WO2012029842A1 - リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法 - Google Patents

リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012029842A1
WO2012029842A1 PCT/JP2011/069743 JP2011069743W WO2012029842A1 WO 2012029842 A1 WO2012029842 A1 WO 2012029842A1 JP 2011069743 W JP2011069743 W JP 2011069743W WO 2012029842 A1 WO2012029842 A1 WO 2012029842A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
treatment
saccharification
fermentation
lignocellulose
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/069743
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
稿太郎 石川
敦 古城
雅蘋 趙
寿子 得能
純 杉浦
基広 松村
Original Assignee
王子製紙株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2011123976A external-priority patent/JP4947223B1/ja
Application filed by 王子製紙株式会社 filed Critical 王子製紙株式会社
Priority to AU2011296986A priority Critical patent/AU2011296986B2/en
Priority to US13/818,824 priority patent/US8728770B2/en
Priority to CA2809519A priority patent/CA2809519C/en
Priority to BR112013004261-3A priority patent/BR112013004261B1/pt
Priority to CN201180052660.9A priority patent/CN103189521B/zh
Priority to EP11821857.7A priority patent/EP2612920B1/en
Priority to NZ607405A priority patent/NZ607405A/en
Publication of WO2012029842A1 publication Critical patent/WO2012029842A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE
    • B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention comprises a pretreatment step of subjecting a lignocellulose-based raw material to a treatment suitable for use in enzymatic saccharification reaction, and an enzymatic saccharification step of saccharifying the pretreated lignocellulosic raw material with an enzyme. More specifically, the present invention relates to an enzyme comprising a cellulolytic enzyme and a hemicellulolytic enzyme that contains lignocellulose that has been subjected to a treatment suitable for saccharification.
  • a group of lignocellulosic biomass capable of recovering the used enzyme group from the reaction solution with high recovery and circulating it over a long period of time
  • Enzymatic saccharification treatment method or biomass containing lignocellulose the fine fibers remaining in the treatment suspension after concurrent saccharification and fermentation treatment are recovered, and the recovered fine fibers are again subjected to the saccharification or concurrent saccharification and fermentation treatment, and the ethanol production can be improved.
  • the present invention relates to a method for producing ethanol from biomass containing lignocellulose. This application is related to Japanese Patent Application No.
  • the technology to produce sugar from lignocellulosic raw material that has been treated appropriately for saccharification uses alcohol as a substitute fuel for gasoline by using this sugar as a fermentation substrate for microorganisms, and converts succinic acid and lactic acid as plastic raw materials It is a useful technology for the formation of a recycling society because it can produce raw materials for products.
  • Methods of producing monosaccharides and oligosaccharides to be fermentation substrates from polysaccharides in plant biomass can be roughly divided into two. One is an acid saccharification method that hydrolyzes using a mineral acid, and the other is an enzyme saccharification method that hydrolyzes using an enzyme and a microorganism that produces the enzyme.
  • the acid saccharification method is technically completed compared to the enzymatic saccharification method, but in the case of the method using lignocellulosic biomass as the raw material, the sugar yield is lower than the method using starch or waste molasses as the raw material In addition to the fact that the treatment equipment for waste acid discharged from the treatment process and large equipment that can resist corrosion by acid are required, this is a cause of the increase in product cost, which is a major barrier to practical use. ing.
  • the enzymatic saccharification method has approached the cost of the acid saccharification method at the whole cost including the post treatment due to the recent decrease of the price of the enzyme and the progress of the technology, but the whole of the enzymatic saccharification method Since the cost of enzymes, which account for a high proportion of the cost, is still high, it is important to further reduce the cost of enzymes for practical application of the enzymatic saccharification method.
  • Lignocellulosic materials from which lignin has not been removed are less susceptible to degradation by enzymes than lignocellulosic materials from which lignin is removed, and are not saccharified and remain as residues in the saccharification solution together with impurities such as resin and metal. Generally, this residue is separated and discarded by screen, centrifugation or the like. Since a large amount of an enzyme that occupies a large specific gravity in the cost of the enzymatic saccharification method is adsorbed to this residue, if the residue separated from the reaction solution is discarded as it is, expensive enzymes are also discarded. There was a problem. That is, the problem is to recover and effectively use the residue to reduce the cost of the enzymatic saccharification method.
  • Patent Document 6 As a technology to reuse the residue recovered in the enzymatic saccharification method, a method of burning the residue and obtaining thermal energy (hydrothermal gasification of the residue) and synthesizing ethanol from the produced synthesis gas with an ethanol synthesis catalyst A method (Patent Document 6), a method of using a residue as fuel or fertilizer (Patent Document 7), and a method of using a residue as thermal energy (Patent Document 8) have been reported. However, these methods are not sufficient as a method for solving the problem of cost reduction when devising a practical facility because the cost increase due to the addition of the process step is large.
  • washing of the residue is considered as a means for recovering the enzyme in the residue as described above.
  • the enzyme is strongly bound to cellulose by the cellulose binding domain (CBD) etc. which specifically adsorbs to the cellulose contained in its molecule, the enzyme adsorbed to cellulose can be sufficiently obtained by mere water washing. It was difficult to recover. Therefore, for the purpose of improving the recovery rate of the enzyme, there has been proposed a method of treating by adding a surfactant (see Patent Document 1).
  • the recovery rate of the enzyme is not sufficient, and the enzyme deactivation due to the addition of a drug, the cost increase associated with the addition of treatment steps, and the adverse effect on microorganisms in the subsequent fermentation stage. It is not practical because there are concerns, etc.
  • Patent Document 4 There has been proposed a method of reusing lignocellulose residue adsorbed by the enzyme for the next enzymatic saccharification without passing through the step of peeling the adsorbed enzyme. In this method, it is feared that the reaction efficiency is reduced since accumulation of residue is inevitable.
  • enzymes that have CBD such as CBH (cellobiohydrolase)
  • reprocessing of lignocellulosic residues in the next step makes it possible to recycle the enzyme, but ⁇ -glucosidase etc. is released in the supernatant. It is difficult to recycle all of the added cellulase.
  • the undegraded residue itself is in a state of being difficult to be degraded even if it is mixed with the enzyme solution again, so it is an object to make the undegraded residue easy to be saccharified.
  • the inventors of the present invention have found that the amount of ethanol production is increased by mechanically treating the undegraded residue recovered by solid-liquid separation and performing saccharification and fermentation again (Patent Document 9).
  • the residue used as a raw material in this method has a problem that it is a residue recovered by a 420 mesh (38 ⁇ m) screen and contains fibers of a wide size.
  • Fibers of large size with large lignin adsorption are difficult to be degraded by enzymes, and therefore, they are not sufficiently saccharified without pretreatment (mechanical treatment etc.). If only fibers of small size with a small amount of lignin adsorption are selectively recovered and pretreated as a raw material and can be enzymatically saccharified again, it is expected that the efficient production of ethanol can be improved.
  • the membrane separation device separates the solution and circulates only the unreacted raw material to the main reaction tank, and the enzyme and generated glucose and cellobiose are separated from the hydrolyzate from the membrane separation device and only the enzyme is recycled to the main reaction tank
  • the cost is predicted assuming a continuous system provided with a circulation line having an external filtration device. According to this system, the saccharification rate is 100% in 25 hours, and the remaining rate of the enzyme is 95% or more in 24 hours.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-87994 Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-234790 Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-144885 JP, 2010-98951, A Patent 4447148 JP, 2005-168335, A JP 2008-54676 A JP, 2009-106932, A Japanese Patent Application No. 2009-190862
  • the technology for producing saccharides from biomass such as lignocellulose is a technology that can newly supply fuel and plastic materials that have relied on fossil resources so far, and is a technology that is particularly useful for the construction of a recycling society.
  • biomass such as lignocellulose
  • the technology for producing saccharides from biomass such as lignocellulose is a technology that can newly supply fuel and plastic materials that have relied on fossil resources so far, and is a technology that is particularly useful for the construction of a recycling society.
  • the problem is that it is not economical because the cost of enzymes required for saccharification is high.
  • the present invention provides a method capable of effectively utilizing the enzyme input for enzymatic saccharification treatment of lignocellulosic material without waste, and in the process of producing lignocellulose-based ethanol, ethanol recovery It aims to provide a high-rate ethanol production method.
  • the present inventors in the step of continuously carrying out the enzymatic saccharification reaction, repeatedly use the high-priced enzyme which accounts for a very large proportion of the overall cost by increasing the recovery rate of the enzyme.
  • the present invention adopts the means for suppressing the adsorption of the enzyme by the lignocellulose raw material, the reaction residue and the like in the enzyme saccharification reaction solution, and the separation of the enzyme from the reaction solution after the enzyme saccharification reaction. It is based on the idea that it is a means by which it is possible to prevent the enzyme from being discharged out of the system together with the residue to be disposed of as well as facilitating the treatment.
  • lignocellulosic material that has been pretreated to be a material suitable for enzymatic saccharification reaction to the water containing cellulose saccharifying enzyme together with the electrolyte consisting of water soluble salts, to make the conductivity 5 to 25 mS / cm
  • Enzymatic saccharification treatment by enzyme saccharification reaction as adjusted raw material suspension, reaction product and enzyme-containing liquid are separated and recovered from the treated suspension after enzymatic saccharification treatment, and the recovered enzyme-containing liquid is used for the enzymatic saccharification treatment process
  • a method of enzymatic saccharification treatment of lignocellulosic material characterized in that it is circulated as an enzyme.
  • One of the alkali chemicals selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate as the pretreatment suitable for the above-mentioned enzymatic saccharification reaction.
  • a pretreatment method comprising the chemical treatment of immersing in a solution containing a mixture of them or a mixture of sodium sulfite and their alkali chemicals as described in (1), which is a pretreatment comprising the chemical treatment.
  • lignocellulose-based material according to any one of (1) to (4), wherein the water-soluble salt is at least one water-soluble salt selected from alkali metal salts and alkaline earth metal salts. Enzymatic saccharification treatment method.
  • the water-soluble salts are halides, sulfates, sulfites, thiosulfates, carbonates, hydrogencarbonates, phosphates, dihydrogenphosphates, phosphoric acids of alkali metals or alkaline earth metals.
  • a pretreatment step of subjecting a lignocellulose-based material to a treatment suitable as a material suitable for an enzyme-glycation reaction and a method comprising subjecting the lignocellulose-based material subjected to the pretreatment to an electrolyte comprising water-soluble salts.
  • a series of lignocellulosic feedstock is a method for enzymatic saccharification treatment according to step (1) to enzymatic saccharification method lignocellulosic feedstock according to any one of (6) with a step.
  • a pretreatment step of subjecting a lignocellulose-based material to a treatment suitable as a material suitable for the enzyme saccharification reaction, and a method of fermenting the lignocellulose-based material subjected to the pretreatment with a saccharide as a fermentation substrate For enzymatic saccharification treatment and saccharides treated with enzymatic saccharification reaction as raw material suspension which is added to cellulose saccharifying enzyme-containing water together with electrolytes consisting of microorganisms and water soluble salts and the electric conductivity is adjusted to 5-25 mS / cm
  • a simultaneous saccharification / fermentation treatment step carried out by carrying out the fermentation treatment in parallel, and separating the treated suspension from the coexistence saccharification / fermentation treatment step into a residue and a liquid fraction with a screw press having a screen size of 1.0 to 2.0 mm Solid-liquid separation step, sieving processing step of separating liquid fraction from the solid-liquid separation step into fine fiber and liquid fraction by sieving treatment of 80 to 600 mesh, after the sieving treatment
  • the enzymatic saccharification treatment method of the present invention the adsorption of the saccharifying enzyme to the unreacted portion of the lignocellulosic material, the reaction residue, etc. is suppressed, and the separation and recovery of the saccharifying enzyme from the enzyme-treated suspension are easy.
  • a highly economical continuous saccharification treatment method for lignocellulosic biomass with extremely low enzyme loss is provided.
  • ethanol is selectively recovered by selectively collecting fine fibers contained in the culture solution after simultaneous saccharification and fermentation using lignocellulose as a raw material, and performing again saccharification or parallel saccharification fermentation using the collected fine fibers as a raw material. It is possible to improve the production volume.
  • lignocellulosic raw materials used as raw materials in the method of the present invention, woody materials such as wood for papermaking, wood residue, chips or barks such as thinnings, sawdust or sawdust generated from lumber factories etc., pruning of street trees Agronomic waste such as kenaf, rice straw, wheat straw, bagasse etc., and residues of industrial crops such as oil crops and rubber (eg EFB: Eumpty Fruit Bunch), herbaceous Examples include Elanthus energy-based energy crops, lignocellulosic biomass such as miscanthus and napiergrass.
  • lignocellulose-based materials in the present invention wood-derived paper, waste paper, pulp, pulp sludge and the like can also be used.
  • the lignocellulosic lignocellulosic raw materials wood bark is hardly used at present, and those of uniform quality are available in large quantities in lumber and chip factories, and more It is particularly preferable as a raw material for saccharification treatment and concurrent saccharification fermentation treatment because it is flexible and contains a large amount of soluble components.
  • the bark of tree species such as Eucalyptus or Acacia, which is generally used for papermaking raw materials, can be obtained in large quantities from lumber and chip factories for papermaking raw materials in particular, especially It is preferably used.
  • the pretreatment to be a raw material suitable for the enzymatic saccharification treatment of the present invention is a treatment for subjecting the lignocellulose-based raw material to the following pretreatment to render lignocellulose into a state capable of enzymatic saccharification.
  • Chemical treatment hydrothermal treatment, pressurized hot water treatment, carbon dioxide added hydrothermal treatment, steaming treatment, wet grinding treatment, mechanical treatment such as mechanical grinding treatment or crushing fiberization treatment, dilute sulfuric acid treatment, steam explosion treatment, Ammonia explosion treatment, carbon dioxide explosion treatment, ultrasonic irradiation treatment, microwave irradiation treatment, electron beam irradiation treatment, ⁇ ray irradiation treatment, supercritical treatment, subcritical treatment, organic solvent treatment, phase separation treatment, wood rot fungus treatment, Green solvent activation treatment, various catalyst treatment, radical reaction treatment, ozone oxidation treatment.
  • These processes may be either single processes or processes combining a plurality of processes. Among them, it is preferable to subject the lignocellulosic biomass to one or more pretreatments selected from chemical treatment, pressurized hot water treatment, crushing fiberization treatment and mechanical grinding treatment.
  • the chemical treatment is a treatment for immersing a lignocellulose-based material in an aqueous solution of a chemical such as an acid or an alkali to make it suitable for the enzymatic saccharification treatment in the next step.
  • a chemical such as an acid or an alkali
  • No particular limitation is imposed on the chemical or the like used for the chemical treatment, but, for example, one or more of alkali metal or alkaline earth metal hydroxide, sulfuric acid, sulfide such as dilute sulfuric acid, carbonate, sulfate or sulfite Alkali treatment etc.
  • the amount of chemical agent used for chemical treatment can be arbitrarily adjusted depending on the situation, from the viewpoint of chemical cost reduction, and also from the viewpoint of prevention of yield loss due to dissolution and overdegradation of cellulose, lignocellulose It is desirable that it is 50 mass parts or less with respect to 100 mass parts of bone dry of a system raw material.
  • the immersion time of the chemical in the chemical treatment in the aqueous solution and the treatment temperature can be optionally set depending on the raw materials and chemicals used, but generally, the treatment time is 20 to 90 minutes and the treatment temperature is 80 to 200 ° C. be able to.
  • the treatment time is preferably 70 minutes or less and the treatment temperature is 180 ° C. or less. More preferably, the treatment time is 30 minutes to 1 hour, and the treatment temperature is 80 ° C. to 130 ° C.
  • the mechanical treatment may be any mechanical means such as crushing, cutting, grinding and the like, and is to make lignocellulose in a state of being easily saccharified in the saccharification and fermentation treatment step of the next step.
  • the mechanical device to be used is not particularly limited, but, for example, a uniaxial crusher, a biaxial crusher, a hammer crusher, a refiner, a kneader or the like can be used.
  • the lignocellulosic material that has been pretreated to be a material suitable for treatment by an enzymatic saccharification reaction is preferably subjected to a sterilization treatment before being used to prepare a lignocellulosic material suspension.
  • a sterilization treatment may be a method of exposing the raw material to a pH at which the growth of bacteria is difficult, such as acid or alkali, but may be a method of treatment under high temperature, or both may be combined.
  • the raw material after acid and alkali treatment is preferably used as a raw material after being adjusted to near neutral or at a pH suitable for saccharification treatment or saccharification fermentation treatment.
  • a pH suitable for saccharification treatment or saccharification fermentation treatment even when pasteurized at high temperature, it is preferable to lower the temperature to room temperature or a temperature suitable for the treatment in the saccharification fermentation step and then use it as a raw material. In this way, by adjusting the temperature and pH and sending out the raw material, it is possible to prevent the enzyme from being exposed to outside of the preferred pH and the preferred temperature and inactivating.
  • the lignocellulosic material which has been pretreated to be a material suitable for treatment by enzymatic saccharification reaction is a mixture of an appropriate amount of water, enzymes and a water-soluble salt, and optionally, microorganisms such as yeast required for fermentation. It is a suspension and is supplied to the enzymatic saccharification treatment step in a state in which the electrical conductivity is adjusted to a predetermined value.
