KR20150099741A

KR20150099741A - 목적의 재조합 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150099741A
Application number: KR1020157015769A
Authority: KR
Inventors: 마리아 라이트마이어; 라이너 슈나이더; 베른하르트 아우어
Original assignee: 산도즈 아게; 베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2013-12-19
Publication date: 2015-09-01
Also published as: WO2014096239A1; CA2894941C; CN105189743B; JP6554514B2; US20140170702A1; EP2935576B1; US9677107B2; AU2013366602A1; EP2746390A1; CN105189743A; AU2013366602B2; JP2016500273A; KR102141353B1; CA2894941A1; SG11201504694VA; EP2935576A1; JP2018023380A; JP6285459B2

Abstract

본 발명은 목적의 재조합 단백질의 제조 방법을 개시한 것이며, 상기 방법은:
(a) 봉입체 중에 N^pro 오토프로테아제 부분 및 목적의 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 스텝,
(b) 상기 봉입체를 가용화하는 스텝,
(c) 카오트로픽 조건 하에서 N^pro 오토프로테아제 부분에 의해 융합 단백질을 절단하고, 상기 목적의 재조합 단백질은 상기 융합 단백질로부터 절단되고, 상기 목적의 재조합 단백질은 아직 재생되거나 동시에 재생되지 않는 스텝, 및
(d) 상기 목적의 단백질을 재생하는 스텝을 선택적으로 포함하는 목적의 단백질의 회수 스텝에 의한 것을 특징으로 한다.

Description

목적의 재조합 단백질의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING A RECOMBINANT PROTEIN OF INTEREST}

본 발명은 페스티바이러스 기술의 오토프로테아제 N^pro를 사용한 소망의 목적 비상동 폴리펩티드의 재조합 제조를 위한 공정에 관한 것이다.

대장균은 치료용 단백질의 발현을 위해 대량으로 널리 사용된다. 의학적 응용을 위해 동종의 N-말단이 중요하지만, 메티오닌 아미노펩티다아제에 의한 N-포르밀메티오닌의 불완전한 제거는 바람직하지 않은 미세 이질성을 야기할 수 있다. 또한, 유전자 융합 기술은 종종 재조합 단백질 발현을 위해 사용된다. 예를 들면, 글루타티온-S-전이효소(GST), 말토오스 결합 단백질(MBP), 또는 티오레독신과 같은 흔히 사용되는 몇몇 융합 표식은 용해성을 조정하는 반면, 예를 들면 폴리-His, FLAG, 연쇄상 구균 Ⅱ, 또는 칼모듈린-결합 펩티드(CBP)와 같은 다른 것들은 보다 용이한 정제를 위한 친화성 표식으로서 사용된다. 유전자 융합 기술은 서로 다른 절단 효율성 및 특수성을 갖는 효소적 또는 화학적 절단에 의한 최종 단백질 생성물로부터 표식의 제거를 필요로 한다. N^pro 오토프로테아제뿐만 아니라 인테인, 소르타아제 A(SrtA), FrpC 단백질, 또는 시스테인 프로테아제 도메인(CPD)은 약학적 관련성을 갖는 단백질의 발현을 위한 유용한 대안을 제공한다. 재조합 단백질 제조를 위한 자가 절단 융합 표식은 Li, Biotech. Let. 33(2011): 869~881; Xing 외에 의해 보고된 절단가능 자가 응집 표식을 사용한 유선형 단백질 발현 및 정제, Microb. Cell Fact. 10(2011):42에 개시되어 있다.

대장균에 있어서의 비상동 단백질의 과발현은 봉입체로서도 알려진 밀도가 높고, 불용성인 입자에 있어서 응집 및 퇴적을 자주 야기한다. 봉입체에 있어서의 발현의 이점은 소망의 생성물의 높은 순도 및 세포 파괴 후의 원심분리에 의한 용이한 정제이다. 그러나, 중대한 스텝은 그 천연 구조로의 단백질의 분해 스텝 및 리폴딩 스텝이다. 가용화는 일반적으로 우레아 또는 구아니디늄하이드로클로라이드와 같은 고농도의 카오트로픽제 중에서 행해져 완전한 언폴딩에 도달한다. 2-메르캅토에탄올(β-ME), 디티오트레이톨(DTT), 또는 1-모노티오글리세롤(MTG) 등의 환원제를 첨가하여 비천연 분자간 및 분자내 디술파이드 결합을 환원시키고, 환원 상태로 시스테인을 유지한다. 자가 단백질 분해성 절단 및 융합 파트너의 차후 방출은 카오트로프 농도에만 의존하고 있는 반응 속도를 갖는 단분자 반응 후의 리폴딩시에 개시된다(Ueberbacher 외, Process Biochem. 44(2009), 1217~1224).

병목 스텝은 상기 단백질의 복원이다. 리폴딩의 제 1 스텝시의 소수성 분자간 상호작용의 제거는 높은 단백질 농도에서의 성공적인 복원 및 응집 방지를 위해 중대하다(Vallejo 외, Microb. Cell Fact. 3(2004), 11). 몇몇 복원 기술이 알려져 있다. 그 간편함때문에 희석에 의한 리폴딩은 압박 처리 또는 크로마토그래피 기술인 것이, 특히 생산 규모에 있어서 바람직하다. 분자간 상호작용에 의해 응집을 방지하는 단일 스텝에 있어서의 단백질 농도 및 카오트로프 농도는 감소된다. 그러나, 대량 및 저농도 단백질은 후속 공정 스텝에 부담을 준다(Jungbauer 외, J. Biotech. 128(2007), 587~596).

따라서, 본 발명의 목적은, 특히 상기 공정의 후속인 자가 단백질 분해성 절단 및 재조합 단백질의 제조를 위해 복원되어야 하는 봉입체의 복원의 향상을 제공하는 것이다. 바람직하게, 본 발명은 상기 목적의 단백질을 얻기 위해 저용량 및 고농도 단백질을 유효하게 해야 하고, 산업 생산 규모에 있어서, 구체적으로는 의약품에 사용되는 단백질에 대해 확립되기에 적합한 방법을 제공해야 한다. 또한, 상기 목적의 단백질의 복원 스텝으로부터의 상기 오토프로테아제의 복원 스텝의 분리 또한 유익할 것이며, 매우 구체적인 복원 조건을 가능하게 할 것이다.

따라서, 본 발명은 목적의 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하고, 이하의 스텝:

(a) 봉입체 중에 N^pro 오토프로테아제 부분 및 목적의 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 스텝,

(b) 상기 봉입체를 가용화하는 스텝,

(c) 카오트로픽 조건 하에서 N^pro 오토프로테아제 부분에 의해 융합 단백질을 절단하고, 상기 목적의 재조합 단백질은 상기 융합 단백질로부터 절단되고, 상기 목적의 재조합 단백질은 아직 재생되거나 동시에 재생되지 않는 스텝, 및

(d) 상기 목적의 단백질을 재생하는 스텝을 선택적으로 포함하는 목적의 단백질의 회수 스텝에 의한 것을 특징으로 한다.

본 발명은 페스티바이러스 기술의 오토프로테아제 N^pro를 사용한 소망의 목적 비상동 폴리펩티드의 재조합 제조에 있어서의 개선이다. 상기 기술은 일반적으로 숙주 세포, 보통 대장균 등의 원핵 숙주 세포 중의 페스티바이러스 및 목적 비상동 폴리펩티드의 오토프로테아제 N^pro로부터 직접 또는 간접적으로 유래된 자가 단백질 분해성 부분을 포함하는 융합 폴리펩티드의 재조합 발현을 제공한다. 상기 비상동 폴리펩티드 또는 목적의 단백질은 펩티드 결합을 통해 N^pro 분자에 공유 결합된다. 상기 목적의 단백질은 Npro의 C-말단 Cys168과 본 발명에 의해 제조되는 목적의 단백질의 정확한 N-말단 아미노산을 나타내는 융합 폴리펩티드의 위치 169 사이의 펩티드 결합의 가수분해를 통해 융합 단백질로부터 방출된다. 목적의 비상동 폴리펩티드는 소망의 비상동 폴리펩티드가 고립된 후에 N^pro 자가 단백질 분해 활성에 의해 융합 폴리펩티드로부터 절단되는 등의 방법으로 처리되는 세포질 봉입체(IB)의 형태로 숙주 세포 중에 제조된다.

따라서, 페스티바이러스의 오토프로테아제 Npro를 포함하는 융합 폴리펩티드는 비상동 재조합 폴리펩티드의 제조에 특히 유용하다. N^pro는 체내에서 168아미노산의 길이 및 약 20kD의 뚜렷한 M_r을 갖는 오토프로테아제이다. 이것은 페스티바이러스의 다단백질 중의 제 1 단백질이고, 이하의 뉴클레오캡시드 단백질 C로부터 자가 단백질 분해성 절단을 거친다. 상기 절단은 N^pro, Cys168의 서열에서 마지막 아미노산 후에 일어난다. 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro 활성은 상동 N-말단을 갖는 목적의 폴리펩티드를 방출하는 이 명백하게 결정된 위치에서 융합 파트너를 항상 절단한다. 또한, N^pro의 자가 단백질 분해 활성은 특정 완충제에 의해 체내에서 유도될 수 있으므로, IB에서 발현되는 융합 폴리펩티드의 절단에 의해 목적의 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

상기 기술에 사용되는 돼지 콜레라 바이러스(CSFV)로부터의 N-말단 오토프로테아제 N^pro는 특히 대장균에서 대량으로 치료용 단백질을 발현하기 위한 유도적 도구로서 사용된다. 의학적 응용은 N-말단 융합 N^pro 오토프로테아제의 자가 절단에 의해 달성될 수 있는 재조합 단백질의 정확한 N-말단을 필요로 한다. 또한, N^pro 융합 기술은 숙주 세포 프로테아제에 의한 그 합성 직후에 저하되는 작거나 또는 유독성인 펩티드의 발현을 가능하게 한다(Achmuller 외, Nat. Methods 4(2007), 1037~1043). 대장균에서의 N^pro 융합 단백질의 발현이 봉입체로서 알려진 불용성 응집체의 형성을 야기하기 때문에, 생물학적 활성 단백질을 얻기 위해 적절한 분해 및 복원 프로토콜이 요구된다.

상술한 바와 같이, 대부분의 경우에 가용화는 고농도에서 환원제와 조합하여 우레아 또는 구아니디늄클로라이드 등의 카오트로픽제 중에서 행해져 잘못 형성된 디술파이드 결합을 없앤다. 그 간편함때문에 희석에 의한 리폴딩은 복원을 개시하기 위해 널리 사용된다. 따라서, 대량의 완충제가 첨가되어 올바른 생물학적 활성 구조의 형성을 가능하게 하는 조건을 제공한다. 따라서, 본 발명에 의하면 오토프로테아제는 높은 우레아 농도에서 절단 활성을 나타내는 것이 적용된다. 이것은 가용화 스텝 후에 요구되는 완충제량의 유효한 저하를 가능하게 하고, 따라서 비용을 저감한다. 또한, 목적의 단백질과 오토프로테아제가 다른 복원 조건을 필요로 하면, 상기 두 스텝을 분리할 수 있어 바람직한 실시형태에 다른 이점을 추가한다. 높은 카오트로픽 조건에서의 오토프로테아제 활성은 목적의 단백질의 복원 공정으로부터 오토프로테아제의 복원 공정을 분리하고, 따라서 매우 특정한 복원 조건을 가능하게 한다. 사실, 목적의 단백질의 복원 스텝은 목적의 단백질의 회수를 위한 완충제 조절을 가능하게 하는 오토프로테아제에 의해 절단 스텝으로부터 분리될 수 있다. 이 경우, 상기 목적의 단백질은 임의의 추후 단계 및 다른 장소에서 완전한 활성으로 이동할 수 있다. 종래 기술에 있어서, (융합 단백질의 절단을 야기한) 오토프로테아제 부분의 활성의 복원은 항상 목적의 단밸질 부분을 포함하는 전체 융합 단백질의 복원으로 직접 연결되었다. 본 발명의 바람직한 실시형태는 오토프로테아제와 목적의 단백질의 분리된 리폴딩을 가능하게 한다.

따라서, 바람직한 방법에 있어서의 봉입체는 재조합 생산 시스템에서, 바람직하게는 원핵 숙주 세포에서, 특히 대장균 숙주 세포에서 생성되었다.

스텝(b)에 있어서의 바람직한 조건은 5M 이상, 바람직하게는 6M 이상, 특히 바람직하게는 7.5M 이상의 우레아 농도에 상응한다. "상응한다"는 어느 한 우레아가 표시된 양으로 존재하는 것 또는 다른 카오트로픽 물질(예를 들면, 부탄올, 에탄올, 구아니디늄클로라이드, 리튬퍼클로레이트, 마그네슘클로라이드, 페놀, 프로판올, 소듐도데실술페이트, 티오우레아 등, 또는 다른 카오트로프의 조합, 예를 들면 우레아와 구아니디늄하이드로클로라이드의 혼합물)이 (시스템의 엔트로피의 증가로서 측정된) 동일한 카오트로픽 효과를 야기하는 농도로 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 바람직한 구아니디늄하이드로클로라이드 농도는 2.5M 이상, 바람직하게는 3M 이상, 특히 바람직하게는 3.75M 이상, 또는 더욱 바람직하게는 4M 이상이다. 바람직하게, 스텝(b)에 있어서 봉입체의 가용화는 봉입체를 제공하여 조건을 변경시킴으로써 행해진다.

스텝(c)에 있어서의 바람직한 카오트로픽 조건은 1.4~5M, 바람직하게는 2~5M, 특히 바람직하게는 2~4M의 우레아 농도에 상응한다. 스텝(c)에 있어서의 바람직한 구아니디늄하이드로클로라이드 농도는 0.7~2.5M, 바람직하게는 1~2.5M, 특히 바람직하게는 1~2M이다. 또한, 다른 카오트로프의 조합을 적용할 수 있고, 예를 들면 우레아와 구아니디늄하이드로클로라이드의 혼합물이다.

