CN101735337B - 制备几丁质和壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备几丁质和壳聚糖的方法。该方法采用灵芝子实体提取多糖和其他化合物后的残渣为原料,经烘干粉碎,脱蛋白和脱色获得精制几丁质,再经脱乙酰化反应获得精制壳聚糖。该方法所得产品质量稳定,而且使灵芝提取多糖和其他化合物后的废弃残渣得以有效利用,提高了资源综合利用价值,降低了几丁质及壳聚糖的生产成本,减少了环境污染,有利于环境保护。
Description
技术领域
本发明涉及几丁质领域,特别是涉及一种制备几丁质和壳聚糖的方法。
背景技术
几丁质又名甲壳素,是目前发现的自然界中唯一带正电荷的可食性动物纤维素,大量存在于海洋节肢动物(如虾、蟹)的甲壳中,昆虫、藻类细胞膜及真菌的细胞壁中,每年的生物合成量近100亿吨,是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。由于几丁质不溶于稀酸、稀碱和普通的有机溶剂中,限制了它的广泛应用。而几丁质的脱乙酰基产物壳聚糖,它可溶于稀酸溶液中,并具有良好的成膜、保湿、吸附和对细胞的亲和性等独特功能,目前已在食品、环保、医药、农林业、轻工业和生物工程等许多领域得到了广泛的应用。
目前工业化生产的几丁质和壳聚糖主要来自于虾、蟹的外壳,其制备方法是:在天然甲壳中加入4-6%盐酸溶液,浸泡1-3天,有的加温到80-90℃,有的在室温下进行,以除去碳酸钙和无机盐;然后在浓度为5-12%NaOH溶液中脱除蛋白质等有机物,得到几丁质,再以KMnO4法对所得几丁质进行脱色,脱色后再加入45-60%的碱液,温度为70-160℃,时间6小时-7天,从而脱去乙酰基,制得壳聚糖。
该生产方式存在不少缺陷,例如,在制备过程中大量用具有腐蚀性的酸、碱,大量强酸性、强碱性废液的排放给环境造成严重的污染;酸液中含有大量的CaCl2,会造成水质的硬化;碱液中还含有大量的蛋白质,蛋白质的腐臭会造成生态的恶化;此外,使用KMnO4法对产品脱色也会产生含有Mn2+和SO2+的废液。近年来,虾壳、蟹壳被用作饲料生产原料,已造成几丁质/壳聚糖生产原料短缺,随着对几丁质、壳聚糖及其衍生物应用研究的逐渐深入,对几丁质和壳聚糖及其制品的需求大幅度增长,因而急需寻找新的几丁质和壳聚糖资源及其生产方法,以解决原料短缺问题,并减轻现有生产方法对环境造成的污染。
近年来,大型真菌产品市场持续成长,利用大量大型真菌子实体提取多糖或其他活性物质后的菌体残渣,如非褶菌目多孔菌科的灵芝、树舌、云芝等真菌子实体提取后残渣中含有丰富的几丁质,且其细胞壁结构较虾壳松软,蛋白质含量低,与传统的从虾、蟹外壳中提取几丁质相比,不需要盐酸脱钙,减少了酸液的排放,并在较温和的条件下制备几丁质,有利于环保。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备几丁质和壳聚糖的方法。
本发明提供的制备几丁质的方法,包括如下步骤:
1)将非褶菌目的真菌子实体粉碎后,加水,将在60-100℃下提取1-4次后的残渣烘干,破碎后过筛,得到用于提取几丁质的原料;
2)脱除蛋白质,得到几丁质粗品;
3)在pH值为6-11的条件下,将所述几丁质粗品分散于水中,加入氧化剂进行氧化脱色,得到所述几丁质。
该方法的步骤1)中,所述非褶菌目的真菌子实体选自灵芝、云芝、桑黄和树舌中的至少一种;水的加入量为用于提取几丁质的原料干重的10-20倍;所述过筛步骤是将所述残渣过筛至40-300目,具体可为40-60目、40-80目、60-80目、80-100目或60-100目,优选60目;