  • a representative process for carrying out the enzymatic saccharification treatment method is shown in FIG.
  • the lignocellulose system supplied from the pretreatment process shown as “pretreatment” A raw material suspension prepared by adding a raw material, a saccharifying enzyme and a water-soluble salt as an electrolyte to an appropriate amount of water is subjected to enzymatic saccharification treatment under stirring.
  • the lignocellulose raw material concentration in the raw material suspension is preferably 1 to 30% by mass. If it is less than 1% by mass, there is a problem that the concentration of the product is finally too low and the cost of concentrating the product is high. In addition, as the concentration becomes higher than 30% by mass, stirring of the raw material becomes difficult, and a problem occurs that the productivity is lowered.
  • the electrical conductivity of the raw material suspension in the enzymatic saccharification treatment step is preferably maintained in the range of 5 mS / cm to 25 mS / cm.
  • the pH is selected in the range of 3.5 to 10.0 without inactivation of the enzyme used, but it is more preferable to maintain the pH in the range of 3.5 to 7.5.
  • the temperature of the enzyme saccharification treatment is not particularly limited as long as it is within the range of the optimum temperature of the enzyme, and generally 25 to 50 ° C., preferably 30 to 40 ° C.
  • the reaction time varies depending on the enzyme concentration, but in the case of a batch system, it is generally 10 to 240 hours, preferably 15 to 160 hours. Also in the case of the continuous system, a typical average residence time is 10 to 150 hours, preferably 15 to 100 hours.
  • the cellulolytic enzyme used for the enzymatic saccharification treatment or parallel saccharification fermentation is appropriately selected from an enzyme group generally having so-called cellulases having cellobiohydrolase activity, endoglucanase activity and beta glucosidase activity.
  • Each cellulolytic enzyme may be added with an appropriate amount of the enzyme having the respective activity, but the commercially available cellulase preparation has hemicellulase activity as well as various cellulase activities described above. Commercial cellulase preparations may be used since many of them are present.
  • cellulase preparations include Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Phanerochaete, Trametes, Humicola, and Bacillus. There are cellulase preparations derived from genus or the like. As commercially available products of such cellulase preparations, all are trade names, for example, cell leucine T2 (manufactured by HI), Meiserase (manufactured by Meiji Seika Kaisha), Novozyme 188 (manufactured by Novozyme), Maltifect CX10L (manufactured by Genencor) And GC220 (manufactured by Genencor Corporation).
  • the amount of the cellulase preparation used is preferably 0.5 to 100 parts by mass, particularly preferably 1 to 50 parts by mass, with respect to 100 parts by mass of the raw material solid content.
  • water-soluble salt to be added as an electrolyte one selected from an acid salt, a basic salt, a neutral salt, or a salt-containing buffer such as an acetate buffer or a citrate buffer may be used alone or in combination.
  • a concentration of the water-soluble salt can be freely set as long as it does not adversely affect the enzymatic saccharification reaction.
  • water-soluble salts selected from alkali metal salts and alkaline earth metal salts are preferable.
  • Alkali metal salts and alkaline earth metal salts include halides, sulfates, sulfites, thiosulfates, carbonates, hydrogencarbonates, phosphates and dihydrogenphosphates of alkali metals and alkaline earth metals, And water soluble salts selected from the group consisting of hydrogen phosphate disalt, acetate, and citrate.
  • a water-soluble salt can be added as an electrolyte in the enzymatic saccharification treatment step.
  • an electrolyte to the raw material suspension to maintain the electric conductivity of the raw material suspension in the range of 5 to 25 mS / cm.
  • the electrolyte can be added without limitation in any step as long as it is a step in which the electrolyte can be added in operation. Addition in the primary saccharification and fermentation process is desirable because operation is easy.
  • Solid-liquid separation The treated suspension leaving the "saccharification step” is sent to a solid-liquid separation step having a filtering device shown as "solid-liquid separation” in FIG. 1 to remove solid residues.
  • the solid residue separated by the filtration device in the solid-liquid separation step contains lignin, hemicellulose, and cellulose, but since cellulose is protected by lignin etc., further saccharification can not be promoted, so usually it is It is discharged out of the process.
  • the culture solution leaving the primary simultaneous saccharification and fermentation step is transferred to the solid-liquid separation step, and separated into a liquid portion (filtrate) and a residue (primary residue).
  • a screw press with a screen size of 1.0 to 2.0 mm is used as an apparatus for solid-liquid separation.
  • the screw press is structurally unlikely to be clogged with fibers, and is an apparatus capable of efficient solid-liquid separation with relatively little energy. A back pressure may be applied to improve the solid-liquid separation efficiency.
  • the residue separated in the solid-liquid separation step contains lignin, hemicellulose, and cellulose, and lignin and the like are adsorbed on the cellulose, making it difficult to saccharify with the enzyme.
  • the residue after the solid-liquid separation step contains a large amount of fibers not decomposed in the primary concurrent saccharification and fermentation step, and the mechanical treatment or chemical treatment facilitates saccharification (Patent Document 6).
  • the filtrate (liquid component) separated in the solid-liquid separation step is transferred to the next sieving step.
  • the liquid fraction from which the solid residue has been removed in the solid-liquid separation step is then sent to the centrifugation step indicated as “centrifugation” and the residual residue associated with the liquid fraction leaving the solid separation step is It is removed and sent to the recovery step of the sugar solution and the enzyme solution shown as “membrane separation” in FIG.
  • the distillation residue is transferred to the centrifugation step and the remaining residue (secondary residue) is removed by centrifugation, and then the liquid fraction is recycled to the primary concurrent saccharification and fermentation step (see FIG. 3).
  • This liquid fraction contains an enzyme and is reused in the primary concurrent saccharification and fermentation process.
  • the residue contains lignin, which can be recovered as a combustion raw material and used as energy, or lignin can be recovered and used effectively.
  • the liquid fraction from which residual residues have been removed in the centrifugation step is a liquid fraction containing the enzyme and the produced saccharide, and the enzyme-containing liquid and the sugar-containing liquid are shown in the membrane separation step shown as "membrane separation" in FIG.
  • the enzyme-containing solution is sent to an enzyme solution reservoir indicated as “recovered enzyme” and circulated therefrom as an enzyme source.
  • the saccharide-containing liquid is taken out as a product as it is.
  • the saccharide-containing liquid contains not only monosaccharides such as hexa- and penta-carbon sugars, but also oligosaccharides, so if the purpose is to produce monosaccharides, separate oligosaccharides and It can also be supplied to the process and further treated with enzymes to be decomposed into monosaccharides.
  • the enzymatic saccharification treatment step shown as the “saccharification step” in FIG. 1 is a so-called parallel saccharification fermentation treatment step in which the fermentation treatment by microorganisms using saccharides produced by the enzymatic saccharification reaction as a raw material (fermentation substrate) is simultaneously performed.
  • a microorganism for fermentation which uses the produced saccharide as a fermentation substrate (fermentation raw material) is added to the raw material suspension.
  • lignocellulosic raw materials treated in a state suitable for enzymatic saccharification treatment in the pretreatment step are added to an appropriate amount of water together with water-soluble salts as electrolytes, cellulolytic enzymes, microorganisms for fermentation such as alcohol yeast, etc.
  • a lignocellulosic material that has been subjected to pretreatment suitable for saccharification and fermentation is mixed with an appropriate amount of water and enzymes, and a microorganism such as yeast required for fermentation, and supplied to the primary concurrent saccharification and fermentation process.
  • a typical process of the parallel saccharification and fermentation treatment method is shown in FIG. In FIG. 3, a lignocellulose-based material treated to a state suitable for saccharification and fermentation treatment in the pretreatment step is saccharified (cellulose ⁇ glucose) by an enzyme and then fermented (glucose ⁇ ethanol) by yeast.
  • Yeast etc. are used as microorganisms used for fermentation.
  • the microorganism may be added together with the medium used for the culture.
  • yeast known yeasts described in Patent Document 3 and the like, for example, Saccharomyces cerevisiae (Sacharomiyces cerevisae), Pichia yeast (Pichia stipitis), Isachenkia orientalis (Issatchenkia orientalis), Candida brassica (Candida brassicae), Rhizopus yeasts (yeast) such as javanicus can be used.
  • the microorganism may be immobilized.
  • Immobilizing the microorganism can omit the step of recovering the microorganism in the next step, or at least reduce the burden on the recovery step, and can also reduce the risk of losing the microorganism. Although there is no merit in immobilizing the microorganism, it is possible to facilitate the recovery of the microorganism by selecting the coagulating microorganism.
  • the treated suspension from the concurrent saccharification and fermentation process is sent to a solid-liquid separation process to remove solids, and then the liquid fraction containing the fermentation product and the saccharide is a fermentation product.
  • a “distillation step” shown as “distillation” in FIG.
  • distillation step fermentation products are separated by distillation under reduced pressure. Vacuum distillation can separate fermentation products at low temperatures, thus preventing enzyme inactivation.
  • a vacuum distillation apparatus a rotary evaporator, a flash evaporator, etc. can be used as a vacuum distillation apparatus.
  • the distillation temperature is preferably 25 to 60 ° C. If it is less than 25 ° C., distillation of the product takes time and productivity is reduced. On the other hand, if the temperature is higher than 60 ° C., the enzyme is thermally denatured and inactivated, and the amount of newly added enzyme is increased, which deteriorates the economic efficiency.
  • the concentration of fermentation products remaining in the distillation residue after distillation is preferably 0.1% by mass or less. By setting it as such a concentration, the amount of fermentation products discharged with the residual residue in the subsequent centrifugation step can be reduced, and the yield can be improved.
  • the distillation residue from the distillation step is then sent to a centrifugation step, shown as "centrifugation” in FIG. 2, to remove entrained residual residues in the distillation residue and to contain enzymes and sugars
  • a liquid fraction is obtained.
  • the liquid fraction containing the enzyme and the saccharide is sent to the membrane separation step shown as “membrane separation” in FIG. 2 to be separated into the enzyme-containing liquid and the sugar-containing liquid, and the enzyme-containing liquid is shown in FIG. It is circulated and supplied to the "simultaneous saccharification and fermentation process" through the enzyme solution storage tank shown as "recovered enzyme". Further, the sugar-containing liquid is collected in a sugar liquid storage tank shown as "sugar” in FIG. 2 to be a sugar product.
  • the oligosaccharide may be recovered as a product as required, or in the same manner as described for the enzymatic saccharification treatment according to the process of FIG. It can also be used as a raw material for
  • the suspension concentration of the lignocellulosic material is preferably 1 to 30% by mass. If it is less than 1% by mass, there is a problem that the concentration of the product is finally too low and the cost of concentrating the product is high. In addition, as the concentration becomes higher than 30% by mass, stirring of the raw material becomes difficult, and a problem occurs that the productivity is lowered.
  • the filtrate after solid-liquid separation is sieved to separate into fine fibers and filtrate (liquid portion).
  • any sieving apparatus capable of separating fine fibers can be used without particular limitation.
  • a screen, a filter press, etc. can be used as a sieve processing apparatus.
  • the mesh (mesh) of the sieve is preferably 80 mesh to 600 mesh (28 to 182 ⁇ m), more preferably 150 mesh to 400 mesh (39 to 97 ⁇ m).
  • the sieve may be vibrated by attaching a vibrating device.
  • the fine fiber separated by the above treatment has a low lignin content as compared with the primary residue and the secondary residue, and is easily saccharified by the enzyme.
  • the recovered fine fibers may be transferred to a primary saccharification and fermentation process and used as a raw material for saccharification and fermentation (see FIG. 3).
  • the recovered fine fibers can be transferred to a secondary saccharification and fermentation step (saccharification and fermentation step different from the primary saccharification and fermentation step) to be described later and used as a raw material for saccharification and fermentation (see FIG. 4).
  • only saccharification may be performed in another step.
  • the enzyme adsorbed to the fine fiber can be effectively used.
  • the filtrate separated by sieving is transferred to a distillation process.
  • the secondary parallel saccharification and fermentation treatment step is a saccharification and fermentation step independent of the primary parallel saccharification and fermentation treatment step, and it is possible to carry out saccharification and fermentation using new lignocellulose as a raw material, or to carry out saccharification and fermentation using residues discharged within the process It can also be done.
  • sugars that have not been fermented to ethanol in the primary simultaneous saccharification and fermentation process can also be fermented in the secondary parallel saccharification and fermentation process.
  • six-carbon sugars derived from cellulose ie, glucose, mannose, galactose, etc.
  • the fine fibers recovered by the sieving process can be transferred to the secondary simultaneous saccharification and fermentation treatment step to be saccharified and fermented.
  • ⁇ Distillation process> The filtrate after the sieving treatment or the treatment solution (culture fluid) after the secondary concurrent saccharification and fermentation treatment step is transferred to the distillation step (see FIGS. 3 and 4).
  • the distillation step fermentation products are separated by distillation under reduced pressure. Under reduced pressure, fermentation products can be separated at a low temperature, thus preventing enzyme inactivation.
  • a vacuum distillation apparatus a rotary evaporator, a flash evaporator, etc. can be used as a vacuum distillation apparatus.
  • Example A1 100 g of crushed forest residue was put into 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda, treated at 90 ° C. for 30 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). What was dewatered and washed with a screw press was used as a substrate raw material. The conductivity of the substrate material is 11 by adding a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) to a final concentration of 1%, ammonium sulfate to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride to a final concentration of 100 mM. A 400 ml lignocellulose suspension of .8 mS / cm was prepared.
  • the lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, cooled to 40 ° C., and then 10 ml of an enzyme (trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation) was added.
  • the saccharification reaction was carried out under stirring at 30 ° C. and 120 rpm, 1 ml of the reaction solution was collected after 24 hours and 48 hours, and the enzyme activity of the supernatant centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes was measured.
  • the recovery rate was calculated using the activity of ⁇ -glucosidase, which is the most important in enzyme recovery, as an indicator.
  • the activity was measured by the following method.
  • ( ⁇ -glucosidase activity) For measurement of ⁇ -glucosidase activity, 4 ⁇ l of enzyme solution is added to 16 ⁇ l of 125 mM acetate buffer (pH 5.0) containing 1.25 mM 4-Methyl-umberiferyl-glucoside, and the reaction is carried out at 37 ° C. for 10 minutes, and then 500 mM glycine The reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of NaOH buffer solution (pH 10.0) and measuring the fluorescence intensity at 460 nm with excitation light of 350 nm.
  • the enzyme recovery rate was determined from the following formula.
  • Enzyme recovery rate (%) (enzyme activity of supernatant / enzyme activity added) ⁇ 100
  • Example A2 The procedure of Example A1 was repeated except that sodium hydrogen carbonate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A1.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 8.6 mS / cm.
  • Example A3 100 g of crushed forest residue was put into 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda, treated at 90 ° C. for 30 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). What was dewatered and washed with a screw press was used as a substrate raw material. The substrate material is added to a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) is added to a final concentration of 1%, ammonium sulfate is added to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride is added to a final concentration of 100 mM. 400 ml of a raw material suspension of / cm was prepared. The lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C.
  • Example A4 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium chloride was added to a final concentration of 100 mM, and potassium chloride was added to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 13.3 mS / cm.
  • Example A5 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium iodide was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 14.5 mS / cm.
  • Example A6 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium sulfate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 14.7 mS / cm.
  • Example A7 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium sulfite was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 13.6 mS / cm.
  • Example A8 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium thiosulfate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 16.9 mS / cm.
  • Example A9 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium carbonate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 12.6 mS / cm.
  • Example A10 Example A3 was carried out in the same manner as Example A3, except that sodium chloride was added to a final concentration of 100 mM and dipotassium hydrogen phosphate was added to a final concentration of 100 mM. .
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 15.0 mS / cm.
  • Example 11 Example A3 was repeated except that sodium dihydrogenphosphate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3. .
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 11.9 mS / cm.
  • Example A12 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium hydrogen carbonate was added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 8.9 mS / cm.
  • Example A13 The procedure of Example A3 was repeated except that sodium chloride was added to a final concentration of 100 mM and trisodium citrate was added to a final concentration of 100 mM in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 15.4 mS / cm.
  • Example A14 The method of Example A3 is the same as Example A3, except that acetic acid buffer (pH 5.0) is added to a final concentration of 100 mM instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM. went.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 7.1 mS / cm.
  • Example A15 The method of Example A3 is the same as Example A3, except that, instead of sodium chloride being added to a final concentration of 100 mM, citric acid buffer (pH 5.0) is added to a final concentration of 100 mM. I went to. The electrical conductivity in the reaction system at this time was 10.9 mS / cm.
