CN111393541A - 一种壳聚糖的酶法精制工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖的酶法精制工艺，属于壳聚糖精制技术领域。该方法是向粗品壳聚糖中加入角蛋白酶进行酶法精制，得到蛋白质含量低于0.2％的精制壳聚糖；所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.1∶1～1.2∶1；所述酶解反应的pH值为10～12；所述酶解反应时间为3～9h。本发明通过优化酶解反应温度、pH值、加酶量和反应时间，提高酶解效率，大大降低了粗品壳聚糖中蛋白质的含量，提高了壳聚糖的抗氧化性。采用特异性角蛋白酶去除壳聚糖中的蛋白质，去除率高。并且酶法反应条件温和，不会对壳聚糖的主链结构有任何影响及改变，也不易对环境造成污染，具有非常好的实用性。

Description

一种壳聚糖的酶法精制工艺
技术领域
本发明属于壳聚糖精制技术领域，具体涉及一种壳聚糖的酶法精制工艺。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)的化学名称为(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，又称为脱乙酰甲壳素，是甲壳素的脱乙酰产物，而甲壳素为自然界中含量仅次于纤维素的第二大天然高分子物质，广泛存在于低等节肢体、甲壳类动物(如虾、蟹、甲壳昆虫)以及低等植物(如藻类、菌类)的细胞壁中，年产量超过100亿吨。因此，壳聚糖来源广泛，且在自然界中含量丰富，还是目前已知唯一的天然碱性阳离子聚合物，生产集中主要在欧美地区部分国家、日本、印度，而我国生产企业主要集中在沿海，规模较小。
粗品壳聚糖中粗蛋白含量较高，大大降低了其抗氧化能力，应用范围受到限制。传统的方法脱除蛋白质和脂质主要采用化学法，Percot A等分析了酸碱法脱蛋白质的动力学过程，优化了提取方法，用0.25mol/L HCl溶液处理15min，1mol/L的NaOH溶液70℃处理24h，所得产品纯度较高。Nguyen Van Toan等先用0.016mol/L苯甲酸进行预处理，再用0.62mol/L的NaOH溶液脱除蛋白质和脂质，研究发现苯甲酸不仅可以有效水解角质蛋白，而且可以减少酸碱的用量。但该法对环境存在污染，而且有机酸一般比较贵。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖的酶法精制工艺，该方法通过优化酶解反应条件，提高酶解效率，大大降低了粗品壳聚糖中蛋白质的含量，提高了粗品壳聚糖的抗氧化性。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种壳聚糖的酶法精制工艺，向粗品壳聚糖中加入角蛋白酶进行酶法精制，得到蛋白质含量低于0.2％的精制壳聚糖。具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液pH值达到设定值时停止加入碱液；
(2)将步骤(1)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度后加入角蛋白酶，继续搅拌反应；反应结束后酶解液经过后处理得到精制壳聚糖。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，预处理粗品壳聚糖：向粗品壳聚糖中加入苯甲酸，在室温下搅拌溶解0.5～1h；然后向溶液中加入碱液进行中和，搅拌反应1～2h后进行过滤，过滤后的固体物质进入酶法精制过程；所述粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.5～1∶2；所述中和反应过程中碱液的加入量为苯甲酸用量的1.2～1.5倍。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.1∶1～1.2∶1，酶解反应的pH值为10～12，酶解反应时间为3～9h，反应温度为20～100℃。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，所述碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵或它们的任意组合；所述碱液的浓度为5％～15％。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，所述表面活性剂为曲拉通-100，表面活性剂的用量与壳聚糖的质量比为0.2∶1～0.5∶1。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，对酶解液水洗2～3遍后进行喷雾干燥，得到精制壳聚糖；所述喷雾干燥的进风口温度为130～150℃，出风口温度为50～70℃。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.15∶1～1.18∶1。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入苯甲酸，在室温下搅拌溶解0.5～1h；所述粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.5～1∶2；
(2)向步骤(1)的溶液中加入碱液进行中和，搅拌反应1～2h后进行过滤；所述中和反应过程中碱液的加入量为苯甲酸用量的1.2～1.5倍。
(3)向过滤后的固体物质中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到10～12时停止加入碱液；
(4)将步骤(3)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度20～100℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应3～9h；反应结束后进入步骤(5)；所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.1∶1～1.2∶1；
