KR101938200B1 - 바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용 방법 - Google Patents

바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오매스의 산/알칼리와 같은 화학 전처리 단계에서 발생되는 전처리 부산물인 폐수에 포함되어 있는 헤미셀룰로즈(hemicellulose)의 주성분을 이루고 있는 자일란(xylan)을 산 가수분해를 통해 모노머 형태의 자일로스로 회수하는 방법 및 상기 회수된 자일로스를 발효시켜 에탄올 또는 자일리톨(xylitol)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 바이오매스를 이용한 바이오에너지 및 바이오리파이너리 생산 공정에서 발생되는 산/알칼리 처리 폐액 내에서 자일로스 성분을 분리하여 에탄올 또는 자일리톨과 같은 바이오리파이너리 제품의 재생산을 위한 당을 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 산/알칼리 처리 부산물 및 산/알칼리 처리 용액의 재사용을 통해 폐수처리 비용 또는 폐기물 처리 비용 저감을 통해 환경 부담 비율을 줄일 수 있으며, 자일로스와 같은 고가의 자일로스 유래의 당 알콜 생산을 통해 바이오매스 유래의 에탄올 및 바이오리파이너리 화학 제품 생산 단가를 저감시킬 수 있다.

Description

바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용 방법{Novel Method for Recovery of Xylose from Byproducts Generated in Biomass-Pretreatment Processes and Use Thereof}
본 발명은 바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스의 회수 및 이의 이용 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오매스의 산/알칼리와 같은 화학 전처리 단계에서 발생되는 전처리 부산물인 폐수에 포함되어 있는 헤미셀룰로즈(hemicellulose)의 주성분을 이루고 있는 자일란(xylan)을 산 가수분해를 통해 모노머 형태의 자일로스로 회수하는 방법 및 상기 회수된 자일로스를 발효시켜 에탄올 또는 자일리톨(xylitol)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 초본계(herbaceous biomass)와 목질계(woody biomass)의 바이오매스는 100g 건조 중량당 30-40% 셀룰로즈, 20-25% 헤미셀룰로즈, 25-30% 리그린을 포함하고 있다. 따라서 에탄올 및 바이오-화학(biorefinery) 제품 생산을 위한 공정에서 셀룰레이즈(cellulase)와 효모 또는 박테리아를 이용한 효소 당화 발효 과정 시, 리그닌과 강하게 결합하고 있는 셀룰로즈 및 헤미셀룰로즈의 해리를 위해 물리적, 화학적, 생물학적 전처리 과정을 통해 바이오매스 조직을 이완시키는 과정을 수행하게 된다 (Mosier et al ., Bioresour . Technol ., 96:673, 2005; Agbor et al., Biotechnol . Adv ., 29:675, 2011). 전처리 과정은 바이오매스를 구성하는 3 성분 중에서 헤미셀룰로즈와 리그닌의 제거를 통해, 건조 단위 중량당 셀룰로즈의 함량을 증가시킬 뿐 아니라, 바이오매스의 조직의 이완 및 폴리머 형태의 셀룰로즈에 섬유소 분해 효소인 셀룰레이즈(cellulase) 효소의 접근성을 용이하게 하여, 셀룰로즈의 포도당으로 전환을 촉진하는데 그 목적이 있다 (Mosier et al ., Bioresour. Technol ., 96:673, 2005).
바이오매스의 특성에 따라 물리, 화학적인 다양한 방법이 사용되고 있으며 (Agbor et al ., Biotechnol . Adv ., 29:675, 2011), 일반적으로 화학적 방법은 산 처리시 헤미셀룰로즈를, 알칼리 처리의 경우 리그닌 제거가 뛰어나다고 알려져 있다 (Mosier et al., Bioresour. Technol., 96:673, 2005; Agbor et al., Biotechnol. Adv ., 29:675, 2011). 이러한 전처리 과정은 바이오매스의 효율적인 당화(saccharification) 과정에 필수적인 공정으로 개별적 바이오매스와 적합한 전처리 과정에 따라 효소 당화과정에서 바이오매스로부터 전환되는 당의 함량이 결정된다(Mosier et al ., Bioresour . Technol ., 96:673, 2005; Yang and Wyman, Biofuels, Bioprod , Bioref ., 2:26, 2008; Kumar et al ., Ind . Eng . Chem . DOI:10.1021/ie801542g, 2009).
화학적 전처리 과정에서 산 전처리 공정은 황산, 염산, 인산 등의 강산 및 약산 등의 산이 이용되고 있으나, 실험적으로 초본계와 목질계 바이오매스에 황산 4% (w/v) 처리시 헤미셀룰로즈의 제거 효율이 뛰어나다고 알려져 있다(Kumar et al ., Ind. Eng . Chem . DOI:10.1021/ie801542g, 2009).화학적 전처리 공정에서는 셀룰로즈 성분이 증대된 바이오매스인 고상(solid phase)과 헤미셀룰로즈와 리그닌이 포함된 액상(liquid phase)의 폐수(waste water)가 각각 양산된다. 산을 이용한 약산-열수, 강산 전처리 시에는 액상은 헤미셀룰로즈의 주성분인 자일로스의 폴리머 형태인 자일란 또는 모노머 형태의 자일로스를 과량 포함하며, 알칼리 전처리의 경우, 일부 헤미셀룰로즈가 리그닌과 복합체 형태로 전처리 폐액에 용출된다고 알려져 있다 (Kumar et al ., Ind . Eng . Chem . DOI:10.1021/ie801542g, 2009;Carvalheiro et al ., J. Sci . Ind . Res ., 67:849, 2008). 산과 알칼리를 사용하는 화학적 전처리 공정에서 발생하는 폐액은 바이오매스로 부터 유리된 자일로스의 오탄당(pentose sugar)과 다양한 방향족 화합물(aromatic compound)을 포함하는 리그닌 계열의 폴리머로 구성되어 있어 고농도 COD(Chemical Oxygen Demand), TOC(Total Organic Carbon) 뿐 아니라 고형분 성분을 포함하는 산 또는 알칼리성 폐수라 할 수 있다.
이와 같은 바이오매스 전처리 공정상에서 발생하는 고농도의 폐수를 처리하기 위한 방법으로 혐기성 소화를 통한 폐수 처리, 폐수처리 시 발생하는 슬러지의 소화를 통한 바이오-가스로의 전환과 같은 대안적 방법 연구가 진행되고 있다(Yang and Wyman, Biofuels , Bioprod , Bioref ., 2:26, 2008). 리그노-셀룰로즈(lignocelluloses) 계열의 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산 및 바이오리파이너리 공정에서 전처리 과정과 공정상 발생하는 폐수 처리는 해당 제품의 생산비용의 약 20%를 차지하고 있는 분야이다 (Hinman et al ., Appl . Biochem . Biotechnol., 34/35:639, 1992; Humbird et al ., NREL Technical Report NREL/TP-5100-47764, 2011). 따라서 전처리 공정과 폐수처리 비용의 저감은 바이오매스 유래의 연료 및 화학전구체 생산 가격을 저감시키는데 결정적 역할을 한다고 할 수 있다.
본 발명과 관련된 본 발명자의 특허로 국내특허 출원번호 10-2011-0119175 “순차적 산/염기 전처리를 통해 셀룰로즈 함량이 증가된 팜 열매 껍질 섬유질 유래 바이오매스의 제조방법”이 있으며, 국내특허로는 공개특허공보 10-2008-0094647 “열대과일 바이오매스 부산물로부터의 활성탄 제조방법”, 공개특허공보 10-2010-0118865 “바이오매스 부산물을 이용한 친환경 바이오탄의 제조방법” 등이 있으며, 본 방법과 유사한 방법으로 자일로스 성분의 분획에 대한 국내 특허로는 출원번호 10-2007-0072682 “열대과일 바이오매스 부산물로부터 자일로스와 아라비노스를 포함하는 가수분해 당화액을 이용한 자일리톨의 제조방법”, 공개번호 10-2004-0018323 “크실로스의 회수방법”, 출원번호 10-2009-0060397 “리그노셀룰로오스계 바이오매스의 분별방법 및 분별장치”가 있다, 국제 특허로는 US patent application No. 12/648,483 (Pub. No. US2010/0167351) “Integrated methods for processing palm fruit bunches”, US patent No. 6,086,681 “method for recovery of xylose from solutions”이 있다. 하지만, 바이오매스 전처리 부산물로 부터 자일로스의 회수에 대한 사례는 보고된바 없다.