  • Example A16 100 g of crushed Eucalyptus globulus bark was put into 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda, treated at 90 ° C. for 30 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). The milled solution from this refiner was dewatered and washed by a screw press, and used as a substrate material. The conductivity of the substrate material is 11 by adding a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) to a final concentration of 1%, ammonium sulfate to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride to a final concentration of 100 mM. A 400 ml lignocellulose suspension of .8 mS / cm was prepared.
  • the lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, cooled to 40 ° C., and then an enzyme (trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation) was added.
  • the saccharification reaction was carried out under stirring at 30 ° C. and 120 rpm, 1 ml of the reaction solution was collected after 24 hours and 48 hours, and the enzyme activity of the supernatant centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes was measured.
  • Example A17 100 g of crushed Eucalyptus globulus bark was put into 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda, treated at 90 ° C. for 30 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). The milled solution from this refiner was dewatered and washed by a screw press, and used as a substrate material. The conductivity of the substrate material is 11 by adding a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) to a final concentration of 1%, ammonium sulfate to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride to a final concentration of 100 mM. A 400 ml lignocellulose suspension of .8 mS / cm was prepared.
  • the lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, cooled to 40 ° C., and then an enzyme (trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation) was added. Furthermore, commercially available yeast (trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited) is added to the lignocellulose suspension prepared as described above, and saccharification fermentation culture is carried out at 30 ° C. under 120 rpm stirring, and after 24 hours, 48 hours The subsequent reaction solution (1 ml) was collected, and the enzyme activity of the supernatant centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes was measured.
  • an enzyme trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation
  • yeast trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited
  • Example A18 100 g of crushed forest residue was put into 700 ml of water containing 20 g of 97.0% sodium sulfite and 1 g of caustic soda, treated at 170 ° C. for 60 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). What was dewatered and washed with a screw press was used as a substrate raw material. The conductivity of the substrate material is 8 by adding a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) to a final concentration of 1%, ammonium sulfate to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride to a final concentration of 100 mM. A 400 ml lignocellulose suspension of 9 mS / cm was prepared.
  • the lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and after cooling to 40 ° C., 10 ml of the enzyme (GC220: Genencor Co.) was added.
  • the saccharification reaction was carried out under stirring at 30 ° C. and 120 rpm, 1 ml of the reaction solution was collected after 24 hours and 48 hours, and the enzyme activity of the supernatant centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes was measured.
  • Example A19 100 g of crushed forest residue was put into 700 ml of water containing 20 g of 97.0% sodium sulfite and 1 g of caustic soda, treated at 170 ° C. for 60 minutes, and then ground with a refiner (clearance 0.5 mm). What was dewatered and washed with a screw press was used as a substrate raw material. The conductivity is increased by adding the substrate material to a final concentration of 5%, CSL (corn steep liquor) to a final concentration of 1%, ammonium sulfate to a final concentration of 0.5%, and sodium chloride to a final concentration of 100 mM. 400 ml of 4 mS / cm lignocellulose suspension was prepared.
  • the lignocellulose suspension thus prepared was steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, cooled to 40 ° C., and then 10 ml of an enzyme (trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation) was added. Furthermore, commercially available yeast (trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited) is added to the lignocellulose suspension prepared as described above, and saccharification fermentation culture is carried out at 30 ° C. under 120 rpm stirring, and after 24 hours, 48 hours The subsequent reaction solution (1 ml) was collected, and the enzyme activity of the supernatant centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes was measured.
  • an enzyme trade name, GC220: manufactured by Genencor Corporation
  • yeast trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited
  • Example A16 was carried out in the same manner as Example A16 except that 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda was replaced with 700 ml of water containing 20 g of 97.0% sodium sulfite and 1 g of caustic soda.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 11.2 mS / cm.
  • Example A21 Example A17 was carried out in the same manner as Example A17 except that 1000 ml of water containing 20 g of 48% caustic soda was replaced with 700 ml of water containing 20 g of 97.0% sodium sulfite and 1 g of caustic soda.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 11.2 mS / cm.
  • Example A1 Example A1 except that in the method of Example A1, instead of adding sodium chloride to a final concentration of 100 mM, sulfuric acid was added to adjust the electric conductivity of the reaction system to 6.5 mS / cm. It went in the same way.
  • Example A2 The procedure of Example A1 was repeated except that sodium hydroxide was added instead of sodium chloride to a final concentration of 100 mM to adjust the conductivity of the reaction system to 8.0 mS / cm. It carried out similarly to Example A1.
  • Example 3 was repeated except that sodium chloride was not added in the method of Example A3.
  • the electrical conductivity in the reaction system at this time was 4.2 mS / cm.
  • Example A4 An example of the method of Example A3 except that in place of sodium chloride to a final concentration of 100 mM, sulfuric acid is added to adjust the electric conductivity in the reaction system to 6.3 mS / cm. It went in the same way as A3.
  • Example A5 An example of the method of Example A3 except that hydrochloric acid is added to adjust the electric conductivity in the reaction system to 6.6 mS / cm instead of adding sodium chloride to a final concentration of 100 mM. It went in the same way as A3.
  • Example A6 The procedure of Example A3 is different from that of adding sodium chloride to a final concentration of 100 mM, except that sodium hydroxide is added to adjust the electric conductivity in the reaction system to 8.2 mS / cm, It carried out similarly to Example A3.
  • Example A7 In the method of Example A1, instead of adding sodium chloride to a final concentration of 100 mM, sodium chloride is added to a final concentration of 5 mM to make the conductivity of the reaction system 4.6 mS / cm. It carried out like Example A1 except having adjusted.
  • the enzymatic saccharification treatment method of the lignocellulosic feedstock of the example comprises adding a water-soluble salt to the enzymatic saccharification reaction system and further adjusting the electrical conductivity to a predetermined numerical range.
  • enzymatic saccharification treatment of the suspension it is shown that the recovery rate of the enzyme from the saccharification treatment solution is not only high at the initial stage, but is also stably high level even with time.
  • no water-soluble salt is added to the enzyme saccharification reaction system, and electric current is generated by using sulfuric acid (comparative examples A1 and A4), hydrochloric acid (comparative example A5) and sodium hydroxide (comparative examples A2 and A6).
  • Example B1 When the conductivity is adjusted, the enzyme recovery rate from the saccharification treatment solution is low at the initial stage, indicating that the recovery rate over time is also significantly reduced. In addition, even when no salt is added or when the conductivity of the enzyme reaction system is low (Comparative Examples A3 and A7), the enzyme recovery rate from the saccharification treatment solution is low at an early stage, It has further declined with the passage of time.
  • Example B1 Comparative Examples A3 and A7
  • the raw material after alkali treatment was ground with a refiner (KRK high concentration disc refiner: clearance 0.5 mm, manufactured by Kumagaya Riki Kogyo Co., Ltd.).
  • KRK high concentration disc refiner clearance 0.5 mm, manufactured by Kumagaya Riki Kogyo Co., Ltd.
  • the same amount of pure water was added to the raw material after grinding treatment, and the pH was adjusted to 5 using sulfuric acid under stirring.
  • the solid (pretreated product) after solid-liquid separation was used as a raw material in the saccharification and fermentation step.
  • a liquid medium glucose 30 g / L, polypeptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L, pH 5.6
  • cellulase Accellerase DUET, manufactured by Genencor Co., Ltd.
  • Solid-liquid separation The culture solution obtained by the above-mentioned primary parallel saccharification and fermentation is subjected to solid-liquid separation with a screw press (SHX-200 x 1500 L, screen size 1.2 mm, manufactured by FUKUKO INDUSTRY CO., LTD.) To separate the residue (primary residue) and the filtrate did.
  • the recovered primary residue was 19.4 kg (absolute dry weight).
  • the filtrate after solid-liquid separation was passed through a 400 mesh (39 ⁇ m) screen to recover fine fibers in the culture solution.
  • the total amount of recovered fine fibers was 15.6 kg (absolute dry weight).
  • the total amount (15.6 kg) of collected fine fibers was returned to the primary parallel saccharification fermenter.
  • the filtrate obtained by the above sieving treatment is concentrated with an aqueous solution containing ethanol under the conditions of a distillation temperature of 40 ° C., a heating temperature of 80 ° C. and a feed liquid volume of 150 L / h using a vacuum distillation apparatus (Evapol CEP-1, Ogawara Seisakusho) It isolate
  • the volume and ethanol concentration of the resulting aqueous solution containing ethanol were measured to calculate the recovery amount of ethanol.
  • the ethanol concentration in the solution was measured by a glucose sensor (model BF-400 manufactured by Oji Scientific Instruments).
  • Centrifugation A decanter centrifuge (manufactured by IHI, HS-204L) was operated at a rotational speed of 4500 rpm and a differential speed of 5.0 rpm to separate the concentrated culture solution separated from the vacuum distillation apparatus into a residue (secondary residue) and a filtrate .
  • the filtrate was transferred to a primary parallel saccharification fermentor.
  • the secondary residue recovered was 18.6 kg (absolute dry weight).
  • Production of ethanol was carried out according to the production flow shown in FIG. [Preprocessing] It carried out by the method similar to Example B1. [Primary concurrent saccharification and fermentation] It carried out by the method similar to Example B1. Solid-liquid separation It carried out by the method similar to Example B1. The recovered primary residue was 19.2 kg (absolute dry weight). [Sieve processing] It carried out by the method similar to Example B1. The recovered amount of fine fibers obtained by treating a total of 100 kg of the raw material by primary simultaneous saccharification and fermentation was 15.5 kg (absolute dry weight) in total. [Secondary concurrent saccharification and fermentation] 15.5 kg (absolute dry weight) of fine fibers obtained by sieving was added as a raw material to a secondary simultaneous saccharification fermenter.
  • Commercially available yeast (trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited) in a liquid medium (glucose 30 g / L, polypeptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L, pH 5.6) at 30 ° C. Incubated for time.
  • [Ethanol production] It carried out by the method similar to Example B1.
  • Centrifugation It carried out by the method similar to Example B1.
  • Comparative Example B1 Production of ethanol was carried out according to the production flow shown in FIG. A test in which [sieve treatment] of Example B1 was omitted was taken as Comparative Example B1 (described below).
  • [Preprocessing] It carried out by the method similar to Example B1.
  • [Primary concurrent saccharification and fermentation] It carried out by the method similar to Example B1.
  • Solid-liquid separation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the recovered primary residue was 19.3 kg (absolute dry weight).
  • the filtrate obtained by the solid separation was separated into an aqueous solution containing ethanol and a concentrated culture solution in the same manner as described in Example B1. The volume and ethanol concentration of the obtained aqueous solution containing ethanol were measured to calculate the recovery amount of ethanol.
  • Centrifugation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the secondary residue recovered was 34.2 kg (absolute dry weight).
  • Example B1 when the fine fibers are recovered and returned to the primary simultaneous saccharification fermentor
  • Example B2 when the fine fibers are recovered and transferred to the second concurrent saccharification fermentor
  • Comparative Example B1 fine fibers recovered
  • Example B1 A saccharification fermentation test was performed in a test tube using the fine fiber obtained in Example B1 as a raw material, and the ethanol production amount was measured by the following method.
  • Liquid medium A polypeptone 5 g / L, yeast extract 3 g / L, malt extract 3 g / L, glucose 30 g / L, dissolved in distilled water, pH 5.6
  • liquid medium B polypeptone 15 g / L, yeast extract 10 g
  • Commercial yeast (trade name: Maurivin: Mauri Yeast Australia Pty Limited) was cultured at 30 ° C.
  • This mixed solution was cultured at 30 ° C. for 24 hours (saccharification and fermentation).
  • the culture solution after culture was centrifuged (5000 rpm, 20 minutes) to measure the ethanol concentration of the supernatant.
  • the kappa number (an index of lignin content) of the fine fiber was measured by the measuring method according to JIS P8211.
  • Comparative Example B2 Using the primary residue obtained in Example B1 as a raw material, a saccharification and fermentation test was conducted in the same manner as in Example B3 to measure the ethanol production and the kappa number of the primary residue.
  • Example B3 Using the secondary residue obtained in Example B1 as a raw material, a saccharification and fermentation test was conducted in the same manner as in Example B3 to measure the ethanol production and the kappa number of the secondary residue.
  • Table B2 shows ethanol concentration and Kappa number.
  • the fine fiber Example B3
  • the ethanol concentration in the culture solution was higher than when the primary residue (Comparative Example B2) and the secondary residue (Comparative Example B3) were used as the raw material.
  • the Kappa number of the fine fiber Example B3 was lower in value than the Kappa number of the primary residue (Comparative Example B2) and the secondary residue (Comparative Example B3).
  • fine fiber has lower lignin content compared with primary residue and secondary residue, and as a result, when fine fiber is used as a raw material for saccharification and fermentation, ethanol production is lower than primary residue and secondary residue. It turned out to be rising. It was found that the fine fibers easily proceeded to saccharification and fermentation without being subjected to pretreatment (such as mechanical treatment), and were suitable as raw materials for saccharification and fermentation.
  • Example B4
  • Example B4 A test using as the raw material Eucalyptus globulus wood residue (70% bark, 30% branches and leaves) instead of the Eucalyptus globulus bark used as a raw material in Example B1 was used as Example B4. The test was conducted in the same manner as in Example B1 except that forest residue was used (the production flow is the same as in FIG. 1).
  • Comparative Example B4 A test in which [sieve treatment] of Example B4 was omitted was taken as Comparative Example B4. The test was conducted in the same manner as in Example B4 except that the sieving treatment was omitted (the production flow is the same as in FIG. 5).
  • Example B4 when the fine fibers were recovered and returned to the primary simultaneous saccharification fermenter, the ethanol production amount was improved as compared to Comparative Example B4 (when the fine fibers were not recovered).
  • Example B5 In Example B4 (when the fine fibers were recovered and returned to the primary simultaneous saccharification fermenter), the ethanol production amount was improved as compared to Comparative Example B4 (when the fine fibers were not recovered).
  • Production of ethanol was carried out according to the production flow shown in FIG. [Preprocessing] It carried out by the method similar to Example B1.
  • [Primary concurrent saccharification and fermentation] The same procedure as in Example B1 was performed except that sodium chloride was added as an electrolyte to the culture solution.
  • the final concentration of sodium chloride (electrolyte) was added to the culture solution prepared in the same manner as in Example B1 to a final concentration of 100 mM (conductivity of the raw material suspension: 12.2 mS / cm).
  • yeast cells and commercially available cellulase were added to the fermenter in the same manner as in Example B1, and primary concurrent saccharification and fermentation was performed. Solid-liquid separation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the primary residue recovered was 15.3 kg (absolute dry weight).
  • [Sieve processing] It carried out by the method similar to Example B1.
  • the collected fine fibers totaled 13.4 kg (absolute dry weight).
  • the total amount (13.4 kg) of collected fine fibers was returned to the primary simultaneous saccharification fermenter.
  • [Ethanol production] It carried out by the method similar to Example B1.
  • Centrifugation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the secondary residue recovered was 14.7 kg (absolute dry weight).
  • Example B5 When sodium chloride was added to the culture solution (Example B5), the ethanol production amount was improved as compared with the case where sodium chloride was not added (Example B1).
  • Example B6 When sodium chloride was added to the culture solution (Example B5), the ethanol production amount was improved as compared with the case where sodium chloride was not added (Example B1).
  • Production of ethanol was carried out according to the production flow shown in FIG. [Preprocessing] It carried out by the method similar to Example B1.
  • [Primary concurrent saccharification and fermentation] The same procedure as in Example B1 was performed except that sodium chloride was added as an electrolyte to the culture solution.
  • the final concentration of sodium chloride (electrolyte) was added to the culture solution prepared in the same manner as in Example B1 to a final concentration of 100 mM (conductivity of the raw material suspension: 12.2 mS / cm).
  • yeast cells and commercially available cellulase were added to the fermenter in the same manner as in Example B1, and primary concurrent saccharification and fermentation was performed. Solid-liquid separation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the primary residue recovered was 14.8 kg (absolute dry weight).
  • [Sieve processing] It carried out by the method similar to Example B1.
  • the collected fine fibers totaled 13.0 kg (absolute dry weight).
  • the total amount (13.0 kg) of collected fine fibers was returned to the primary parallel saccharification fermenter.
  • [Secondary concurrent saccharification and fermentation] It carried out by the method similar to Example B2.
  • [Ethanol production] It carried out by the method similar to Example B1.
  • Centrifugation It carried out by the method similar to Example B1.
  • the secondary residue recovered was 14.2 kg (absolute dry weight).
  • the enzymatic saccharification treatment method of the present invention adsorption of the saccharification enzyme to unreacted components of lignocellulosic raw material, reaction residue, etc. is suppressed, and separation of the enzyme from the enzymatic saccharification treatment solution is easy, Since the circulation rate of the saccharifying enzyme in the saccharification treatment step is maintained at a high level for a long time, it becomes possible to industrially produce saccharides, ethanol and the like by enzymatic saccharification treatment of lignocellulosic material. Furthermore, according to the present invention, it becomes possible to improve the amount of ethanol production by reusing fine fibers contained in the culture solution after saccharification fermentation as a raw material for saccharification fermentation. In addition, it is possible to improve the amount of ethanol production by adding the electrolyte to the culture solution.