(5)对酶解液水洗2～3遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；所述喷雾干燥的进风口温度为130～150℃，出风口温度为50～70℃。
所述的壳聚糖的酶法精制工艺，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.17∶1，酶解反应的pH值为11，酶解反应时间为6h，反应温度70℃。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明通过优化酶解反应温度、pH值、加酶量和反应时间，提高酶解效率，大大降低了粗品壳聚糖中蛋白质的含量，提高了粗品壳聚糖的纯度。
(2)酶法去除壳聚糖中的蛋白质，去除率较高。并且酶法反应条件温和，不会对壳聚糖的主链结构有任何影响及改变，也不易对环境造成污染，具有非常好的实用性。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明壳聚糖中蛋白质含量的检测方法参考《壳聚糖中蛋白质含量的测定方法的研究》(韩婷，史国华，李素哲等，中国医疗器械杂质(监管与测试)，2016，40(2)，122-124)。检测原料粗品壳聚糖中蛋白质的含量为5％。
实施例1
一种壳聚糖的酶法精制工艺，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到11时停止加入氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为10％；
(2)将步骤(1)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度80℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应6h；反应结束后进入步骤(3)；角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量的质量比为1.17∶1；
(5)对酶解液水洗2遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；喷雾干燥的进风口温度为140℃，出风口温度为60℃。
对水洗后的酶解液参照上述方法进行蛋白质含量的检测，检测到精制后的壳聚糖中蛋白质含量为0.19％。
实施例2
一种壳聚糖的酶法精制工艺，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入苯甲中，在室温下搅拌溶解0.8h；粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.7；
(2)向步骤(1)的溶液中加入氢氧化钠溶液进行中和，搅拌反应1.5h后进行过滤；中和反应过程中氢氧化钠溶液的加入量为苯甲酸用量的1.5倍，氢氧化钠溶液的浓度为10％；
(3)向过滤后的固体物质中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到10时停止加入碱液；
(4)将步骤(3)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度33℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应4h；反应结束后进入步骤(5)；角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量的质量比为1.1∶1；
(5)对酶解液水洗3遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；喷雾干燥的进风口温度为140℃，出风口温度为60℃。
对水洗后的酶解液参照上述方法进行蛋白质含量的检测，检测到精制后的壳聚糖中蛋白质含量为0.15％。
实施例3
一种壳聚糖的酶法精制工艺，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入苯甲中，在室温下搅拌溶解0.8h；粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.7；
(2)向步骤(1)的溶液中加入氢氧化钠溶液进行中和，搅拌反应1.5h后进行过滤；中和反应过程中氢氧化钠溶液的加入量为苯甲酸用量的1.5倍。
(3)向过滤后的固体物质中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到11时停止加入氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为10％；
(4)将步骤(3)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度70℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应6h；反应结束后进入步骤(5)；角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量的质量比为1.17∶1；
(5)对酶解液水洗3遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；喷雾干燥的进风口温度为140℃，出风口温度为60℃。
对水洗后的酶解液参照上述方法进行蛋白质含量的检测，检测到精制后的壳聚糖中蛋白质含量为0.09％。
实施例4
一种壳聚糖的酶法精制工艺，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入苯甲中，在室温下搅拌溶解0.8h；粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.7；