이에 본 발명자들은 바이오매스 전처리 부산물로부터 자일로스를 회수하기 위해 예의 노력한 결과, 바이오매스의 산/알칼리와 같은 화학 전처리 단계에서 발생되는 전처리 부산물인 폐수에 포함되어 있는 헤미셀룰로즈(hemicellulose)의 주성분을 이루고 있는 자일란(xylan)을 산 가수분해를 통해 모노머 형태의 자일로스로 회수하고 이를 사용해 에탄올 및 자일리톨이 생산되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 바이오매스 산 전처리 부산물 또는 알칼리 전처리 부산물로부터 자일로스의 분리 방법 및 이의 이용 방법에 관한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (a) 바이오매스를 산으로 처리하여 바이오매스와 산 처리 폐액을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 바이오매스를 물을 이용해 세척한 다음, 세척된 바이오매스와 세척액을 분리하는 단계; (c) (a) 단계에서 분리된 산처리 폐액 및 (b) 단계에서 분리된 세척액을 재사용하여 자일로스가 함유된 산처리 폐액 및 세척액을 회수하는 단계; (d) 상기 자일로스가 포함된 폐액 및 세척액을 칼슘이온으로 처리하여 폐액 및 세척액에 포함되어 있는 산을 칼슘염 형태로 침전시켜 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 산이 제거된 폐액 및 세척액에 포함되어 있는 발효 저해 물질을 활성탄을 이용하여 제거한 다음, 자일로스 성분을 포함하는 수용액을 회수하는 단계를 포함하는 바이오매스 산 처리 공정에서 발생하는 폐액에서 자일로스를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 바이오매스의 산 처리액에 내성을 가진 효모를 배양하여 에탄올을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 알코올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 산 처리액에 내성을 가진 효모를 배양하여 자일리톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 자일리톨을 회수하는 단계를 포함하는 자일리톨의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 바이오매스를 염기성 물질로 처리하여 알칼리 처리 공정을 거친 다음, 바이오매스와 알칼리 처리 폐액을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 알칼리 처리 폐액 내의 거대입자를 제거한 후, 분리-여과막을 사용하여 알칼리 처리 폐액에 포함되어 있는 리그닌 및 헤미셀룰로스를 농축 시키는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 리그닌 및 헤미셀룰로스 포함된 농축액을 산으로 처리하여 리그닌-헤미셀룰로스 복합체에서 자일란의 산 가수분해 과정을 통해 자일로스를 유리시키는 단계; (d) 상기 자일로스가 유리된 수용액을 칼슘이온으로 처리하여 폐액에 포함되어 있는 산 성분을 칼슘염으로 침전시켜 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 산 성분이 제거된 수용액에 포함되어 있는 발효 저해 물질을 활성탄을 이용하여 제거한 다음, 자일로스 성분을 포함하는 수용액을 회수하는 단계를 포함하는 바이오매스 알칼리 처리 공정에서 발생하는 폐액에서 자일로스를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 산 처리액에 내성을 가진 효모를 배양하여 자일리톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 자일리톨을 회수하는 단계를 포함하는 자일리톨의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 바이오매스를 이용한 바이오에너지 및 바이오리파이너리 생산 공정에서 발생되는 산/알칼리 처리 폐액 내에서 자일로스 성분을 분리하여 에탄올 또는 자일리톨과 같은 바이오리파이너리 제품의 재생산을 위한 당을 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 산/알칼리 처리 부산물 및 산/알칼리 처리 용액의 재사용을 통해 폐수처리 비용 또는 폐기물 처리 비용 저감을 통해 환경 부담 비율을 줄일 수 있으며, 자일로스와 같은 고가의 자일로스 유래의 당 알콜 생산을 통해 바이오매스 유래의 에탄올 및 바이오리파이너리 화학 제품 생산 단가를 저감시킬 수 있다.
도 1은 팜 열매 껍질 바이오매스의 헤미셀룰로즈 성분 제거를 위한 산 처리를 통한 전체적인 프로세스 및 이 과정으로 배출되는 폐액으로부터 자일로스 분리를 위한 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 팜 열매 껍질 바이오매스에 처리하는 산 농도에 따라 유리되는 자일로스 양의 변화(A)와 HPLC를 이용한 산 처리액 내에 존재하는 당 성분 분석 결과(B)를 나타낸 데이타이다.
도 3은 팜 열매 껍질 바이오매스 산 처리 폐액의 연속 재사용 회수에 따른 산-폐액과 바이오매스의 세척수 내에 증가되는 자일로스의 농도(A)와 미량 당 성분 및 발효 저해 물질인 산 가수분해 산물의 농도 변화(B)를 나타낸 데이타이다.
도 4는 발효 저해 물질을 제거하지 않은 산 처리 자일로스 용액에 대한 내성을 갖는 효모 캔디다 트로피칼리스의 연속-회분식 배양에 따른 세포 성장 양상(A)과 그에 따른 자일로스 이용(○) 및 생산되는 자일리톨의 양(●) (B)을 나타낸 데이타이다.
도 5는 발효 저해 물질을 제거하지 않은 산 처리 자일로스 용액에 대한 내성을 갖는 효모 피키아 스티피티스의 연속-회분식 배양에 따른 세포 성장 양상(A)과 그에 따른 자일로스 이용(○) 및 생산되는 에탄올의 양(●) (B)을 나타낸 데이타이다.
도 6은 발효 저해 물질을 제거하지 않은 산 처리 자일로스 용액에 내성 효모 피키아 스티피티스를 배양시켰을 때, 자일로스(◆) 및 포도당(●)의 농도 변화와 에탄올(■) 및 아세트산(▲) 생산량을 나타낸 데이타이다.
도 7은 발효 저해 물질을 제거하지 않은 산 처리 자일로스 용액에 내성 효모 캔디다 트로피칼리스를 배양시켰을 때, 자일로스(●)의 농도 변화와 자일리톨(■) 생산량을 나타낸 데이타이다.
도 8은 거대억새 바이오매스의 리그닌/헤미셀룰로즈 성분 제거를 위한 알칼리-열처리를 통한 전체적인 프로세스 및 이 과정으로 배출되는 폐액으로부터 자일로스 분리를 위한 공정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 알칼리 폐액에서의 황산 농도에 따른 산 가수 분해되는 자일로스의 농도 변화(A)와 유기산 분석 컬럼과 HPLC를 이용한 산-가수분해 전,후의 알칼리 폐액 내의 당성분을 분석한 HPLC 크로마토그램(B)을 나타낸 데이타이다.