所述步骤2)中,脱除蛋白质步骤所用的脱除剂选自NaOH水溶液和KOH水溶液中的至少一种;所述NaOH水溶液和KOH水溶液的质量百分浓度均为5-12%,具体可为5-8%、8-12%、9-12%、9-11%或7-9%,优选8%;所述脱除剂与所述步骤1)处理完毕的原料干重的比例为5-20ml∶1g,具体可为5-15ml∶1g、15-20ml∶1g、10-20ml∶1g或12-18ml∶1g,优选10ml∶1g;用NaOH水溶液和KOH水溶液中的至少一种脱除蛋白质时,脱除的温度为70-100℃,优选80℃,脱除的时间为1-8小时,具体可为1-2小时、1-4小时或2-4小时,优选2小时;
所述步骤3)中,所述氧化剂为质量百分浓度为30%的过氧化氢水溶液;水的用量为所述几丁质粗品干重的5-20倍,优选10倍;所述加入过氧化氢水溶液后,所述过氧化氢占所述过氧化氢、水和所述几丁质粗品总重的质量百分浓度为3-10%,优选6%;氧化脱色的次数为1-3次,优选2次;氧化脱色的时间为20分钟-2小时,优选1小时。
本发明提供的制备壳聚糖的方法,包括如下步骤:
1)将前述几丁质进行脱乙酰化反应,得到壳聚糖粗品;
2)纯化所述壳聚糖粗品,得到所述壳聚糖。
该方法的步骤1)中,所述脱乙酰化反应是将所述几丁质与NaOH的水溶液或KOH的水溶液进行反应;所述NaOH的水溶液和KOH的水溶液的质量百分浓度均为40-60%,优选45%。脱乙酰化反应的温度为70-120℃,优选100℃,反应时间为2-10小时,优选3小时;所述NaOH的水溶液或KOH的水溶液与所述几丁质干重的重量比为100-300∶1,优选150∶1;
所述步骤2)中,纯化的方法为将所述壳聚糖粗品用酸进行萃取,收集上清液,调节所述上清液的pH值为6-11,收集析出的沉淀,得到所述壳聚糖;所述酸选自乙酸、乳酸和柠檬酸中的至少一种;所述酸的质量百分浓度为1-30%,优选10%;所述酸的体积与所述壳聚糖粗品干重的比例为100-300mL∶1kg,优选100mL∶1kg;萃取的温度为20-100℃,优选70℃;萃取的时间为1-10小时,优选3小时。
上述制备几丁质和壳聚糖的方法中,所用的干燥方式为烘干、真空干燥、喷雾干燥、气流干燥或冷冻干燥等干燥方法,优选为冷冻干燥。
按照上述方法制备所得几丁质和壳聚糖,也属于本发明的保护范围。
本发明以灵芝提取多糖和其他化合物后的残渣为原料生产几丁质及壳聚糖的工艺,所得产品质量稳定,而且使灵芝提取多糖和其他化合物后的废弃残渣得以有效利用,提高了资源综合利用价值,降低了几丁质及壳聚糖的生产成本,减少了环境污染,有利于环境保护。
附图说明
图1为市售几丁质红外图谱。
图2为本发明实施例1制备的精制几丁质红外图谱。
图3为本发明实施例1制备的精制壳聚糖红外图谱。
图4为本发明测定脱乙酰度方法中,不同浓度的N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶液在波长200、201、202和203nm处的吸光度曲线。
图5为本发明测定脱乙酰度方法中的工作曲线。
图6为本发明测定脱乙酰度方法中,各实施例所得壳聚糖产物在波长200、201、202和203nm处的吸光度曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中,如无特别说明,所述浓度均为质量百分浓度。
脱乙酰度测定方法:
