CN103189521B - 含木质纤维素的生物质的酶解糖化处理方法以及由含木质纤维素的生物质制造乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

一种木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其特征在于，将木质纤维素系原料与由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，以电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液的形式通过酶解糖化反应进行酶解糖化处理，从酶解糖化处理后的处理悬浮液中分离回收反应产物和含酶液体，将所回收的含酶液体作为前述酶解糖化处理工序用的酶而循环，其中，所述木质纤维素系原料施加了制成适合于酶解糖化反应的原料的预处理。

Description

含木质纤维素的生物质的酶解糖化处理方法以及由含木质纤维素的生物质制造乙醇的方法
技术领域
本发明涉及木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法或由木质纤维素系原料制造乙醇的方法，所述方法具备以下工序：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；以及，酶解糖化工序，将施加过预处理的木质纤维素系原料用酶进行糖化。更具体而言，涉及木质纤维素系生物质的酶解糖化处理方法，其包含将含有木质纤维素的生物质用由纤维素分解酶、半纤维素分解酶组成的酶群进行糖化处理的反应，所述木质纤维素施加过适合于糖化的处理，在该方法中，能够将所使用的酶群以高回收率从反应液中回收并长期循环利用，或者，涉及由含有木质纤维素的生物质制造乙醇的方法，在该方法中，通过回收同步糖化发酵处理后的处理悬浮液中残留的微细纤维，将所回收的微细纤维再次进行糖化或同步糖化发酵处理，能够提高乙醇产量。
本申请基于2010年8月31日在日本申请的日本特愿2010-193310号、2010年11月15日在日本申请的日本特愿2010-254441号、2010年12月9日在日本申请的日本特愿2010-274235号、2011年3月30日在日本申请的日本特愿2011-075772号、2011年5月13日在日本申请的日本特愿2011-107820号、2011年6月2日在日本申请的日本特愿2011-123976号要求优先权，并将其内容援引于此。
背景技术
由施加过适合于糖化的处理的木质纤维素原料制造糖的技术，由于使用该糖作为微生物的发酵基质能够制造汽油的代替燃料即醇或塑料原料即琥珀酸、乳酸等化学品原料，因此是对形成循环型社会有益的技术。
由植物系生物质中的多糖类制造发酵基质即单糖、寡糖类的方法大致分为两类。一类是使用无机酸进行水解的酸解糖化法，另一类是使用酶、生产该酶的微生物进行水解的酶解糖化法。
酸解糖化法与酶解糖化法相比在技术上已完善，但在以木质纤维素系生物质为原料的方法的情况下，与以淀粉、黑糖浆等为原料的方法相比，糖收率低，且需要处理从处理工序中排出的废酸的设备、能够耐受酸腐蚀的大型设备等会成为产品成本增加的原因，成为实用化的主要障碍。
另一方面，酶解糖化法由于近年来酶的价格逐渐降低和技术的进步，包括至后处理在内的整体成本逐渐接近于酸解糖化法的成本，但酶解糖化法的整体成本中所占比例较高的酶的价格依然昂贵，因此为了酶解糖化法的实用化，重要的是进一步降低酶所消耗的费用。
作为降低酶解糖化法的成本的技术，可考虑开发使酶与纤维素纤维的接触更容易的预处理方法，开发将结晶性纤维素高效地糖化的方法，进而开发有效地回收、再利用酶的方法等。
与去除了木质素的木质纤维素材料相比，未去除木质素的木质纤维素材料难以利用酶分解，不会糖化而与树脂、金属等杂质一起以残渣的形式残留在糖化液中。通常而言，该残渣能通过筛网、离心分离等而分离废弃。该残渣中吸附有大量占酶解糖化法成本的比重较大的酶，因此将从反应液中分离的残渣直接废弃时，存在价格昂贵的酶也被废弃的问题。即，课题在于，为了降低酶解糖化法的成本而将残渣回收并有效利用。作为对酶解糖化法中回收的残渣进行再利用的技术，报告有：将残渣燃烧而得到热能的方法(专利文献5)；将残渣制成水热气体，利用乙醇合成催化剂由所生成的合成气体合成乙醇的方法(专利文献6)；将残渣用作燃料或肥料的方法(专利文献7)；将残渣用作热能的方法(专利文献8)。但是，由于这些方法伴随附加处理工序而导致成本大幅增加，因此考虑到实用的设备的情况下，作为用于解决成本降低这一课题的方法还不能说是充分的。