(2)向步骤(1)的溶液中加入氢氧化钠溶液进行中和，搅拌反应1.5h后进行过滤；中和反应过程中氢氧化钠溶液的加入量为苯甲酸用量的1.5倍。
(3)向过滤后的固体物质中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到12时停止加入氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液的浓度为10％；
(4)将步骤(3)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度90℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应9h；反应结束后进入步骤(5)；角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量的质量比为1.2∶1；
(5)对酶解液水洗3遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；所述喷雾干燥的进风口温度为140℃，出风口温度为60℃。
对水洗后的酶解液参照上述方法进行蛋白质含量的检测，检测到精制后的壳聚糖中蛋白质含量为0.12％。
通过以上实施结果可知：首先采用特异性角蛋白酶可以有效去除粗品壳聚糖中的蛋白质，使精制壳聚糖中的蛋白质符合标准含量，同时提高了壳聚糖的抗氧化性，夸大壳聚糖的应用范围；另外从实施例2～4实验结果可以知道，酶法精制过程中加酶量、反应温度、反应时间和溶液pH值均为结果产生影响，实施例3中的实验结果为最佳，可以作为酶法精制过程中优化后的最佳反应条件。
综上所述，本发明通过优化酶解反应温度、pH值、加酶量和反应时间，提高酶解效率，大大降低了粗品壳聚糖中蛋白质的含量，提高了粗品壳聚糖的纯度。酶法去除壳聚糖中的蛋白质，去除率较高。并且酶法反应条件温和，不会对壳聚糖的主链结构有任何影响及改变，也不易对环境造成污染，具有非常好的实用性。

Claims (10)

1.一种壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，向粗品壳聚糖中加入角蛋白酶进行酶法精制，得到蛋白质含量低于0.2％的精制壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液pH值达到设定值时停止加入碱液；
(2)将步骤(1)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度后加入角蛋白酶，继续搅拌反应；反应结束后酶解液经过后处理得到精制壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，预处理粗品壳聚糖：向粗品壳聚糖中加入苯甲酸，在室温下搅拌溶解0.5～1h；然后向溶液中加入碱液进行中和，搅拌反应1～2h后进行过滤，过滤后的固体物质进入酶法精制过程；所述粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.5～1∶2；所述中和反应过程中碱液的加入量为苯甲酸用量的1.2～1.5倍。
4.根据权利要求1或2所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.1∶1～1.2∶1，酶解反应的pH值为10～12，酶解反应时间为3～9h，反应温度为20～100℃。
5.根据权利要求2或3所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，所述碱液为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵或它们的任意组合；所述碱液的浓度为5％～15％。
6.根据权利要求2或3所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，所述表面活性剂为曲拉通-100，表面活性剂的用量与壳聚糖的质量比为0.2∶1～0.5∶1。
7.根据权利要求2或3所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，对酶解液水洗2～3遍后进行喷雾干燥，得到精制壳聚糖；所述喷雾干燥的进风口温度为130～150℃，出风口温度为50～70℃。
8.根据权利要求2或3所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.15∶1～1.18∶1。
9.根据权利要求1或2所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)向粗品壳聚糖中加入苯甲酸，在室温下搅拌溶解0.5～1h；所述粗品壳聚糖与苯甲酸的用量比为1∶1.5～1∶2；
(2)向步骤(1)的溶液中加入碱液进行中和，搅拌反应1～2h后进行过滤；所述中和反应过程中碱液的加入量为苯甲酸用量的1.2～1.5倍。
(3)向过滤后的固体物质中加入表面活性剂，然后缓慢加入碱液，加入碱液的过程中不断搅拌，直到溶液的pH值达到10～12时停止加入碱液；
(4)将步骤(3)中的溶液放入黑暗环境中，采用微波辅助加热，加热到反应温度20～100℃后加入角蛋白酶，继续搅拌反应3～9h；反应结束后进入步骤(5)；所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.1∶1～1.2∶1；
(5)对酶解液水洗2～3遍，然后进行喷雾干燥，得到固体精制壳聚糖；所述喷雾干燥的进风口温度为130～150℃，出风口温度为50～70℃。
10.根据权利要求1或2所述的壳聚糖的酶法精制工艺，其特征在于，所述角蛋白酶的用量与壳聚糖中蛋白质含量比为1.17∶1，酶解反应的pH值为11，酶解反应时间为6h，反应温度为70℃。
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