CN108017724B - 一种植物源性壳聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物源性壳聚糖的制备方法，该方法为：(1)取灵芝孢子粉中加入去离子水，水浴超声提取，离心，加入乙醇、超声处理，再离心，加入去离子水，浸泡，离心，烘干，得到粗料几丁质；(2)将粗料几丁质置于H2O2溶液中，置于水浴中，用NaOH溶液调节至中性，离心，加入碱溶液,水浴处理，用HCl溶液调节至中性，烘干，得到壳聚糖粗品。该方法以灵芝孢子粉为原材料，以低浓度的化学溶剂、低温度反应条件、快捷方便的将灵芝孢子粉转化为壳聚糖，适用于规模化生产。该方法制得的壳聚糖性质稳定，提高了资源综合利用价值，降低了壳聚糖生产成本，减少了环境污染，具有优异的生物特性與有效提供一种新的植物性壳聚糖，拓宽了壳聚糖原料来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖领域，特别涉及一种植物源性壳聚糖的制备方法。
背景技术
几丁质是一种壳聚糖的前躯物，是地球上丰富存在的生物高分子，仅次于纤维素，广泛存在于海洋甲壳动物、浮游生物、昆虫外骨骼、海藻和真菌。据《自然》2015年第524卷发表的文章称，全球每年的几丁质生物合成量达1000亿吨。但是由于几丁质很难溶解于一般的溶液中，所以往往需要复杂制备步骤，阻碍了广泛应用的可行性。另一方面，由于海鲜类的腐烂与变质特性，造成几丁质制备步骤大量使用化学溶剂与添加物，同时也造成制备的成本与繁琐工艺的限制。壳聚糖是几丁质的一种衍生物，可由几丁质经过去乙酰化处理后获得。由于其具有良好的生物相容性、可降解性及无毒等特点而被广泛应用于医药、生物组织工程、食品、保健品、化妆品等众多领域。
目前商品化的壳聚糖几乎都是从海鲜类的副产品，像是：虾、蟹壳等海产品的下脚料中获得，不同程度的存在腐坏、金属残留、致过敏污染物等残留问题。同时，据相关报道称目前工业上生产壳聚糖的一般都是以虾壳为原料，原料来源与品质的不一致性需要利用大量的化学反应与制备步骤。例如：原料需先经过切片，再以浓度为40％的氢氧化钠溶液处理，搭配高温处理70-160℃去除无机盐与碳酸钙，使之完成去乙酰化转化为壳聚糖。习知制备方法中，存在大量使用强酸与强硷，造成环境与水质的严重污染，而其海鲜类的物质腐化产生恶臭的环境。另一方面，随着全球医学与生技的蓬勃发展，高品质的壳聚糖及其制品的应用需求大幅增加，寻找一种新的壳聚糖与其生产方式刻不容缓。因此，探寻新的壳聚糖制备方法及原料来源，除了一方面能杜绝目前工业生产壳聚糖造成的资源浪费、环境污染等问题；另一方面能开拓高品质壳聚糖的新来源，满足市场对壳聚糖与日俱增的需求。
近年来，灵芝孢子粉以被广泛于中国、日本、韩国与台弯等地，作为日常保健品服用。已有研究显示灵芝孢子粉具有的细胞壁所含几丁质的比例很高，导致直接口服灵芝孢子粉的几丁质在人体中难以消化，容易引起便秘与消化负担等不良反应。因此，将灵芝孢子粉提取多糖后的残渣转化为壳聚糖，既提高了灵芝多糖的疗效避免了口服灵芝孢子粉引起的不良反应，又可将副产物转化为有用物质，同时还拓宽了高品质壳聚糖的来源。
目前，壳聚糖的规模化生产都是利用海鲜类的副产品为原料，在高浓度强碱、强酸、高温下完成几丁质的去乙酰化而实现壳聚糖，存在腐坏、耗时、废液、恶臭与污染环境等弊端。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种植物源性壳聚糖的制备方法，该方法高效、环保、低成本、充分利用副产物，适于规模化生产。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种植物源性壳聚糖的制备方法，本发明中所使用的各名词定义如下：
几丁质：指灵芝孢子粉经提取多糖、三萜和蛋白后剩余的残渣；
壳聚糖：指几丁质经热化学去乙酰化后的产物。
该方法包括如下步骤：
(1)取干燥的灵芝孢子粉按料液比1：15-30(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45-65℃下水浴超声提取1-6次灵芝多糖后再离心去除上清液得一次沉淀物；按料液比1:15-30(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温下超声处理1-3h，再离心得二次沉淀物；按料液比1：30-50(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25-45℃下浸泡1-3h，离心，得三次沉淀物，烘干，得到粗料几丁质；
(2)将粗料几丁质置于30wt％H2O2溶液中，以料液比1:10-20(g:ml)混合，置于50-70℃下水浴维持1-3h，使粗料几丁质完成脱色，用1wt％NaOH溶液调节脱色后的几丁质溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物；
(3)向步骤(2)离心得的沉淀物中按料液比为1：10-30(g：ml)加入碱溶液,70-95℃下水浴处理混合液完成去乙酰化反应，用1mol/L HCl溶液调节溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物，烘干，得到壳聚糖粗品。
进一步的，离心处理参数是7000-10000rpm，5-15min。
进一步的，所述步骤(1)中超声处理的功率为100-300W、频率为40kHz。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(3)中烘干的温度范围是55-65℃。
进一步的，所述碱溶液为为NaOH溶液或KOH溶液，其浓度为10wt％-50wt％。
进一步的，所述步骤(3)中所用水浴处理时间为：4-8h。