용어 "코스모트로프"(질서 메이커) 및 "카오트로프"(무질서 메이커)는 원래 각각 안정하거나 또는 불안정한 용질, 단백질, 및 멤브레인을 나타내었다. 이후에는 그들은 물의 구조화를 각각 증가시키거나 감소시키는 명백한 상관성을 나타낸다. 이러한 성질은 환경, 측정 방법, 또는 조사된 용매화 껍질에 따라 달라도 좋다. 삼투성 스트레스를 받는 세포에서 (물의 네트워크에 결합된 천연 수소를 파괴하는)높은 염 함량의 유해한 효과에 대해 보상하는 것을 발견했기 때문에, 코스모트로프를 위해 사용되는 대체 용어는 "보상 용질"이다. 수소 결합의 면적 및 강도 모두 용질에 의해 독립적으로 변경되어도 좋지만, 이들 모두 질서 메이킹의 측정에 사용되어도 좋고, 사용되고 있다. 그러나, 이것은 최우선 중요성인 우수한 수소 결합의 범위에 있어서의 효과이다. 수화 카오트로프보다 큰 주위의 대용량 물을 갖는 무질서의 보다 넓은 무질서한 교차존을 만드는 그 확산 회전에 의해 코스모트로프의 배치 효과가 혼란스러워질 수 있다. 대부분의 코스모트로프는 물에서 큰 규모의 네트 구조화를 야기하지 않는다.

주로 주위의 물 분자의 유도 및 편광된 배열때문에, 이온성 코스모트로프(또는: 비이온성 코스모트로프와 구별하기 위해 "안티카오트로프")는 비이온성 코스모트로프와 다르게 처리되어야 한다. 일반적으로, 이온성 반응은 호프마이스터 시리즈와 유사하다. 낮은 전하 밀도를 갖는 대량 단독 대전된 이온(예를 들면, SNC^-, H₂PO₄ ^-, HSO₄ ^-, HCO₃ ^-, I^-, Cl^-, NO₃ ^-, NH₄ ⁺, Cs⁺, K⁺, (NH₂)₃C⁺(구아니디늄), 및 (CH₃)₄N⁺(테트라메틸암모늄) 이온; 물과 물의 상호작용보다 약한 물과의 상호작용을 나타내므로, 주위의 물의 수소 결합에 조금 간섭함)은 카오트로프인 반면, 높은 전하 농도를 갖는 소량 또는 다중 대전된 이온은 코스모트로프이다(예를 들면, SO₄ ^2-, HPO₄ ^2-, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Li⁺, Na⁺, H⁺, OH^-, 및 HPO₄ ² ^-,물과 물의 상호작용보다 강한 물 분자와의 상호작용을 나타내므로, 물-물 수소 결합을 절단할 수 있음). 단독 대전된 카오트로픽 이온의 반지름은 양이온보다 1.06Å 이상 크고, 음이온보다 1.78Å 이상 크다. 따라서, 물 분자 사이의 수소 결합은 이온성 카오트로프보다 이온성 코스모트로프의 바로 인근에서 절단된다. 이 결론을 보강하면, 할라이드 이온 F^-, Cl^-, Br^-, 및 I^- 주위의 물의 수소 결합 구조의 라만 스펙트럼 연구는 이온 크기의 증가와 함께 수성 수소 결합의 총 면적이 증가하는 것을 나타내고, HDO:D₂O에 있어서의 IR 연구는 사이즈 증가에 대하여 느려지는 이들 할라이드 이온 주위의 느린 수소 결합 재배향을 나타냈다. 몇몇 다른 수소 결합을 절단함(구조 브레이커; 예를 들면, 코스모트로픽 양이온은 내측 껍질 물 분자에 의해 수용되는 수소 결합을 약화시킴)과 동시에 용질이 그 주위의 몇몇 수소 결합을 강화할 수 있는 것(구조 메이킹; 예를 들면, 코스모트로픽 양이온은 내측 껍질 물 분자에 의해 기부된 수소 결합을 강화함)은 불합리하지 않다. 물 분자는 순전하를 갖지 않는 분자에 의한 것보다 순전하를 갖는 분자에 의해 보다 강하게 포획된다; 쌍성 이온성 아미노산과 양이온성 아미노산 사이의 차이에 의해 나타내어진 바와 같다.

약하게 수화된 이온(카오트로프, K⁺, Rb⁺, Cs⁺, Br^-, I^-, 구아니디늄⁺)은 이온수 수화작용의 강도가 (강한 측 경계선의 Na⁺와 약한 측 경계선의 Cl^-를 갖는) 벌크 용액 중에 물-물 상호작용의 강도와 대략 동등하게 발생하는 강한 이온성 수화작용으로부터 약한 이온성 수화작용으로 변화된 강한 물-물 상호작용에 의해 약하게 수화된 표면으로 "내밀릴" 수 있다. 2종의 중요한 카오트로프(구아니디늄과 티오시아네이트 이온)에 대한 중성자 회절 연구는 물보다 단백질과 우선적으로 상호작용한다는 제안을 지지하는 매우 빈약한 수화작용을 나타낸다. 코스모트로프와의 연결에 있어서는, 이전의 낮은 전하 농도때문에 이온성 카오트로프와 비이온성 카오트로프의 성질 사이에 작은 중요 차이점이 있다.

염에 의한 생물학적 고분자의 최적 안정화는 카오트로픽 양이온과 코스모트로픽 음이온의 혼합물을 필요로 한다.

카오트로프가 물의 수소 결합 네트워크를 절단하여 고분자가 보다 구조적 자유를 갖고, 단백질 확대 및 변성을 조장한다. 코스모트로프는 물의 질서를 증가시키는 안정화 용질(예를 들면, 다가 알코올, 트레할로오스, 트리메틸아민N-옥사이드, 글리신베타인, 에크토인, 프롤린, 및 각종 다른 쌍성 이온)인 반면, 카오트로프는 물의 질서를 저하시키고, 표면장력을 증가시키고, 고분자 구조(예를 들면, 고농도에서의 구아니디늄클로라이드 및 우레아) 불안정화시키는 보다 약한 수소 결합을 생성한다. 최근의 작업은 우레아가 수소 결합과 소수성 상호작용을 모두 약화시키지만, 글루코오스가 이들 성질이 향상된 코스모트로프로서 작용하는 것을 나타낸다. 따라서, 충분한 물의 존재 하에서 그 자체 및 (펩티드 결합을 크게 포함하는) 단백질에 결합한 최적으로 수화된 우레아 수소 결합보다 우레아 문자가 적을 경우, 보다 소수성이 되고, 따라서 단백질 상의 추가 위치에서 상호작용이 보다 가능해지고, 탈수 주도 변성의 국소화를 야기한다. 구아니디늄은 그 모서리 주위에 약한 수소 결합을 형성해도 좋지만, 흔히 발견되는 4차 구조 아르기닌-카르복실레이트"염" 결합과 유사한 단백질 카르복실레이트와 강하게 포획된 수소 결합 이온쌍을 확립해도 좋은 평면 이온이다. 또한, 구아니디늄은 유사 단백질 표면과 상호작용하여 단백질 변성을 가능하게 해도 좋은 약간의 소수성 표면을 보유한다. 양방의 변성제는 단백질 팽창 및 소수성 위치 사이의 슬라이딩과, 그 결과 발생하는 수소 결합된 물 중에 드래깅에 의해 구조 파괴를 야기하여 변성을 완료해도 좋다.

일반적으로, 용질의 코스모트로픽/카오트로픽 특성은 자주 필연적으로 고농도에서의 물의 물리적 벌크성으로부터 정해진다. 구조화의 정도의 변화는, 예를 들면 NMR 또는 진동 스펙트럼을 사용하여 발견될 수 있다. 단백질 안정화 용질(코스모트로프)은 (양성자와 ¹⁷O 스핀 격자 완화 시간을 감소시키는) 수소 결합의 범위를 증가시키는 반면, NMR 화학적 이동은 (보다 약한 결합을 나타내는, 예를 들면 쌍성 이온성 코스모트로프, 트리메틸아민N-옥사이드)를 증가시키거나, 또는 (보다 강한 결합을 나타내는, 예를 들면 폴리히드록시코스모트로프, 트레할로오스)를 감소시킬 수 있다. 보다 적은 범위가 단백질 안정화제 (NH₄)₂SO₄를 행하는 것에 대하여 트레할로오스는 화학적 이동과 완화 시간 모두에 있어서의 감소를 나타내는 반면, NaCl은 화학적 이동에 있어서의 감소만을 나타내고, 단백질 불안정화제 KSCN은 완화 시간에 있어서의 증가 및 화학적 이동에 있어서의 감소를 나타낸다. 진동 스펙트럼은 수소 결합이 보다 강해질 경우에 보다 긴 파장(보다 작은 파수)을 향해 이동하는 IR 부근 파장 5200㎝^-1 부근(v₂+v₃ 조합)을 사용해도 좋다.

가장 중요한 코스모트로프 중 하나는 비환원당 α,α-트레할로오스이다. 변광 회전의 부족에 의한 트레할로오스, 또는 푸란환의 부족에 의한 다른 흔한 비환원 사카라이드, 수크로오스가 환원당보다 정적인 구조를 갖는 것을 아마도 유의해야 한다.

따라서, 용어 "카오트로픽 조건"은 각각 액체 개시제(예를 들면, 용액, 현탁액, 유액, 2상 또는 3상 액계 등이어도 좋음)의, 특히 -1상 이상을 함유하는 조제물에 있어서의- 조제물의 수성으로 간주된다. 본 발명에 의한 방법 중의 스텝(c)에 있어서의 바람직한 카오트로픽 조건은 1.4~5M(특히 완충 염류 용액에 있어서, 예를 들면 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g KH₂PO₄ ad 1000㎖ with A. 증류, pH 7.4 with HCl) 우레아 농도에 상응하는 것이다. 카오트로픽 조건의 상응(뿐만 아니라 카오트로픽도의 감소("보다 낮은" 또는 "보다 적은" 카오트로픽 조건))은 상술한 방법뿐만 아니라 호프마이스터 시리즈의 교육의 적용에 의해 용이하게 정해질 수 있다. 결합을 위한 최적 결합/비응집 조건을 제공하기 위해 개시액 중의 각종 물질의 첨가는 개별적으로 확인되어야 한다. 예를 들면, 환원제의 사용은 최적화되어 0.05~50mM 디티오트레이톨(DTT), 특히 0.1~10mM DTT의 양에 상응해야 한다. 또한, 상술한 바와 같이 세정제의 첨가도 개시제의 카오트로픽도에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 의미에 있어서의 용어 "변성 형태"(또는 "비리폴딩 형태")는 재조합 제조 공정의 생성물로서 얻어지는, 일반적으로 (융합 단밸질의 천연 3차원 구조를 방해하는 조건 하에서의) 봉입체의 가용화 후에 얻어지는 발현 융합 단밸질의 생물학적으로 불활성인 형태를 명시한다.

용어 "리폴딩"(또는 "복원")은 가용화 단백질 또는 단백질의 일부(복원되는 경우에는 상기 부분의 특정 활성에 관한 부분)가 그 기본 형태 및 생물학적 활성(또는 상기 각각의 부분의 생물학적 활성)을 회복할 때, 즉 변성 불활성 상태로부터 활성 형태로 단백질을 재구성할 때의 메커니즘을 나타낸다(Kaar 외, Biotech. Bioeng. 104(2009) 774~784 참조).

용어 "자가 단백질 분해성 기능", "자가 단백질 분해성 활성", 또는 "자가 단백질 분해성"은 융합 단백질이 변성 상태인 동안에 억제되고, 융합 단백질의 부분(즉, 오토프로테아제 부분) 또는 완전 리폴딩시에 활성화되는 융합 단백질의 일부분의 자가 단백질 분해성 활성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "오토프로테아제"는 자가 단백질 분해성 활성을 갖고, 폴리펩티드 부분으로부터 스스로를 절단할 수 있는, 즉 N^pro 오토프로테아제가 본 발명에 의한 융합 단백질의 목적의 단백질 부분으로부터 스스로를 절단하는 폴리펩티드를 나타낼 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재생"은 정제된 형태의, 즉 발현 처리 시스템, 특히 오토프로테아제에 존재하는 다른 단백질뿐만 아니라, 중간 또는 최종 생성물에 존재해야하는 것은 아닌 다른 모든 단백질 또는 다른 성분으로부터 목적의 단백질을 본질적으로 분리함으로써 목적의 단백질을 얻는 것을 나타낼 것이다. 본 발명에 의한 방법에 의해 재생되는 목적의 단백질은 본 발명에 의한 절단 스텝으로부터 직접 얻어지거나 또는 더 정제 및/또는 특정 배합, 예를 들면 약학적 배합으로 배합되는 벌크 형태로 상품화해도 좋다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "봉입체"는 변형 숙주 세포의 세포질에 존재하는 비상동 폴리펩티드(본 발명에 의한 융합 단백질)를 함유하는 불용성 응집체를 나타낼 것이다. 이들은 현미경 아래에서 밝은 점으로서 나타나고, 세포질의 분리에 의해 재생될 수 있다. 상기 봉입체는 일반적으로 카오트로픽제를 사용하여 가용화된다. 가용화시 봉입체가 용해되고, 실질적으로 감소된 분자내 및 분자간 상호작용을 갖는 단분자 현탁액을 목적으로 한다. 바람직한 용제는 우레아, 구아니딘HCl, N-라우로일사르코신과 같은 강이온성 세정제이다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 또한 봉입체는 알칼리성 pH에서의 알콜 수용액 또는 알칼리성 pH에서의 수용액을 사용하여 가용화된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가용화"는 봉입체를 용해해야 하는 공정을 나타낼 것이다. 가용화는 최소 분자내 및 분자간 상호작용을 갖는 폴리펩티드의 단분자 분산을 야기하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 범위 내의 바람직한 봉입체의 가용화 방법은 산화 시스테인 잔사가 존재할 경우에 50mM Tris/HCl, 8M 우레아, pH 7.3, 환원제 첨가, 예를 들면 50mM DTT 중의 현탁에 의해 행해진다. 필요에 따라서 잠재적으로 불용성인 물질을, 예를 들면 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 불활성 융합 단백질이 세포 내에서 가용화될 경우, 정화된 세포 균질액은 후술하는 가용화 봉입체에 대해 더 후처리를 행한다.

본 발명에 대해, 스텝(c)에 있어서의 자가 단백질 분해성 활성의 리폴딩(복원)은 카오트로픽 조건 하에서, 즉 목적의 단백질 부분이 바람직하게는 여전히 비리폴딩 형태로 존재하는 조건 하에서 행해진다. 목적의 단백질의 리폴딩은 (절단 후에) 보다 적은 카오트로픽 조건을 형성함으로써, 예를 들면 희석, 코스모트로픽 물질의 첨가, 또는 카오트로픽 물질의 제거에 의해 달성될 수 있다. 한편, 목적의 단백질은 스텝(c)에 있어서의 오토프로테아제 부분과 동시에, 즉 카오트로픽 조건 하에서 복원되어도 좋다.