Abstract

酵素糖化反応に適した原料とする前処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水中に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から反応生成物と酵素含有液を分離回収し、回収した酵素含有液を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。

Description

リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
本発明は、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、及び、前処理が施されたリグノセルロース系原料を酵素で糖化する酵素糖化工程を有する、リグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法又はリグノセルロース系原料からのエタノール製造方法に関し、より具体的には、糖化に適した処理を施したリグノセルロースを含有するバイオマスをセルロース分解酵素やヘミセルロース分解酵素からなる酵素群により糖化処理する反応を含むリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法において、使用する酵素群を反応液から高回収率で回収して長期間にわたって循環利用することを可能とするリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法、或いは、リグノセルロースを含有するバイオマスからエタノールを製造する方法において、併行糖化発酵処理後の処理懸濁液に残存する微細繊維を回収し、回収した微細繊維を再度、糖化または併行糖化発酵処理することによりエタノール生産量の向上が可能となるリグノセルロースを含有バイオマスからのエタノール製造方法に関する。
　本願は、２０１０年８月３１日に日本に出願された特願２０１０－１９３３１０号、２０１０年１１月１５日に日本に出願された特願２０１０－２５４４４１号、２０１０年１２月９日に日本に出願された特願２０１０－２７４２３５号、２０１１年３月３０日に日本に出願された特願２０１１－０７５７７２号、２０１１年５月１３日に日本に出願された特願２０１１－１０７８２０号、２０１１年６月２日に日本に出願された特願２０１１－１２３９７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　糖化に適した処理を施したリグノセルロース原料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりガソリンの代替燃料となるアルコールや、プラスチック原料となるコハク酸や乳酸などの化成品原料を製造することができることから、循環型社会の形成に有益な技術である。
植物系バイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法は２つに大別できる。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
　酸糖化法は酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、リグノセルロース系バイオマスを原料とする方法の場合は、澱粉や廃糖蜜などを原料とする方法に比べて糖収率が低いことに加えて、処理工程から排出される廃酸の処理設備や、酸による腐食に耐え得る大型の設備が必要となること等が製品コストの増大原因となっていて実用化の大きな障壁となっている。
　一方、酵素糖化法は、近年酵素の価格が下がってきていることと技術の進歩から、後処理まで含めた全体のコストで酸糖化法のコストに近づいてきてはいるが、酵素糖化法の全体コストに占める割合が高い酵素の価格は依然として高いことから、酵素糖化法の実用化のためには酵素にかかる費用の一層の低減が重要である。
　酵素糖化法のコストを下げる技術としては、セルロース繊維への酵素のアクセスを容易にする前処理の方法の開発や、結晶性セルロースを効率よく糖化する方法の開発、更には酵素の効率的な回収、再利用方法の開発などが考えられる。
リグニンを除去していないリグノセルロース材料は、リグニンを除去したリグノセルロース材料と比べて酵素によって分解されにくく、糖化されずに樹脂、金属などの不純物と一緒に糖化液中に残渣として残る。一般に、この残渣はスクリーン、遠心分離等により分離し廃棄される。この残渣には酵素糖化法におけるコストの中で大きな比重を占めている酵素が多量に吸着されているため、反応液から分離した残渣をそのまま廃棄してしまうと高価な酵素も廃棄されてしまうという問題があった。すなわち、酵素糖化法のコスト低減のために残渣を回収し有効利用することが課題である。酵素糖化法において回収した残渣を再利用する技術として、残渣を燃焼し熱エネルギーを得る方法（特許文献５）、残渣を水熱ガス化して、生成した合成ガスよりエタノール合成触媒でエタノールを合成する方法（特許文献６）、残渣を燃料あるいは肥料として利用する方法（特許文献７）、残渣を熱エネルギーとして利用する方法（特許文献８）が報告されている。しかし、これらの方法は、処理工程付加に伴うコストアップが大きいため実用的な設備を考案する場合、コスト低減という課題を解決するための方法として充分であるとは言えない。
　上記のような残渣中の酵素の回収手段として、残渣の洗浄が考えられる。しかし、酵素は、その分子内に有しているセルロースに特異的に吸着するセルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）等によりセルロースと強固に結合しているため、単なる水洗浄ではセルロースに吸着した酵素を十分に回収することは困難であった。
　そこで、酵素の回収率の改善を目的として界面活性剤を添加して処理する方法（特許文献１参照）などが提案されている。しかし、界面活性剤処理法でも、酵素の回収率が十分であるとはいえず、また、薬品添加による酵素の失活や、処理工程付加に伴うコストアップ及び後の発酵段階における微生物への悪影響などが懸念されることなどから実用的ではない。
　糖液からの酵素の回収法としては、限外濾過を用いた方法（特許文献２参照）、糖液に再度セルロースを添加して酵素を吸着回収する方法（特許文献３参照）などが提案されている。しかし、限外濾過法は微少な不純物がろ過膜につまり十分な処理速度及び酵素回収率が得られない問題があるし、セルロース添加による回収法では十分な酵素回収が困難であった。
　吸着した酵素を剥離させる工程を経ずに、酵素が吸着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する方法が提案されている（特許文献４）。　　
この方法では、残渣の蓄積は避けられないので反応効率が低下することが懸念される。また、ＣＢＨ（セロビオハイドラーゼ）等、ＣＢＤを有する酵素に関してはリグノセルロース残渣を次回分で再処理することで酵素の循環利用が可能であるが、β－グルコシダーゼ等は上清中に遊離している場合もあるので、添加したセルラーゼの全てを循環利用することは困難である。
また、この方法では未分解残渣自体は再度酵素溶液と混合しても分解されにくい状態になっているため未分解残渣を糖化し易い状態にすることが課題である。本発明者らは固液分離により回収した未分解残渣を機械処理し再度、糖化発酵することによりエタノール生産量が高まることを見出した（特許文献９）。しかし、この方法で原料として用いた残渣は４２０メッシュ(３８μｍ)のスクリーンで回収された残渣で幅広いサイズの繊維が含まれているという問題がある。リグニンが多く吸着したサイズの大きい繊維は酵素で分解されにくいため前処理（機械的処理等）を施さないと充分に糖化されない。もし、リグニン吸着量の少ない小さいサイズの繊維のみを選択的に回収し原料として前処理を施さず、再度、酵素糖化することができれば効率の良いエタノール生産量の向上が期待できる。
　酵素のコストを下げる方法として、酵素を循環利用する方法が報告されている。Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．らの方法（非特許文献１）によると、酵素を大量（濾紙分解活性で基質１ｇに対して８０－１６０単位）に添加して古紙原料を酵素加水分解する主反応槽に、酵素加水分解液中の未反応古紙面から高剪断力で生成グルコースやセロビオース成分を除いて常に新しいセルロース繊維表面を露出させる高速遠心ポンプによる磨砕装置と、磨砕装置からの処理液から未反応原料と加水分解液を分離して未反応原料のみを主反応槽に循環する膜分離装置と、膜分離装置からの加水分解液から酵素と生成グルコース及びセロビオースを分離して酵素のみを主反応槽に循環する限外濾過装置とを有する循環ラインを設けた連続システムを想定してコストを予測している。このシステムにより、糖化率は２５時間で１００％であり、酵素の残存率は２４時間で９５％以上であるとされている。また、酵素が残渣に吸着されて失われること、残渣の酵素の吸着機能はｐＨを５～７に高めることで低下可能な場合があること、温度を５℃に下げることで低減できるという報告もあることが記載されている。
　酵素を回収再利用する方法として、蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を５％の濃度で糖化槽に加え、２万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、８日間で２ｋｇのシラカンバ材から単糖類を６３０ｇ得ている方法も報告されており、この方法で酵素の使用量を２０％節約できたとされている（非特許文献２）。
特開昭６３-８７９９４号公報 特開昭６１-２３４７９０号公報 特開昭５５-１４４８８５号公報 特開２０１０-９８９５１号公報 特許第４４４７１４８号 特開２００５－１６８３３５号公報 特開２００８－５４６７６号公報 特開２００９－１０６９３２号公報 特願２００９－１９０８６２号
Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｔｈｒｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｂiｏｃｈｅｍ．Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５／４６，ｐｐ．６４１－６５３（１９９４） Ｉｓｈiｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂiｏｅｎｇ．，３７，９４８－９５４（１９９１）
　リグノセルロースなどのバイオマスから糖類を製造する技術は、これまで化石資源に頼ってきた燃料やプラスチック原料を新たに供給し得る技術であり、特に循環型社会の構築に役立つ技術である。前述したように、これまで様々な技術が開発されてはいるものの、糖化に要する酵素のコストが高いことが主たる原因で経済性がないことが課題となっている。
　前記したように、糖化に用いた酵素を回収し繰り返し使用することにより酵素の使用量を削減しようという試みが種々なされているが、糖化の際に生じる残渣に酵素が強く吸着しているため、回収率が下ってしまい、問題の解決には至っていない。このように、酵素糖化の際に生じる残渣に酵素が強度に吸着することが、酵素回収の際の最大の問題であり、これを解決できれば酵素のリサイクル性は向上し、コストを低下させ、酵素糖化処理法の経済性は大きく改善できる。それ故、本発明は、リグノセルロース材料の酵素糖化処理のために投入される酵素を無駄なく有効利用することができる方法を提供すること、及びリグノセルロースを原料とするエタノール製造工程において、エタノール収率の高いエタノール製造方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、連続的に酵素糖化反応を行う工程において、全体コストに極めて大きな割合を占める価格の高い酵素について、酵素の回収率を高めて繰り返し使用することによりコストを下げる方法を検討した結果、下記の発明をなすに至った。本発明は、酵素糖化反応液中で、酵素がリグノセルロース原料や反応残渣等に酵素が吸着されることを抑制する手段を採択することが、酵素糖化反応後の反応液からの酵素の分離を容易ならしめると共に、廃棄処理される残渣と共に酵素が系外に排出されることを防止できる手段であるという発想に基づくものであり、さらに、併行糖化発酵工程の培養液中に含まれる残渣から糖化され易い微細繊維のみを選択的に回収し、回収した微細繊維を原料として再度、糖化または併行糖化発酵を行うことによりエタノール生産量が向上し、かつ、工程内で排出される残渣量が減少することを見出し、下記発明を完成した。
本発明は、上記知見に基づきなされたものであり、以下の態様を有する。
（１）酵素糖化反応に適した原料とする前処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水中に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から反応生成物と酵素含有液を分離回収し、回収した酵素含有液を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（２）前記酵素糖化反応に適した原料とする前処理が、リグノセルロース系原料を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、及び炭酸水素ナトリウムから選ばれるアルカリ薬品の１種もしくはそれらの混合物、又は亜硫酸ナトリウムとそれらのアルカリ薬品との混合物を含有する溶液に浸漬する化学的処理を含む前処理である（１）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（３）前記リグノセルロース系原料が林地残材である（１）又は（２）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（４）前記リグノセルロース系原料が、樹皮である（１）又は（２）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（５）前記水溶性塩類が、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる少なくとも１種の水溶性塩である（１）～（４）のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（６）前記水溶性塩類が、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の、ハロゲン化物、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選ばれる塩類である（１）～（５）のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（７）前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水中に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により処理する酵素糖化処理工程、該酵素糖化処理工程から出る処理懸濁液から固形残渣を除去する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分を遠心分離して残留残渣が除去された酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、該遠心分離工程から出る液体留分を酵素含有液と生成糖含有液に分離する膜分離工程、及び該膜分離工程から得られる酵素含有液を酵素糖化処理工程に酵素源として循環供給する酵素循環工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を酵素糖化処理する方法である（１）～（６）のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（８）前記酵素糖化処理工程が、セルラーゼ製剤と糖類を発酵基質（＝原料）とする発酵用微生物を併用してリグノセルロース系原料の酵素糖化反応による処理と生成糖類の発酵用微生物による発酵処理とを併行して行って糖類と共に発酵生成物を生成する併行糖化発酵処理工程である（１）～（７）のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（９）前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を糖類を発酵基質とする発酵用微生物及び水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ/ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化処理と生成糖類を基質とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程、該併行糖化発酵処理工程から出る処理懸濁液から固形残渣を除去する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分から蒸留により発酵生成物を分離回収する蒸留工程、該蒸留工程から出る蒸留残液を遠心分離して残留残渣を除去して酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、該遠心分離工程から出る液体留分を酵素含有液と糖含有液に分離する膜分離工程、該膜分離工程で分離される酵素含有液を酵素糖化処理工程に酵素源として循環供給する酵素循環工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を併行糖化発酵処理する方法である（８）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（１０）前記膜分離工程から分離回収される糖含有液が、オリゴ糖を主体とする糖類含有液である（９）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（１１）前記遠心分離工程から出る液体留分を、前記膜分離工程を経ることなく糖類を含有する酵素含有液として酵素糖化処理工程に循環供給する（９）に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
（１２）前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を糖類を発酵基質とする発酵用微生物及び水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ/ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により処理する酵素糖化処理と生成糖類を基質とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程、該併行糖化発酵処理工程から出る処理懸濁液をスクリーンサイズが１．０ ～ ２．０ｍｍのスクリュープレスで残渣と液体留分に分離する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分を８０～６００メッシュの篩い処理で微細繊維と液体留分に分離する篩い処理工程、該篩い処理後の微細繊維を除いた液体留分から蒸留により発酵生成物を分離回収する蒸留工程、該蒸留工程から出る蒸留残液を遠心分離して残留残渣を除去して酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、及び該遠心分離工程から出る液体留分を、前記膜分離工程を経ることなく糖類を含有する酵素含有液として酵素糖化処理工程に循環供給する工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を併行糖化発酵処理する方法である（８）記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。 
　本発明の酵素糖化処理方法によれば、リグノセルロース系原料の未反応分や反応残渣等への糖化酵素の吸着が抑えられて、酵素処理懸濁液からの糖化酵素の分離・回収が容易となる結果、酵素損失が極めて少ない経済性の高い連続的なリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法が提供される。
　また、本発明により、リグノセルロースを原料とした併行糖化発酵後の培養液に含まれる微細繊維を選択的に回収し、回収した微細繊維を原料として再度、糖化または併行糖化発酵を行うことによりエタノール生産量の向上が可能となる。
本発明のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法の一実施形態を示す工程図である。 本発明のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理工程を、酵素糖化処理と生成糖を原料とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程とした工程図である。 実施例Ｂ１の製造工程フローを示す図 実施例Ｂ２の製造工程フローを示す図 比較例Ｂ１の製造工程フローを示す図 実施例Ｂ５の製造工程フローを示す図 実施例Ｂ６の製造工程フローを示す図
　以下、本発明をさらに詳しく説明する。
＜リグノセルロース系原料＞　
　本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられ、草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、バガスなどの農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えばＥＦＢ：Ｅｕｍｐｔｙ　Ｆｒｕｉｔ　Ｂｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等のリグノセルロース系バイオマスが挙げられる。また、本発明におけるリグノセルロース系原料としては、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ等も利用可能である。
　前記木質系のリグノセルロース系原料の中でも、木材の樹皮は、現在ほとんど有効利用されておらず、製材工場やチップ工場で均一な品質のものが大量に入手可能であり、木材の木部部分より柔軟かつ可溶性成分が多いため、糖化処理や併行糖化発酵処理の原料として特に好ましい。
　例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。
＜酵素糖化処理に適した原料とする前処理＞
　本発明の酵素糖化処理に適した原料とする前処理とは、前記リグノセルロース系原料に以下の前処理を行って、リグノセルロースを酵素糖化可能な状態とする処理である。
　化学的処理、水熱処理、加圧熱水処理、二酸化炭素添加水熱処理、蒸煮処理、湿式粉砕処理、機械的磨砕処理又は破砕繊維化処理等の機械的処理、希硫酸処理、水蒸気爆砕処理、アンモニア爆砕処理、二酸化炭素爆砕処理、超音波照射処理、マイクロ波照射処理、電子線照射処理、γ線照射処理、超臨界処理、亜臨界処理、有機溶媒処理、相分離処理、木材腐朽菌処理、グリーン溶媒活性化処理、各種触媒処理、ラジカル反応処理、オゾン酸化処理。
　これらの処理は、各単独処理もしくは複数を組み合わせた処理のいずれであってもよい。
　中でも、上記リグノセルロース系バイオマスに対し、化学的処理、加圧熱水処理、破砕繊維化処理及び機械的磨砕処理から選択される１つ以上の前処理を行うことが好ましい。
　前記化学的処理は、酸やアルカリ等の薬品の水溶液にリグノセルロース系原料を浸漬して、次工程の酵素糖化処理に適した状態にする処理である。
　化学的処理に使用する薬品等については特に限定されないが、例えば、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、硫酸、希硫酸などの硫化物、炭酸塩、硫酸塩又は亜硫酸塩から１種以上選択されたものであり、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、硫化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、亜硫酸ナトリウム等から選択された１種以上の薬品の水溶液に浸漬してなるアルカリ処理等が化学的処理として好適である。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。
　化学的処理は、前記破砕繊維化処理や機械的磨砕処理等の機械的処理と組み合わせてそれらの前処理の後処理として行うことが好適である。