以0.85%磷酸为溶剂,配制浓度为100ug的N-乙酰基-D-葡萄糖胺(Alfa Aesar)标准溶液。分别吸取0.5,1.0,3.0,4.0和5.0标准溶液置10ml容量瓶中,用0.85%磷酸溶液稀释至刻度。配制成5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml和50ug/ml的梯度溶液。0.85%磷酸溶液为参比,在紫外分光光度计上测定不同浓度的N-乙酰基-D-葡萄糖胺溶液在波长200、201、202和203nm处的吸光度,所得曲线如图4所示,并对波长作图得到线性关系良好的一组直线,其斜率与对应溶液浓度呈正比。因此利用斜率与对应溶液浓度绘制出标准曲线,作为工作曲线,所得曲线如图5所示,该曲线所对应的线性方程为y=-0.0215x+0.0066,R2=0.9857。在同样波长下,测定待测样品吸光度值并对波长作图求出斜率,由工作曲线得到待测物浓度。
称取一定量壳聚糖样品加入20ml85%磷酸溶液,60℃下加热40min使之溶解。从中取出1ml溶液于50ml容量瓶中,以蒸馏水定容,配成与工作曲线相同的0.85%磷酸溶液。
以0.85%磷酸溶液为参比,分别测定样品在200,201,202,204nm下的吸光值,并对波长作图求得斜率,通过工作曲线得到N-乙酰基-D-葡萄糖胺浓度。按下式求得样品的脱乙酰度(%DD):
%DD=(C0-C)/(CO-42C/203)×100%
C0:壳聚糖样品浓度;
C:样品中N-乙酰基-D-葡萄糖胺测定浓度。
实施例1、制备几丁质和壳聚糖
一、制备几丁质
1.取50g灵芝粉碎后,加水,在90℃下提取3次后的残渣,干燥,高速粉碎机粉碎至粉末状,60目过筛。
2.脱除蛋白质
取上述粉碎过筛后的原料50.0g(干重),加入浓度为8.0%的NaOH溶液500ml,加热搅拌使其混合均匀,加热至80℃,反应2小时后,过滤除去碱液,并将所得过滤物用适量蒸馏水冲洗,直至冲洗后的蒸馏水为中性,获得的过滤物为几丁质粗品。
3.氧化脱色
将几丁质粗品分散在10倍水中,用NaOH调节pH值至10,加入一定量的30%过氧化氢水溶液使反应体系中过氧化氢浓度为6%,缓慢搅拌,脱色1小时后,过滤,将过滤物洗净后,同上方法,再进行一次脱色,过滤,将过滤物水洗至中性,冷冻干燥得本发明提供的几丁质9.0g。该几丁质的红外图谱如图1所示,可知,其结构正确。
二、制备壳聚糖
1.脱乙酰反应
取上述几丁质9.0g,加入180ml 45%的NaOH溶液,100℃下回流反应3小时,过滤除去碱液。将过滤物用适量蒸馏水冲洗至冲洗液呈中性,再次加入180ml 45%的NaOH溶液进行反应,最后将滤出物用蒸馏水充分清洗至中性,冷冻干燥得壳聚糖粗品1.5g。
2.纯化壳聚糖粗品
将步骤1所得壳聚糖粗品1.5g中加入150ml 10%的乙酸,室温下搅拌萃取1小时,过滤,滤液用NaOH调节pH值至10,沉淀析出,收集沉淀,蒸馏水洗至中性,冷冻干燥后得白色片絮状壳聚糖0.96g,得率为0.96g/50g残渣。该壳聚糖的红外谱图如图2所示,由图可知,该化合物结构正确。
将该壳聚糖产物按照前述方法测定脱乙酰度,其中,所得该壳聚糖产物的吸光度值与波长关系曲线,如图6中曲线a所示,该曲线a相关数据如表1所示;经测定及计算,该壳聚糖产物的脱乙酰度为98.82%。
实施例2、制备几丁质和壳聚糖
一、制备几丁质
1.取50g灵芝粉碎后,加水,在60℃下提取4次后的残渣,干燥,高速粉碎机粉碎至粉末状,100目过筛。
2.脱除蛋白质
取上述粉碎过筛后的原料50.0g(干重),加入浓度为5%的NaOH溶液1000ml,加热搅拌使其混合均匀,加热至100℃,反应4小时后,过滤除去碱液,并将所得过滤物用适量蒸馏水冲洗,直至冲洗后的蒸馏水为中性,获得的过滤物为几丁质粗品。