실질적 절단 속도를 가능하게 하여 적절한 반응 시간으로, 구체적으로는 대규모 설정으로 공정을 행할 수 있는 카오트로픽 조건 하에서 스텝(c)을 행하는 것도 바람직하다. 자가 단백질 분해성 절단 속도는, 예를 들면 7M 구아니딘/HCl 용액 중에서 고립/정제된 봉입체를 최초로 가용화한 후에 반응액 중에 1:100으로 희석함으로써 구할 수 있다. 약 24시간 동안의 배양 후, 절단이 행해지는 동안 SDS-PAGE에 의해 상기 반응액을 검사한다. 웨스턴 블롯을 행하여 처리 및 미처리 비율을 확인한다. 쿠마씨-스테인드 SDS-PAGE 겔의 농도계 분석에 의해 절단된 물질의 비율을 구할 수 있다. 보다 높은 카오트로픽 조건은 가용화 공정을 지지하지만, 일반적으로 오토프로테아제의 절단 속도를 감소시킨다. 지나치게 낮은 절단 속도는 적어도 대규모 설정에서의 본 발명의 적절한 산업적 사용이 불가하다. 따라서, N^pro 오토프로테아제 부분은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 40%의 2.5M 우레아에서 바람직한 절단 속도를 갖는다. 예를 들면, 2.5M에서 24시간 동안 특정 융합 단백질의 N^pro 오토프로테아제 부분의 배양이 50%의 양의 절단된 물질(쿠마씨-스테인드 SDS-PAGE 겔의 농도계 분석에 의해 구함)을 야기하면, N^pro 오토프로테아제 부분은 50%의 2.5M 우레아에서 절단 속도를 갖는 것으로 정의된다.

본 발명의 방법에 적용되는 바람직한 N^pro 오토프로테아제 부분은 SEQ ID nos. 1 또는 2(Δ21N^pro(HoBi) 또는 N^pro(HoBi)(UniProt Database accession no. Q5L4B1))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, N^pro 오토프로테아제 부분은 인터페론 조절 인자 3 결합 위치가 삭제된 서열을 갖는다. 이 삭제는 최종 생성물이 실질적으로 인간의 인터페론 제조를 방해할 수 있는 불순물을 갖지 않게 한다.

본 발명의 방법은 임의의 목적의 단백질, 특히 N^pro 오토프로테아제 기술에 의해 제조가능하다고 알려진 모든 단백질의 제조에 대해 이론적으로 적용할 수 있다. 본 발명에 의한 방법은 대규모 제조 및 약학품 제조 실행에 적합하기 때문에, 본 발명에 의해 인간 치료용 단백질, 바람직하게는 인간 재조합 단백질 또는 백신 접종 항원을 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 목적의 단백질은 FDA 또는 2009년 Ferrer-Miralles 외의 리뷰(Microbial Cell Factories 8(2009), 17 doi: 10.1186/1475-2859-8-17)에 의한 EMEA에 의해 인간에게의 사용이 허가된 151 재조합 의약품, 특히 이미 대장균 숙주 세포에 제조된 단백질에 의거하는 생성물으로서 나타내어지는 단백질을 포함한다: 듀코랄(경구 콜레라 백신), 페가시스(페그인터페론 알파-2a), 페그인트론(페그인터페론 알파-2b), 인퍼겐(인터페론 알파콘-1), 레베트론(인터페론 알파-2b), 로페론 A(인터페론 알파-2^a), 비라페론(인터페론 알파-2b), 비라페론페그(페그인터페론 알파-2b), 인트론 A(인터페론 알파-2b), 베로문(타소네르민), 액티뮨(인터페론 감마-1b), IPLEX(메카세르민 린파베이트 재조합), 케피반스(팔리페르민), 뉴라스타(페그필그라스팀), 뉴메가(오프렐베킨), 뉴포겐(필그라스팀), 휴마로그(인슐린 리스프로), 휴마트로프(소마토트로핀), 휴뮬린(인간 인슐린), 인슈만(인간 인슐린), 란투스(인슐린 글라진), 포르티칼(연어 칼시토닌), 아피드라(인슐린 글라진), 엑주베라(인간 인슐린), 포르칼토닌(연어 칼시토닌), 포르스테오(테디파라타이드), 포르스테오/포르테오(테리파라타이드), 제노트로핀(소마토트로핀), 글루카곤, 인크레렉스(메카세르민), 인슐린 인간 윈스럽(인슐린 인간), 노르디트로핀(소마트로핀), 뉴트로핀(소마트로핀), 뉴트로핀AQ(소마트로핀), 오프티슐린(인슐린 글라진), 프레오택트(인간 부갑상선 호르몬), 프로트로핀(소마트렘), 소마베르트(페그비소만트), 베타페론/베타세론(인터페론 베타-1b), 루센티스(라니비주마브), 나트레코르(네시리타이드), 라피라이신/레타바스(레테플레이스), 온탁(데닐류킨 디프티톡스), 키네레트(아나킨라), 및 옴니트로프(소마트로핀).

공정 파라미터는 각각의 설정되어, 바람직하게는 사용되는 N^pro 오토프로테아제 및 제조되는 목적의 단백질에 의해 최적화될 수 있다. 예를 들면, 스텝(b) 및/또는 스텝(c)은 5~11의 pH, 바람직하게는 6~9.5의 pH, 특히 6.5~8.5의 pH에서 행할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 특시 스텝(b)에 있어서, 예를 들면 5mM 이상의 NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 25mM 이상의 NaOH 또는 KOH, 보다 바람직하게는 50mM 이상의 NaOH 또는 KOH, 특히 바람직하게는 100mM 이상의 NaOH 또는 KOH(또는 KOHd와 NaOH의 혼합물); 또는 10 이상의 pH, 특히 11~14의 pH를 야기하는 다른 염기성 성분(또는 그 혼합물)의 존재에 의해 염기성 조건이 적용된다. 스텝(b)의 구체적인 바람직한 실시형태는, 바람직하게는 우레아구아니디늄하이드로클로라이드와 NaOH의 혼합물에 의해 융합 단백질에 변성 조건을 적용한다.

바람직하게는, 공정(b) 및/또는 공정(c)은 완충액 중에서, 특히 인산염, 수소화 인산염 또는 트리스/HCL 완충액에서 행해진다. 완충액은 NaCl 등의 염, 글리세롤이나 탄수화물 등의 폴리올, 또는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 쌍성이온성 계면활성제 등의 계면활성제, 비계면활성 술포베타인, 예를 들면 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC), 도데실 황산 나트륨(SDS), 도데실 황산 리튬(LDS) 또는 N-라우로일 사르코신을 포함해도 좋다.

NaCl, 바람직하게는 50~1000mM NaCl, 특히 바람직하게는 100~500mM NaCl을 포함하고; 인산염 이온 및/또는 수소화 인산염 이온, 바람직하게는 5~500mM 인산염 및/또는 수소화 인산염, 특히 바람직하게는 10~200mM 인산염 및/또는 수소화 인산염을 포함하고; 글리세롤, 바람직하게는 1~10% 글리세롤, 특히 바람직하게는 2~8% 글리세롤을 포함하고, 트리스/HCl, 바람직하게는 1mM~5M 트리스/HCl, 특히 바람직하게는 5mM~2M 트리스/HCl을 포함하는 완충액의 존재 하에 공정(c)을 행하는 것도 바람직하다. 공정(c)에 사용된 완충액은 하기 성분: L-아르기닌, 저농도의 변성제, 계면활성제, 시클로덱스트린, 폴리에틸렌 글리콜, 술포베타인, 치환 피리딘 및 피롤 등의 저분자량의 쌍성이온성 비계면활성제, 및 산 치환 아미노시클로헥산 중 하나 이상을 더 함유할 수 있다.

바람직한 실시형태에 따라, 목적 단백질의 재생 공정은 목적 단백질을 회수한 후에 행해진다. 예를 들면, 목적 단백질의 재생 공정은 목적 단백질을 완전히 정제한 후에 행해질 수 있다. 이 실시형태는 목적 단백질이 이 단백질의 완전 재생("활성")형보다 비재생형이 보다 안정한 경우에 있어서 매우 유리하다. 따라서, 목적 단백질은 환자에게 투여하기 직전에 재편성되어도 좋은 약학 조성물(예를 들면, 건조(동결 건조) 조성물로 처방될 수 있다. 이러한 경우, 목적 단백질의 재생은 투여 직전에 이러한 재편성에 의해 행해진다. 이것은 예를 들면, 절단 후 정제 시, 의약품으로의 제제 또는 이러한 단백질/약학적 제제의 보존 전에 목적 단백질의 활성을 잃어버리는 위험을 극복한다.

절단 공정(c)은 용액 중에서 행해질 수 있지만, 바람직한 실시형태에 따라 이러한 절단(예를 들면, 자가단백질분해 활성을 얻기 위한 오토프로테아제 부위의 리폴딩)은 고체 지지체 상에 고정된 융합 단백질을 이용하여 행해질 수 있다. 오토프로테아제의 리폴딩(단백질 분해 활성을 가능하게 한다)은 본 발명에 의해 카오트로픽 조건 하에서 개시된 후에 단백질 분해 활성이 고체 지지체 상에 활성화될 수 있다. 절단부(C-말단 오토프로테아제(목적 단백질이 고체 지지체 상에 커플링되는 경우) 또는 목적 단백질(오토프로테아제 부위가 고체 지지체 상에 커플링된 경우) 중 하나)는 고체 지지체로부터 풀려 쉽게 회수될 수 있다. 따라서, 본 방법의 바람직한 실시형태에 따라, 융합 단백질은 고체 지지체 상에 고정되고 N^pro 오토프로테아제의 자가단백질분해 활성이 고체 지지체 상에 나타나도록 공정(c)을 행한다.

고체상 재료로서, 본 분야에 이미 적용된 모든 재료가 적절하다. 바람직하게는, 고체상은 특히 셀룰로오스, 아가로오스, 아크릴아미드, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 또는 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 미량정량판, 니트로셀룰로오스, 멤브레인, 마이크로칩, 유리판, 또는 금속 코팅 지지체에 의해 지지되는 크로마토그래피 물질로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 의해, 셀룰로오스, 아가로오스(세파로오스 또는 Macro-Prep 겔), 덱스트란(세파덱스 겔), 아크릴아미드(세파크릴, 트리스아크릴 겔), 실리카(TSK, SW 겔), 폴리(스티렌-디비닐벤젠)(소스 또는 포로스 겔), 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체(토요펄 HWW, TSK, PW, 프락토겔 EMD 겔) 또는 혼합물, 특히 아가로오스 및 덱스트란(슈퍼덱스 겔)에 의거한 지지체 등의 각종 고체상 지지체를 사용해도 좋다. 보다 구체적으로 관할 미국 당국(식품 및 약제 투여를 위한 FDA)에 의해 사람 또는 수의적 용도로 승인된 지지체를 선택할 수 있다. 또한, 선택된 지지체는 바람직하게는 공유결합에 의해 친화성 리간드에 결합될 수 있다(지지체는 기능화되어 있다고 할 수 있다). 고체상 매트릭스는 단백질 및 다른 생체 분자의 고체 분리에 적용가능한 것으로 알려진 천연 또는 합성 및 유기 또는 무기 재료, 예를 들면 한천 및 아가로오스 등의 천연 또는 합성 다당류; 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 에테르; 탄수화물; 구아검, 및 아라비아검, 가티검, 트라가칸트검, 로거스트빈검, 크산탄검 등의 검; 펙틴; 뮤신; 덱스트란; 키틴; 키토산; 알기네이트; 카라기난; 헤파린; 젤라틴; 폴리아크릴아미드 및 폴리메타크릴아미드와 같은 폴리아미드 등의 합성 폴리머; 폴리이미드; 폴리에스테르; 폴리에테르; 폴리비닐알코올 및 폴리스티렌 등의 폴리머성 비닐 화합물; 폴리알켄; 비결정성 실리카 및 석영을 포함하는 이산화규소와 같은 실리카질 재료 등의 무기 재료; 금속 실리케이트. 다공질 유리 및 세라믹; 금속 산화물 및 황화물, 또는 이들 천연 또는 합성 및 유기 또는 무기 재료의 조합을 매트릭스 백본으로서 포함해도 좋다.

매트릭스 백본은 한천, 아가로오스, 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 에테르, 폴리(메타)아크릴아미드 등의 폴리아미드, 폴리비닐알코올, 실리카, 및 다공질 유리로부터 바람직하게 선택된다.

특히 매트릭스 백본으로서의 목적 고체상 재료는 예를 들면, 스웨덴Pharmacia Biotech사의 세파로오스 및 슈퍼로오스 비즈 및 미국 Biorad사의 바이오겔; Pharmacia Biotech사의 세파덱스 등의 덱스트란계 비즈; 체코슬로키아 Secheza사의 Perloza 셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 비즈 및 멤브레인; Pharmacia Biotech사의 세파크릴 및 슈퍼덱스 등의 합성 비즈; 미국 Toso-Haas사의 프락토겔 등의 합성 유기 폴리머의 비즈; 미국 Perceptive Biosystems사의 POROS 매체, 미국 Biorad사의 Bio-gel-P 및 Macro Prep, 미국 TESSEK사의 세파론 및 미국 BioSepra사의 Hyper D 및 트리스아크릴 매체, 미의 3M사의 엔즈아크릴 및 아즐락톤; 영국 Bioprocesing사의 다공질 유리 PROSEP 및 BioSepra사의 스페로실 등의 규산질 재료의 비즈; 및 미국 Arbor Technologies사의 ACTI-DISK, ACTI-MOD 및 CycloSep 등의 비즈 또는 멤브레인 형태의 코팅 실리카 복합물이다.

전형적으로, 고체상 매트릭스 백본뿐만 아니라 상기 얻어지는 기능성 고체상 매트릭스는 예를 들면, 불규칙한 입자 또는 구상 비즈, 멤브레인 또는 시트, 몰딩 표면, 또는 스틱형이어도 좋다. 고체상 재료는 단백질에 대하여 완전히 또는 부분적으로 투과성을 갖거나 완전히 불투과성을 가져도 좋다. 특히 본 발명의 실시형태에 있어서, 매트릭스는 1~10000㎛, 바람직하게는 10~1000㎛, 고성능화를 위해서는 10~60㎛; 조제 목적으로는 50~500㎛, 바람직하게는 50~300㎛ 범위의 사이즈를 갖는 불규칙 또는 구상 비즈의 형태이다. 본 발명에 사용되는 바람직한 재료(폴리메타크릴레이트 모놀리스)는 Junbauer 외(J. Chromatogr. A 1184 (2008), 62-79)에 기재되어 있다.

매트릭스의 특히 바람직한 형태는 밀도 제어 입자를 포함하는 덩어리 형태의 밀도 제어 매트릭스이다. 이들 덩어리는 유동층 또는 팽창층 크로마토그래피를 위한 대규모 조작뿐만 아니라 비패키징 컬럼에 있어서의 다른 배치식 크로마토그래피 기술, 예를 들면 교반기 내의 단순 배치 흡착에 적용가능하다.