　化学的処理に使用する薬品の添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面からは、リグノセルロース系原料の絶乾１００質量部に対して５０質量部以下であることが望ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、一般的には、処理時間２０～９０分、処理温度８０～２００℃で行うことができる。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は７０分以下、処理温度は１８０℃以下であることが好ましい。より好ましくは、処理時間３０分～１時間、処理温度８０℃～１３０℃である。
　前記機械的処理としては、破砕、裁断、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の糖化発酵処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー等を用いることができる。
　酵素糖化反応による処理に適した原料とする前処理が施されているリグノセルロース系原料に対しては、リグノセルロース系原料懸濁液の調製に使用する前に、殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
　殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化処理又は糖化発酵処理に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程における処理に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。
　酵素糖化反応による処理に適した原料とする前処理が施されているリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素及び水溶性塩、場合によりさらに発酵に必要な酵母等の微生物と混合されて原料懸濁液とされ、電気伝導度が所定の数値に調整された状態で酵素糖化処理工程に供給される。酵素糖化処理方法を実施するための代表的な工程を図１に示す。
＜酵素糖化処理＞
　図１の工程に従った酵素糖化処理方法の場合、図１に「糖化」として示されている酵素糖化処理工程では、「前処理」として示されている前処理工程から供給されるリグノセルロース系原料と糖化酵素と電解質としての水溶性塩類を適量の水に添加して調製されている原料懸濁液が攪拌下に酵素糖化処理される。原料懸濁液中のリグノセルロース原料濃度は、１～３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。
　酵素糖化処理工程における原料懸濁液の電気伝導度は５ｍＳ／ｃｍ～２５ｍＳ／ｃｍの範囲に維持することが好ましい。
　ｐＨは使用酵素が失活することのない３．５～１０．０の範囲で選択されるが、３．５～７．５の範囲に維持することがより好ましい。
糖化工程または併行糖化発酵工程でのｐＨは３．５～１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０～７．５の範囲に維持することがより好ましい。
酵素糖化処理の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、一般的には２５～５０℃であり、３０～４０℃が好ましい。
　また、酵素糖化反応方式としては、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。
　反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は一般的には１０～２４０時間であり、好ましくは１５～１６０時間である。連続式の場合も、一般的な平均滞留時間は１０～１５０時間であり、好ましくは１５～１００時間である。
　酵素糖化処理又は併行糖化発酵に使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素群より適宜選択される。
　各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤には、上記した各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いても良い。
　市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
　原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、０．５～１００質量部が好ましく、１～５０質量部が特に好ましい。
　電解質として添加する水溶性塩としては、酸性塩、塩基性塩、中性塩、あるいは酢酸緩衝液やクエン酸緩衝液のような塩含有緩衝液などから選ばれるものを単独あるいは組み合わせて使用することができる。水溶性塩の濃度は、酵素糖化反応に好ましくない影響を与えない範囲であれば自由に設定できる。
中でもアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる水溶性塩類が好ましい。アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属のハロゲン化物、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選ばれる水溶性塩が挙げられる。
　本発明では、酵素糖化処理工程内に電解質として水溶性塩を添加することができる。
酵素糖化処理工程において、電解質を原料懸濁液に添加し原料懸濁液の電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍの範囲に維持することが好ましい。電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍの範囲に維持することによりリグノセルロース原料の未反応成分や反応残渣等への酵素の吸着が抑制されるため、酵素糖化処理工程内における酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持することができる。酵素糖化処理工程内において、操作上、電解質を添加することが可能な工程であれば、いずれの工程においても制限なく電解質を添加することができる。一次糖化発酵工程内で添加することが操作が容易なため望ましい。
＜固液分離＞
　「糖化工程」を出た処理懸濁液は、図１中に「固液分離」として示されている濾過装置を有する固液分離工程に送られて固体残渣が除かれる。固液分離工程で濾過装置により分離された固体残渣はリグニン、ヘミセルロース、セルロースを含んでいるが、セルロースはリグニン等により保護されている状態で、それ以上の糖化は促進できない状態にあるので通常は工程外に排出される。
また、一次併行糖化発酵工程を出た培養液は、固液分離工程へ移送され、液体分（濾液）と残渣（一次残渣）に分離される。固液分離を行う装置としてスクリーンサイズが１．０ ～ ２．０mmのスクリュープレスを用いる。スクリュープレスは構造的に繊維による目詰まりが発生しにくく比較的少ないエネルギーで効率よく固液分離できる装置である。固液分離効率を向上させるために背圧をかけても良い。
固液分離工程で分離された残渣にはリグニン、ヘミセルロース、セルロースが含まれており、セルロースにリグニン等が吸着しており、酵素による糖化が困難な状態となっている。固液分離工程後の残渣は一次併行糖化発酵工程で分解されなかった繊維分を多く含み、機械的処理や化学的処理を施すことにより糖化が容易となる（特許文献６）。
固液分離工程で分離された濾液（液体分）は、次の篩い処理工程へ移送される。
＜遠心分離工程＞
　固液分離工程で固体残渣を除かれた液体留分は、ついで、「遠心分離」として示されている遠心分離工程に送られて固体分離工程から出る液体留分に随伴されている残留残渣が除去され、図１中に「膜分離」として示されている糖液と酵素液の回収工程に送られる。
　また、蒸留残液は、遠心分離工程へ移送され残留している残渣（二次残渣）を遠心分離によって除去した後、液体留分は一次併行糖化発酵工程に循環される（図３参照）。この液体留分には酵素が含まれており、一次併行糖化発酵工程で再利用される。一方、残渣には、リグニンが含まれており燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。
＜膜分離工程＞
　遠心分離工程で残留残渣が除かれた液体留分は酵素と生成糖類を含有する液体留分であり、図１に「膜分離」として示されている膜分離工程で酵素含有液と糖含有液とに分離され、酵素含有液は「回収酵素」として示されている酵素液貯槽に送られ、そこから酵素源として循環される。糖類含有液はそのまま製品として取り出される。
　糖類含有液には６炭糖、５炭糖等の単糖類のみならず、オリゴ糖類も含まれているので、単糖類を製造することが目的である場合は、オリゴ糖類を分離して「糖化工程」に供給し、さらに酵素処理して単糖類に分解することもできる。
＜一次併行糖化発酵処理工程＞
　図１に「糖化工程」として示されている酵素糖化処理工程は、酵素糖化反応で生成する糖類を原料(発酵基質）とする微生物による発酵処理を同時に行う、いわゆる併行糖化発酵処理工程とすることができる。この場合、原料懸濁液には糖化酵素と共に、生成糖類を発酵基質（発酵原料）とする発酵用微生物が加えられる。併行糖化発酵処理方法を実施するための典型的な工程は図２に示される。
　図２において、前処理工程で酵素糖化処理に適した状態に処理されたリグノセルロース系原料は、電解質としての水溶性塩類、セルロース分解酵素、アルコール酵母等の発酵用微生物と共に適量の水に添加され、電気伝導度が所定の値に調整された原料懸濁液として併行糖化発酵工程において酵素糖化反応によるセルロースの糖化処理と、生成糖類を発酵基質とするアルコール発酵等の発酵処理とが併行して行われる。
　糖化発酵に適した前処理が施されているリグノセルロース系原料が、適量の水と酵素、及び発酵に必要な酵母等の微生物と混合され、一次併行糖化発酵工程に供給される。併行糖化発酵処理方法の典型的なプロセスは、図１に示される。
　図３において、前処理工程で糖化発酵処理に適した状態に処理されたリグノセルロース系原料は酵素により糖化（セルロース→グルコース）され、次に酵母により発酵（グルコース→エタノール）される。
　発酵用に用いられる微生物としては酵母などが用いられる。微生物はその培養に使用された培地などと一緒に添加しても良い。酵母としては、特許文献３などに記載される周知の酵母、たとえば、サッカロミセス　セレビシア（Ｓａｃｈａｒｏｍｉｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、イサチェンキア　オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ　ブラッシカー（Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、リゾープス　ジャワニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ）等の酵母類（イースト）が使用できる。
　微生物は固定化しておいてもよい。微生物を固定化しておくと、次工程に微生物を回収するという工程を省くことができるか、少なくとも回収工程にかかる負担を軽減することができるし、微生物をロスするリスクを軽減することもできる。また、微生物を固定化するほどでのメリットはないが、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。
　図２の工程では、併行糖化発酵工程から出る処理懸濁液は、固液分離工程に送られて固体分が除かれた後、発酵生成物と糖類を含有する液体留分は、発酵生成物を分離回収するために図２に「蒸留」として示されている「蒸留工程」に送られる。蒸留工程では、減圧蒸留装置により発酵生成物が蒸留分離される。減圧蒸留によれば低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
　蒸留温度は２５～６０℃が好ましい。２５℃未満であると、生成物の蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、６０℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪化する。
　蒸留後の蒸留残液中に残る発酵生成物濃度は０．１質量％以下であることが好ましい。このような濃度とすることによって、後段の遠心分離工程において残留残渣とともに排出される発酵生成物量を低減することができ、収率を向上させることができる。
　蒸留工程からの蒸留残液は、次いで図２に「遠心分離」として示されている遠心分離工程に送られ、蒸留残液中の随伴されている残留残渣が除かれて酵素と糖類を含有する液体留分が得られる。
　この酵素と糖類とを含有する液体留分は、図２に「膜分離」として示されている膜分離工程に送られて酵素含有液と糖類含有液に分離され、酵素含有液は図２に「回収酵素」として示されている酵素液貯槽を経て「併行糖化発酵工程」に循環供給される。また、糖含有液は図２に「糖」として示されている糖液貯槽に集められ、糖製品とされる。
　併行糖化発酵工程では、セルロースの酵素分解生成物である六炭糖、即ち、グルコース、マンノース、ガラクトース等、ヘミセルロースに由来する五炭糖、即ち、キシロース等のほかにオリゴ糖類が生成し、グルコース等の六炭糖類が主として発酵基質とされエタノールのようなアルコール等が生成する。また五炭糖、オリゴ糖は発酵基質とならないのでそのまま酵素回収工程まで酵素と共に送られてくる。このような場合、五炭糖についてはそれを確実に発酵基質とする酵母をも原料懸濁液に添加するか、あるいは、別工程で発酵処理しても良い。また、必要に応じて製品として回収してもよい。
　また、オリゴ糖類については、必要に応じて製品として回収しても良いし、図１の工程に従った酵素糖化処理法について述べたと同様に、併行糖化発酵工程で酵素により単糖類に分解するための原料として利用することもできる。
　リグノセルロース系原料の懸濁濃度は、１～３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。
＜篩い処理工程＞
固液分離後の濾液を篩い処理を行い微細繊維と濾液（液体分）に分離する。篩い処理の方法としては、微細繊維を分離できる篩い処理装置であれば特に限定なく用いることができる。篩い処理装置としては、スクリーン、フィルタープレス等を用いることができる。篩いのメッシュ（網目）は８０メッシュ～６００メッシュ（２８～１８２μｍ）が好ましく、１５０メッシュ～４００メッシュ（３９～９７μｍ）がさらに好ましい。処理効率を向上させるために、篩いに振動装置をつけて振動を加えてもよい。以上の処理で分離された微細繊維は一次残渣や二次残渣と比較しリグニン含量が低く、酵素により糖化され易い。また、篩い処理で微細繊維を除くことにより後段の蒸留工程で用いる減圧蒸留装置内に付着する固形分量を軽減することができ装置の長時間の運転が可能となるというメリットがある。回収された微細繊維は、一次糖化発酵工程へ移送し糖化発酵の原料として用いても良い（図３参照）。また、回収された微細繊維を後述の二次糖化発酵工程（一次糖化発酵工程とは異なる糖化発酵工程）へ移送し糖化発酵の原料として用いることもできる（図４参照）。更には、別の工程で糖化のみを行っても良い。このように微細繊維を糖化または糖化発酵することにより、微細繊維に吸着している酵素を有効に利用できる。
一方、篩い処理で分離された濾液は蒸留工程へ移送される。
＜二次併行糖化発酵処理工程＞
　二次併行糖化発酵処理工程は一次併行糖化発酵処理工程とは独立した糖化発酵工程で、新しいリグノセルロースを原料として糖化発酵させることもできるし、工程内で排出された残渣を原料として糖化発酵させることもできる。また、一次併行糖化発酵工程でエタノールへ発酵されなかった糖を二次併行糖化発酵処理工程で発酵させることもできる。一次併行糖化発酵工程において、セルロースに由来する六炭糖、即ち、グルコース、マンノース、ガラクトース等がエタノール発酵されるが、ヘミセルロースに由来する五炭糖であるキシロースは未反応のまま残留するものもある。このような場合、二次併行糖化発酵処理工程で五炭糖をより確実に発酵する酵母を添加して五炭糖を発酵させることもできる。本発明では、前記篩い処理で回収された微細繊維を二次併行糖化発酵処理工程へ移送し糖化発酵させることができる。
＜蒸留工程＞
　篩い処理後の濾液、あるいは二次併行糖化発酵処理工程後の処理液（培養液）は蒸留工程へ移送される（図３、図４参照）。
　蒸留工程では、減圧蒸留装置により発酵生成物が蒸留分離される。減圧下では低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
　以下、実施例に従って本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。各実施例及び比較例における「％」は「質量％」、「部」は「質量部」である。
（実施例Ａ１）
　４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌに破砕した林地残材１００ｇを投入し、９０℃、３０分間処理した後にリファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。これをスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。
　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、さらに塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで、電気伝導度が１１．８ｍＳ／ｃｍのリグノセルロース懸濁液４００ｍｌを調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却した後に、酵素１０ｍｌ（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。
　３０℃、１２０ｒｐｍの攪拌下で糖化反応を行い、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
　酵素回収で最も重要とされるβ－グルコシダーゼの活性を指標にして回収率を算出した。活性測定は以下に示す方法で行った。（β－グルコシダーゼ活性）
　β－グルコシダーゼ活性の測定は、１．２５ｍＭ　 ４－Ｍｅｔｈｙｌ－ｕｍｂｅｒｉｆｅｒｙｌ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含む１２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１６μｌに、酵素液４μｌ加え、３７℃、１０分間反応を行った後、５００ｍＭ 　ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１００μｌを添加して反応を停止させ、３５０ｎｍの励起光での４６０ｎｍの蛍光強度を測定することで行った。酵素回収率は以下の計算式から求めた。　
　　酵素回収率（％）＝（上清の酵素活性／添加した酵素活性） ×１００
（実施例Ａ２）
　実施例Ａ１の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、炭酸水素ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ１と同様に行った。このときの反応系内の電気伝導度は８．６ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ３）
　４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌに破砕した林地残材１００ｇを投入し、９０℃、３０分間処理した後にリファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。これをスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。
　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで電気伝導度が１２．０ｍＳ／ｃｍの原料懸濁液を４００ｍｌ調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却した後に、酵素１０ｍｌ（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。
　さらに、市販酵母（商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ：Ｍａｕｒｉ　Ｙｅａｓｔ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を上記のように調製した原料懸濁液に添加し、３０℃、１２０ｒｐｍ攪拌下で糖化発酵培養し、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
（実施例Ａ４）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、塩化カリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１３．３ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ５）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、ヨウ化カリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１４．５ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ６)
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、硫酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１４．７ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ７）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、亜硫酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１３．６ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ８）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、チオ硫酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１６．９ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ９）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、炭酸ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１２．６ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１０）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、リン酸水素二カリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１５．０ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例１１）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、リン酸水素二ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１１．９ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１２）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、炭酸水素ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は８．９ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１３）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、クエン酸三ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１５．４ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１４）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、酢酸バッファー（ｐＨ５．０）を終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は７．１ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１５）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）を終濃度１００ｍＭとなるように添加した以外は、実施例Ａ３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１０．９ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ１６）
