,G.Sekot,R.Hahn,A.Jungbauer,A.Dürauer,(2013):Prediciton of Inclusion Body Solubilzation From Shaken to StirredReactors,Biotechnology&Bioengineering,111:84-94
结果
在不同尿素浓度时D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)相较于D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9)的切割动力学:
IB溶解在8M尿素中,并在递增浓度的尿素存在时在两个不同的再折叠缓冲液Tris和AmPh中再折叠。对于所有的实验蛋白浓度相同,即c=0.1mg/mL。
图12表明,当在Tris缓冲液中再折叠时,D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)的切割动力学和产率更优越。当在Am-Ph中再折叠时,D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)的24小时后切割产率同样优越(表5)。
表5:当在Am-Ph中再折叠时,在不同尿素浓度时D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.8)相较于D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO.9)的切割产率
在不同尿素浓度时D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6)相较于D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO.7)的切割产率:
IB溶解在8M尿素或5M GuHCl中,在递增浓度的尿素或GuHCl存在时在两个不同的再折叠缓冲液Tris和AmPh中再折叠。对于所有的实验蛋白浓度相同,即c=0.1mg/mL。
表6:溶解于8M尿素或5M GuHCl之后,当递增浓度的残余离液剂存在时D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO.6)相较于D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO.7)在Tris缓冲液或Am-Ph缓冲液中以0.1mg/mL的恒定蛋白浓度在24小时后的切割产率。
n.d.…未确定
总结:
对于两种兴趣蛋白(pep6His(SEQ.ID.NO.11)和SOD-FLS(SEQ.ID.NO.12)),以及在不同的折叠缓冲液(图12、表5和表6)中,递增浓度的离液剂中D21Npro(HoBi)自我蛋白酶活性比D21EDDIE自我蛋白酶优越。
Claims (42)
1.用于生产重组兴趣蛋白的方法,特征在于如下步骤:
(a)提供包涵体中的包含Npro自我蛋白酶部分和兴趣蛋白部分的融合蛋白,
(b)溶解所述包涵体,
(c)允许所述Npro自我蛋白酶部分在离液序列高的条件下切割所述融合蛋白,其中所述离液序列高的条件对应着2至5M的尿素浓度,其中所述重组兴趣蛋白从所述融合蛋白中切割下来,以及其中所述重组兴趣蛋白尚未复性或同时复性,以及
(d)回收所述兴趣蛋白,
其中,所述Npro自我蛋白酶部分由SEQ ID No.1的序列组成或由SEQ ID No.2的序列组成。
2.根据权利要求1所述的方法,特征在于回收所述兴趣蛋白包括所述兴趣蛋白的复性步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于所述包涵体产生于重组生产系统中。
4.根据权利要求3所述的方法,特征在于所述包涵体产生于原核宿主细胞中。
5.根据权利要求3所述的方法,特征在于所述包涵体产生于大肠杆菌宿主细胞中。
6.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于步骤(b)中的所述条件对应着大于5M的尿素浓度。
7.根据权利要求6所述的方法,特征在于步骤(b)中的所述条件对应着大于6M的尿素浓度。
8.根据权利要求6所述的方法,特征在于步骤(b)中的所述条件对应着大于7.5M的尿素浓度。
9.根据权利要求1所述的方法,特征在于步骤(c)中的所述离液序列高的条件对应着2至4M的尿素浓度。
10.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于所述Npro自我蛋白酶部分在2.5M尿素时的切割速率是至少20%。
11.根据权利要求10所述的方法,特征在于所述Npro自我蛋白酶部分在2.5M尿素时的切割速率是至少30%。
12.根据权利要求10所述的方法,特征在于所述Npro自我蛋白酶部分在2.5M尿素时的切割速率是至少40%。
13.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于所述Npro自我蛋白酶部分具有这样的序列,在所述序列中缺失干扰素调节因子3结合位点。
14.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于所述兴趣蛋白是用于人的治疗性用途的蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法,特征在于所述兴趣蛋白是人的重组蛋白或者免疫接种抗原。
16.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于在5至11的pH下进行步骤(b)和/或步骤(c)。
17.根据权利要求16所述的方法,特征在于在6至9.5的pH下进行步骤(b)和/或步骤(c)。
18.根据权利要求16所述的方法,特征在于在6.5至8.5的pH下进行步骤(b)和/或步骤(c)。
19.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于在碱性条件下进行步骤(b)。
20.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于在NaOH或者KOH存在时,进行步骤(b)。
21.根据权利要求20所述的方法,特征在于在大于5mM的NaOH或者KOH存在时,进行步骤(b)。
22.根据权利要求20所述的方法,特征在于在大于25mM的NaOH或者KOH存在时,进行步骤(b)。
23.根据权利要求20所述的方法,特征在于在大于50mM的NaOH或者KOH存在时,进行步骤(b)。
24.根据权利要求20所述的方法,特征在于在大于100mM的NaOH或者KOH存在时,进行步骤(b)。
25.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于在回收兴趣蛋白之后进行兴趣蛋白的复性步骤。
26.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于所述融合蛋白包含额外的部分。
27.根据权利要求26所述的方法,特征在于所述融合蛋白包含亲和标签或者辅助再折叠的部分。
28.根据权利要求26所述的方法,特征在于所述融合蛋白包含His-标签、SlyD、由正电或者负电部分组成的寡聚氨基酸延伸片段、Strep-标签和/或FLAG-标签。
29.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于在步骤(b)和步骤(c)之间纯化或者部分纯化所述融合蛋白。
30.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于通过亲和纯化在步骤(b)和步骤(c)之间纯化或者部分纯化所述融合蛋白。
31.根据权利要求30所述的方法,特征在于通过亲和色谱或者亲和沉淀在步骤(b)和步骤(c)之间纯化或者部分纯化所述融合蛋白。
32.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于步骤(b)中盐酸胍的浓度大于2.5M。
33.根据权利要求32所述的方法,特征在于步骤(b)中盐酸胍的浓度大于3M。
34.根据权利要求32所述的方法,特征在于步骤(b)中盐酸胍的浓度大于3.75M。
35.根据权利要求1或2所述的方法,特征在于步骤(c)中盐酸胍的浓度是0.7至2.5M。
36.根据权利要求35所述的方法,特征在于步骤(c)中盐酸胍的浓度是1至2.5M。
37.根据权利要求35所述的方法,特征在于步骤(c)中盐酸胍的浓度是1至2M。
38.SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的Npro自我蛋白酶部分用于蛋白的重组表达的用途。
39.融合蛋白用于蛋白的重组表达的用途,其中所述融合蛋白包含重组兴趣蛋白以及SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的Npro自我蛋白酶部分。
40.核酸分子用于蛋白的重组表达的用途,其中所述核酸分子包含编码SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的Npro自我蛋白酶部分的序列、或者编码根据权利要求39中所述的融合蛋白的序列。
41.表达载体用于蛋白的重组表达的用途,其中所述表达载体包含根据权利要求40中所述的核酸分子。
42.Npro自我蛋白酶部分,其由SEQ ID No.1的序列组成。
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