도 10은 발효 저해 물질을 제거하지 않은 알칼리 처리 자일로스 용액에 내성 효모 캔디다 트로피칼리스를 배양시켰을 때, 자일로스(●)의 농도 변화와 자일리톨(■) 생산량을 나타낸 데이타이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일관점에서, (a) 바이오매스를 산으로 처리하여 바이오매스와 산 처리 폐액을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 바이오매스를 물을 이용해 세척한 다음, 세척된 바이오매스와 세척액을 분리하는 단계; (c) (a) 단계에서 분리된 산처리 폐액 및 (b) 단계에서 분리된 세척액을 재사용하여 자일로스가 함유된 산처리 폐액 및 세척액을 회수하는 단계; (d) 상기 자일로스가 포함된 폐액 및 세척액을 칼슘이온으로 처리하여 폐액 및 세척액에 포함되어 있는 산을 칼슘염 형태로 침전시켜 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 산이 제거된 폐액 및 세척액에 포함되어 있는 발효 저해 물질을 활성탄을 이용하여 제거한 다음, 자일로스 성분을 포함하는 수용액을 회수하는 단계를 포함하는 바이오매스 산 처리 공정에서 발생하는 폐액에서 자일로스를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 산 처리에 사용되는 바이오매스는 팜 열매 껍질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 처리하는 산은 황산, 염산, 인산 등의 강산 및 약산인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 (a) 단계는 0.1 내지 8.0%(v/v)의 황산을 처리하여, 100 내지 200℃로 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 팜 열매 껍질에 산 처리를 하여 폐액에서 자일로스를 분리하는 과정을 수행하였다. 팜 열매 껍질인 건조된 바이오매스(150ｇ)에 0.1 내지 8.0%(v/v)의 황산을 이용해 산-열처리 과정을 121℃에서 1 시간 반응시킨 후, 산 처리 과정을 통해 헤미셀룰로스 성분이 제거된 바이오매스와 바이오매스의 헤미셀룰로스 성분히 포함된 산 처리 폐액(A)을 분리하였다. 전처리한 바이오매스는 상온에서 물속에 침적하여, 표면에 있는 변성물질을 제거한 후, 상기 세척액(B)에서 바이오매스를 회수하여 동일한 양의 바이오매스(150ｇ)에 상기에서 사용한 산 처리 폐액(A)을 이용하여 동일 조건에서 반응시켰다. 그 후 다시 바이오매스를 회수하여 상기에서 사용한 세척액(B)를 이용하에 바이오매스를 세척하였으며, 이를 5회 이상 반복하였다.
본 발명의 산 처리에 사용되는 황산의 농도에 따른 산 처리 폐액 내의 자일로스 농도 변화 및 폐액 속의 부산물을 측정한 결과, 산 처리에 사용되는 황산의 농도가 높을수록 폐액 속의 자일로스 함량이 증가하였으며(도 2A), 폐액 속의 당성분을 분석한 결과, 자일로스(xylose) 82%, 포도당(glucose) 4%, 올리고-자일로스(oligo-xylose) 3% 및 3% 아세테이트(acetic acid) 3%가 측정되었다 (도 2B).
팜 열매 껍질을 이용한 산 처리 공정에서 배출되는 산 용액에는 자일로스가 과량으로 포함되어있으며, 산 처리 공정에서 발생하는 폐액의 연속적인 재활용을 통해 산 처리시 사용되는 황산 용액의 저감 및 산 폐액 내에 과량의 자일로즈가 포함된 용액 제조가 가능하다.
산 처리는 헤미셀룰로즈 내에 자일란이 산 처리에 의해 산 가수분해가 자동으로 일어나기 때문에, 중합체 형태의 자일란을 단량체 형태의 자일로스로 회수하기 위한 산 가수 분해 반응을 추가로 수행할 필요가 없으며, 바로 자일로스를 분획해 낼 수 있는 장점이 있다. 또한 산 처리된 바이오매스 표면에서 당 성분 및 산 가수 분해 산물을 제거하기 위해, 산 처리된 바이오매스를 물속에 침적시키는 펄프 작업을 통해서 배출되는 세척수의 약산 용액에도 상당량의 자일로스가 포함되어 있어, 앞선 산 처리 폐액과 혼합하여 팜 열매 껍질로부터 고농도의 자일로스 분획 산물을 수득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 칼슘 이온은 탄산칼슘 또는 수산화칼슘 등과 같은 칼슘염 형태로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 (d) 단계는 탄산칼슘 또는 수산화칼슘은 폐액 및 세척액의 pH가 5 내지 8이 되도록 첨가하여, 20℃ 내지 30℃ 이하에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 발효저해물질은 퓨리퓨랄을 포함하는 산처리 변형 당 성분인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 실시예 1에서 5회 이상 재사용한 산 처리 용액(산 처리 폐액 + 세척액)(pH < 1)의 수용액 상의 황산(H2SO4)을 제거하기 위하여, 황산(H2SO4)을 염(salt)으로 전환할 수 있는 고체 상태의 탄산칼슘(Calcium carbonate, CaCO3) 또는 수산화칼슘(Calcium hydroxide, Ca(OH)2)을 pH 5 내지 8이 되도록 천천히 주입시켜 약산 또는 약 알칼리 상태로 중화과정을 수행하였다. 이때 발열 반응으로 용액 내에 당 성분들이 변성을 일으킬 가능성이 있기 때문에 냉각장치를 통해 용액을 20 내지 30℃이하로 유지하였으며, 고체 상태의 탄산칼슘의 양 또는 수산화 칼슘의 양은 산 처리 폐액의 부피와 pH의 정도에 따라 가변적이다.
상기 수용액 상에 석출되는 황산칼슘(Calcium sulfate, CaSO4) 염은 중력에 의한 침전, 필터링 및 원심분리로 제거하였으며, 황산칼슘 염 제거 후, 회수된 액상의 자일로스 및 기타 성분의 농도를 HPLC로 분석한 결과, 자일로스 64.3 ± 8.8 ｇ/ℓ, 포도당 7.6 ± 2.4 ｇ/ℓ, 아세테이트 10.1 ± 1.4 ｇ/ℓ 및 퓨리퓨랄 0.7 ± 0.2 ｇ/ℓ이 포함된 것으로 측정되었다.
황산 칼슘염이 제거된 과량의 자일로스를 포함하는 수용액은 활성탄 처리 또는 활성탄 컬럼 통과를 통해 발효 저해 물질로 작용하는 퓨리퓨랄과 같은 산 처리 변형 당 성분과 용액 내에 당 성분의 갈변화로 인하여 진한 갈색을 나타내는 성분을 제거하였으며, 상기 과정을 통해 탈색된 옅은 노란색의 자일로스가 함유된 수용액을 회수하였으며, 산 처리 폐액으로부터 80% 이상의 효율로 자일로스를 성분을 포함하는 당 수용액을 최종적으로 얻을 수 있었다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 바이오매스 산 처리 폐액에 내성을 가진 효모를 배양하여 에탄올을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 알코올의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (a) 단계는 20℃ 내지 30℃, pH가 5 내지 8 및 200rpm 조건으로 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 바이오매스 산처리액에 내성을 가지도록 적응시킨 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 또는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS5773 균주인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 및 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS5773 균주를 사용하여 바이오매스의 산처리액에 적응을 시켜 내성을 가지도록 하였으며, 상기의 두 균주는 자일로스를 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 균주로 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 발효 저해 물질이 포함된 산 처리 폐액 내의 자일로스를 에탄올 또는 자일리톨로 전환 시킬 수 있는 내성 효모 균주를 선별하기 위해 실험을 수행하였으며, 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액과 Yeast nitrogen base (YNB)가 포함되어 있는 액상 배지에 균주를 접종하여 연속적 회분식 배양을 10회 반복하였다. 각 회분식 배양 동안 일정한 시간에 배양액을 채취하여 세포의 성장 및 배양 배지 내의 성분변화를 조사한 결과, 10회 연속-회분식 배양을 통해 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액에 적응시킨 캔디다 트로피칼리스 CBS94 균주 성장 정도(도 4A) 및 배양 배지 내의 성분 함량변화(도 4B)는 연속 회분식 배양의 회수가 증가함에 따라 최초 배양에 비해 세포 성장속도가 빨라지고 자일로스의 이용 속도가 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 최초 배양에서는 자일리톨 생성되지 않았으나, 두 번째 회분식 배양에서 자일리톨이 생성되고 10회 연속 배양 후에는 자일리톨 생성능이 5배 이상 향상되는 것을 확인하였다.