　４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌに、破砕したユーカリ・グロビュラスの樹皮１００ｇを投入し、９０℃、３０分間処理した後、リファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。このリファイナーからの磨砕処理液をスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。
　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、さらに塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで、電気伝導度が１１．８ｍＳ／ｃｍのリグノセルロース懸濁液４００ｍｌを調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却した後、酵素（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。
　３０℃、１２０ｒｐｍの攪拌下で糖化反応を行ない、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
（実施例Ａ１７）
　４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌに、破砕したユーカリ・グロビュラスの樹皮１００ｇを投入し、９０℃、３０分間処理した後、リファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。このリファイナーからの磨砕処理液をスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。
　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、さらに塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで、電気伝導度が１１．８ｍＳ／ｃｍのリグノセルロース懸濁液４００ｍｌを調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却した後、酵素（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。さらに、市販酵母（商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ：Ｍａｕｒｉ　Ｙｅａｓｔ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を上記のように調製したリグノセルロース懸濁液に添加し、３０℃、１２０ｒｐｍ攪拌下で糖化発酵培養し、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
（実施例Ａ１８）
　９７．０％亜硫酸ソーダ２０ｇと苛性ソーダ１ｇを含む水７００ｍｌに破砕した林地残材１００ｇを投入し、１７０℃、６０分間処理した後にリファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。これをスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、更に塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで、電気伝導度が８.９ｍＳ／ｃｍのリグノセルロース懸濁液４００ｍｌを調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却後に酵素１０ｍｌ（ＧＣ２２０：ジェネンコア社）を添加した。
　３０℃、１２０ｒｐｍ攪拌下で糖化反応を行ない、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
（実施例Ａ１９）
　９７．０％亜硫酸ソーダ２０ｇと苛性ソーダ１ｇを含む水７００ｍｌに破砕した林地残材１００ｇを投入し、１７０℃、６０分間処理した後にリファイナー（クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。これをスクリュープレスにて脱水・洗浄したものを基質原料とした。
　基質原料を終濃度５％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を終濃度１％、硫酸アンモニウムを終濃度０．５％、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することで、電気伝導度が９．４ｍＳ／ｃｍのリグノセルロース懸濁液を４００ｍｌ調製した。
　このように調製したリグノセルロース懸濁液を１２０℃で２０分間蒸気滅菌し、４０℃まで冷却した後に、酵素１０ｍｌ（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。
　さらに、市販酵母（商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ：Ｍａｕｒｉ　Ｙｅａｓｔ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ）を上記のように調製したリグノセルロース懸濁液に添加し、３０℃、１２０ｒｐｍ攪拌下で糖化発酵培養し、２４時間後、４８時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。
（実施例Ａ２０）
　実施例Ａ１６の方法において、４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌのところを、９７．０％亜硫酸ソーダ２０ｇと苛性ソーダ１ｇを含む水７００ｍｌに代える以外は、実施例Ａ１６と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１１．２ｍＳ／ｃｍであった。
（実施例Ａ２１）
　実施例Ａ１７の方法において、４８％苛性ソーダ２０ｇを含む水１０００ｍｌのところを、９７．０％亜硫酸ソーダ２０ｇと苛性ソーダ１ｇを含む水７００ｍｌに代える以外は、実施例Ａ１７と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は１１．２ｍＳ／ｃｍであった。
（比較例Ａ１）
　実施例Ａ１の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、硫酸を添加して反応系の電気伝導度を６．５ｍＳ／ｃｍに調整した以外は、実施例Ａ１と同様に行った。
（比較例Ａ２）
　実施例Ａ１の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、水酸化ナトリウムを添加して反応系の電気伝導度を８．０ｍＳ／ｃｍに調整した以外は、実施例Ａ１と同様に行った。
（比較例Ａ３）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを添加しない以外は、実施例３と同様に行った。この時の反応系内の電気伝導度は４．２ｍＳ／ｃｍであった。
（比較例Ａ４）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、硫酸を添加して反応系内の電気伝導度を６．３ｍＳ／ｃｍに調整する以外は、実施例Ａ３と同様に行った。
（比較例Ａ５）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、塩酸を添加して反応系内の電気伝導度を６．６ｍＳ／ｃｍに調整する以外は、実施例Ａ３と同様に行った。
（比較例Ａ６）
　実施例Ａ３の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、水酸化ナトリウムを添加して反応系内の電気伝導度を８．２ｍＳ／ｃｍに調整する以外は、実施例Ａ３と同様に行った。
（比較例Ａ７）
　実施例Ａ１の方法において、塩化ナトリウムを終濃度１００ｍＭとなるように添加することに代えて、塩化ナトリウムを終濃度５ｍＭとなるように添加して反応系の電気伝導度を４．６ｍＳ／ｃｍに調整した以外は、実施例Ａ１と同様に行った。
　実施例Ａ１～Ａ２1及び比較例Ａ１～Ａ７の結果を表Ａ１に示す。
　　（表Ａ１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　表Ａ１の結果は、実施例のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法は、酵素糖化反応系に水溶性塩を添加し、さらに、電気伝導度を所定の数値範囲に調節したリグノセルロース系原料懸濁液を酵素糖化処理することにより、糖化処理液からの酵素回収率が初期段階で高いのみならず、経時でも安定して高い水準にあることを示している。
　これに対して、酵素糖化反応系に水溶性塩を添加せず、硫酸（比較例Ａ１、比較例Ａ４）や塩酸（比較例Ａ５）、水酸化ナトリウム（比較例Ａ２、比較例Ａ６）によって電気伝導度を調整した場合は糖化処理液からの酵素回収率は、初期段階で低く、経時での回収率の低下も著しいことを示している。また、塩を添加せず、又は添加しても、酵素反応系の電気伝導度が低い場合（比較例Ａ３、比較例Ａ７）も、糖化処理液からの酵素回収率が初期の段階で低く、経時ではさらに低下している。
（実施例Ｂ１）
図３に示す製造フローでエタノールの製造を実施した。
［前処理］
チップ状のユーカリ・グロブラスの樹皮を２０ｍｍの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機（西邦機工社製、ＳＣ－１５）で破砕し原料として用いた。
上記原料１００ｋｇ（絶乾重量）に対して１２．５質量％の水酸化カルシウムとなるように水に懸濁した水酸化カルシウム溶液を原料に添加後（原料に対する液比８）、１２０℃で１時間加熱（アルカリ処理）した。アルカリ処理後の原料をレファイナー（熊谷理器工業製、ＫＲＫ高濃度ディスクレファイナー：クリアランス０．５ｍｍ）で磨砕した。磨砕処理後の原料に同量の純水を添加後、撹拌下で硫酸を用いてｐＨ５に調整した。次に２０メッシュ（８４７μm）のスクリーンを用いて固液分離（脱水）することにより溶液の電気伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の固形物（前処理物）を原料として糖化発酵工程に供した。
［一次併行糖化発酵］
一次併行糖化発酵槽に原料濃度が１０質量％になるように原料１００ｋｇ（絶乾重量）、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を添加後，水を添加し最終容量を１ｍ３に調整した。液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで３０℃、２４時間前培養を行った酵母菌体を含む培養液及び市販セルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ ＤＵＥＴ、ジェネンコア社製）５０Ｌを発酵槽に添加し、３０℃、２４時間で一次併行糖化発酵を行った。糖化発酵中の培養液のｐＨは５．０に調整した。
［固液分離］
前記第一次併行糖化発酵で得られた培養液を、スクリュープレス（富国工業株式会社製ＳＨＸ－２００ ｘ １５００Ｌ、スクリーンサイズ１．２ｍｍ）で固液分離して残渣（一次残渣）と濾液を分離した。回収した一次残渣は１９．４ｋｇ（絶乾重量）であった。
［篩い処理］
固液分離後の濾液を４００メッシュ（３９μm）のスクリーンを通過させて培養液中の微細繊維を回収した。得られた微細繊維の回収量は合計で１５．６kg（絶乾重量）であった。回収した微細繊維は全量(１５．６ｋｇ)、一次併行糖化発酵槽へ返送した。
［エタノール製造］
前記篩い処理で得られた濾液を減圧蒸留装置（エバポールＣＥＰ－１、大川原製作所）で蒸留温度：４０℃、加熱温度：８０℃、供給液量：１５０Ｌ／ｈの条件でエタノールを含む水溶液と濃縮培養液に分離した。得られたエタノールを含む水溶液の体積及びエタノール濃度を測定しエタノールの回収量を算出した。溶液中のエタノール濃度はグルコースセンサー（王子計測機器製ＢＦ－４００型）で測定した。
［遠心分離］
減圧蒸留装置から分離された濃縮培養液をデカンタ式遠心機（ＩＨＩ製、ＨＳ－２０４Ｌ形）は、回転数４５００rpm、差速５．０rpmで運転し、残渣（二次残渣）と濾液に分離した。濾液は、一次併行糖化発酵槽へ移送した。回収した二次残渣は、１８．６ｋｇ（絶乾重量）であった。
（実施例Ｂ２）
図４に示す製造フローでエタノールの製造を実施した。
［前処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［一次併行糖化発酵］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［固液分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した一次残渣は１９．２ｋｇ（絶乾重量）であった。
［篩い処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。合計１００ｋｇの原料を一次併行糖化発酵で処理して得られた微細繊維の回収量は合計で１５．５ｋｇ（絶乾重量）であった。
［二次併行糖化発酵］
　篩い処理で得られた微細繊維１５．５ｋｇ（絶乾重量）を原料として二次併行糖化発酵槽に添加した。ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を二次併行糖化発酵槽に添加し水で最終容量を１５０Ｌに調整した。液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで市販酵母（商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: Ｍａｕｒｉ Ｙｅａｓｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を３０℃で２４時間培養した。培養後の酵母を含む培養液５０L及び市販セルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ ＤＵＥＴ、ジェネンコア社製）１０Ｌを発酵槽に添加し、３０℃、２４時間で二次併行糖化発酵を行った。糖化発酵中の培養液のｐＨは５．０に調整した。
［エタノール製造］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［遠心分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した二次残渣は、１８．６ｋｇ（絶乾重量）であった。
＜比較例Ｂ１＞
　図５に示す製造フローでエタノールの製造を実施した。実施例Ｂ１の［篩い処理］を省略した試験を比較例Ｂ１とした（下記）。
［前処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［一次併行糖化発酵］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［固液分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した一次残渣は１９．３ｋｇ（絶乾重量）であった。
［エタノール製造］
前記固形分離で得られた濾液を実施例Ｂ１に記載と同様の方法でエタノールを含む水溶液と濃縮培養液に分離した。得られたエタノールを含む水溶液の体積とエタノール濃度を測定しエタノールの回収量を算出した。
［遠心分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した二次残渣は、３４．２ｋｇ（絶乾重量）であった。
　　（表Ｂ１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　エタノールの生産量の結果を表Ｂ１に示す。実施例Ｂ１（微細繊維を回収し一次併行糖化発酵槽に返送した場合）及び実施例Ｂ２（微細繊維を回収し二次併行糖化発酵槽に移送した場合）では、比較例Ｂ１（微細繊維を回収しない場合）と比較しエタノール生産量が向上した。
（実施例Ｂ３）
［糖化発酵試験］
　実施例Ｂ１で得られた微細繊維を原料として用いて試験管内で糖化発酵試験を行いエタノール生産量を下記の方法で測定した。
液体培地Ａ（ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、グルコース３０ｇ／Ｌ、蒸留水に溶解、ｐＨ　５．６）１００ｍｌと液体培地Ｂ（ポリペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、麦芽エキス１０ｇ／Ｌ：蒸留水に溶解）２０ｍｌを混合した培地で市販酵母（商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: Ｍａｕｒｉ Ｙｅａｓｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を３０℃、２４時間培養した。培養後の培養液１００ｍｌを遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清を取り除き培養液の容量を１０ｍｌに調製（酵母を集菌）した（濃縮酵母菌体）。
３００ｍｌ容三角フラスコ（滅菌済）に原料（微細繊維）の最終濃度が５質量％になるように添加した。次に、濃縮酵母菌体１０ｍｌ、市販セルラーゼ（Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ ＤＵＥＴ、ジェネンコア社製）２．５ｍｌを添加し、最終容量を蒸留水で１００ｍｌにメスアップした。この混合液を３０℃で２４時間培養（糖化発酵）した。培養後の培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、２０分間）し、上清液のエタノール濃度を測定した。また、微細繊維のカッパー価（リグニン含量の指標）をＪＩＳＰ８２１１に準拠の測定法で測定した。
＜比較例Ｂ２＞
実施例Ｂ１で得られた一次残渣を原料として用いて実施例Ｂ３と同様の方法で糖化発酵試験を行いエタノール生産量及び一次残渣のカッパー価を測定した。
＜比較例Ｂ３＞
実施例Ｂ１で得られた二次残渣を原料として用いて実施例Ｂ３と同様の方法で糖化発酵試験を行いエタノール生産量及び二次残渣のカッパー価を測定した。
　　（表Ｂ２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　表Ｂ２にエタノール濃度及びカッパー価を示す。微細繊維（実施例Ｂ３）を原料とした場合、一次残渣（比較例Ｂ２）及び二次残渣（比較例Ｂ３）を原料とした場合と比較し培養液中のエタノール濃度が高かった。また、微細繊維（実施例Ｂ３）のカッパー価は、一次残渣（比較例Ｂ２）及び二次残渣（比較例Ｂ３）のカッパー価と比較し値が低かった。以上の結果から、微細繊維は一次残渣及び二次残渣と比較しリグニン含量が低く、その結果として微細繊維を糖化発酵の原料として用いた場合、一次残渣及び二次残渣と比較しエタノール生産量が高まることがわかった。微細繊維は前処理（機械的処理等）を施さなくても糖化発酵が容易に進行し、糖化発酵の原料として適していることが判明した。
（実施例Ｂ４）
　実施例Ｂ１で原料として用いたユーカリ・グロブラスの樹皮の変わりにユーカリ・グロブラスの林地残材（樹皮７０％、枝葉３０％）を原料として用いた試験を実施例Ｂ４とした。
林地残材を用いた以外は全て実施例Ｂ１と同様の方法で試験した（製造フローは図１と同様）。
＜比較例Ｂ４＞
　実施例Ｂ４の［篩い処理］を省略した試験を比較例Ｂ４とした。篩い処理を省略した以外は全て実施例Ｂ４と同様の方法で試験した（製造フローは図５と同様）。
　　（表Ｂ３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　エタノールの生産量の結果を表Ｂ３に示す。実施例Ｂ４（微細繊維を回収し一次併行糖化発酵槽に返送した場合）では、比較例Ｂ４（微細繊維を回収しない場合）と比較しエタノール生産量が向上した。
（実施例Ｂ５）
図６に示す製造フローでエタノールの製造を実施した。
［前処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［一次併行糖化発酵］
培養液中に電解質として塩化ナトリウムを添加する以外は実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。実施例Ｂ１と同様の方法で調整した培養液に塩化ナトリウム(電解質)の最終濃度が、１００ｍＭとなるように添加した（原料懸濁液の電気伝導度：１２．２ｍＳ／ｃｍ）。次に、実施例Ｂ１と同様の方法で酵母菌体及び市販セルラーゼを発酵槽に添加し、一次併行糖化発酵を行った。
［固液分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した一次残渣は１５．３ｋｇ（絶乾重量）であった。
［篩い処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した微細繊維は合計で１３．４kg（絶乾重量）であった。回収した微細繊維は全量(１３．４ｋｇ)、一次併行糖化発酵槽へ返送した。
［エタノール製造］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［遠心分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した二次残渣は、１４．７ｋｇ（絶乾重量）であった。
　　（表Ｂ４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
エタノール生産量の結果を表Ｂ４に示す。培養液中に塩化ナトリウムを添加した場合（実施例Ｂ５）では、塩化ナトリウムを添加しない場合(実施例Ｂ１)と比較しエタノール生産量が向上した。
（実施例Ｂ６）
図７に示す製造フローでエタノールの製造を実施した。
［前処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［一次併行糖化発酵］
培養液中に電解質として塩化ナトリウムを添加する以外は実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。実施例Ｂ１と同様の方法で調整した培養液に塩化ナトリウム(電解質)の最終濃度が、１００ｍＭとなるように添加した（原料懸濁液の電気伝導度：１２．２ｍＳ／ｃｍ）。次に、実施例Ｂ１と同様の方法で酵母菌体及び市販セルラーゼを発酵槽に添加し、一次併行糖化発酵を行った。
［固液分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した一次残渣は１４．８ｋｇ（絶乾重量）であった。
［篩い処理］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した微細繊維は合計で１３．０kg（絶乾重量）であった。回収した微細繊維は全量(１３．０ｋｇ)、一次併行糖化発酵槽へ返送した。
［二次併行糖化発酵］
実施例Ｂ２と同様の方法で実施した。
［エタノール製造］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。
［遠心分離］
実施例Ｂ１と同様の方法で実施した。回収した二次残渣は、１４．２ｋｇ（絶乾重量）であった。
　　（表Ｂ５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　エタノール生産量の結果を表５に示す。培養液中に塩化ナトリウムを添加した場合（実施例Ｂ６）では、塩化ナトリウムを添加しない場合(実施例Ｂ２)と比較しエタノール生産量が向上した。
　本発明の酵素糖化処理方法によれば、リグノセルロース系原料の未反応成分や反応残渣等への糖化酵素の吸着が抑えられていて、酵素糖化処理液からの酵素の分離が容易であり、酵素糖化処理工程内における糖化酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持されるので、リグノセルロース系原料の酵素糖化処理による糖類やエタノール等を工業的に生産することが可能となる。
　また、本発明により、糖化発酵後の培養液に含まれる微細繊維を糖化発酵の原料として再利用することによりエタノール生産量を向上することが可能となる。また、電解質を培養液中に添加することによりエタノール生産量の向上が可能となる。