作为回收上述那种残渣中的酶的手段，可以考虑残渣的清洗。但是，酶通过其分子内具有的、特异性吸附于纤维素的纤维素结合结构域(CBD)等而与纤维素牢固地结合，因此单纯地用水清洗难以充分地回收吸附于纤维素的酶。
因而，为了改善酶的回收率，提出了添加表面活性剂进行处理的方法(参照专利文献1)等。但是，表面活性剂处理方法不能说酶的回收率是充分的，另外，由于担心添加化学品导致酶的失活、伴随附加处理工序而导致成本增加以及对之后的发酵阶段的微生物的不良影响等等，因而是不实用的。
作为从糖液中回收酶的方法，提出了：使用超滤的方法(参照专利文献2)，在糖液中再次添加纤维素来吸附回收酶的方法(参照专利文献3)等。但是，超滤法存在微少的杂质堵塞过滤膜而无法获得充分的处理速度和酶回收率的问题，利用添加纤维素进行的回收方法难以充分地回收酶。
提出了不经由将所吸附的酶剥离的工序而将吸附有酶的木质纤维素残渣再利用于下次的酶解糖化的方法(专利文献4)。
该方法中，担心无法规避残渣的蓄积从而使反应效率降低。另外，CBH(纤维二糖水解酶)等具有CBD的酶能够通过将木质纤维素残渣进行下次的再处理，从而实现酶的循环利用，但β-葡萄糖苷酶等有时会游离于上清中，因而难以对所添加的全部纤维素酶进行循环利用。
另外，该方法中，未分解残渣本身处于即使再次与酶溶液混合也难以分解的状态，因而使未分解残渣处于易糖化的状态成为课题。本发明人等发现：通过对固液分离而回收的未分解残渣进行机械处理而再次糖化发酵，会提高乙醇产量(专利文献9)。但是，该方法中存在作为原料而使用的残渣是利用420目(38μm)的筛网回收的残渣、包含尺寸分布较大的纤维这一问题。大量吸附木质素的大尺寸纤维难以用酶分解，因而不施加预处理(机械处理等)就不会充分地糖化。如果仅选择性地回收木质素吸附量少的小尺寸纤维来作为原料，不施加预处理就能够再次进行酶解糖化，即可期待高效的提高乙醇的产量。
作为降低酶成本的方法，报告有循环利用酶的方法。根据Scott,C.D.等的方法(非专利文献1)，考虑设置有循环线的连续系统来预测成本，所述循环线具备以下装置：利用高速离心泵进行的磨碎装置，在大量(相对于1g基质的滤纸分解活性为80-160单位)添加酶来酶水解废纸原料的主反应槽中，从酶水解液中的未反应废纸面以高剪切力去除生成的葡萄糖、纤维二糖成分，使废纸面总是露出新的纤维素纤维表面；膜分离装置，从来自磨碎装置的处理液中分离未反应原料和水解液，仅将未反应原料循环于主反应槽中；和超滤装置，从来自膜分离装置的水解液中分离酶和生成的葡萄糖以及纤维二糖，仅将酶循环于主反应槽中。通过该系统，糖化率以25小时计认为是100%，酶的残留率以24小时计认为是95%以上。另外，还记载有存在如下报告：酶吸附于残渣而损失、残渣中的酶的吸附功能有可能因pH提高至5～7而降低、能够通过将温度降低至5℃而降低。
作为回收并再利用酶的方法，还报告有如下方法：将进行了蒸煮、爆碎处理的桦木材料以5%的浓度添加至糖化槽中，添加2万单位的纤维素酶，通过超滤来分离糖液和酶液而回收再利用酶，同时用8日由2kg桦木材料得到630g单糖类，认为该方法中能够节约酶用量的20%(非专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭63-87994号公报
专利文献2：日本特开昭61-234790号公报
专利文献3：日本特开昭55-144885号公报
专利文献4：日本特开2010-98951号公报
专利文献5：日本专利第4447148号
专利文献6：日本特开2005-168335号公报
专利文献7：日本特开2008-54676号公报
专利文献8：日本特开2009-106932号公报
专利文献9：日本特愿2009-190862号
非专利文献
非专利文献1：Scott,C.D.,Rothrock,D.S.,Appl.Biochem.Biotechnol.,45/46,pp.641-653(1994)