또한, 10회 연속-회분식 배양을 통해 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액에 적응시킨 피키아 스티피티스 CBS5773는 균주 성장 정도(도 5A) 및 배양 배지 내의 성분 함량변화(도 5B)를 조사한 결과, 최초 배양에 비해 세포 성장속도가 빨라지고 자일로스의 이용 속도가 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 산 처리 폐액에 내성을 가진 효모는 상기의 방법에 의해 분리된 산 처리 폐액을 포함하는 배지에 효모를 연속 회분식 방법으로 배양하여 분리된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 산 처리 폐액에 대한 내성을 증가시킨 효모 피키아 스티피티스(P.stipitis)를 이용하여 에탄올 발효를 수행한 결과, 상대적으로 고농도로 접종된 피키아 스티피티스는 배양액 내에 소량 존재하는 포도당(4 ｇ/ℓ)을 빠르게 소모하고, 71.9 ｇ/ℓ의 자일로스를 천천히 소모하면서 에탄올 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 약 140시간 동안 6.7 ｇ/ℓ의 에탄올이 생성되었다 (도 6). 이때, 최종적으로 남아있는 자일로스는 53.5 ｇ/ℓ으로 확인되었으며, 아세트산은 10 ｇ/ℓ미만으로 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 바이오매스 산 처리 폐액에 내성을 가진 효모를 배양하여 자일리톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 자일리톨을 회수하는 단계를 포함하는 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (a) 단계는 20℃ 내지 30℃, pH가 5 내지 8 및 200rpm 조건으로 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 산 처리 폐액에 내성을 가진 효모는 바이오매스 산 처리 폐액에 내성이 생기도록 적응시킨 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 또는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS5773 균주인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 산 처리 폐액에 내성을 가진 효모는 상기의 방법에 의해 분리된 산 처리 폐액을 포함하는 배지에 효모를 연속 회분식 방법으로 배양하여 분리된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예어서, 산 처리 폐액에 대한 내성을 증가시킨 효모 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)를 이용하여 자일리톨 발효를 수행한 결과, 캔디다 트로피칼리스는 배양 초기 자일로스의 소비속도가 느렸지만, 배양 10시간 이후부터는 74 ｇ/ℓ 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 배양 61시간에는 최고 25.2 ｇ/ℓ의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 바이오매스를 염기성 물질로 처리하여 알칼리 처리 공정을 거친 다음, 바이오매스와 알칼리 처리 폐액을 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 알칼리 처리 폐액 내의 거대입자를 제거한 후, 분리-여과막을 사용하여 알칼리 처리 폐액에 포함되어 있는 리그닌 및 헤미셀룰로스를 농축시키는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 리그닌 및 헤미셀룰로스 포함된 농축액을 산으로 처리하여 리그닌-헤미셀룰로스 복합체에서 자일란의 산 가수분해 과정을 통해 자일로스를 유리시키는 단계; (d) 상기 자일로스가 유리된 수용액을 칼슘이온으로 처리하여 폐액에 포함되어 있는 산을 칼슘염으로 침전시켜 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 산이 제거된 수용액에 포함되어 있는 발효 저해 물질을 활성탄을 이용하여 제거한 다음, 자일로스 성분을 포함하는 수용액을 회수하는 단계를 포함하는 바이오매스 알칼리 처리 공정에서 발생하는 폐액에서 자일로스를 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 바이오매스는 거대억새(Miscanthus gianteus)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 초본계 바이오매스인 거대억새(Miscanthus gianteus)는 건조중량 당 38.7% 셀룰로즈(cellulose), 13.2% 헤미셀룰로즈(hemicellulose), 24.3% 리그닌(lignin), 1.4% 회분(ash) 및 수분을 포함한 기타 성분으로 구성되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 염기성 물질은 수산화칼슘, 수산화칼륨, 수산화마그나슘, 수산화나트륨 및 중탄산나트륨 등의 강염기성 물질 또는 약염기성 물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 (a) 단계는 0.1 내지 5.0 M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)를 처리하여, 50 내지 120℃로 반응시킨 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 여과된 알칼리 처리 폐액은 (a) 단계의 알칼리 처리 공정에 재사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 원심분리, 중력에 의한 침전 또는 모래 컬럼 (sand column)을 이용하여 알칼리 폐수 내의 거대 입자를 제거하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 거대억새는 연속 전처리 장치를 이용하여 3㎜ 이하의 크기로 분해한 후, 0.4 내지 1.2 M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)를 처리하여 70 내지 90℃로 반응시켜 알칼리 처리 단계를 수행하였다. 알칼리 처리 단계를 통해 리그닌/헤미셀룰로스가 제거된 바이오매스와 리그닌/헤밀셀룰로스가 포함된 알칼리 처리 폐액을 분리하였으며, 회수된 바이오매스는 물을 이용하여 표면에 남아있는 알칼리 성분을 제거한 후, 105℃에서 24시간 동안 건조시킨 다음, 바이오매스의 성분을 분석하였다. 분석결과, 알칼리 처리된 거대억새는 건조중량 당 셀룰로스 64.1%, 헤미셀룰로즈 10.9%, 리그닌 0.5% 및 수분을 포함한 기타 성분으로 구성되어 있으며, 알칼리 처리 과정으로 거대억새에서 리그닌/헤미셀룰로스가 일부 제거된 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 분리-여과막은 미세여과막(microfiltration, MF), 한외여과막(ultrafiltration, UF) 또는 나노분리막(nanofiltration, NF)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 알칼리 처리 과정에서 유출되는 리그닌/헤미셀룰로스 성분이 포함된 알칼리성 폐액을 회수하여 재사용하기 위해 폐액을 원심분리, 중력에 의한 침전 또는 모래 컬럼 (sand column) 등을 이용하여 알칼리 폐수 내의 거대 입자를 제거하고, 미세여과막(microfiltration, MF), 한외여과막(ultrafiltration, UF) 또는 강알칼리에 강한 폴리설폰(polysulfone) 재질의 보강 지지체가 들어 있는 나노분리막(nanofiltration, NF)를 사용하여 알칼리 폐수에 용융되어 있는 리그닌/헤미셀룰로스를 농축시키고, 여과되는 알칼리성 폐액을 재사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 산은 황산, 염산, 인산 등의 강산 및 약산인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 (c) 단계에서는 2 내지 20%(v/v)의 황산을 처리하여 100 내지 200 ℃에서 10분 내지 120분 동안 반응을 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 알칼리 처리 폐액은 산 처리와는 달리 전처리시 자일로스 성분이 유리되지 않은 상태인 자일란 형태인 헤미셀룰로즈로 존재하며, 리그닌과 복합체 상태로 되어있으므로, 알칼리 폐액속의 리그닌/헤미셀룰로즈에서 자일로스를 분리하기 위해서는 산 처리를 통한 가수분해 과정이 요구된다. 알칼리 폐액에서 유리되는 자일로스의 농도는 주입되는 황산의 농도에 의해 결정되며, 알칼리 용액이 황산 용액에 의해 중화된 이후의 산성 상태에서의 가수분해에 의해 자일로스를 유리시킬 수 있다.
본 발명에서 나노여과막(NF)을 이용하여 회수한 리그닌/헤미셀룰로스가 포함되어있는 알칼리 폐액에서 자일로스를 유리시키기 위해 산 처리를 통한 가수분해를 실시하였으며, 첨가되는 황산의 농도 비율에 따른 자일로스의 유리양을 분석하였다. 그 결과, 황산의 농도가 0 내지 6%(v/v)의 범위에서는 자일로스가 유리되지 않았으며, 알칼리 용액이 산성화가 되는 6%(v/v) 이후의 8 내지 14%(v/v)의 범위부터 헤밀셀룰로즈의 자일란으로 부터 자일로스가 유리되는 것을 확인하였다 (도 9A). 10% (v/v) 황산 첨가 시 최대 20.7 ｇ/ℓ의 자일로스를 회수하였으며 (도 9B), 황산의 농도가 10%(v/v) 이상이 되는 경우에는 자일로스의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 산-열 가수분해에 의해 자일로스 성분이 변성이 일어났기 때문에 자일로스 함량이 감소했다고 볼 수 있다.