Claims (12)

  1. 　酵素糖化反応に適した原料とする前処理が施されているリグノセルロース系原料を水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水中に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により酵素糖化処理し、酵素糖化処理後の処理懸濁液から反応生成物と酵素含有液を分離回収し、回収した酵素含有液を前記酵素糖化処理工程用の酵素として循環することを特徴とするリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  2. 前記酵素糖化反応に適した原料とする前処理が、リグノセルロース系原料を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから選ばれるアルカリ薬品の１種もしくはそれらの混合物、又は亜硫酸ナトリウムとそれらのアルカリ薬品との混合物を含有する溶液に浸漬する化学的処理を含む前処理である請求項１に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  3. 　前記リグノセルロース系原料が林地残材である請求項１又は２に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  4. 　前記リグノセルロース系原料が樹皮である請求項１又は２に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  5. 　前記水溶性塩類がアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる少なくとも１種の水溶性塩である請求項１～４のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  6. 前記水溶性塩類が、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の、ハロゲン化物、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、酢酸塩、クエン酸塩からなる群から選ばれる塩類である請求項１～５のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  7. 　前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水中に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ／ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により処理する酵素糖化処理工程、該酵素糖化処理工程から出る処理懸濁液から固形残渣を除去する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分を遠心分離して残留残渣が除去された酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、該遠心分離工程から出る液体留分を酵素含有液と生成糖含有液に分離する膜分離工程、及び該膜分離工程から得られる酵素含有液を酵素糖化処理工程に酵素源として循環供給する酵素循環工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を酵素糖化処理する方法である請求項１～６のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  8. 　前記酵素糖化処理工程が、セルロース糖化酵素と糖類を発酵基質（原料）とする発酵用微生物を併用してリグノセルロース系原料の酵素糖化反応による処理と生成糖類の発酵用微生物による発酵処理とを併行して行って糖類と共に発酵生成物を生成する併行糖化発酵処理工程である請求項１～７のいずれか１項に記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  9. 　前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を糖類を発酵基質とする発酵用微生物及び水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ/ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化処理と生成糖類を基質とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程、該併行糖化発酵処理工程から出る処理懸濁液から固形残渣を除去する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分から蒸留により発酵生成物を分離回収する蒸留工程、該蒸留工程から出る蒸留残液を遠心分離して残留残渣を除去して酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、該遠心分離工程から出る液体留分を酵素含有液と糖含有液に分離する膜分離工程、及び該膜分離工程で分離される酵素含有液を酵素糖化処理工程に酵素源として循環供給する酵素循環工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を併行糖化発酵処理する方法である請求項８記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  10. 　前記膜分離工程から分離回収される糖含有液が、オリゴ糖を主体とする糖含有液である請求項９記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  11. 前記遠心分離工程から出る液体留分を、前記膜分離工程を経ることなく糖類を含有する酵素含有液として酵素糖化処理工程に循環供給する請求項９１３記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。
  12. 前記酵素糖化処理方法が、リグノセルロース系原料に酵素糖化反応に適した原料とする処理を施す前処理工程、該前処理が施されたリグノセルロース系原料を糖類を発酵基質とする発酵用微生物及び水溶性塩類よりなる電解質と共にセルロース糖化酵素含有水に添加し、電気伝導度を５～２５ｍＳ/ｃｍに調整した原料懸濁液として酵素糖化反応により処理する酵素糖化処理と生成糖類を基質とする発酵処理を併行して行う併行糖化発酵処理工程、該併行糖化発酵処理工程から出る処理懸濁液をスクリーンサイズが１．０ ～ ２．０ｍｍのスクリュープレスで残渣と液体留分に分離する固液分離工程、該固液分離工程から出る液体留分を８０～６００メッシュの篩い処理で微細繊維と液体留分に分離する篩い処理工程、該篩い処理後の微細繊維を除いた液体留分から蒸留により発酵生成物を分離回収する蒸留工程、該蒸留工程から出る蒸留残液を遠心分離して残留残渣を除去して酵素及び糖類を含有する液体留分を得る遠心分離工程、及び該遠心分離工程から出る液体留分を、前記膜分離工程を経ることなく糖類を含有する酵素含有液として酵素糖化処理工程に循環供給する工程を有する一連の工程に従ってリグノセルロース系原料を併行糖化発酵処理する方法である請求項８記載のリグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法。 
PCT/JP2011/069743 2010-08-31 2011-08-31 リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法 WO2012029842A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2011296986A AU2011296986B2 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Method for enzymatic saccharification of lignocellulosic-containing biomass, and method for producing ethanol from lignocellulosic-containing biomass
US13/818,824 US8728770B2 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Method for enzymatic saccharification treatment of lignocellulose-containing biomass, and method for producing ethanol from lignocellulose-containing biomass
CA2809519A CA2809519C (en) 2010-08-31 2011-08-31 Method for enzymatic saccharification treatment of lignocellulose-containing biomass, and method for producing ethanol from lignocellulose-containing biomass
BR112013004261-3A BR112013004261B1 (pt) 2010-08-31 2011-08-31 Método para o tratamento de sacarificação enzimática de uma matéria-prima a base de lignocelulose
CN201180052660.9A CN103189521B (zh) 2010-08-31 2011-08-31 含木质纤维素的生物质的酶解糖化处理方法以及由含木质纤维素的生物质制造乙醇的方法
EP11821857.7A EP2612920B1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Method for enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass, and method for manufacturing ethanol from lignocellulosic biomass
NZ607405A NZ607405A (en) 2010-08-31 2011-08-31 Method for enzymatic saccharification treatment of lignocellulose-containing biomass, and method for producing ethanol from lignocellulose-containing biomass

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-193310 2010-08-31
JP2010193310 2010-08-31
JP2010-254441 2010-11-15
JP2010254441 2010-11-15
JP2010274235 2010-12-09
JP2010-274235 2010-12-09
JP2011075772 2011-03-30
JP2011-075772 2011-03-30
JP2011107820 2011-05-13
JP2011-107820 2011-05-13
JP2011123976A JP4947223B1 (ja) 2010-08-31 2011-06-02 リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法
JP2011-123976 2011-06-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012029842A1 true WO2012029842A1 (ja) 2012-03-08