非专利文献2：Ishihara,M.,etal.,Biotechnol.Bioeng.,37,948-954(1991)
发明内容
发明要解决的问题
由木质纤维素等生物质制造糖类的技术是能够提供新型的至今为止依赖于化石资源的燃料、塑料原料的技术，尤其是有助于构建循环型社会的技术。如前所述，至今为止开发了各种技术，但主要由于糖化所需的酶的成本高，存在不经济的课题。
如前所述，对回收糖化中使用的酶并重复使用从而降低酶的用量，进行了各种尝试，但由于糖化时产生的残渣较强地吸附酶，导致回收率降低，问题尚未得到解决。像这样，酶解糖化时产生的残渣程度强地吸附酶是酶回收时的最大问题，如果能够将该问题解决则酶的再循环性提高，能够使成本降低，从而大幅改善酶解糖化处理方法的经济性。因此，本发明的目的在于，提供一种能够有效利用为了木质纤维素材料的酶解糖化处理而投入的酶而不使其浪费的方法，并且提供一种以木质纤维素为原料的乙醇制造工序中乙醇收率高的乙醇制造方法。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题，本发明人等对于在连续进行酶解糖化反应的工序中占整体成本极大比例的价格昂贵的酶，研究了通过提高酶的回收率并重复使用来降低成本的方法，其结果，完成了下述的发明。本发明选择抑制酶解糖化反应液中的酶被木质纤维素原料、反应残渣等吸附的手段是基于该手段能够使从酶解糖化反应后的反应液中分离酶变得容易、同时防止酶与要进行废弃处理的残渣一起排出至体系外这一构思，进而发现，从同步糖化发酵工序的培养液所包含的残渣中仅选择性地回收易被糖化的微细纤维，将所回收的微细纤维作为原料再次进行糖化或同步糖化发酵，由此，乙醇产量提高且工序内排出的残渣量减少，从而完成了下述发明。
本发明是基于上述发现而进行的，具有以下方式。
(1)一种木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其特征在于，将木质纤维素系原料与由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，以电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液的形式通过酶解糖化反应进行酶解糖化处理，从酶解糖化处理后的处理悬浮液中分离回收反应产物和含酶液体，将所回收的含酶液体作为前述酶解糖化处理工序用的酶而循环，其中，所述木质纤维素系原料施加了制成适合于酶解糖化反应的原料的预处理。
(2)根据(1)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述制成适合于酶解糖化反应的原料的预处理包括化学处理，所述化学处理中，将木质纤维素系原料浸渍于含有选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠以及碳酸氢钠中的碱性化学品的1种或它们的混合物、或者亚硫酸钠与这些碱性化学品的混合物的溶液中。
(3)根据(1)或(2)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述木质纤维素系原料为林地废料。
(4)根据(1)或(2)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述木质纤维素系原料为树皮。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述水溶性盐类为选自碱金属盐和碱土金属盐中的至少1种水溶性盐。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述水溶性盐类为选自由碱金属或碱土金属的、卤化物、硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、乙酸盐、柠檬酸盐组成的组中的盐类。