또한, 미세여과막(MF) 및 한외여과막(UF)을 이용하여 회수한 알칼리 농축액으로부터 자일로스를 유리시킨 결과, 2%(v/v) 황산을 처리한 경우에는 자일로스가 유리되지 않았으며, 미세여과막(MF) 이용하여 회수한 알칼리 농축액에 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 20.4 ｇ/ℓ의 자일로스가 유리되었으며, 한외여과막(UF)을 이용하여 회수한 알칼리 농축액에 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 42.4 ｇ/ℓ의 자일로스가 유리되었다. 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 발효 저해물질인 퓨리퓨랄의 함량이 적은 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 칼슘 이온은 탄산칼슘 또는 수산화칼슘 등과 같은 칼슘염 형태로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 (d) 단계는 탄산칼슘 또는 수산화칼슘은 폐액의 pH가 5 내지 8이 되도록 첨가하며, 20℃ 내지 30℃ 이하에서 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 발효저해물질은 퓨리퓨랄을 포함하는 산처리 변형 당 성분인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 산이 제거된 수용액에 포함되어 있는 이온성 물질을 제거하기 위해 이온교환 수지를 이용하여 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 이온성 물질 중에서, 양이온은 AG 50W-X8의 양이온 교환 수지 레진 또는 컬럼을 사용하여 제거하고, 음이온은 AG1-X8의 음이온 교환 수지 레진 또는 컬럼을 사용하여 제거하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 알칼리 처리 폐액의 산-가수분해 반응액의 수용액 상의 황산(H2SO4)을 제거하기 위하여, 황산(H2SO4)을 염(salt)으로 전환할 수 있는 고체 상태의 탄산칼슘(Calcium carbonate, CaCO3) 또는 수산화칼슘(Calcium hydroxide, Ca(OH)2)을 pH 5 내지 8이 되도록 천천히 주입시켜 약산 또는 약 알칼리 상태로 중화과정을 수행하였다. 이때 발열 반응으로 용액 내에 당 성분들이 변성을 일으킬 가능성이 있기 때문에 냉각장치를 통해 용액을 20 내지 30℃이하로 유지하였으며, 고체 상태의 탄산칼슘의 양 또는 수산화 칼슘의 양은 중화시키는 반응액의 부피와 pH의 정도에 따라 가변적이다.
본 발명에서, 수용액 상에 석출되는 황산칼슘(Calcium sulfate, CaSO4) 염은 중력에 의한 침전, 필터링 또는 원심분리로 제거하였으며, 황산 칼슘염이 제거된 과량의 자일로스를 포함하는 수용액은 활성탄 처리 또는 활성탄 컬럼 통과를 통해 발효 저해 물질로 작용하는 퓨리퓨랄과 같은 산처리 변형 당 성분과 용액 내에 당 성분의 갈변화로 인하여 진한 갈색을 나타내는 성분을 제거하였다.
또한, 수용액 내에 존재하는 나트륨(Na) 이온은 AG 50W-X8 resin의 양이온 교환 수지 컬럼으로 제거하였으며, 미량으로 존재하는 음이온은 AG1-X8의 음이온 교환 수지 컬럼으로 제거하였다. 상기 과정을 통해 탈색된 옅은 노란색의 자일로스가 함유된 수용액을 회수하였으며, 알칼리 처리 폐액으로부터 80% 이상의 효율로 자일로스를 성분을 포함하는 당 수용액을 최종적으로 얻을 수 있었다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기의 방법에 의해 분리된 자일로스가 함유된 수용액을 이용하여 알칼리 처리액의 산 가수분해 액에 내성을 가진 효모를 배양하여 자일리톨을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 자일리톨을 회수하는 단계를 포함하는 자일리톨의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (a) 단계는 20℃ 내지 30℃, pH가 5 내지 8 및 200rpm 조건으로 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 효모는 알칼리 처리액의 산 가수분해 액에 내성을 가지도록 적응시킨 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 또는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS5773 균주인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알칼리 처리액에 산 가수분해를 통해 자일로스가 유리된 용액에 내성을 가진 효모는 상기 방법에 의해 수득한 자일로스가 과량으로 포함되어 있는 배지에 효모를 연속 회분식 방법으로 배양하여 분리된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기의 용액에 내성을 증가시킨 효모 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)를 이용하여 자일리톨 발효를 수행한 결과, 캔디다 트로피칼리스는 배양 초기 자일로스의 소비속도가 느렸지만, 배양 20시간 이후부터는 30ｇ/ℓ 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 배양 54시간에는 최고 11.5ｇ/ℓ의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
팜 열매 껍질의 산 처리 및 산 처리 용액의 재사용
본 발명은 바이오매스의 전처리 효율을 높이고, 산 처리 단계에서 발생하는 폐액 속에 헤미셀룰로즈의 성분인 자일란의 모노머 형태의 자일로스 양을 증가시키기 위해 산 처리 용액을 재사용하였다. 상세한 반응 조건 및 전체적인 공정은 도 1에 나타내었다.
본 발명에서는 팜 열매 껍질에 산 처리를 하여 폐액에서 자일로스를 분리하는 과정을 수행하였다. 팜 열매 껍질인 건조된 바이오매스(150ｇ)에 0.1 내지 8.0%(v/v)의 묽은 황산을 이용해 산 처리 과정을 121℃에서 1 시간 반응시킨 후, 산 처리 과정을 통해 헤미셀룰로스 성분이 제거된 바이오매스와 바이오매스의 헤미셀룰로스 성분히 포함된 산 처리 폐액(A)을 분리하였다. 산 처리한 바이오매스는 상온에서 물속에 침적한 후 펄프작업을 통해 팜 열매 껍질 섬유질 조직을 이완시켜 섬유질 조직을 연하게 하였으며, 표면에 있는 변성물질을 제거한 후, 상기 세척액(B)에서 바이오매스를 회수하여 동일한 양의 바이오매스(150ｇ)에 상기에서 사용한 산 처리 폐액(A)을 이용하여 동일 조건에서 반응시켰다. 그 후 다시 바이오매스를 회수하여 상기에서 사용한 세척액(B)를 이용하에 바이오매스를 세척하였다. 상기와 같은 과정을 5회 이상 반복하면서, 산 처리 공정 중에서 배출되는 산-폐액(A)와 세척수(B) 내의 자일로스의 함량과 바이오매스 산 처리 과정에서 생성되는 부산물을 모니터링하였다.
산 처리에 사용되는 황산의 농도에 따른 산 처리 폐액 내의 자일로스 농도 변화 및 폐액 속의 부산물을 측정하기 위해 고속액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography; HPLC)를 이용하여 분석을 실시하였다.
Refractive index detector (Waters, Milford, MA, USA)와 auto-sampler가 장착된 HPLC 시스템 (Young-Lin instrument, Anyang, Korea)을 이용하였으며, 분석 컬럼으로 Rezex ROA-Organic Acid H+ column (7.8 x 300 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA)와 guard cartridge (KJ0-4282; Phenomenex, Torrance, CA, USA)가 포함되어 있는 SecurityGardTM 가드컬럼을 이용하여, 컬럼 온도를 65℃로 유지하면서 이동상으로 2.5 mM 황산용액으로 0.6㎖/min 유속으로 하여 측정하였다.
그 결과, 산 처리에 사용되는 황산의 농도가 높을수록 폐액 속의 자일로스 함량이 증가하였으며(도 2A), 폐액 속의 당성분을 분석한 결과, 자일로스(xylose) 82%, 포도당(glucose) 4%, 올리고-자일로스(oligo-xylose) 3% 및 3% 아세테이트(acetic acid) 3%가 측정되었다 (도 2B).