进一步的，所述灵芝孢子粉的粒径为粒径范围为100纳米至30微米。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.与传统的从虾、蟹外壳中提取几丁质相比，植物性灵芝孢子粉含有丰富的几丁质与较低蛋白质，不需要盐酸脱钙，不容易腐坏与产生恶臭，减少了酸液的排放；本发明以灵芝孢子粉为起始原料，有利于高效环保，并制备高品质植物性壳聚糖。
2.与传统的从虾、蟹外壳中提取壳聚糖相比，本发明以灵芝孢子粉为起始原料，省去了单独的去矿质元素和脱蛋白过程，降低了强酸强碱的使用量，缩短了反应时间，提高了转化速率、降低了生产成本、保护了环境；
3.利用提取多糖后灵芝孢子粉残渣为原料，实现了副产物的再利用；
4.本发明原料为植物性食用灵芝孢子粉，粒径约为1-8微米，含有丰富的几丁质与高比表面积，不需要切片与其他工艺，有效降低所需的原料准备与制备步骤。
附图说明
图1是市售壳聚糖与本发明壳聚糖红外图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：15(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45℃下水浴超声(100W)提取1次灵芝多糖后以7000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：15(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理1h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25℃下浸泡3h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，55℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 10ml，与70℃下水浴锅中恒温1h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)分别按料液比几丁质(g)：NaOH(ml)＝1:(10、15、20、25、30)向沉淀物加入10wt％NaOH溶液，70℃下处理8h。结束后，用1mol/l的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm下离心15min，收集沉淀物，55℃下干燥至恒重；
(4)去乙酰度的测定：用甲基橙、苯胺蓝作指示剂，采用酸碱滴定法测定制备所得壳聚糖的去乙酰度，步骤如下：
准确称取烘干至恒重的样品0.3～0.5g壳聚糖样品，置于250ml三角瓶中，加入0.1mol/l的HCl标准溶液30ml，在20～25℃下搅拌至溶解完全(若粘度太大可加适量蒸馏水稀释)，加入2～3滴混合指示剂(1wt％)甲基橙+(1wt％)苯胺蓝(1:2,v/v)，用0.1mol/lNaOH标准溶液滴定游离盐酸；
去乙酰度计算公式如下：
自由氨基含量(-NH2)％＝[(C1V1-C2V2)×0.016/G]×100％
去乙酰度(DD％)＝(-NH2/9.94)×100％
C1:盐酸标准溶液浓度，mol/l
C2：氢氧化钠标准溶液浓度，mol/l
V1：加入盐酸标准溶液的体积，ml。
V2：加入氢氧化钠标准溶液的体积，ml
G：样品重，g
0.016：与1ml浓度为1mol/l盐酸溶液相当的氨基量，g
9.94：理论氨基含量，％
(5)、FT-IR测定市售壳聚糖与制备得到壳聚糖的红外图谱，以确定该方法制备所得产物是否为壳聚糖。对比市售壳聚糖与制备得到壳聚糖的红外图谱，可确定该方法制备所得产物为壳聚糖，见图1。根据滴定法对终产物的去乙酰度进行测定，结果显示，去乙酰度分别是56.8％、67.2％、63.5％、66.4％、60.4％。结果说明，料液比对壳聚糖的去乙酰度有明显影响。料液比从1:10(g:ml)增加到1:15(g:ml)，产物去乙酰度从56.8％增加到67.2％，但产物去乙酰度却随料液比的继续增加呈先降低再升高的趋势，这说明一定范围内增加料液比可促进去乙酰化过程的进行。
实施例2：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：25(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在55℃下水浴超声(150W)提取3次灵芝多糖后以10000rpm离心5min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：25(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理2h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：40(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，35℃下浸泡2h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，60℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 20ml，与60℃下水浴锅中恒温2h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，10000rpm离心5min，收集沉淀物。
(3)按料液比几丁质(g)：NaOH(ml)＝1:15，分别向沉淀物加入浓度为10、20、30、40、50wt％的NaOH溶液，80℃下处理5h。结束后，用1mol/l的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，10000rpm下离心5min，收集沉淀物，65℃下干燥至恒重；