3.氧化脱色
将几丁质粗品分散在10倍水中后用NaOH调pH至10,加入一定量30%过氧化氢水溶液使反应体系中过氧化氢浓度为6%,缓慢搅拌,40℃脱色1小时,过滤,将过滤物洗净后,同上方法,再进行一次脱色,过滤,将过滤物水洗至中性,冷冻干燥得本发明提供的几丁质15.2g,其红外图谱与图1无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
二、制备壳聚糖
1.脱乙酰反应
将前述所得几丁质15.0g,加入150ml 60%的NaOH溶液,90℃下回流反应5小时,过滤除去碱液。将过滤物用适量蒸馏水冲洗至冲洗液呈中性,再次加入150ml 60%的NaOH溶液进行反应,将滤出物用蒸馏水充分清洗至中性,冷冻干燥得壳聚糖粗品3.7g。
2.纯化壳聚糖粗品
将步骤1所得壳聚糖粗品3.7g加入740ml 5%的乙酸,60℃下回流萃取3小时,过滤,滤液用NaOH调节pH值至10,沉淀析出,收集沉淀物,蒸馏水洗至中性,冷冻干燥后得壳聚糖0.3g,得率为0.3g/50g残渣,其红外图谱与图2无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
将该壳聚糖产物按照前述方法测定脱乙酰度,其中,所得该壳聚糖产物的吸光度值与波长关系曲线,如图6中曲线b所示,该曲线b相关数据如表1所示;经测定及计算,该壳聚糖产物的脱乙酰度为97.67%。
实施例3、制备几丁质和壳聚糖
一、制备几丁质
1.取50g灵芝粉碎后,加水,在100℃下提取2次后的残渣,干燥,高速粉碎机粉碎至粉末状,100目过筛。
2.脱除蛋白质
取上述粉碎过筛的原料50.0g(干重),加入浓度为12%的NaOH溶液750ml,加热搅拌使其混合均匀,加热至70℃,反应2小时后,过滤除去碱液,并将所得过滤物用适量蒸馏水冲洗,直至冲洗后的蒸馏水为中性,获得的过滤物为几丁质粗品。
3.氧化脱色
将几丁质粗品分散在10倍水中后用NaOH溶液调节pH值至10,加入一定量30%过氧化氢水溶液使反应体系中过氧化氢浓度为3%,缓慢搅拌,脱色1小时,过滤,将过滤物洗净,同上方法,再进行一次脱色,过滤,将过滤物水洗至中性,冷冻干燥得本发明提供的几丁质8.0g,红外图谱与图1无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
二、制备壳聚糖
1.脱乙酰反应
将前述所得几丁质8.0g,加入160ml 55%的NaOH溶液,70℃回流反应6小时,过滤除去碱液。将过滤物用适量蒸馏水冲洗至冲洗液呈中性,再次加入160ml 55%的NaOH溶液进行反应,将滤出物用蒸馏水充分清洗至中性,冷冻干燥得壳聚糖粗品1.2g。
2.纯化壳聚糖粗品
将步骤1所得壳聚糖粗品1.2g中加入150ml 10%的乙酸,室温下下搅拌萃取1小时,过滤,滤液用NaOH调节pH值至10,沉淀析出,收集沉淀物,蒸馏水洗至中性,冷冻干燥后得壳聚糖0.8g,得率为0.8g/50g残渣,其红外图谱与图1无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
将该壳聚糖产物按照前述方法测定脱乙酰度,其中,所得该壳聚糖产物的吸光度值与波长关系曲线,如图6中曲线c所示,该曲线c相关数据如表1所示;经测定及计算,该壳聚糖产物的脱乙酰度为98.68%。
实施例4制备几丁质和壳聚糖
一、制备几丁质
1.取50g灵芝粉碎后,加水,在90℃下提取3次后的残渣,干燥,高速粉碎机粉碎至粉末状,80目过筛。
2.脱除蛋白质