본 발명에 의한 융합 단백질에 대한 친화성 리간드는 친화성 리간드와 고체상 물질 사이의 직접적 화학 반응, 또는 상술한 고체상 물질 또는 그 자체가 매트릭스 백본과 리간드에 연결가능한 것으로 알려진 적합한 시약을 갖는 리간드의 활성화에 의해 그 자체가 이 목적에 적용가능한 것으로 알려진 임의의 타입의 공유 결합에 의해 고체상 물질에 부착되어도 좋다. 이러한 적합한 활성화 시약의 예는 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 알릴-글리시딜에테르; 비스-에폭사이드, 예를 들면 부탄디올디글리시딜에테르; 할로겐 치환 지방족 화합물, 예를 들면 디클로로-프로판올, 디비닐술폰; 카르보닐디이미다졸; 알데히드, 예를 들면 글루타릭디알데히드; 퀴논; 시아노젠브로마이드; 페리오데이트, 예를 들면 소듐-메타-페리오데이트; 카르보디이미드; 클로로-트리아진, 예를 들면 시아누릭클로라이드; 술포닐클로라이드, 예를 들면 토실클로라이드 및 트레실클로라이드; N-히드록시숙신이미드; 2-플루오로-1-메틸피리디늄톨루엔-4-술포네이트; 옥사졸론; 말레이미드; 피리딜디술파이드; 및 히드라지드이다. 이들 중에, 단일 결합과는 다른 스페이서기 SP1을 탈리하는 활성화제, 예를 들면 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 알릴-글리시딜에테르; 비스에폭사이드; 할로겐 치환 지방족 화합물; 디비닐술폰; 알데히드; 퀴논; 시아노젠브로마이드; 클로로-트리아진; 옥사졸론; 말레이미드; 피리딜디술파이드; 및 히드라지드가 바람직하다.

특히 바람직한 활성화제는 에피클로로히드린, 알릴-글리시딜에테르, 및 부탄디올디글리시딜에테르 등의 에폭시 화합물인 것으로 간주된다.

본 발명의 범위 내의 폴리펩티드 친화성 크로마토그래피에 대해, 펩티드 리간드의 부동화에 유용한 임의의 매트릭스를 사용할 수 있다. 바람직하게는 프락토젤 에폭시(M)(Merck, Darmstadt, 독일) 또는 마찬가지로 바람직한 "모놀리식 크로마토그래피 매개체" CIM-에폭시를 사용한다. 리간드는 크로마토그래피 매트릭스의 화학적 활성화 백본에 직접, 또는 스페이서 또는 링커를 통해 부동화할 수 있다. 후자의 경우에 있어서 스페이서는 크로마토그래픽 매트릭스에 결합되고, 리간드의 결합을 가능하게 하기 위해 상기 스페이서가 화학적으로 활성화된다. 바람직하게는 프락토젤 에폭시 매트릭스를 스페이서와 조합하여 사용한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 스페이서는 크로마토그래픽 매트릭스와 디아미노디프로필아민(DADPA)의 반응 및 이후의 숙신산 무수물(SA)과의 반응에 의해 생성된다. 스페이서 상에 얻어지는 말단 카르복시기는 화학적으로 활성화되고, 바람직하게는 말단 아미노기에 연결된다. 상기 리간드는 매트릭스 또는 스페이서 상에 그것을 포함하는 반응성기를 통해 부동화된다. 반응성기와 같은 펩티드 리간드의 경우에 아미노,기, 카르복시기, 또는 술포히드릴기 중 어느 하나이어도 좋다. 본 발명에 있어서 아미노 결합을 통한 매트릭스 또는 스페이서 상의 펩티드의 앵커리지가 특히 바람직하다.

바람직하게, 본 발명에 의해 사용되는 고체상은 친화성 크로마토그래피 물질로서 제공되고, WO2006/113958 A2에 개시된 올리고펩티드 리간드를 나타낸다.

바람직하게, 고체 지지체는 크로마토그래피 컬럼이다. 이론상, (N^pro 및 목적의 단백질을 포함하는) 융합 폴리펩티드를 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 크로마토그래피 물질을 본 발명의 테두리 안에서 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 크로마토그래피의 매트릭스는 컬럼의 형태이어도 좋지만, 친화성 펩티드로 수식된 폴리에틸렌글리콜과 같은 비즈 또는 유기물과 같은 다른 형태이어도 좋다.

본 발명에 사용하기에 적합한 크로마토그래피 물질은 셀룰로오스 결합 도메인에 의거해도 좋고, 예를 들면, 폴리아르기닌 또는 폴리라이신과 같은 폴리양이온 표식을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피 물질뿐만 아니라, 예를 들면, 폴리아스파라긴과 같은 폴리음이온 표식을 갖는 음이온 교환 크로마토그래피이어도 좋다. 본 발명에 따른 고체 지지체로서의 친화성 크로마토그래피 물질의 사용은 바람직하게는 부동화 금속 이온 크로마토그래피(IMAC), 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 셀룰로오스 결합 도메인 크로마토그래피, 및 펩티드 친화성 크로마트그래피로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

보다 바람직하게, 사용되는 친화성 크로마토그래피는 융합 폴리펩티드가 폴리양이온 표식을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 보다 바람직한 것은 폴리아르기닌 또는 폴리리신 친화성 표식 중 어느 하나를 사용하는 것이다.

양이온 교환 크로마토그래피에 대해, 발현 폴리펩티드는 바람직하게는 N-말단 폴리양이온 표식, 예를 들면 폴리아르기닌 또는 폴리리신 표식을 포함한다. 숙주 세포로부터 추출된 발현 폴리펩티드를 함유하는 용액은 (여과되어) 예를 들면, SP 세파로오스 FF, CM 세파로오스 FF, 프락토젤 EMD SO3- 등의 양이온 교환 크로마토그래피에 적합한 임의의 매개체로 가득한 컬럼에 적재된다. 바람직하게, 낮은 전도성을 갖는 완충제를 적용한다. 적재 후, 해제된 물질을 세정해도 좋고, 리폴딩을 개시해도 좋다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태는 고체 지지체가 친화성 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 상기 컬럼에 결합된 폴리펩티드가 폴리음이온 표식을 포함하는 것이다. 보다 바람직하게, 폴리아스파라긴이 친화성 표식으로서 사용된다.

소망의 결합 특성을 달성하기 위한 더욱 바람직한 실시형태는 부동화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 고체 지지체는 부동화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 재료이고, 결합되는 폴리펩티드(특히, Npro의 제 2 부분과 목적의 단백질을 포함하는 융합 단백질)은 금속 킬레이트 친화성 표식을 포함한다. 이 경우, 상기 폴리펩티드는 삭제되고, 거기에 포함되는 금속 킬레이트 친화성 표식에 의해 결합된다. 본 발명의 보다 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 금속 킬레이트 친화성 표식은 폴리히스티딘 친화성 표식이다. IMAC는 히스티딘 또는 다른 적합한 특유의 아미노산(단백질의 표면에 자연적으로 존재하거나 또는 재조합 DNA 기술로 접합된 것 중 어느 하나)과 구리, 니켈, 아연 또는 철 등의 각종 부동화 금속 이온 사이의 특정 배위 공유 결합에 의거한다. IMAC에 사용되는 종래 알려진 크로마토그래피 물질도 본 발명 내에서 유용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, Ni² ⁺-킬레이팅 세파로오스 패스트 플로우(GE Healthcare, Uppsala, SE)가 매트릭스로서 사용된다.

대신, 상기 고체 지지체는 상기 폴리펩티드의 N-말단에 존재하며, 상기 표식을 인식하는 항체를 통해 크로마토그래피 물질에 결합되는 상술한 에피토프 표식을 채용하는 면역 친화성 크로마토그래피 물질이어도 좋다. 다른 바람직한 친화성 크로마토그래피 물질은 WO2006/113958 A에 개시된 올리고펩티드 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피이다.

본 발명의 바람직한 실시형태는 융합 단백질이 추가 부분, 바람직하게는 친화성 표식 또는 리폴딩 보조 부분, 특히 바람직하게는 His-tag, SlyD(또는 SlyD 부분), 포지티브 또는 네가티브 대준 부분 중 어느 하나로 이루어지는 올리고 아미노산 구간, Strep-표식, 및/또는 FLAG-표식을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 실시형태에 의하면, 상기 융합 단백질은 특히 스텝(b)과 스텝(c) 사이에 정제 또는 부분 정제된다. 바람직하게, 상기 융합 단백질은 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피 또는 친화성 침전법에 의해 (특히 스텝(b)과 스텝(c) 사이에) 정제 또는 부분 정제된다.

본 발명은 N^pro 기술로 행해진다. 이 기술은 예를 들면, WO 01/11057 A, WO 01/11056 A, WO 2006/113957 A, WO 2006/113958 A, WO 2006/113959 A, Cheng 외, Amino Acids 39 (5) (2010): 1545~1552; Durauer 외, Sep. Sci. Technol. 45 (2010): 2194~2209; Schmoeger 외, J. Chromatog. 1217 (2010): 5950~5956; Hahn 외, J. Chromatog. 1217 (2010): 6203~6213; 및 Achmuller 외, Nat. Meth. 4 (2007), 1037~1043에 개시되어 있다. 일반적인 용어에 있어서, N^pro 기술은 (ⅰ) 융합 단백질에 대해 부호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로 변형된 박테리아 숙주 세포, 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 자가 단백질 분해성 기능을 나타내는 제 1 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 제 1 폴리펩티드의 자가 단백질 분해성 활성에 의해 융합 단백질로부터 제 2 폴리펩티드를 절단할 수 있으며, 제 2 폴리펩티드는 목적의 비상동 단백질인 방법으로 제 1 폴리펩티드의 C-말단에서 제 1 폴리펩티드에 결합되는 제 2 폴리펩티드의 배양 공정으로서, 상기 배양은 융합 단백질의 발현 및 상응하는 세포질 봉입체의 형성을 야기하는 조건하에서 발생하는 공정, (ⅱ) 상기 숙주 세포로부터의 봉입체의 분리 공정, (ⅲ) 분리된 봉입체의 가용화 공정, (ⅳ) 융합 단백질로부터의 목적의 비상동 단백질의 자가 단백질 분해성 절단이 행해지는 반응액을 부여하기 위한 가용화물의 희석 공정, 및 (ⅴ) 절단된 목적의 비상동 단백질의 분리 공정("재생")을 포함하는 목적의 비상동 단백질의 재조합 제조용 공정에 관한 것이다.

상기 기술은 많은 종류의 목적의 단백질에 적합하다. 본 발명의 목적에 대해, 용어 "비상동 단백질", "타겟 단백질", "목적의 폴리펩티드", 또는 "목적의 단백질"(등)은 자연적으로 발생하는 융합 단백질 또는 다단백질로부터 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro에 의해 자연적으로 절단되지 않는 폴리펩티드를 의미한다(즉, 구조 단백질 C 및 이후의 바이러스성 단백질을 부호화하는 페스티바이러스 다단백질의 아미노산 169ff를 자연적으로 따르는 것과는 다른 폴리펩티드). 이러한 목적의 비상동 단백질의 예는 산업용 효소(공정 효소) 또는 약학적, 특히 인간 약학적 활성을 갖는 폴리펩티드이다.

자가 촉매 절단에 의해 약학적 응용을 위해 특히 중요한 실제 N-말단을 갖는 단백질의 합성이 가능해진다. 또한, 큰 단백질("목적의 단백질")뿐만 아니라, 작은 펩티드 또한 N^pro로의 C-말단 연결에 의해 안정적으로 발현될 수 있다. 높은 발현율은 봉입체로 융합 단백질을 밀어 넣는다. 정제 후, N^pro는 리폴딩되고, 스스로를 절단한다.

본 발명에 의해 제조되는 목적의 단백질이 N^pro 오토프로테아제의 Cys168 후에 C-말단에 부착되는 것은 필수적이며, 이것은 (Cys168에서의) Npro 부분의 C-말단과 목적의 단백질 사이의 펩티드 결합이 본 발명에 의한 스텝(c)에서 절단되는 절단 위치이기 때문이다.

인간 약학적 활성을 갖는 바람직한 목적의 단백질의 예는 인터류킨 등의 사이토카인, 예를 들면 IL-6, 류코사이트 등의 인터페론, 예를 들면 인터페론 a2B, G-CSF, 에리스로포에틴, 또는 IGF 등의 성장 인자, 특히 조혈 인자 또는 상처 치유 성장 인자, 인간 성장 호르몬(hGH), 항체, 또는 백신 등의 호르몬이다. 현기술에 의해 5~30개의 아미노 잔사만을 갖는 매우 짧은 폴리펩티드 또한 목적의 단백질로서 제조할 수 있다. N^pro 기술은 봉입체를 만드는 용도의 발현 시스템에 있어서 특정 이점을 갖고, 융합 오토프로테아제의 강한 응집 바이어스가 융합 파트너의 거의 독립적인 내측 봉입체의 형성을 가능하게 하기 때문이다. 따라서, 대부분의 임의의 목적의 단백질은 본 시스템으로 대량 및 높은 수율로 제조가능하다. 예를 들면, 합성의 발현이 가능한 인터페론-a1; 유독성 자이레이스 억제제 CcdB, 짧은 16-잔사 모델 펩티드 pep6His(SVDKLAAALEHHHHHH(SEQ ID No. 3)), 인간 프로인슐린, 포도상구균 단백질 A(sSpA-D₂)의 합성 2중 도메인 D, 케라틴 관련 단백질 10-4(KRTAP10-4), 합성 녹색 형광 단백질 변종(sGFPmut3.1), N-말단 시스테인을 갖는노화 방지 인자의 합성 억제성 펩티드(C-sSNEVi), C-말단 시스테인을 갖는 임의의 아미노산 서열을 갖는 노화 방지 인자의 합성 억제성 펩티드(sSNEVscr-C); 재조합 인간 단핵백혈구 화학색인물질 단백질 1(rhMCP-1)이 보고되어 있다. 지금까지, 대조적인 단백질 폴딩을 지지하는 성질을 갖는 셰프론 및 단백질에 대해 높은 수율에 대한 한계만 의심되어 왔다. 융합 파트너로서의 이러한 단백질은 보다 적은 응집체에 의해 보다 낮은 수율을 야기하는 N^pro 분자의 응집 바이어스를 억제할 수 있었다. 그러나, 현기술은 이러한 단백질 카운터 반응 응집체를 발현하기 위해서도 적용할 수 있다.