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述酶解糖化处理方法是按照一系列的工序对木质纤维素系原料进行酶解糖化处理的方法，所述工序包括：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；酶解糖化处理工序，将该施加了预处理的木质纤维素系原料与由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，以电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液的形式通过酶解糖化反应进行处理；固液分离工序，从来自该酶解糖化处理工序的处理悬浮液中去除固体残渣；离心分离工序，将来自该固液分离工序的液体馏分离心分离，得到去除了残留残渣的、含有酶和糖类的液体馏分；膜分离工序，将来自该离心分离工序的液体馏分分离为含酶液体和含有生成的糖的液体；以及，酶循环工序，将由该膜分离工序得到的含酶液体作为酶源循环供给至酶解糖化处理工序。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述酶解糖化处理工序是组合使用纤维素酶制剂和以糖类作为发酵基质(=原料)的发酵用微生物，同步进行木质纤维素系原料的利用酶解糖化反应进行的处理和生成的糖类的利用发酵用微生物进行的发酵处理，从而一并生成糖类和发酵产物的同步糖化发酵处理工序。
(9)根据(8)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述酶解糖化处理方法是按照一系列的工序对木质纤维素系原料进行同步糖化发酵处理的方法，所述工序包括：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；同步糖化发酵处理工序，将该施加了预处理的木质纤维素系原料与以糖类为发酵基质的发酵用微生物以及由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，以电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液的形式同步进行酶解糖化处理和以生成的糖类作为基质的发酵处理；固液分离工序，从来自该同步糖化发酵处理工序的处理悬浮液中去除固体残渣；蒸馏工序，通过蒸馏从来自该固液分离工序的液体馏分中分离回收发酵产物；离心分离工序，将来自该蒸馏工序的蒸馏残液离心分离，去除残留残渣，得到含有酶和糖类的液体馏分；膜分离工序，将来自该离心分离工序的液体馏分分离为含酶液体和含糖液体；以及，酶循环工序，将由该膜分离工序分离的含酶液体作为酶源循环供给至酶解糖化处理工序。
(10)根据(9)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，从前述膜分离工序中分离回收的含糖液体为以寡糖为主体的含糖类液体。
(11)根据(9)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，将来自前述离心分离工序的液体馏分不经由前述膜分离工序而作为含有糖类的含酶液体循环供给至酶解糖化处理工序。
(12)根据(8)所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，前述酶解糖化处理方法是按照一系列的工序对木质纤维素系原料进行同步糖化发酵处理的方法，所述工序包括：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；同步糖化发酵处理工序，将该施加了预处理的木质纤维素系原料与以糖类为发酵基质的发酵用微生物以及由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，以电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液的形式同步进行通过酶解糖化反应进行处理的酶解糖化处理和以生成的糖类作为基质的发酵处理；固液分离工序，将来自该同步糖化发酵处理工序的处理悬浮液用筛网尺寸为1.0～2.0mm的螺旋压力机分离为残渣和液体馏分；筛分处理工序，将来自该固液分离工序的液体馏分通过80～600目的筛分处理分离为微细纤维和液体馏分；蒸馏工序，通过蒸馏从该筛分处理后的去除了微细纤维的液体馏分中分离回收发酵产物；离心分离工序，将来自该蒸馏工序的蒸馏残液离心分离，去除残留残渣，得到含有酶和糖类的液体馏分；以及，将来自该离心分离工序的液体馏分不经由前述膜分离工序而作为含有糖类的含酶液体循环供给至酶解糖化处理工序的工序。