재사용되는 산 처리 폐액 내의 자일로스 농도 변화를 측정한 결과, 1회 사용시 20.3 ± 3.6 ｇ/ℓ, 2회 사용시 39.9 ± 11.1 ｇ/ℓ, 3회 사용시 55.1 ± 20.0 ｇ/ℓ, 4회 사용시 70.2 ± 29.0 ｇ/ℓ, 5회 사용시 82.3 ± 38.8 ｇ/ℓ의 자일로스가 폐액에 포함되어 있는 것을 확인하였다 (도 3A). 이때 산 가수분해 산물로 측정되는 당 성분 및 유기산인 포도당(glucose), 아세트산(acetate) 및 퓨리퓨랄(furfural)이 검출 되었으며, 산 처리 폐액의 재활용 빈도에 따라 폐액 속에 포함된 농도가 증가하는 것을 확인하였다 (도 3B).
산 처리 폐액으로부터 발효 저해 독성물질이 제거된 자일로스 용액의 제조
상기 실시예 1에서 5회 이상 재사용한 산 처리 용액(산 처리 폐액 + 세척액)(pH < 1)의 수용액 상의 황산(H2SO4)을 제거하기 위하여, 황산(H2SO4)을 염(salt)으로 전환할 수 있는 고체 상태의 탄산칼슘(Calcium carbonate, CaCO3) 또는 수산화칼슘(Calcium hydroxide, Ca(OH)2)을 pH 5 내지 8이 되도록 천천히 주입시켜 약산 또는 약 알칼리 상태로 중화과정을 수행하였다. 이때 발열 반응으로 용액 내에 당성분들이 변성을 일으킬 가능성이 있기 때문에 냉각장치를 통해 용액을 20 내지 30℃이하로 유지하였으며, 불용성 염으로 석출되는 과정은 다음 화학식과 같다:
H2SO4 (aq) + CaCO3 (s) → CaSO4 (s) + 2H2O (l) + CO2 (g) 또는
H2SO4 (aq) + Ca(OH)2 (s) → CaSO4 (s) + 2H2O (l)
이 과정 중에서 수용액 상에 석출되는 황산칼슘(Calcium sulfate, CaSO4) 염은 중력에 의한 침전, 필터링 및 원심분리로 제거하였으며, 황산칼슘 염 제거 후, 회수된 액상의 자일로스 및 기타 성분의 농도를 HPLC로 분석한 결과, 자일로스 64.3 ± 8.8 ｇ/ℓ, 포도당 7.6 ± 2.4 ｇ/ℓ, 아세테이트 10.1 ± 1.4 ｇ/ℓ 및 퓨리퓨랄 0.7 ± 0.2 ｇ/ℓ이 포함된 것으로 측정되었다.
황산 칼슘염이 제거된 과량의 자일로스를 포함하는 수용액은 활성탄 처리 또는 활성탄 컬럼 통과를 통해 발효 저해 물질로 작용하는 퓨리퓨랄과 같은 산 처리 변형 당 성분과 용액 내에 당 성분의 갈변화로 인하여 진한 갈색을 나타내는 성분을 제거하였으며, 상기 과정을 통해 탈색된 옅은 노란색의 자일로스가 함유된 수용액을 회수하였으며, 산 처리 폐액으로부터 80% 이상의 효율로 자일로스를 성분을 포함하는 당 수용액을 최종적으로 얻을 수 있었다.
발효 저해 물질이 포함된 산 처리액 내의 자일로스 이용을 위한 내성 효모 개발
상기 실시예 2에서 회수한 자일로스를 성분을 포함하는 당 수용액은 여전히 발효 저해 물질이 포함되어 있으므로, 발효 저해 물질이 포함된 산 처리액 내의 자일로스를 에탄올 또는 자일리톨로 전환 시킬 수 있는 내성 효모 균주를 선별하기 위해 실험을 수행하였다.
본 발명에서는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) CBS94 또는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS5773 균주를 사용하였으며, 상기의 두 균주는 자일로스를 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 균주로 알려져 있다.
상기 균주는 YPD (10 ｇ/ℓ Yeast extract; 20 ｇ/ℓ Bacto-peptone; 20 ｇ/ℓ Dextrose)고체 배지에 도말하여, 25 내지 30℃에서 배양한 다음, 단일 종의 균체의 군집으로 확인된 단일 콜로니(colony)를 선별하였다. 그 후에 발효 저해 물질이 포함된 10 ㎖의 산 처리액(25 ｇ/ℓ 자일로스 함량) 및 6.7 ｇ/ℓ Yeast nitrogen base (YNB)가 포함되어 있는 액상 배지에 상기 선별된 콜로니를 접종하여 25 내지 30℃에서 240 rpm으로 24시간 동안 교반 하면서 회분식 배양(batch culture)을 수행하였다. 배양 후 배양액의 10%(v/v)를 다시 발효 저해 물질이 포함된 10 ㎖의 산 처리액(25 ｇ/ℓ 자일로스 함량) 및 6.7 ｇ/ℓ Yeast nitrogen base (YNB)가 포함되어 있는 액상 배지에 접종하여 같은 방법으로 배양하였으며, 상기와 같은 연속적 회분식 배양을 10회 반복하였다.
각 회분식 배양 동안 동일한 시간에 배양액을 채취하여 세포의 성장 및 배양 배지 내의 성분변화를 조사하였다. 세포의 성장은 흡광광도계(Spectrophotometer)를 사용하여 600 nm 파장에서 모니터링 하였으며 이를 세포의 건조 중량으로 환산하였다. 또한 배양 배지 내의 성분 변화는 HPLC 분석 방법을 통해 분석하였다.
10회 연속-회분식 배양을 통해 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액에 적응시킨 캔디다 트로피칼리스 CBS94 균주 성장 정도(도 4A) 및 배양 배지 내의 성분 함량변화(도 4B)를 조사한 결과, 연속 회분식 배양의 회수가 증가함에 따라 최초 배양에 비해 세포 성장속도가 빨라지고 자일로스의 이용 속도가 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 최초 배양에서는 자일리톨 생성되지 않았으나, 두번 째 회분식 배양에서 자일리톨이 생성되고 10회 연속 배양 후에는 자일리톨 생성능이 5배 이상 향상되는 것을 확인하였다.
10회 연속-회분식 배양을 통해 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액에 적응시킨 피키아 스티피티스 CBS5773는 균주 성장 정도(도 5A) 및 배양 배지 내의 성분 함량변화(도 5B)를 조사한 결과, 최초 배양에 비해 세포 성장속도가 빨라지고 자일로스의 이용 속도가 2배 이상 증가하는 것을 확인하였다.
산 처리액에 내성을 가진 효모를 이용한 에탄올 발효
상기 실시예 3에서 산 처리액에 대한 내성을 증가시킨 효모 피키아 스티피티스(P. stipitis)를 YPD 액체 배지를 이용하여 30℃에서 24시간 동안 전배양(seed culture) 한 후, 전배양된 균주를 1% YNB이 포함된 15 ㎖ 자일로스 용액(발효 저해 물질이 포함된 산 처리액)에 10% (v/v) 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 24시간 동안 교반하였다. 배양된 균체를 원심분리로 회수한 후 1.5 ℓ의 생물 반응기(jar-fermenter)에 1 ℓ의 상기의 동일 배지를 넣고 고농도의 균체(8 OD600nm)를 접종하였다. 이때 생물 반응기의 운전조건은 30℃, pH 5.5 내지 6.0 및 200 rpm을 유지하였으며, 세포의 성장에 따른 자일로스, 포도당의 농도 변화와 에탄올 및 아세트산 생산량은 HPLC 분석을 통해 분석하였다.