본 발명에 의한 융합 단백질은 추가적으로 친화성 표식 또는 리폴딩 보조 부분 등의 보조 서열을 함유할 수 있고; 1종 이상의 목적의 단밸질을 함유해도 좋다(예를 들면, 이후의 단계에서 또는 같은 단계에서도 각자 다른 것으로부터 Npro 오토프로테아제에 의한 절단으로서 분리되어도 좋은 2종 또는 3종 또는 4종 또는 그 이상의 목적의 단백질을 함유할 수 있음).

다른 실시형태에 의하면, 본 발명은 와일드타입 Npro, 또는 WO 2006/113957 A에 의한 EDDIE 변종 등의 다른 알려진 Npro 변종에 비해 카오트로픽 성질이 향상된 N^pro 오토프로테아제 부분(고립 형태 또는 목적의 단백질을 함께 갖는 융합 폴리펩티드의 형태)에 관한 것이기도 하다. 본 발명에 의해 제공된 Npro 부분은 베타 응집에 대해 비범히 높은 경향을 갖는다. 이것은 "HoBi" 형태(UniProt Database accession no. Q5L4B1)로 발견되었다. 베타 응집체에 대해 이 높은 경향은 이들 오토프로테아제의 특정 성질, 즉 높은 카오트로픽 조건에서의 제조성 및 복원성과 연관성이 있다. 본 발명에 있어서, 효소 활성과 호환가능한 N^pro 변종을 자연적으로 발생시키는 소수성 패치가 제공된다. 원래의 HoBi 스캐폴드 상의 소수성 패칭의 조합은 발현, 봉입체 형성, 및 복원시에 베타 응집체에 대한 성질이 향상된 새로운 활성 N^pro 변종을 제공한다. 따라서, 이들 Npro 변종은 특히 재조합 발현에 적합하다. 이하의 HoBi 단백질 서열(SEQ.ID.No.2)에서의 아미노산 교환 단독 또는 조합을 본 발명에 의한 새로운 분자 중에 제공한다:

N28~V, L 또는 I; A30~T; T39~V 또는 I; L81~V, F82~Y, V83~I, K84~E, P85~L, P87~A, V88~I, Q91~K; S94~I, L 또는 V; Q105~L; P110~V; N127~K, M131~I, T135~V, V141~L. 본 발명에 의한 Npro 변종의 바람직한 실시형태에 있어서, 적어도 2회의 교환, 보다 바람직하게는 적어도 3회의 교환, 특히 바람직하게는 적어도 4회의 교환이 존재한다.

이들 아미노산 교환은 최적화 HoBi-Npro 베타 응집 경향에 크게 영향을 주고, 이들 교환이 효소적 활성 Npro-변종에서 발견되었기 때문에, 페스티바이러스종의 진화시에 이들 모든 교환이 용인된다.

따라서, 본 발명은 SEQ ID No. 2에 비해 적어도 1종의 아미노산 교환을 포함하는 서열을 갖는 N^pro 오토프로테아제를 제공하고, 상기 아미노산 교환은 N28~V, L 또는 I; A30~T; T39~V 또는 I; L81~V, F82~Y, V83~I, K84~E, P85~L, P87~A, V88~I, Q91~K; S94~I, L 또는 V; Q105~L; P110~V; N127~K, M131~I, T135~V, V141~L로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 의한 N^pro 오토프로테아제 부분은 N28~V, L 또는 I; A30~T; T39~V 또는 I; L81~V, F82~Y, V83~I, K84~E, P85~L, P87~A, V88~I, Q91~K; S94~I, L 또는 V; Q105~L; P110~V; N127~K, M131~I, T135~V, V141~L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종, 바람직하게는 적어도 3종, 특히 바람직하게는 적어도 4종의 아미노산 교환을 포함해도 좋다.

바람직하게는, SEQ ID No. 2의 아미노산 2~21이 삭제된다. 이것은 단백질 발현 시스템의 향상도 야기한다.

본 발명에 의한 N^pro 오토프로테아제 부분에 있어서의 다른 바람직한 교환은 SEQ ID No. 2와 T의 교환이다.

(SEQ ID No. 2에 의한 N^pro 오토프로테아제를 포함하는) 본 발명의 N^pro 오토프로테아제는 단백질의 재조합 발현에 특히 유용하다.

본 발명은 (SEQ ID No. 2에 의한 N^pro 오토프로테아제 부분을 포함하는) 본 발명에 의한 목적의 재조합 단백질 및 N^pro 오토프로테아제를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 N^pro 오토프로테아제 부분 또는 융합 단백질, 특히 재조합 발현을 위한 발현 벡터(예를 들면, 적합한 촉진제, 마커 유전자(내성 마커 등) 등을 갖는)을 부호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이기도 하다.

상기 연구에 의하면, 본 발명은 구체적으로 SEQ ID Nos. 1 또는 2(Δ21N^pro(HoBi) 또는 Npro(HoBi))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 N^pro 오토프로테아제 부분을 제공한다. 한편, 마찬가지로 알려진 페스티바이러스 스트레인 D32/00_HoBi의 N-말단 프로테아제 등의 Npro 오토프로테아제 서열을 적용할 수 있다(GenBank Accession No. AAS68353.1).

바람직한 실시형태에 의해, 본 발명은 오토프로테아제 및 목적 단백질의 리폴딩을 특이적으로 분리시키는 높은 카오트로픽 조건에서 자가단백질분해 활성을 보이는 "ASC" 모티프(SEQ.ID.No.2; "N^pro(HoBi)라고도 한다)를 자연발생적으로 생성시키는 대신에 C-말단에 "TSC" 모티프를 갖는 페스티바이러스성 N^pro 오토프로테아제 D32/00_"HoBi"(SEQ.ID.No.1)의 변종을 사용한 정확히 규정된 N-말단을 가진 재조합 단백질(모든 분자가 동일한 N-말단을 갖는 단백질 생성물질을 의미하고; 대장균의 표준 단백질 생성이 N-말단에 N-포르밀기를 가진 단백질뿐만 아니라 N-말단 메티오닌이 결핍된 단백질도 부분적으로 이끈다)의 제조에 관한 것이다.

본 발명은 SEQ:ID:Nos 1 및 2dp 의한 N^pro 오토프로테아제를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 발현벡터에도 관한 것이다. 본 발명에 의한 공정에 채용되는 발현벡터에 있어서, 융합 폴리펩티드는 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 발현 제어 서열은 특히 촉진제(lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL 또는 phoA 촉진제 등), 리보솜 결합부위(예를 들면 상술한 촉진제에 속하는 천연 리보솜 결합부위, 또는 합성 리보솜 결합부위), 또는 전자 종결(예를 들면 rrnB T1T2 또는 bla)이다.

후술하는 바와 같이, 벡터는 융합 폴리펩티드의 N-말단에 존재하고 있고 친화성 크로마토그래피 시스템, 예를 들면 폴리리신과 같은 폴리아미노산 또는 소위 "에피토프 표식"이라고 하는 면역 친화성 크로마토그래피와의 결합에 필요한 융합 도메인을 인코딩하는 서열을 함유해도 좋고, 이것은 통상 특이적 항체를 이용가능한 단쇄 펩티드이다. 특이적 단일클론항체가 쉽게 입수가능한 공지의 에프토프 표식은 FLAG, 독감 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 c-myc 표식을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 발현벡터는 플라스미드이다.

본 발명의 다른 양상은 숙주 세포, 바람직하게는 원핵생물 숙주 세포, 특히 바람직하게는 본 발명에 의한 발현벡터를 함유하는 대장균 숙주 세포에 관한 것이다. 형질 전환된 세균 숙주 세포, 즉 발현 변형은 그 자체 공지의 미생물학적 관행에 따라 배양된다. 숙주 변형은 통상 영양 배지에서 단일 콜로니로부터 개시되지만, 저온 보존 세포 현탁액(세포은행)을 채용하는 것도 가능하다. 상기 변형은 통상 더 많은 용도의 바이오매스를 충분히 얻기 위해 다단계 공정으로 배양된다. 소규모로 이것은 진동 플라스크에서 일어날 수 있고, 많은 경우에는 복합 배지(예를 들면 LB 배지)를 채용하는 것도 가능하다. 그러나, 제한 배치(예를 들면 시트레이트 배지)를 사용하는 것도 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 발현 융합 폴리펩티드를 불용성 봉입체의 형태로 하고 있으므로, 이 경우에 있어서 배양은 비교적 고온(예를 들면 30℃~37℃)에서 행해질 수 있다. 유도계는 특히 봉입체(예를 들면 trp, lac, tac 또는 phoA 촉진제)를 제조하는데 적합하다.

대규모에 대해, 다단계는 복수의 바이오리액터(발효조)로 이루어지고, 정해진 배양기를 채용하는 것이 바람직하다. 또한, 특히 영양분(유가배양)을 계량함으로써 바이오매스를 크게 증가시키고, 생산품 형성이 가능하다. 그렇지 않으면, 공정은 흔들어진 플라스크와 유사하다. 본 발명에 의한 공정에 있어서, 상기 봉입체는 그 자체로 알려진 방법으로 숙주 세포로부터 분리된다. 예를 들면, 발효작용이 행해진 후, 상기 숙주 세포가 원심분리, 마이크로여과, 응집 또는 그 조합, 바람직하게는 원심분리에 의해 회수된다. 습식 세포 매스는 고압 호모지나이저, 비드밀, 프렌치프레스, 휴즈프레스, 삼투압 충격, 세정제, 효소 용균, 또는 그 조합 등의 기계적, 화학적, 또는 물리적 방법에 의해 분해된다. 바랍직하게, 상기 세포의 분열은 고압 균질화에 의해 행한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 재조합 융합 폴리펩티드가 봉입체로서 용착될 경우, 예를 들면 고압 분산에 의해, 또는 바람직하게는 낮은 회전 속도에서의 단순 원심분리에 의해 상기 봉입체를 얻을 수 있다. 상기 봉입체는 원심분리 또는 마이크로여과 또는 그 조합에 의해 분리된다. 소망의 목적의 폴리펩티드에 대한 순도는 각종 완충액 중의, 예를 들면 NaCl(예를 들면, 0.5~1.0M) 및/또는 세정제(예를 들면, Triton X 100)의 존재 하의 봉입체의 다중 재현택에 의해 향상시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 봉입체 조제물의 순도는 각종 완충액(예를 들면, 0.5% 데옥시클로레이트에 이어서 2회의 1M NaCl 용액 및 최종적으로 증류수)에 의한 몇몇 세정 스텝에 의해 향상된다. 이것은 일반적으로 봉입체로부터의 이질 폴리펩티드 대부분의 제거를 야기한다.

본 발명을 이하의 실시예 및 도면에 의해 더 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1: 2.5M 우레아를 함유하는 5종의 다른 리폴딩 완충액 중에 Δ21N^pro(HoBi)-pep6His의 리폴딩의 SDS-PAGE. 100㎕ 리폴딩 배치(c=200㎍/㎖) 20,000xg에서 원심분리되었다. TCA에 의해 상청 물질이 침전되었다. 펠렛 및 상청 물질이 10㎕ 1x Magic Mix 샘플 완충액 중에 재현가되고, NuPAGE® Bis-Tris 4~12% 겔에 적재되었다. 대조군과 동일한 양의 봉입체를 침전 및 분석했다. M… PageRuler™ Prestained Protein Ladder, P…펠렛, S…상청 물질, co…대조군, b…완충액. PAGE 샘플 중에 단백질의 양: P 및 S 합쳐 20㎍.
도 2: 2.5M 우레아의 존재 하의 5종의 다른 완충액 중의 D21N^pro(HoBi)-pep6His의 리폴딩 효율. 겔을 스캔하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.
도 3: 최대 4.5M까지 증가하는 우레아 농도를 갖는 500mM NaCl 중의 Δ21N^pro(HoBi)-pep6His, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤의 리폴딩. 100㎕ 리폴딩 배치(c=200㎍/㎖)를 20,000xg에서 원심분리했다. TCA에 의해 상청 물질이 침전되었다. 펠렛 및 상청 물질이 10㎕ 1x Magic Mix 샘플 완충액 중에 재현가되고, NuPAGE® Bis-Tris 4~12% 겔에 적재되었다. 대조군과 동일한 양의 봉입체를 침전 및 분석했다. M… PageRuler™ Prestained Protein Ladder, P…펠렛, S…상청 물질, co…대조군. PAGE 샘플 중에 단백질의 양: P 및 S 합쳐 20㎍.
도 4: 최대 4.5M까지 증가하는 우레아 농도를 갖는 500mM NaCl 중의 Δ21N^pro(HoBi)-pep6His, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤의 리폴딩. 겔을 촬영하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.
도 5: 3M(A), 3.5M(B), 및 4M(C) 우레아를 함유하는 500mM NaCl 중의 Δ21N^pro(HoBi)-pep6His, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤의 리폴딩. 각 시점 100㎕ 샘플을 리폴딩 배치(c=200㎍/㎖)로부터 추출하고, TCA에 의해 침전시켰다. 재현탁 후, 10㎕ 1x Magic Mix 샘플에서 완충액 샘플이 NuPAGE® Bis-Tris 4~12% 겔 상에 있었다. M… PageRuler™ Prestained Protein Ladder, P…펠렛, S…상청 물질, co…대조군, b…완충액. PAGE 샘플 중에 단백질의 양: 10㎍(A와 C) 및 5㎍(B).
도 6: 3M, 3.5M, 및 4M 우레아의 존재 하의 500mM NaCl 중의 Δ21N^pro(HoBi)-pep6His, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤의 동적 리폴딩의 결정. 겔을 촬영하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.
도 7: 2.5M 우레아를 함유하는 5종의 다른 리폴딩 완충액 중의 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep5His의 리폴딩의 SDS-PAGE. 100㎕ 리폴딩 배치(c=200㎍/㎖)를 20,000xg에서 원심분리했다. TCA에 의해 상청 물질이 침전되었다. 펠렛 및 상청 물질이 10㎕ 1x Magic Mix 샘플 완충액 중에 재현가되고, NuPAGE® Bis-Tris 4~12% 겔에 적재되었다. 대조군과 동일한 양의 봉입체를 침전 및 분석했다. M… PageRuler™ Prestained Protein Ladder, P…펠렛, S…상청 물질, co…대조군, b…완충액. PAGE 샘플 중에 단백질의 양: P 및 S 합쳐 20㎍.
도 8: 최대 4.5M까지 증가하는 우레아 농도를 갖는 500mM NaCl 중의 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep5His, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤의 리폴딩. 100㎕ 리폴딩 배치(c=200㎍/㎖)를 20,000xg에서 원심분리했다. TCA에 의해 상청 물질이 침전되었다. 펠렛 및 상청 물질이 10㎕ 1x Magic Mix 샘플 완충액 중에 재현가되고, NuPAGE® Bis-Tris 4~12% 겔에 적재되었다. 대조군과 동일한 양의 봉입체를 침전 및 분석했다. M… PageRuler™ Prestained Protein Ladder, P…펠렛, S…상청 물질, co…대조군. PAGE 샘플 중에 단백질의 양: P 및 S 합쳐 20㎍.
도 9: D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4) 및 D21EDDIE-MCP-1 (SEQ.ID.NO. 5)의 발효: 바이오매스의 형성 과정(DCW), 융합 단백질의 역가, 및 융합 단백질 내의 MCP-1(SEQO ID.No. 10)의 역가.
x축은 [h]로 공급 시간을 나타낸다.
좌측 y축은 [g/L]로 역가를 나타낸다.
우측 y축은 [g/L]로 DCW(건조 세포 중량)를 나타낸다.
A: D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)을 제조하는 세포의 DCW
B: D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4)을 제조하는 세포의 DCW
C: D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)의 역가
D: D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4)의 역가
E: D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5) 내의 MCP-1의 역가
F: D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4) 내의 MCP-1의 역가
도 10: D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4) 및 D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)의 발효: 융합 단백질의 역가의 비교, 융합 단백질 내의 MCP-1의 역가, 및 MCP-1의 특정 역가
좌측 y축은 [g/L]로 역가를 나타낸다.
우측 y축은 [㎎/gDCW]로 특정 역가를 나타낸다.
EDDIE는 D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)을 나타낸다.
HoBi는 D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4)을 나타낸다.
a: 융합 단백질의 역가
b: 융합 단백질 내의 MCP-1의 역가
c: MCP-1의 특정 역가
도 11: N^pro-융합 단백질 D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO. 6), D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8), D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO. 7), 및 D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 9)의 발현: 유도(20μ몰 IPTG/gCDM) 3시간 후의 가용성(S) 및 불용성(IB) 부분의 SDS-PAGE.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO. 6), S
레인 3: D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO. 6), IB
레인 4: D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8), S
레인 5: D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8), IB
레인 6: D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 9), S
레인 7: D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 9), IB
도 12: 8M 우레아 중의 가용화 및 잔존하는 우레아의 농도의 증가 하에서 c=0.1㎎/ℓ의 단백질 농도에서의 트리스 완충액 중의 리폴딩 후의 D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8)(A) 및 D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 9)(B)에 대한 리폴딩 및 동적 절단.
x축은 [분]으로 시간을 나타낸다.
y축은 [%]로 절단 수율을 나타낸다.
A: 0.4M 우레아에서의 절단 수율[%]
B: 1M 우레아에서의 절단 수율[%]
C: 2M 우레아에서의 절단 수율[%]
D: 3M 우레아에서의 절단 수율[%]