(4)采用酸碱滴定法测定产物的去乙酰度。结果显示，去乙酰度分别是72.9％、73.2％、73.5％、75.3％、84.1％。结果说明，不同浓度的NaOH溶液对去乙酰化过程有明显影响，浓度增加可促进去乙酰化进程有助于几丁质转化为壳聚糖。但过高的碱溶液，则需要更多的酸溶液才能调节pH至中性，对环境及操作人员的负担相应增加，所以需要根据实际情况综合考虑选择碱溶液的浓度。
实施例3：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：25(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在65℃下水浴超声(200W)提取5次灵芝多糖后以8000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：25(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理3h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：50(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，45℃下浸泡1h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，60℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 30ml，与50℃下水浴锅中恒温3h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比几丁质(g)：NaOH(ml)＝1:15，向沉淀物加入浓度为50wt％NaOH溶液，分别在70、80、85、90、95℃下处理4h。结束后，用1mol/l的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm下离心15min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重；
(4)采用酸碱滴定法测定产物的去乙酰度。结果显示，去乙酰度分别是67.2％、69.7％、77.6％、82.9％、86.8％。结果说明，温度对产物去乙酰度有显著影响，温度升高有助于去乙酰化过程的进行，可能原因是温度增加可促进分子间运动，有助于碱溶液到达反应位点。
实施例4：
(1)取干燥的灵芝孢子粉1g，按料液比1：30(g:ml)向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45℃下水浴超声(250W)提取1次灵芝多糖后以7000rpm离心10min去除上清液得一次沉淀物；按料液比1：15(g:ml)向一次沉淀物加入95v/v％的乙醇、在室温(25℃±1℃)下超声处理1h去除三萜类化合物，再以相同条件离心得二次沉淀物；按料液比1：30(g:ml)向二次沉淀物加入去离子水，25℃下浸泡3h以去除水溶性蛋白，以相同离心后将所得三次沉淀物，55℃烘干，得到粗料几丁质；
(2)取粗料几丁质1g，加30％H2O2 10ml，与70℃下水浴锅中恒温1h。加1wt％的NaOH溶液调节pH至中性，7000rpm离心10min，收集沉淀物。
(3)按料液比几丁质(g)：NaOH(ml)＝1:15，向沉淀物加入浓度为的30wt％的NaOH溶液，在95℃下分别处4、5、6、7、8h。结束后，用1mol/l的HCl溶液调节混合溶液的pH值至中性，静置过夜，7000rpm下离心15min，收集沉淀物，60℃下干燥至恒重；采用酸碱滴定法测定产物的去乙酰度。结果显示，该产物为壳聚糖，去乙酰度分别是77.6％、79.0％、82.0％、83.4％、86.8％。结果说明，增加去乙酰化反应时间可促进去乙酰化进程的进行，获得更高去乙酰度的壳聚糖。但据已有研究报道，过高的温度会导致壳聚糖分子解聚的增加，所以温度不宜太过，需结合实际情况选择。
Claims (1)
1.一种植物源性壳聚糖的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）取干燥的灵芝孢子粉按料液比1：15-30（g:ml）向灵芝孢子粉中加入去离子水，在45-65℃下水浴超声提取1-6次灵芝多糖后再离心去除上清液得一次沉淀物；按料液比1:15-30（g:ml）向一次沉淀物加入95 v/v%的乙醇、在室温下超声处理1-3h，再离心得二次沉淀物；按料液比1：30-50（g:ml）向二次沉淀物加入去离子水，25-45℃下浸泡1-3h，离心，得三次沉淀物，烘干，得到粗料几丁质；
（2）将粗料几丁质置于30 wt% H2O2溶液中，以料液比1:10-20（g:ml）混合，置于50-70℃下水浴维持1-3h，使粗料几丁质完成脱色，用1wt% NaOH溶液调节脱色后的几丁质溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物；
（3）向步骤（2）离心得的沉淀物中按料液比为1：10-30（g ：ml）加入碱溶液, 70-95℃下水浴处理混合液完成去乙酰化反应，用1 mol/L HCl溶液调节溶液的pH值至中性，然后离心得沉淀物，烘干，得到壳聚糖粗品；
离心处理参数是7000-10000rpm，5-15min；
步骤（1）中超声处理的功率为100-300W、频率为40kHz；
步骤（1）和步骤（3）中烘干的温度范围是55-65℃；
碱溶液为为NaOH溶液或KOH溶液，其浓度为10 wt%-50 wt%；
步骤（3）中所用水浴处理时间为：4-8h；
所述灵芝孢子粉的粒径为粒径范围为100纳米至30微米的。
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