Family

ID=47846631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/069743 WO2012029842A1 (ja) 2010-08-31 2011-08-31 リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8728770B2 (ja)
EP (1) EP2612920B1 (ja)
CN (1) CN103189521B (ja)
AU (1) AU2011296986B2 (ja)
BR (1) BR112013004261B1 (ja)
CA (1) CA2809519C (ja)
MY (1) MY160964A (ja)
NZ (1) NZ607405A (ja)
WO (1) WO2012029842A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0919301A (ja) * 1995-07-04 1997-01-21 Bangaade:Kk 携帯用の上履き
WO2012133495A1 (ja) * 2011-03-29 2012-10-04 東レ株式会社 糖液の製造方法
JP2014023447A (ja) * 2012-07-25 2014-02-06 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014054208A (ja) * 2012-09-12 2014-03-27 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014090707A (ja) * 2012-11-06 2014-05-19 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2016028564A (ja) * 2014-07-18 2016-03-03 王子ホールディングス株式会社 リグノセルロース系原料からのエタノール製造方法
JP2016146849A (ja) * 2012-04-26 2016-08-18 王子ホールディングス株式会社 リグノセルロース系原料からのエタノールの製造方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4524351B2 (ja) 2008-02-01 2010-08-18 三菱重工業株式会社 バイオマス原料を用いた有機原料の製造システム及び方法
CA2741602C (en) 2010-03-10 2013-04-30 Mitsubishi Heavy Industries, Ltd. Biomass hydrothermal decomposition apparatus, temperature control method thereof, and organic raw material production system using biomass material
US9422519B2 (en) 2010-07-09 2016-08-23 Mitsubishi Hitachi Power Systems Environmental Solutions, Ltd. Biomass hydrothermal decomposition system and saccharide-solution production method using biomass material
JP4764527B1 (ja) 2010-07-09 2011-09-07 三菱重工業株式会社 バイオマスの処理システム及びバイオマス原料を用いた糖液生産方法
BR112012028430B1 (pt) 2011-01-13 2018-04-24 Mitsubishi Hitachi Power Systems Enviromental Solutions, Ltd. Aparelho produtor de solução de sacarídeo, sistema de fermentação, método para produção de solução de sacarídeo e método de fermentação.
WO2013145236A1 (ja) * 2012-03-29 2013-10-03 三菱重工メカトロシステムズ株式会社 バイオマスの処理システム、バイオマス原料を用いた糖液生産方法、アルコール製造方法
MY185323A (en) 2013-02-20 2021-05-04 Toray Industries Sugar-solution production method
NZ706072A (en) 2013-03-08 2018-12-21 Xyleco Inc Equipment protecting enclosures
CA2917413A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Toray Industries, Inc. Method for producing alcohol from cellulose-containing biomass
EA201790035A1 (ru) * 2014-07-21 2017-10-31 Ксилеко, Инк. Обработка биомассы
BR112017006195A2 (ja) 2014-10-31 2018-06-19 Toray Industries, Inc. A manufacturing method of honeydew and xylo oligosaccharide
CN105671088B (zh) * 2014-11-20 2019-05-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法
MY185762A (en) 2015-04-10 2021-06-04 Comet Biorefining Inc Methods and compositions for the treatment of cellulosic biomass and products produced thereby
CN104774876B (zh) * 2015-04-10 2017-11-17 山东龙力生物科技股份有限公司 一种木质纤维素生物质综合利用的方法
EP3438269A4 (en) * 2016-03-29 2019-12-11 Toray Industries, Inc. PROCESS FOR PRODUCTION OF SUGAR LIQUOR
WO2018042464A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Arvind Mallinath Lali Rapid enzymatic hydrolysis of substrates for production of fermentable sugars
CN107232396A (zh) * 2017-06-15 2017-10-10 李广新 一种利用复配菌剂制备紫花苜蓿青贮饲料的方法
CN109554409A (zh) * 2017-09-25 2019-04-02 华东理工大学 一种木质纤维素原料同步糖化发酵醪的固液分离方法
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
EP3790409A4 (en) 2018-05-10 2021-07-21 Comet Biorefining Inc. COMPOSITIONS WITH GLUCOSE AND HEMICELLULOSE AND THEIR USES
AU2019321182A1 (en) 2018-08-15 2021-03-11 Cambridge Glycoscience Ltd. Novel compositions, their use, and methods for their formation
WO2021032647A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
BR112022011603A2 (pt) 2019-12-12 2022-08-30 Cambridge Glycoscience Ltd Produtos alimentícios multifase com baixo teor de açúcar

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55144885A (en) 1979-04-27 1980-11-12 Gulf Oil Corp Recirculation of enzyme
JPS61234790A (ja) 1985-04-10 1986-10-20 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> 糖化液の処理方法
JPS6387994A (ja) 1986-10-02 1988-04-19 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> 糖化液から糖液および酵素を得る方法
JP2005168335A (ja) 2003-12-09 2005-06-30 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 各種リグノセルロース資源からのエタノール生産システム
JP2008054676A (ja) 2006-08-04 2008-03-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology バイオマスからのエタノールの製造方法
JP2009106932A (ja) 2007-10-12 2009-05-21 Nippon Steel Engineering Co Ltd エタノール及び油の回収・製造方法
JP2009190862A (ja) 2008-02-15 2009-08-27 Mitsubishi Electric Corp エレベータ装置
JP4447148B2 (ja) 2000-11-27 2010-04-07 月島機械株式会社 セルロース系廃棄物の処理方法
JP2010098951A (ja) 2008-10-21 2010-05-06 Hitachi Zosen Corp セルロース糖化酵素の簡易的回収・再利用方法
JP2010193310A (ja) 2009-02-19 2010-09-02 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 空間多重受信装置、及び空間多重受信方法
JP2010254441A (ja) 2009-04-27 2010-11-11 Canon Electronics Inc シート搬送装置、及びシート処理装置
JP2010274235A (ja) 2009-06-01 2010-12-09 Sony Corp 白金含有触媒及びこれを用いた燃料電池
JP2011075772A (ja) 2009-09-30 2011-04-14 Seiko Epson Corp プロジェクター
JP2011107820A (ja) 2009-11-13 2011-06-02 Hitachi Solutions Ltd 訂正データ分析システム
JP2011123976A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Showa Denko Kk 磁気記録媒体の製造方法及び磁気記録再生装置

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7109005B2 (en) * 1990-01-15 2006-09-19 Danisco Sweeteners Oy Process for the simultaneous production of xylitol and ethanol
US5196069A (en) * 1991-07-05 1993-03-23 The United States Of America As Represented By The United States National Aeronautics And Space Administration Apparatus and method for cellulose processing using microwave pretreatment
US6409841B1 (en) * 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US20020197686A1 (en) * 2001-06-25 2002-12-26 Lightner Gene E. Water soluble carbhydrates derived from lignocellulose by enzyme hydrolysis
US20040231060A1 (en) * 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
JP4554314B2 (ja) * 2004-09-22 2010-09-29 財団法人地球環境産業技術研究機構 リグノセルロースの連続糖化法
US20070161095A1 (en) * 2005-01-18 2007-07-12 Gurin Michael H Biomass Fuel Synthesis Methods for Increased Energy Efficiency
WO2008033842A2 (en) * 2006-09-11 2008-03-20 The Trustees Of Dartmouth College Conversion of soybean hulls to ethanol and high-protein food additives
WO2008095098A2 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Board Of Supervisors Of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College Process for sugar production from lignocellulosic biomass using alkali pretreatment
ES2303792B1 (es) * 2007-02-15 2009-06-12 Industrias Mecanicas Alcudia S.A. Un procedimiento para la revalorizacion energetica de la fraccion organica de residuos solidos urbanos, e instalacion.
CN101765663B (zh) * 2007-03-14 2014-11-05 托莱多大学 生物质预处理
US10023881B2 (en) * 2007-04-24 2018-07-17 Novozymes A/S Detoxifying pre-treated lignocellulose-containing materials
KR101558430B1 (ko) * 2007-08-23 2015-10-12 스티흐팅 딘스트 란드바우쿤더흐 온데르주크 리그노셀룰로스계 바이오매스로부터 유기산을 얻기 위한 약알칼리성 전처리 및 동시 당화 및 발효
US20090061495A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Chris Beatty Treatment Systems and Processes for Lignocellulosic Substrates that Contain Soluble Carbohydrates
WO2009061745A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Energy Enzymes, Inc. Process of producing ethanol using starch with enzymes generated through solid state culture
CN101981200A (zh) * 2008-03-27 2011-02-23 诺维信公司 从含木素纤维素材料产生发酵产物
JP5233452B2 (ja) * 2008-07-08 2013-07-10 王子ホールディングス株式会社 糖化発酵システム
EP2169074A1 (en) * 2008-09-30 2010-03-31 Sekab E-Technology AB Fermentation process starting from cellulosic biomass and involving the recirculation of detoxified stillage into the process
EP2343379A4 (en) * 2008-10-30 2016-01-13 Oji Holdings Corp Saccharide production process and ethane production process
US20110314726A1 (en) * 2008-11-21 2011-12-29 Hasan Jameel Production of ethanol from lignocellulosic biomass using green liquor pretreatment
CN101736630B (zh) * 2008-11-21 2011-08-17 安琪酵母股份有限公司 一种木质纤维素生物炼制的预处理方法
BRPI1014908A2 (pt) * 2009-05-26 2017-01-31 Mallinath Lali Arvind método para produção de açucares fermentáveis a partir de biomassa
US20110039319A1 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Theodora Retsina Enzyme recycle from hydrolysis of lignocellulosic material
JP5353554B2 (ja) 2009-08-20 2013-11-27 王子ホールディングス株式会社 木質系バイオマスからのエタノール製造方法
WO2011027360A1 (en) * 2009-09-07 2011-03-10 Council Of Scientific & Industrial Research (An Indian Registered Body Incorporated Under The Registration Of Societies Act (Act Xxxi Of 1860) A process for integrated production of ethanol and seaweed sap from kappaphycus alvarezii

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55144885A (en) 1979-04-27 1980-11-12 Gulf Oil Corp Recirculation of enzyme
JPS61234790A (ja) 1985-04-10 1986-10-20 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> 糖化液の処理方法
JPS6387994A (ja) 1986-10-02 1988-04-19 Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> 糖化液から糖液および酵素を得る方法
JP4447148B2 (ja) 2000-11-27 2010-04-07 月島機械株式会社 セルロース系廃棄物の処理方法
JP2005168335A (ja) 2003-12-09 2005-06-30 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 各種リグノセルロース資源からのエタノール生産システム
JP2008054676A (ja) 2006-08-04 2008-03-13 National Institute Of Advanced Industrial & Technology バイオマスからのエタノールの製造方法
JP2009106932A (ja) 2007-10-12 2009-05-21 Nippon Steel Engineering Co Ltd エタノール及び油の回収・製造方法
JP2009190862A (ja) 2008-02-15 2009-08-27 Mitsubishi Electric Corp エレベータ装置
JP2010098951A (ja) 2008-10-21 2010-05-06 Hitachi Zosen Corp セルロース糖化酵素の簡易的回収・再利用方法
JP2010193310A (ja) 2009-02-19 2010-09-02 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 空間多重受信装置、及び空間多重受信方法
JP2010254441A (ja) 2009-04-27 2010-11-11 Canon Electronics Inc シート搬送装置、及びシート処理装置
JP2010274235A (ja) 2009-06-01 2010-12-09 Sony Corp 白金含有触媒及びこれを用いた燃料電池
JP2011075772A (ja) 2009-09-30 2011-04-14 Seiko Epson Corp プロジェクター
JP2011107820A (ja) 2009-11-13 2011-06-02 Hitachi Solutions Ltd 訂正データ分析システム
JP2011123976A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Showa Denko Kk 磁気記録媒体の製造方法及び磁気記録再生装置

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DESHPANDE M.V. ET AL.: "Reutilization of enzymes for saccharification of lignocellulosic materials", ENZYME.MICROB.TECHNOL., vol. 6, 1984, pages 338 - 340, XP023679079 *
ISHIHARA M. ET AL.: "Semicontinuous enzymatic hydrolysis of lignocelluloses", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 37, 1991, pages 948 - 954, XP055103828 *
ISHIHARA, M. ET AL., BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 37, 1991, pages 948 - 954
SCOTT C.D. ET AL.: "An advanced bioprocessing concept for the conversion of waste paper to ethanol", APPL.BIOCHEM.BIOTECHNOL., vol. 45/46, 1994, pages 641 - 653, XP035176524 *
SCOTT, C.D.; ROTHROCK, D.S., APPL. BIOCHEM. BIOTECHNOL., vol. 45/46, 1994, pages 641 - 653

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0919301A (ja) * 1995-07-04 1997-01-21 Bangaade:Kk 携帯用の上履き
WO2012133495A1 (ja) * 2011-03-29 2012-10-04 東レ株式会社 糖液の製造方法
JPWO2012133495A1 (ja) * 2011-03-29 2014-07-28 東レ株式会社 糖液の製造方法
JP6136267B2 (ja) * 2011-03-29 2017-05-31 東レ株式会社 糖液の製造方法
US10179924B2 (en) 2011-03-29 2019-01-15 Toray Industries, Inc. Method for producing sugar solution
JP2016146849A (ja) * 2012-04-26 2016-08-18 王子ホールディングス株式会社 リグノセルロース系原料からのエタノールの製造方法
JP2014023447A (ja) * 2012-07-25 2014-02-06 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014054208A (ja) * 2012-09-12 2014-03-27 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014090707A (ja) * 2012-11-06 2014-05-19 Oji Holdings Corp リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2016028564A (ja) * 2014-07-18 2016-03-03 王子ホールディングス株式会社 リグノセルロース系原料からのエタノール製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20130157318A1 (en) 2013-06-20
MY160964A (en) 2017-03-31
AU2011296986A1 (en) 2013-03-14
US8728770B2 (en) 2014-05-20
EP2612920A4 (en) 2016-08-24
CA2809519C (en) 2014-07-29
CA2809519A1 (en) 2012-03-08
BR112013004261A2 (pt) 2016-08-02
AU2011296986A8 (en) 2013-03-21
BR112013004261B1 (pt) 2021-04-06
EP2612920A1 (en) 2013-07-10
CN103189521B (zh) 2015-11-25
NZ607405A (en) 2013-12-20
EP2612920B1 (en) 2020-10-14
AU2011296986B2 (en) 2013-11-21
CN103189521A (zh) 2013-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012029842A1 (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP4947223B1 (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法
JP5685959B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスからの有価物の製造方法
JP5621528B2 (ja) リグノセルロース系原料の酵素糖化処理方法
JP4930650B1 (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP6213612B2 (ja) リグノセルロース系原料からのエタノールの製造方法
JP6256967B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスの前処理方法
JP6123504B2 (ja) エタノールの製造方法
JP6331490B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014090707A (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法及びリグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP5910427B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP5924192B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法
JP2013183704A (ja) リグノセルロース系原料からのエタノール製造方法。
JP2015167480A (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法
JP6528928B2 (ja) リグノセルロース系原料からのエタノール製造方法
JP2014039492A (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2014132052A (ja) 燃料組成物
JP5910367B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP6492724B2 (ja) リグノセルロース含有バイオマスの破砕方法
JP2013183690A (ja) リグノセルロース含有バイオマスの前処理方法
JP2015159755A (ja) リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
JP2015027285A (ja) バイオマス原料からのエタノール製造方法
JP5637254B2 (ja) 木質系バイオマスからのエタノール製造方法。
JP2013247924A (ja) リグノセルロース含有バイオマスの前処理方法
JP2015167530A (ja) リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11821857

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13818824

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2809519

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011821857

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011296986

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20110831

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013004261

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013004261

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130222