(실시예)

재료 및 방법

단백질 발현

NdeI 및 SpeI를 사용하는 타겟 단백질로서 pET30a 벡터 하버링 pep6His뿐만 아니라 SDD-diUbi-pep6His로 Δ21N^pro(HoBi(SEQ.ID.NO.1); (SEQ.ID.NO.2)의 아미노산 2~21의 삭제)를 복제했다. 상기 벡터를 전기천공법에 의해 대장균 BL21(DE3)으로 변형시키고, 세포를 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 세포를 1:100으로 희석하고, OD₆₀₀이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양했다. 1M IPTG(이소프로필β-D-1-xl티오갈락토피라노사이드)를 37℃에서 4시간 동안의 배양 후의 최종 농도 1mM IPTG에 첨가함으로써 단백질 발현을 유도했다. 원심분리에 의해 세포를 회수했다. 프렌치프레스를 사용하여 세포 용해를 행했다. 추가 원심분리 스텝에 의해 봉입체를 회수했다.

Δ21N^Pro(HoBi) 오토프로테아제 부분(SEQ.ID.NO.1)

MEPLYDKNGA VLFGEPSDTH PQSTLKLPHP RGEKEVIVGI RDLPRKGDCR TGNRLGPVSG LFVKPGPVFY QDYSGPVYHR APLEQFKQAP MCEVTKRIGR VTGSDGNLYH MYVCTDGCIL VKTAKREGQD VLKWVYNVLD SPIWVTSC

SVDKLAAALEHHHHHH 모티프(SEQ.ID.NO.3)는 오토프로테아제 부분에 부착된 모델 펩티드이다.

N^Pro(HoBi) 오토프로테아제 부분(SEQ.ID.NO.2)

MELLNFELLY KTYKQKPAGV QEPLYDKNGA VLFGEPSDTH PQSTLKLPHP RGEKEVIVGI RDLPRKGDCR TGNRLGPVSG LFVKPGPVFY QDYSGPVYHR APLEQFKQAP MCEVTKRIGR VTGSDGNLYH MYVCTDGCIL VKTAKREGQD VLKWVYNVLD SPIWVASC

2.5M 우레아의 존재 하에서의 다른 완충액 중의 리폴딩

봉입체를 8M 우레아/50mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5/10mM MTG에서 가용화하고,

a) 완충액 1: 500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤

b) 완충액 2: 1M Tris/HCl pH 7.5, 5% 글리세롤

c) 완충액 13: 300mM Arg/HCl, 500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 9.0, 5% 글리세롤

d) 완충액 17: 100mM NaCl, 100mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤

e) 완충액 19: 150mM NaCl, 50mM NaPhosphate pH 7.5, 5% 글리세롤

d) 완충액 23: 150mM NaCl, 20mM Tris/HCl pH 7.5, 5% 글리세롤에서 리폴딩했다. 2.5M의 최종 농도가 되도록 8M 우레아/50mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5를 첨가했다. 20℃에서 68시간 후에 20,000xg에서의 원심분리에 의해 리폴딩을 중지했다. TCA에 의해 상청 물질을 침전시켰다. 샘플 완충액 중에서 더 리폴딩되는 것을 방지하기 위해 8M 우레아를 함유하는 완충액이 채워진 겔 중에서 펠렛 및 상청 물질을 재현탁하고, Bis-Tris 겔을 사용하는 갤 전기이동에 의해 분석했다. 염색 및 탈염 후, 겔을 촬영하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.

각종 우레아 농도 하에서 500mM NaCl, 20mM (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중의 리폴딩

8M 우레아/50mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5/10mM MTG(메틸티오글리세롤) 중에서 봉입체를 가용화하고, 500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중에서 리폴딩했다. 최종 농도 2.5, 3, 3.5, 4, 및 4.5M 우레아가 되도록 8M 우레아/500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤을 리폴딩 배치에 첨가했다. 15분 동안 및 실온에서 20,000xg에서 원심분리에 의해 20℃에서 44시간 후에 리폴딩을 중지하고, 샘플 완충액 중에서 더 리폴딩되는 것을 방지하기 위해서 8M 우레아를 함유하는 완충액에 채워진 겔에서 재현탁하고, Bis-Tris 겔을 사용하는 겔 전기이동에 의해 분석했다. 염색 및 탈염 후, 겔을 촬영하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.

3종의 다른 우레아 농도 하에서의 500mM NaCl, 20mM (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중의 동적 리폴딩의 결정

8M 우레아/500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중에서 봉입체를 가용화하고, 20℃에서 500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중에서 리폴딩했다. 최종 농도 3, 3.5, 및 4M 우레아가 되도록 8M 우레아/500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤을 리폴딩 배치에 첨가했다. 정해진 시점(0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 30시간) 후, 샘플을 추출하고, TCA(트리클로로아세트산)에 의해 침전시키고, 샘플 완충액 중에서 더 리폴딩되는 것을 방지하기 위해서 8M 우레아를 함유하는 완충액에 채워진 겔에서 재현탁했다. 샘플을 Bis-Tris 겔에 적재했다. 염색 및 탈염 후, 겔을 촬영하고, AlphaDigDoc 1200 기기를 사용하는 농도계에 의해 결합 강도를 구했다.

실시예 1: Δ21N ^pro ( HoBi )- pep6His

2.5M 우레아 존재 하의 다른 완충액의 리폴딩

서로 다른 효율성을 갖는 모든 완충액 중에 2.5M 우레아의 존재 하에서 Δ21N^pro(HoBi)를 절단할 수 있다는 리폴딩 연구가 발표되었다(도 1 및 도 2).

SDS-PAGE는 21N^pro(HoBi)가 4.5M 우레아에서 pep6His를 절단할 수 있는 것을 나타낸다(도 3). 도 4의 그래프는 서로 다른 우레아 농도 하에서의 용해도 및 21N^pro(HoBi)-pep6His의 리폴딩 효율을 나타낸다. 우레아 농도가 높을수록 리폴딩 효율이 낮은 것을 추측할 수 있다.

3종의 다른 우레아 농도 하에서의 500mM NaCl, 20mM (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중의 동적 리폴딩의 결정

도 5는 3, 3.5, 및 4M 우레아에서의 500mM NaCl, 20mM (NH₄)₂HPO₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중의 21N^pro(HoBi)-pep6His의 동적 리폴딩을 나타낸다. 우레아 농도가 높을수록 절단 반응이 느리게 행해졌다(도 6).

실시예 2: Δ21N ^pro ( HoBi )- SDD - diUbi - pep6His

2.5M 우레아의 존재 하에서 서로 다른 완충액의 리폴딩

SDS-PAGE에 의한 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His의 리폴딩 반응의 분석은 Δ21N^pro(HoBi)가 서로 다른 효율을 갖는 다수의 완충액(완충액 2 및 완충액 13 제외) 중의 2.5M 우레아의 존재 하에서 SDD-diUbi-pep6His를 절단할 수 있는 것을 나타냈다(도 7). N-말단 서열은 적절한 분자량에서 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His의 대조군 레인에서 결합을 볼 수 있는 것을 결정했다. 체내에서 유도된 18kD가 Δ21N^pro(HoBi)를 절단했다. SDD-diUbi-pep6His의 넓은 결합때문에, 리폴딩 효율의 결정을 설명에서 배제했다.

각종 농도 하에서 500mM NaCl, 20mM (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ pH 7.5, 5% 글리세롤 중의 리폴딩

도 8의 SDS-PAGE는 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His가 여전히 절단 활성 4.5M 우레아를 나타낸 것을 나타낸다. 타겟 단백질 SDD-diUbi-pep6His의 넓은 결합때문에 Δ21N^pro(HoBi)-SDD-diUbi-pep6His의 리폴딩 효율은 산출하지 않았지만, 우레아 농도가 증가하는 리폴딩 효율이 감소하는 것을 볼 수 있다.

실시예 3: 유가배양 모드에서 대장균을 갖는 D21N ^pro ( HoBi )- MCP -1, SEQ.ID.NO. 4, 및 D21EDDIE - MCP -1, SEQ .ID.NO. 5의 발현

박테리아 스트레인의 생성 및 재조합 단백질의 설명

분자량

MCP-1(SEQ.ID.NO. 10): 8.7kD

D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4): 25.2kD

D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5): 25.3kD

서열

D21Npro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4):

MEPLYDKNGAVLFGEPSDTHPQSTLKLPHPRGEDEVEVGIRDLPRKGDCRTGNRLGPVSGLFVKPGPVFYQDYSGPVYHRAPLEQFKQTPMEETTKRIGRVTGSDGNLYHMYVETDGEILVKQAKREGQDVLKWTYNTLDSPIWVTSCQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT

D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5):

MEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSCQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT

MCP-1(SEQ.ID.NO. 10):

QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT

목적의 유전자에 최적화된 코돈(GOIs)을 합성하고(Geneart AG, 독일), NdeI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위뿐만 아니라, 2 TAA 정지 코돈을 갖는 Geneart 플라스미드에 제공했다. 얻어지는 GOI DNA를 NdeI 및 EcoRI로 소화시키고, 동일 효소로 제한된 pET30a 벡터(Novagen, Merck Millipore)에 결찰했다.

Npro의 발현을 위해, 조각 대장균 스트레인 BL21(DE3)을 사용했다. 대장균 BL21(DE3)을 변형시키고, 37℃에서 하룻밤 성장시켰다.

3개의 복제물을 선택하고, Luria-Bertani(LB) 매개체(Bertani 외, 1951)에서 재현탁하고, 광학 농도(OD550㎚) 0.2~0.5까지 37℃에서 성장시키고, 모두 각각 글리세롤 스탁으로서 냉동시켰다.

식의 표현을 위해 복제물 스크리닝을 행했다: LB 매개체를 글리세롤 스탁으로부터 접종하고, 37℃에서 하룻밤 성장시켰다. 복제물 스크리닝 제조를 위해, 0.2의 DO에 배양 LB 매개체를 종균배양으로 접종하고, OD 1까지 성장시켰다. 이어서, 1mM IPTG(이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노사이드)를 현탁액에 첨가함으로써 단백질 발현을 유도했다. 37℃에서 4시간 동안의 배양 후, 원심분리에 의해 세포 펠렛을 회수하고, -20℃에서 저장하고, 이하와 같은 SDS(소듐도데실술페이트) Page(폴리아실아미드 겔 전기이동)에 의해 제조성에 대해 분석했다:

- 샘플 조제: BugBuster Extraction Reagent(Novagen-Merck) plus Lysonase Bioprocessing Reagent mix(Novagen-Merck)

- Gel: NuPage 12% Bis Tris, 1.0㎜(Invitrogen)

- 샘플 완충액: NuPAGE LDS 샘플 완충액(Invitrogen)

- 환원제: 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)

- 런닝 완충액: NuPAGE MES SDS 런닝 완충액(Invitrogen)

- 세정제: SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)

배양 모드 및 공정 분석

전배양

글리세롤 스탁으로부터 유리 진탕 플라스크 중에 300㎖ 전배양 매개체(실시예 4에서 설명하는 매개 조성물)를 주입하고, 1.25~2.75)의 광학 농도(OD 550㎚)에 도달할 때까지 성장시켰다.

주배양

표준 제어 장치가 구비된 7ℓ(순부피 5ℓ, 배치 부피 3ℓ) 컴퓨터 조절된 바이오리액터(Sartorius Stedim Biotech AG, 독일)에서 세포를 성장시켰다. "매개 조성물" 하의 배치 매개체를 실시예 4에서 설명한다. pH는 25% 암모니아 용액의 첨가에 의해 6.8±0.2의 설정값으로 유지하고, 온도는 37℃±0.5℃로 설정하고, 통기 속도는 5ℓ/분으로 고정한다. 산소 제한을 방지하기 위해, 교반기 속도 및 순산소의 농축에 의해 용해된 산소 레벨을 포화도 20%로 안정화시킨다. 광음향 멀티 가스 분석기(Innova)에 의해 외측 공기 중의 O₂ 및 CO₂의 함량을 구했다. 항발포 현탁액(PPG 2000, Dow)의 첨가에 의해 발포를 억제했다. 접종을 위해, 30㎖ 전배양을 바이오리액터로 무균적으로 이동시켰다. 배양이 고정상에 들어갈 때 공급을 개시했다. 기하급수적 기질 공급으로 유가배양 규칙을 사용하여 8.5시간 동안 0.25h^-1의 지속적 성장 속도를 제공한 후, 실제 공급 속도에서 지속적 모드로 공급을 변경했다. "매개 조성물" 하의 공급 매개체를 실시예 4에서 설명한다.