取上述粉碎过筛后的原料50.0g(干重),加入浓度为8%的NaOH溶液1000ml,加热搅拌使其混合均匀,加热至100℃,反应2小时,过滤除去碱液,并将所得过滤物用适量蒸馏水冲洗,直至冲洗后的蒸馏水为中性,获得的过滤物为几丁质粗品。
3.氧化脱色
将几丁质粗品分散在10倍水中用NaOH调pH至10,加入一定量30%过氧化氢水溶液使反应体系中过氧化氢浓度为6%,缓慢搅拌,40℃脱色2小时,过滤,将过滤物水洗至中性,冷冻干燥得本发明提供的几丁质13.5g,红外图谱与图1无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
二、制备壳聚糖
1.脱乙酰反应
将前述所得几丁质10.0g,加入300ml 40%的KOH溶液,110℃回流反应2小时,过滤除去碱液。将滤出物用蒸馏水充分清洗至中性,冷冻干燥得壳聚糖粗品1.1g。
2.纯化壳聚糖粗品
将步骤1所得壳聚糖粗品1.1g加入330ml 20%的乙酸,100℃回流萃取1小时,过滤,滤液用NaOH溶液调节pH值至10,沉淀析出,收集沉淀物,蒸馏水洗至中性,冷冻干燥后得壳聚糖0.3g,得率为0.3g/50g残渣,其红外图谱与图2无实质性差别,表明结构正确,不在熬述。
将该壳聚糖产物按照前述方法测定脱乙酰度,其中,所得该壳聚糖产物的吸光度值与波长关系曲线,如图6中曲线d所示,该曲线d相关数据如表1所示;经测定及计算,该壳聚糖产物的脱乙酰度为97.71%。
表1 图6中曲线a-d相关数据列表
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
A200 0.01 0.239 0.032 0.212
A201 0.009 0.23 0.029 0.202
A202 0.007 0.221 0.027 0.194
A203 0.006 0.212 0.025 0.185
K -0.0014 -0.009 -0.0023 -0.0089
C(ug/ml) 0.37 0.73 0.414 0.72
CO(ug/ml 25 25 25 25
DD% 98.82 97.67 98.68 97.71
Claims (2)
1.一种制备几丁质的方法,包括如下步骤:
1)以灵芝为原料,粉碎后,加水,将在60-100℃下提取1-4次后的残渣烘干,粉碎后过筛,得到用于提取几丁质的原料;
2)脱除蛋白质,得到几丁质粗品;
3)在pH值为6-11的条件下,将所述几丁质粗品分散于水中,加入氧化剂进行氧化脱色,得到所述几丁质;
所述步骤1)中,所述过筛步骤是将所述残渣过筛至40-300目;水的加入量为粉碎后灵芝干重的10-20倍;
所述步骤2)中,脱除蛋白质步骤所用的脱除剂选自NaOH水溶液和KOH水溶液中的至少一种;所述NaOH水溶液和KOH水溶液的质量百分浓度均为5-12%;所述脱除剂与所述用于提取几丁质的原料干重的比例为5-15ml∶1g;用NaOH水溶液和KOH水溶液中的至少一种脱除蛋白质时,脱除的温度为70-100℃,脱除的时间为1-8小时;
所述步骤3)中,所述氧化剂为质量百分浓度为30%的过氧化氢水溶液;水的用量为所述几丁质粗品干重的5-20倍;加入过氧化氢水溶液后,过氧化氢占过氧化氢、水和几丁质粗品总重的质量百分浓度为3-10%;氧化脱色的次数为1-3次;氧化脱色的时间为20分钟-2小时。
2.根据权利要求1的方法,所述脱除剂与所述用于提取几丁质的原料干重的比例为10ml∶1g。
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