에탄올 발효 결과, 상대적으로 고농도로 접종된 피키아 스티피티스는 배양액 내에 소량 존재하는 포도당(4 ｇ/ℓ)을 빠르게 소모하고, 71.9 ｇ/ℓ의 자일로스를 천천히 소모하면서 에탄올 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 약 140시간 동안 6.7 ｇ/ℓ의 에탄올이 생성되었다 (도 6). 이때, 최종적으로 남아있는 자일로스는 53.5 ｇ/ℓ으로 확인되었으며, 아세트산은 10 g/L 미만으로 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
산 처리액에 내성을 가진 효모를 이용한 자일리톨 생산
상기 실시예 3에서 산 처리액에 대한 내성을 증가시킨 효모 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)를 1% YNB 포함된 15 ㎖ 자일로스 용액(발효 저해 물질이 포함된 산 처리액)에 10% (v/v) 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 24시간 동안 교반하였다. 배양된 균체를 원심분리로 회수한 후 1.5 ℓ의 생물 반응기(jar-fermenter)에 1 ℓ의 상기의 동일 배지를 넣고 고농도의 균체(8 OD600nm)를 접종하였다. 이때 생물 반응기의 운전조건은 30℃, pH 5.5 내지 6.0 및 200 rpm을 유지하였으며, 세포의 성장에 따른 자일로스의 농도 변화와 자일리톨 생산량은 HPLC 분석을 통해 분석하였다.
자일리톨 발효 결과, 캔디다 트로피칼리스는 배양 초기 자일로스의 소비속도가 느렸지만, 배양 10시간 이후부터는 74 ｇ/ℓ 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 배양 61시간에는 최고 25.2 ｇ/ℓ의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).
거대억새 알칼리 처리 액에서 알칼리 처리액 재사용을 위한 멤브레(여과막)인 이용한 헤미셀룰로즈 및 리그닌 제거
본 발명은 바이오매스의 알칼리 처리 효율을 높이고, 알칼리 처리 단계에서 발생하는 폐액 속에 리그닌/헤미셀룰로즈를 증가시키기 위해 알칼리 처리 용액을 재사용하였다. 상세한 반응 조건 및 전체적인 공정은 도 8에 나타내었다.
본 발명에서는 거대억새(Miscanthus gianteus)에 알칼리 처리를 하여 폐액에서 리그닌/헤미셀룰로오스를 분리하는 과정을 수행하였다. 거대억새는 연속 전처리 장치를 이용하여 3㎜ 이하의 크기로 분해한 후, 0.4 내지 1.2 M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)를 처리하여 70 내지 90℃로 반응시켜 알칼리 처리 단계를 수행하였다. 알칼리 처리 단계를 통해 리그닌/헤미셀룰로스가 제거된 바이오매스와 리그닌/헤밀셀룰로스가 포함된 알칼리 처리 폐액을 분리하였으며, 회수된 바이오매스는 물을 이용하여 표면에 남아있는 알칼리 성분을 제거한 후, 105℃에서 24시간 동안 건조시킨 다음, 바이오매스의 성분을 분석하였다. 분석결과, 알칼리 처리된 거대억새는 건조중량 당 셀룰로스 64.1%, 헤미셀룰로즈 10.9%, 리그닌 0.5% 및 수분을 포함한 기타 성분으로 구성되어 있으며, 알칼리 처리 과정으로 거대억새에서 리그닌/헤미셀룰로스가 대부분 제거된 것을 확인하였다.
본 발명의 알칼리 처리 과정에서 유출되는 리그닌/헤미셀룰로스 성분이 포함된 알칼리성 폐액을 회수하여 재사용하기 위해 폐액을 원심분리, 중력에 의한 침전 또는 모래 컬럼 (sand column) 등을 이용하여 알칼리 처리 폐수 내의 거대 입자를 제거하고, 미세여과막(microfiltration, MF), 한외여과막(ultrafiltration, UF) 및 나노분리막(nanofiltration, NF)를 사용하여 알칼리 처리 폐수에 용융되어 있는 리그닌/헤미셀룰로스를 농축시키고, 여과되는 알칼리성 폐액을 재사용하였다.
상기의 나노분리막을 통해 여과한 여과액은 폐액 내에 존재하는 리그닌 및 헤미셀룰로즈 성분이 제거되어 탁도 제거율이 향상되었으며, 여과액과 여과 후 남는 농축액을 비교한 결과 비용해성 물질의 제거율이 거의 100%로 측정되었다 (표 1).
나노분리막(NF)을 통해 처리한 바이오매스 알칼리 처리 폐액의 성상 분석
샘플 부피감소(%) 탁도
(NTU)		 TOC
(mg/L)		 Na+
(mg/L)
알칼리 폐수 원액 - 2,800 5,575 5,331
전처리액 - 1,500 5,101 5,206
2배 농축액 50 3,065 7,858 5,336
여과액 50 0.01 2,381 5,059
4배 농축액 75 4,785 9,417 5,031
여과액 75 0.01 3,288 4,399
8배 농축액 90 7,445 11,996 5,201
여과액 90 0.01 2,890 5,012
분리막 최초 여과액 - 0.01 2,243 4,703
분리막 세정후 여과액 - 0.01 5,887 5,585
또한 폐액 중에 용융되어 있는 유기성 탄소(total organic carbon, TOC)를 분석한 결과 2배, 4배 및 8배 농축시 농축액과 여과액의 유기성 탄소 제거율은 각각 3.3배, 2.8배 및 4.2배로 분석되었으며, 알칼리로 사용된 수산화나트륨의 농도를 나타내는 지표인 나트륨 이온(Na+) 농도는 여과 전후로 최대 농도와 최저 농도를 비교한 결과 20% 내외의 농도 차이로 유지되었다.
알칼리 처리액에서 제거한 농축 헤미셀룰로즈로 부터 자일로스의 회수
7-1 : 산 가수분해 과정을 이용한 자일로스의 유리
본 발명에서는 실시예 6에서 나노여과막(NF)을 이용하여 회수한 리그닌/헤미셀룰로스가 포함되어있는 알칼리 폐액에서 자일로스를 유리시키기 위해 산 처리액을 통한 가수분해를 실시하였으며, 첨가되는 황산의 농도 비율에 따른 자일로스의 유리양을 분석하였다.
우선, 농축된 거대억새의 알칼리 처리 폐액에 황산 원액을 0 내지 14%(v/v) 비율로 첨가한 후, 121℃에서 1시간 동안 열처리를 통해 알칼리 처리 폐액에서 리그닌과 복합체로 형성되어 있는 헤미셀룰로즈의 자일란 성분을 자일로스로 가수분해 시켰으며, 반응 후 각각의 황산 농도의 비율에 따른 자일로스의 유리 양을 HPLC로 분석하였다.
분석 결과, 황산의 농도가 0 내지 6%(v/v)의 범위에서는 자일로스가 유리되지 않았으며, 알칼리 용액이 산성화가 되는 6%(v/v) 이후의 8 내지 14%(v/v)의 범위부터 헤밀셀룰로즈의 자일란으로 부터 자일로스가 유리되는 것을 확인하였다 (도 9A). 10% (v/v) 황산 첨가 시 최대 20.7 ｇ/ℓ의 자일로스를 회수하였으며 (도 9B), 황산의 농도가 10%(v/v) 이상이 되는 경우에는 자일로스의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 산-열 가수분해에 의해 자일로스 성분이 변성이 일어났기 때문에 자일로스 함량이 감소했다고 볼 수 있다.
또한, 실시예 6에서 미세여과막(MF)과 한외여과막(UF)을 이용하여 회수한 알칼리 농축액을 상기의 방법을 이용하여 자일로스를 회수하였으며, 생성된 자일로스 및 산 가수분해 산물의 양을 측정하였다 (표2).