유도

단일 펄스에 의해 종래 모드에서 바이오리액터로 직접 유도를 행했다. 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 공급량을 산출하여 완전한 유도 시스템을 얻기 위해 공정의 후반에 1mM IPTG의 농도를 설정했다.

오프라인 분석

550㎚에서 Spectronic Instruments, 미국으로부터의 Genesis 10 스펙트로포토미터로 광학 농도(OD)를 구했다. 0.2~0.6의 범위에서 OD 550㎚를 측정했다. 상기 0.6 샘플의 소멸을 OD-완충액(20.7g/ℓ Na₂HPO₄*12H₂O, 5.7g/ℓ KH₂PO₄, 및 11.6g/ℓ NaCl)으로 희석했다. 측정된 OD-샘플로서 비교가능한 배양액 희석액을 여과하여(포어 사이즈 0.2㎛) 블랭크값을 생성했다.

10㎖의 세포 현탁액의 원심분리에 의해 박테리아성 건조 물질(건조 세포 중량, DCW)을 구한 후에 원심분리에 의해 증류수에서 재현탁하고, 재차 재현탁했다. 그 후, 수분 분석기(Sartorius Stedim Biotech AG, 독일)를 사용하여 세포 건조 중량을 구했다.

35g의 샘플 배양액을 원심분리했다. 상청 물질을 버리고, 잔존하는 액체를 제거하고, 바이오매스 펠렛의 중량을 구했다.

글루코오스 분석기 YSI 2700 Select(Yellow Springs)로 배양 현상액 중에 글루코오스를 측정했다.

이하와 같이 SDS Page를 환원시킴으로써 재조합 단백질의 함량을 구했다:

- 겔: NuPage 12% Bis Tris, 1.0㎜(Invitrogen)

- 샘플 완충액: NuPAGE LDS 샘플 완충액(Invitrogen)

- 환원제: 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)

- 런닝 완충액: NuPAGE MES SDS 런닝 완충액(Invitrogen)

- 세정제: SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)

결과

불용성 봉입체(IB)로서 양쪽 융합 단백질, D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4), 및 D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)이 발현되었다(도 9 및 도 10).

요약:

도 9 및 도 10은 D21EDDIE-MCP-1(SEQ.ID.NO. 5)에 비해 D21N^pro(HoBi)-MCP-1(SEQ.ID.NO. 4)의 발현에 의한 MCP-1(SEQ. ID. NO. 10)에 대한 역가만 현저하게 증가한 것을 명백히 나타낸다. 체적(배양액 1ℓ당 MCP의 g수)뿐만 아니라 특정(세포 건조 중량, DCW 1g당 MCP-1의 ㎎수) 역가도 각각 1.5-및 1.4- 증가했다.

실시예 4: 융합 파트너로서 pep6His ( SEQ .ID.NO. 11) 및 SOD-FLS(SEQ.ID.NO.12)를 갖는 EDDIE 융합 단백질에 비교되는 Npro ( BoBi ) 융합 단백질의 리폴딩 및 절단

박테리아 스트레인의 발생 및 재조합 단백질의 설명

Novagen에 의해 제공된 B-스트레인 BL21(DE3)로 실험을 행했다. 명칭(DE3)은 숙주가, lacUV5 촉진제의 조절 하에서 T7 RNA 폴리메라아제 유전자의 염색체 복제물을 운반하는 λ DE3 프로파지의 리소겐인 것을 가리킨다(Studier and Moffat, 1986; Studier 외, 1990). Novagen으로부터의 pET30a 플라스미드(pET System manual, 11^th edition)로 타겟 단백질의 발현을 행했다.

D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO. 6)

MEPLYDKNGA VLFGEPSDTH PQSTLKLPHP RGEKEVIVGI RDLPRKGDCR TGNRLGPVSG LFVKPGPVFY QDYSGPVYHR APLEQFKQAP MCEVTKRIGR VTGSDGNLYH MYVCTDGCIL VKTAKREGQD VLKWVYNVLD SPIWVASCSV DKLAAALEHH HHHH

D21Npro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8)

MEPLYDKNGA VLFGEPSDTH PQSTLKLPHP RGEDEVEVGI RDLPRKGDCR TGNRLGPVSG LFVKPGPVFY QDYSGPVYHR APLEQFKQTP MEETTKRIGR VTGSDGNLYH MYVETDGEIL VKQAKREGQD VLKWTYNTLD SPIWVTSCSV MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER HVGDLGNVTA DKDGVADVSI EDSVISLSGD HCIIGRTLVV HEKADDLGKG GNEESTKTGN AGSRLACGVI GTAQVDDYKD DDDKGGGGSG GGGSWSHPQF EK

D21EDDIE-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 9)

MEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL RDLPRKGDCR SGNHLGPVSG IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ FEETTKRIGR VTGSDGKLYH IYVEVDGEIL LKQAKRGTPR TLKWTRNTTN CPLWVTSCDT MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER HVGDLGNVTA DKDGVADVSI EDSVISLSGD HCIIGRTLVV HEKADDLGKG GNEESTKTGN AGSRLACGVI GTAQVDDYKD DDDKGGGGSG GGGSWSHPQF EK

D21EDDIE-pep6His(SEQ.ID.NO. 7)

MEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL RDLPRKGDCR IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ FEETTKRIGR VTGSDGKLYH IYVEVDGEIL LKQAKRGTPR TLKWTRNTTN CPLWVTSCDT SVDKLAAALE HHHHHH

Pep6His(SEQ.ID.NO. 11)

SV DKLAAALEHH HHHH

SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 12)

SV MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER HVGDLGNVTA DKDGVADVSI EDSVISLSGD HCIIGRTLVV HEKADDLGKG GNEESTKTGN AGSRLACGVI GTAQVDDYKD DDDKGGGGSG GGGSWSHPQF EK

배양 모드 및 공정 분석

표준 조절 장치가 구비된 10ℓ(작업 부피 5ℓ)의 컴퓨터로 조절된 바이오리액터(MBR; Wetzikon, CH) 중에 세포를 성장시켰다. pH는 25% 암모니아 용액(ACROS Organics)의 첨가에 의해 7.0±0.05의 설정값을 유지하고, 온도는 37℃±0.5℃로 설정했다. 산소 제한을 방지하기 위해, 교반기 속도 및 통기 속도 조절에 의해 용해 산소 레벨을 30% 초과 포화도로 안정화시켰다. Hartmann and Braun Advanced Optima gas analyzer에의해 외부 공기 중에 O₂ 및 CO₂의 함량을 구했다. 바이오매스 모니터, 모델 214M(Aber Instruments, Aberystwyth, 영국) 세트로 유전체 용량 및 전도율을 측정했다. 0.5㎖/ℓ 농도의 공급 매개체로 항발포 현탁액(PPG2000, Bussetti, Vienna)의 첨가에 의해 발포를 억제했다. 접종을 위해, 고냉동(-80℃)된 작업 세포 뱅크 용기를 해동시키고, 1㎖(광학 농도 OD₆₀₀=1)를 무균적으로 바이오리액터로 이동시켰다. 4.0ℓ 배치 매개체 중에 7.5g의 박테리아성 건조 물질을 성장시킨 배양액이 고정상으로 들어갈 때 공급을 개시한다. 기하급수적 기질 공급을 갖는 유가배양 규칙을 사용하여 2배가시간 동안에 0.2h^- ¹의지속적인 성장 속도를 제공했다. 기질 탱크 중에 중량 손실의 적재적 피드백 조절을 갖는 기하급수적 성장 알고리즘, x=x₀.e^μt에 의한 펌프 속도를 증가시킴으로서 기질 공급을 조절했다(Cserjan-Puschmann 외, 1999). 공급 매개체가 충분한 성분을 제공하여 129g의 박테리아성 건조 물질을 얻는다.

유도

단일 펄스에 의해 종래 모드에서 바이오리액터로 직접 유도를 행했다. IPTG의 공급량을 산출하여 완전히 유도된 시스템을 얻기 위해 공정의 후반에서의 20μ몰 IPTG/g CDM의 농도를 설정했다.

매개 조성물

본 연구에 사용되는 최소 매개체는 1ℓ당 3g KH₂PO₄ 및 6g K₂HPO₄*3H₂O를 함유한다. 이들 농도는 소망의 완충액 용량을 제공하고, P 및 K로서도 작용한다. 제조되는 박테리아성 건조 물질에 다른 성분을 첨가했다: 소듐시트레이트(트리소듐염 *2H₂O; ACROS organics) 0.25g, MgSO₄*7H₂O 0.10g, CaCl₂*2H₂O 0.02g, 미량 원소 용액 50㎕, 및 글루코오스*H₂O 3g. 개체군의 최초 성장을 가속화하기 위해, 착체 조성물 이스트 추출물 0.15g을 최소 매개체에 첨가하여 배치 매개체를 얻는다. 공급상에 대해, 생물학적 건조 물질 129g의 양에 의해 1ℓ의 최소 매개체를 조제하여 공급상 중에 제조함으로써 P-염을 재차 1ℓ당 첨가한다. 미량 원소 용액: 5N HCl(g/ℓ): FeSO₄*7H₂O 40.0, MnSO₄*H₂O 10.0, AlCl₃*6H₂O 10.0, CoCl₂(Fluka) 4.0, ZnSO₄*7H₂O 2.0, Na₂MoO₂*2H₂O 2.0, CuCl₂*2H₂O 1.0, H₃BO₃ 0.50 중에서 조제.

오프라인 분석

600㎚에서 광학 농도(OD)를 측정했다. 10㎖의 세포 현탁액의 원심분리에 의해 박테리아성 건조 물질을 구한 후, 원심분리에 의해 증류수에서 재현탁하고, 미리 중량된 비이커로 재현탁액을 이동시킨 후에 24시간 동안 105℃에서 건조시키고, 재차 중량했다.

바이오매스의 총량(총 박테리아성 건조 물질 BDM; 세포 건조 중량 CDW라고도 함)을 산출함으로써 박테리아 성장의 절차를 구했다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 참조의 선형 회귀 곡선의 방법에 의해 SDS-PAGE로 발현된 융합 단백질의 정량화를 행했다. 따라서, 가용화된 IB의 샘플을 희석하여 측정 범위 내로 하고, ImageQuantTL Software에 의해 농도계로 밴드의 단백질 함량을 구했다.

표 2에 기재한 발현 시스템을 사용하여 pep6His(SEQ.ID.NO. 11)을 갖는 D21N^pro(Hobi) 및 D21EDDIE의 융합 단백질을 제조하고, 서로 다른 리폴딩 조건 하에서 융합 파트너로서 SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 12)를 2종의 오토프로테아제 변종의 절단 성질에 대해 비교했다. 유도 시스템을 완전히 얻기 위해 단일 압력의 1종 배가시간 공급 개시로서 유도를 행한다.

Cserjan - Puschmann , M.; Kramer, W.; Durrschmid , E.; Striedner , G.; Bayer, K. Metabolic approaches for the optimisation of recombinant fermentation processes. Appl . Microbiol . Biotechnol , 1999, 53, 43-50.

Studier, F.W ., and Moffatt , B.A . Use of the bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol . Biol., 1986, 189, 113-130.

Studier, F.W .; Rosenberg , A.L .; Dunn , J.J .; Dubendorff , J.W . Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Meth . Enzym ., 1990, 185, 60-89.

봉입체( IB )의 조제

상술한 바와 같이, 상술한 단백질의 IB를 회수했다(Walter 외, 2013). 디스크 원심분리기(Pathfinder PSC 1-06-177; GEA GEA Westfalia Separator Group, Oelde, 독일)를 사용하여 습식 세포 페이스트를 회수하고, pH 8.0에서 50mM Tris, 50mM NaCl, 및 0.02% Tween 중에서 ultra turrax(IKA, Staufen, 독일)를 사용하여 재현택하여 농도 30g/ℓ의 건조 물질을 얻었다. 1000bar의 압력에서 Panda 2K 호모지나이저(GEA Niro Soavi S.p.A., 이탈리아)를 통해 슬러리를 2회 통과시켰다. 디스크 원심분리시를 사용하여 IB를 분리하고, 얻어진 펠렛을 20mM Tris, 0.5M NaCl, 및 0.02% Tween으로 2회 세정했다. 원심분리 후, ultra turrax를 사용하여 펠렛을 재현탁하고, 0.5M NaCl로 1회 세정했다. 각각의 세정 스텝 후, 디스크 원심분리기를 사용하여 IB를 분리했다. 수중에서 최종 펠렛을 재현탁하여 40% IB 현탁액을 얻고, -20℃에서 저장했다. 이전의 실험에서 IB를 감압 하에 동결 건조시키고, 4℃에서 저장했다.

C. Walther , S. Mayer, A. Trefilov , G. Sekot , R. Hahn, A. Jungbauer , A. Durauer, (2013): Prediciton of Inclusion Body Solubilzation From Shaken to Stirred Reactors, Biotechnology & Bioengineering, 111: 84-94

봉입체(IB)의 가용화

상술한 바와 같이 IB 가용화를 행했다(Walther 외, 2013). IB 단백질의 가용화를 위해, 수중에서 1시간 동안 감압 하에 동결 건조된 IB를 재현탁했다. 상응하는 가용화 완충액 중에 1:10의 비율로 IB 현탁액을 용해했다. IB 현탁액의 희석 인자를 취하는 완충액 성분의 농도를 8M 또는 4M 및 5M GuHCl의 얻어진 우레아 농도를 달성하는 범위로 각각 조정했다. 또한, 가용화 완충액은 pH 7.3에서 최종 농도 50mM Tris 및 100mM MTG를 함유한다. 2시간 후, 13,200rpm, 21℃에서 5분 동안 원심분리기(5415R, Eppendorf, 독일)에 및 0.22㎛ 필터(Millipore, Billerica, MA, 미국)를 통한 연속 여과에 의해 리액터 중에 가용화를 정지시켰다.

C. Walther , S. Mayer, A. Trefilov , G. Sekot , R. Hahn, A. Jungbauer , A. Durauer, (2013): Prediciton of Inclusion Body Solubilization From Shaken to Stirred Reactors, Biotechnology & Bioengineering, 111: 84-94

리폴딩 및 절단

1:20의 비율로 리폴딩 완충액으로의 가용화 IB의 빠른 희석에 의해 리폴딩을 행하여 모든 실험에 대한 카오트로프 정수의 잔사 농도를 유지하거나, 또는 단백질 농도를 다르게 하거나 반대로 했다. 표 4에 나타내는 바와 같이, 리폴딩 완충액으로서 2종의 조성물을 사용했다.

절단 수율[ % ]의 결정

상술한 바와 같이 절단 수율의 부석을 행했다(Walther 외, 2013). RP-HPLC에 의해 복원 공정 초과 시간에 걸쳐 리폴딩 샘플의 부분 표본을 분석하여 절단 수율을 구했다. 절단 타겟 및 오토프로테아제로부터의 융합 단백질의 분리는 최초 전체 융합 단백질에 대한 절단 타겟/오토프로테아제의 증가를 통한 절단 수율의 산출을 가능하게 한다.

TSKgel Super-Octyl 컬럼(4.6×50/100㎜, 2㎛, 110Å)(Tosoh Bioscience, 독일)을 사용하여 RP-HPLC를 행했다. 완충액 시스템은 완충액 A로서의 수중의 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA) 및 완충액 B로서의 아세토니트릴 중의 0.1%(v/v) TFA로 구성된다. 가용화 및 리폴딩 샘플을 직접 주입했다. 분석된 각각의 융합 단백질에 대해 최적화된 서로 다른 기울기를 사용하여 용출을 행했다. 2개의 파장, 214㎚ 및 280㎚에서 검출을 진행하여 단백질과 완충액 성분을 구별했다.

결과

서로 다른 우레아 농도에서 D21EDDIE -SOD- FLS(SEQ.ID.NO. 9)에 대한 D21N ^pro (HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8)의 동적 절단

8M 우레아에서 IB를 가용화하고, 2종의 서로 다른 리폴딩 완충액 중에서 우레아 농도의 증가 하에 Tris 및 AmPh를 리폴딩했다. 모든 실험에 대해 단백질 농도를 동일하게, 즉 c=0.1㎎/㎖로 했다.

도 12는 Tris 완충액 중에서 리폴딩될 때의 D21N^pro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8)에 대한 동적 절단이 우수한 것을 나타낸다. Am-Ph 중에서 리폴딩될 때의 24시간 후의 D21N^pro(HoBi)-SOD-FLS(SEQ.ID.NO. 8)에 대한 절단 수율 또한 우수했다(표 5).

서로 다른 농도에서의 D21EDDIE - pep6His(SEQ.ID.NO. 7)에 대한 D21Npro(HoBi)-pep6His(SEQ.ID.NO. 6)의 절단 수율:

8M 우레아 또는 5M GuHCl 중에서 IB를 가용화하고, 2종의 서로 다른 리폴딩 완충액 중에서 우레아 또는 GuHCl의 농도 증가 하에서 Tris 및 AmPh를 리폴딩했다. 모든 실험에 대해 단백질 농도를 동일하게, 즉 c=0.1㎎/㎖로 했다.

요약:

증가하는 카오트로프 농도에 있어서의 D21N^pro(HoBi) 오토프로테아제 활성은 양방의 목적의 단백질(pep6His, SEQ.ID.NO. 11과 SOD-FLS, SEQ.ID.NO. 12)에 대한 것이었고, D21EDDIE 오토프로테아제에 비해 서로 다른 리폴딩 완충액(도 12, 표 5, 및 표 6) 중에서 우수했다.

SEQUENCE LISTING <110> Sandoz AG Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG <120> Method for producing a recombinant protein of interest <130> R 65202 <150> EP 12198006.4 <151> 2012-12-19 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 148 <212> PRT <213> CSFV <400> 1 Met Glu Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Ala Val Leu Phe Gly Glu Pro 1 5 10 15 Ser Asp Thr His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Pro Arg Gly 20 25 30 Glu Lys Glu Val Ile Val Gly Ile Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Thr Gly Asn Arg Leu Gly Pro Val Ser Gly Leu Phe Val Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Ser Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Gln Phe Lys Gln Ala Pro Met Cys Glu Val Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Tyr His Met Tyr 100 105 110 Val Cys Thr Asp Gly Cys Ile Leu Val Lys Thr Ala Lys Arg Glu Gly 115 120 125 Gln Asp Val Leu Lys Trp Val Tyr Asn Val Leu Asp Ser Pro Ile Trp 130 135 140 Val Thr Ser Cys 145 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> CSFV <400> 2 Met Glu Leu Leu Asn Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Ala Gly Val Gln Glu Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Ala Val Leu 20 25 30 Phe Gly Glu Pro Ser Asp Thr His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Pro Arg Gly Glu Lys Glu Val Ile Val Gly Ile Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Thr Gly Asn Arg Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Leu Phe Val Lys Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Ser Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Gln Phe Lys Gln Ala Pro Met Cys 100 105 110 Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu 115 120 125 Tyr His Met Tyr Val Cys Thr Asp Gly Cys Ile Leu Val Lys Thr Ala 130 135 140 Lys Arg Glu Gly Gln Asp Val Leu Lys Trp Val Tyr Asn Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Pro Ile Trp Val Ala Ser Cys 165 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> model peptide termed pep6His <400> 3 Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 1 5 10 15 <210> 4 <211> 224 <212> PRT <213> CSFV <400> 4 Met Glu Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Ala Val Leu Phe Gly Glu Pro 1 5 10 15 Ser Asp Thr His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Pro Arg Gly 20 25 30 Glu Asp Glu Val Glu Val Gly Ile Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Thr Gly Asn Arg Leu Gly Pro Val Ser Gly Leu Phe Val Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Ser Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Gln Phe Lys Gln Thr Pro Met Glu Glu Thr Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Tyr His Met Tyr 100 105 110 Val Glu Thr Asp Gly Glu Ile Leu Val Lys Gln Ala Lys Arg Glu Gly 115 120 125 Gln Asp Val Leu Lys Trp Thr Tyr Asn Thr Leu Asp Ser Pro Ile Trp 130 135 140 Val Thr Ser Cys Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys 145 150 155 160 Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr 165 170 175 Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys 180 185 190 Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val 195 200 205 Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 210 215 220 <210> 5 <211> 224 <212> PRT <213> CSFV <400> 5 Met Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro 1 5 10 15 Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu Glu Thr Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr 100 105 110 Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala Lys Arg Gly Thr 115 120 125 Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Thr Thr Asn Cys Pro Leu Trp 130 135 140 Val Thr Ser Cys Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys 145 150 155 160 Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr 165 170 175 Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys 180 185 190 Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val 195 200 205 Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 210 215 220 <210> 6 <211> 164 <212> PRT <213> CSFV <400> 6 Met Glu Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Ala Val Leu Phe Gly Glu Pro 1 5 10 15 Ser Asp Thr His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Pro Arg Gly 20 25 30 Glu Lys Glu Val Ile Val Gly Ile Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Thr Gly Asn Arg Leu Gly Pro Val Ser Gly Leu Phe Val Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Ser Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Gln Phe Lys Gln Ala Pro Met Cys Glu Val Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Tyr His Met Tyr 100 105 110 Val Cys Thr Asp Gly Cys Ile Leu Val Lys Thr Ala Lys Arg Glu Gly 115 120 125 Gln Asp Val Leu Lys Trp Val Tyr Asn Val Leu Asp Ser Pro Ile Trp 130 135 140 Val Ala Ser Cys Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His 145 150 155 160 His His His His <210> 7 <211> 156 <212> PRT <213> CSFV <400> 7 Met Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro 1 5 10 15 Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr 50 55 60 Gly Pro Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln 65 70 75 80 Phe Glu Glu Thr Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly 85 90 95 Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys 100 105 110 Gln Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Thr 115 120 125 Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Asp Thr Ser Val Asp Lys 130 135 140 Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 145 150 155 <210> 8 <211> 332 <212> PRT <213> CSFV <400> 8 Met Glu Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Ala Val Leu Phe Gly Glu Pro 1 5 10 15 Ser Asp Thr His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Pro Arg Gly 20 25 30 Glu Asp Glu Val Glu Val Gly Ile Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Thr Gly Asn Arg Leu Gly Pro Val Ser Gly Leu Phe Val Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Phe Tyr Gln Asp Tyr Ser Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Gln Phe Lys Gln Thr Pro Met Glu Glu Thr Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Asn Leu Tyr His Met Tyr 100 105 110 Val Glu Thr Asp Gly Glu Ile Leu Val Lys Gln Ala Lys Arg Glu Gly 115 120 125 Gln Asp Val Leu Lys Trp Thr Tyr Asn Thr Leu Asp Ser Pro Ile Trp 130 135 140 Val Thr Ser Cys Ser Val Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys 145 150 155 160 Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser 165 170 175 Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly 180 185 190 Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys 195 200 205 Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly 210 215 220 Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala 225 230 235 240 Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser 245 250 255 Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu 260 265 270 Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr 275 280 285 Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Thr Ala Gln 290 295 300 Val Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 305 310 315 320 Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 325 330 <210> 9 <211> 332 <212> PRT <213> CSFV <400> 9 Met Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro 1 5 10 15 Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly 20 25 30 Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp 35 40 45 Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys 50 55 60 Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro Val Tyr His Arg 65 70 75 80 Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu Glu Thr Thr Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr 100 105 110 Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala Lys Arg Gly Thr 115 120 125 Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Thr Thr Asn Cys Pro Leu Trp 130 135 140 Val Thr Ser Cys Asp Thr Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys 145 150 155 160 Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser 165 170 175 Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly 180 185 190 Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys 195 200 205 Thr Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly 210 215 220 Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala 225 230 235 240 Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser 245 250 255 Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu 260 265 270 Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr 275 280 285 Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Thr Ala Gln 290 295 300 Val Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 305 310 315 320 Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 325 330 <210> 10 <211> 76 <212> PRT <213> CSFV <400> 10 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> CSFV <400> 11 Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 184 <212> PRT <213> CSFV <400> 12 Ser Val Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro 1 5 10 15 Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val 20 25 30 Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe 35 40 45 His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly 50 55 60 Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu 65 70 75 80 Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly 85 90 95 Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp 100 105 110 His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp 115 120 125 Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Thr Ala Gln Val Asp Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 165 170 175 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 180

Claims

(a) 봉입체 중에 N^pro 오토프로테아제 부분 및 목적의 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 스텝,
(b) 상기 봉입체를 가용화하는 스텝,
(c) 카오트로픽 조건 하에서 상기 N^pro 오토프로테아제 부분에 의해 상기 융합 단백질을 절단시키는 스텝으로서, 상기 목적의 재조합 단백질은 상기 융합 단백질로부터 절단되고, 상기 목적의 재조합 단백질은 아직 재생되지 않거나, 또는 동시에 재생되지 않는 스텝, 및
(d) 필요에 따라 상기 목적의 단백질을 재생하는 스텝을 포함하는 목적의 단백질을 회수하는 스텝에 의해 목적의 재조합 단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 봉입체는 재조합 생산 시스템, 바람직하게는 원핵 숙주 세포, 특히 대장균 숙주 세포 중에서 생성된 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스텝(b)에 있어서의 조건은 5M 이상, 바람직하게는 6M 이상, 특히 7.5M 이상의 우레아 농도에 상응하는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(c)에 있어서의 카오트로픽 조건은 1.4~5M, 바람직하게는 2~5M, 특히 2~4M의 우레아 농도에 상응하는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N^pro 오토프로테아제 부분의 2.5M 우레아에서의 절단율은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 특히 적어도 40%인 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N^pro 오토프로테아제 부분은 SEQ ID nos. 1 또는 2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 N^pro 오토프로테아제 부분은 인터페론 조절 인자 3 결합 위치가 삭제된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적의 단백질은 인간에 있어서의 치료용 단백질, 바람직하게는 인간 재조합 단백질 또는 백신 접종 항원인 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(b) 및/또는 스텝(c)은 5~11의 pH, 바람직하게는 6~9.5의 pH, 특히 6.5~8.5의 pH에서 행해지는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(b)은 염기 조건 하에서 행해지는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(b)은 NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 5mM 초과의 NaOH 또는 KOH, 바람직하게는 25mM 초과의 NaOH 또는 KOH, 보다 바람직하게는 50mM 초과의 NaOH 또는 KOH, 특히 100mM 초과의 NaOH 또는 KOH의 존재 하에서 행해지는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 목적의 단백질에 대한 재생 스텝은 상기 목적의 단백질의 회수 후에 행해지는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 추가 부분, 바람직하게는 친화성 표식 또는 리폴딩 보조 부분, 특히 His-표식, SlyD, 양전하부 또는 음전하부 중 어느 하나로 이루어지는 올리고 아미노산 구간, Strep-표식 및/또는 FLAG-표식을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 스텝(b)과 스텝(c) 사이에 정제 또는 부분 정제되는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 융합 단백질은 친화성 정제, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피 또는 친화성 침전에 의해 스텝(b)과 스텝(c) 사이에 정제 또는 부분 정제되는 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(b)에 있어서 구아니디늄하이드로클로라이드 농도는 2.5M 초과, 바람직하게는 3M 초과, 특히 3.75M 초과인 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스텝(c)에 있어서 구아니디늄하이드로클로라이드 농도는 0.7~2.5M, 바람직하게는 1~2.5M, 특히 1~2M인 것을 특징으로 하는 목적의 재조합 단백질의 제조 방법.
SEQ ID No. 2와 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는 서열을 갖는 N^pro 오토프로테아제 부분으로서,
상기 아미노산 치환은 N28~V, L 또는 I; A30~T; T39~V 또는 I; L81~V, F82~Y, V83~I, K84~E, P85~L, P87~A, V88~I, Q91~K; S94~I, L 또는 V; Q105~L; P110~V; N127~K, M131~I, T135~V, V141~L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분.
제 18 항에 있어서,
N28~V, L 또는 I; A30~T; T39~V 또는 I; L81~V, F82~Y, V83~I, K84~E, P85~L, P87~A, V88~I, Q91~K; S94~I, L 또는 V; Q105~L; P110~V; N127~K, M131~I, T135~V, V141~L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
SEQ ID No. 2의 아미노산 2~21은 삭제되는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분.
제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID No. 2의 아미노산 A166은 T로 치환되는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분.
제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 N^pro 오토프로테아제 부분 또는 SEQ ID No. 2에 의한 N^pro 오토프로테아제 부분을 사용하여 단백질의 재조합 발현을 행하는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분의 용도.
목적의 재조합 단백질, 및 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 N^pro 오토프로테아제 부분 또는 SEQ ID No. 2에 의한 N^pro 오토프로테아제 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 N^pro 오토프로테아제 부분 또는 제 23 항에 기재된 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 24 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
SEQ ID No. 1의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 N^pro 오토프로테아제 부분.