여과막을 통해 회수한 알칼리 농축액의 산 가수분해로 얻어지는 자일로스와 산 가수 분해산물의 양
시료 포도당
(ｇ/ℓ)		 자일로스
(ｇ/ℓ)		 아세트산
(ｇ/ℓ)		 퓨리퓨랄
(ｇ/ℓ)
알칼리 폐수 원액
2%(v/v) 황산 처리 - - - -
6%(v/v) 황산 처리 3.5 25.8 5.8 0.9
10%(v/v) 황산 처리 4.7 20.0 7.0 3.4
전처리액
2%(v/v) 황산 처리 - - 6.5 -
6%(v/v) 황산 처리 1.7 23.7 5.6 0.7
10%(v/v) 황산 처리 1.6 16.1 5.1 1.5
MF 여과 농축액
2%(v/v) 황산 처리 - - 6.3 -
6%(v/v) 황산 처리 1.8 20.4 5.7 0.7
10%(v/v) 황산 처리 1.4 13.9 5.1 1.7
UF 여과 농축액
2%(v/v) 황산 처리 - - 4.1 -
6%(v/v) 황산 처리 2.6 42.4 4.8 1.6
10%(v/v) 황산 처리 2.3 28.8 4.0 4.1
미세여과막(MF) 또는 한외여과막(UF)을 이용하여 회수한 알칼리 농축액으로부터 자일로스를 유리시킨 결과, 2%(v/v) 황산을 처리한 경우에는 자일로스가 유리되지 않았으며, 미세여과막(MF) 이용하여 회수한 알칼리 농축액에 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 20.4 ｇ/ℓ의 자일로스가 유리되었으며, 한외여과막(UF)을 이용하여 회수한 알칼리 농축액에 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 42.4 ｇ/ℓ의 자일로스가 유리되었다.
또한, 6%(v/v) 황산을 처리하여 자일로스를 유리시킨 경우, 발효 저해물질인 퓨리퓨랄의 함량이 적은 것을 확인할 수 있었다.
7-2 : 유리된 자일로스의 회수
상기 실시예 7-1에서 산 가수분해된 자일로스 성분의 회수는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
산-가수분해 반응액의 수용액 상의 황산(H2SO4)을 제거하기 위하여, 황산(H2SO4)을 염(salt)으로 전환할 수 있는 고체 상태의 탄산칼슘(Calcium carbonate, CaCO3) 또는 수산화칼슘(Calcium hydroxide, Ca(OH)2)을 pH 5 내지 8이 되도록 천천히 주입시켜 약산 또는 약 알칼리 상태로 중화과정을 수행하였다. 이때 발열 반응으로 용액 내에 당성분들이 변성을 일으킬 가능성이 있기 때문에 냉각장치를 통해 용액을 20 내지 30℃이하로 유지하였으며, 고체 상태의 탄산칼슘의 양 또는 수산화 칼슘의 양은 산 처리액의 부피와 pH의 정도에 따라 가변적이며, 불용성 염으로 석출되는 과정은 다음 화학식과 같다:
H2SO4 (aq) + CaCO3 (s) + NaOH(aq) → CaSO4 (s) + 2H2O (l) + CO2 (g) + NaOH (aq) 또는
H2SO4 (aq) + Ca(OH)2 (s) + NaOH(aq) → CaSO4 (s) + 2H2O (l) + NaOH (aq)
이 과정 중에서 수용액 상에 석출되는 황산칼슘(Calcium sulfate, CaSO4) 염은 중력에 의한 침전, 필터링 및 원심분리로 제거하였으며,황산 칼슘 염이 제거된 과량의 자일로스를 포함하는 수용액은 활성탄 처리 또는 활성탄 컬럼 통과를 통해 발효 저해 물질로 작용하는 퓨리퓨랄과 같은 산처리 변형 당 성분과 용액 내에 당 성분의 갈변화로 인하여 진한 갈색을 나타내는 성분을 제거하였다.
또한, 수용액 내에 존재하는 나트륨(Na) 이온은 AG 50W-X8 resin과 같은 양이온 교환 수지 컬럼으로 제거하였으며, 미량으로 존재하는 음이온은 AG1-X8과 같은 음이온 교환 수지 컬럼으로 제거하였다. 상기 과정을 통해 탈색된 옅은 노란색의 자일로스가 함유된 수용액을 회수하였으며, 알칼리 처리 폐액으로부터 80% 이상의 효율로 자일로스를 성분을 포함하는 당 수용액을 최종적으로 얻을 수 있었다.
산 처리액에 내성을 가진 효모를 이용한 자일리톨 생산
상기 실시예 3에서 산 처리액에 대한 내성을 증가시킨 효모 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)를 1% YNB가 포함된 3 ㎖ 자일로스 용액(실시예 7에서 회수한 알칼리 처리 폐액에서 분리한 발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액)에 10% (v/v) 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 24시간 동안 교반하였다. 배양된 균체의 배양액을 1% YNB이 포함된 15 ㎖ 자일로스 용액(발효 저해 물질이 포함된 자일로스 용액)에 10% (v/v) 접종하여 30℃에서 240 rpm으로 24시간 동안 교반하여 배양하면서 자일로스 및 자일리톨의 소비량과 생산량을 HPLC 분석을 통해 분석하였다.
자일리톨 발효 결과, 캔디다 트로피칼리스는 배양 초기 자일로스의 소비속도가 느렸지만, 배양 20시간 이후부터는 30ｇ/ℓ 자일로스(xylose)를 빠르게 소모하면서 자일리톨의 생산이 일어나는 것을 확인하였으며, 배양 54시간에는 최고 11.5ｇ/ℓ의 자일리톨을 생산하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (21)

  1. 삭제
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  10. 다음의 단계를 포함하는 거대억새(Miscanthus gianteus) 알칼리 처리 공정에서 발생하는 폐액에서 자일로스를 분리하는 방법:
    (a) 거대억새를 0.4 내지 1.2 M의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)을 처리하여 70 내지 90℃로 반응시켜 알칼리 처리 공정을 거친 다음, 거대억새와 알칼리 처리 폐액을 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 알칼리 처리 폐액 내의 거대입자를 제거한 후, 분리-여과막을 사용하여 알칼리 처리 폐액에 포함되어 있는 리그닌 및 헤미셀룰로스를 농축 시키는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 리그닌 및 헤미셀룰로스가 포함된 농축액을 산으로 처리하여 리그닌-헤미셀룰로스 복합체에서 자일란의 산 가수분해 과정을 통해 자일로스를 유리시키는 단계;
    (d) 상기 자일로스가 유리된 수용액을 칼슘이온으로 처리하여 폐액에 포함되어 있는 산을 칼슘염으로 침전시켜 제거하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 산이 제거된 수용액에 포함되어 있는 발효 저해 물질을 활성탄을 이용하여 제거한 다음, 자일로스 성분을 포함하는 수용액을 회수하는 단계.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 여과된 알칼리 처리 폐액은 (a) 단계의 알칼리 처리 공정에 재사용하는 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 원심분리, 중력에 의한 침전 또는 모래 컬럼 (sand column)을 이용하여 알칼리 폐수 내의 거대 입자를 제거하는 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분리-여과막은 미세여과막(microfiltration, MF), 한외여과막(ultrafiltration, UF) 또는 나노분리막(nanofiltration, NF)인 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 상기 (c) 단계의 산 가수분해 과정은 2 내지 20%(v/v)의 황산을 처리하여, 100 내지 200 ℃에서 10분 내지 120분 동안 산 처리 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 (d) 단계의 칼슘이온으로 탄산칼슘 또는 수산화칼슘을 폐액의 pH가 5 내지 8이 되도록 첨가하여, 20℃ 내지 30℃ 이하에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  18. 제10항에 있어서, 상기 (e) 단계의 발효저해물질은 퓨리퓨랄(furfural)을 포함하는 산 처리 변형 당 성분인 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
  19. 제10항에 있어서, 상기 (e) 단계는 산 성분이 제거된 수용액에 포함되어 있는 이온성 물질을 제거하기 위해 이온교환 수지를 이용하여 분리 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자일로스를 분리하는 방법.
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