发明的效果
根据本发明的酶解糖化处理方法，能够抑制糖化酶吸附于木质纤维素系原料的未反应成分、反应残渣等，从酶处理悬浮液中分离、回收糖化酶变得容易，其结果，能够提供酶损失极少、经济性高且连续的木质纤维素系生物质的酶解糖化处理方法。
另外，根据本发明，通过将以木质纤维素为原料的同步糖化发酵后的培养液中包含的微细纤维选择性地回收，将所回收的微细纤维作为原料再次进行糖化或同步糖化发酵，从而能够提高乙醇产量。
附图说明
图1是表示本发明的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法的一个实施方式的工序图。
图2是使本发明的木质纤维素系原料的酶解糖化处理工序为同步进行酶解糖化处理和以生成的糖作为原料的发酵处理的同步糖化发酵处理工序的工序图。
图3是表示实施例B1的制造工序流程的图。
图4是表示实施例B2的制造工序流程的图。
图5是表示比较例B1的制造工序流程的图。
图6是表示实施例B5的制造工序流程的图。
图7是表示实施例B6的制造工序流程的图。
具体实施方式
以下，进一步对本发明进行详细说明。
＜木质纤维素系原料＞
作为本发明的方法中用作原料的木质纤维素系原料，作为木本系，可列举出造纸用树木、林地废料、间伐材料等树片或树皮、锯木厂等产生的锯末或木屑、路边树的修剪枝叶、建筑废材等；作为草本系，可列举出槿麻、稻草、麦秆、甘蔗渣等农产废弃物、油料作物或橡胶等工艺作物的残渣以及废弃物(例如EFB：EmptyFruitBunch(空果束))、草本系能量作物的蔗茅属(Erianthus)、芒属(Miscanthus)、象草(napiergrass)等木质纤维素系生物质。另外，作为本发明中的木质纤维素系原料，还可以利用来自木材的纸、废纸、纸浆、纸浆泥等。
在前述木本系的木质纤维素系原料之中，木材的树皮目前基本上没有被有效利用，从锯木厂、树片工厂能够大量获取品质均匀的树皮，树皮比木材的木部部分柔软且可溶性成分多，因而特别优选作为糖化处理、同步糖化发酵处理的原料。
例如，通常用于造纸原料用途的Eucalyptus属或Acacia属等树种的树皮能够从造纸原料用途的锯木厂、树片工厂等稳定且大量地获取，因而特别适合使用。
＜制成适合于酶解糖化处理的原料的预处理＞
本发明的制成适合于酶解糖化处理的原料的预处理是指对前述木质纤维素系原料进行以下的预处理，从而将木质纤维素制成能够酶解糖化的状态的处理。
化学处理、水热处理、加压热水处理、二氧化碳添加水热处理、蒸煮处理、湿式粉碎处理、机械磨碎处理或破碎纤维化处理等机械处理、稀硫酸处理、水蒸气爆碎处理、氨爆碎处理、二氧化碳爆碎处理、超声波照射处理、微波照射处理、电子束照射处理、γ射线照射处理、超临界处理、亚临界处理、有机溶剂处理、相分离处理、木材腐朽菌处理、绿色溶剂活化处理、各种催化剂处理、自由基反应处理、臭氧氧化处理。
这些处理可以是各自单独处理，或者也可以是组合多种而成的处理。
其中，优选对上述木质纤维素系生物质进行选自化学处理、加压热水处理、破碎纤维化处理以及机械磨碎处理中的一种以上预处理。
前述化学处理是将木质纤维素系原料浸渍在酸、碱等化学品的水溶液中从而将其制成适合于下一工序的酶解糖化处理的状态的处理。
对化学处理中使用的化学品等没有特别限定，例如，为选自碱金属或碱土金属的氢氧化物、硫酸、稀硫酸等硫化物、碳酸盐、硫酸盐或亚硫酸盐中的1种以上，在选自氢氧化钠、氢氧化钙、硫化钠、碳酸钠、碳酸钙、亚硫酸钠等中的1种以上化学品的水溶液中浸渍而成的碱处理等作为化学处理是适合的。另外，还可以通过臭氧、二氧化氯等氧化剂进行化学处理。
作为这些预处理的后处理，将化学处理与前述破碎纤维化处理、机械磨碎处理等机械处理组合进行是适合的。
化学处理中使用的化学品的添加量可以根据情况而任意调整，从降低化学品成本的方面考虑，或者从防止因纤维素的溶出、过分解导致收率降低的方面考虑，理想的是，化学品的添加量相对于木质纤维素系原料的绝干品100质量份为50质量份以下。化学处理中的在化学品的水溶液中浸渍的时间和处理温度可以根据所使用的原料、化学品而任意地设定，通常来说，可以在处理时间为20～90分钟、处理温度为80～200℃的条件下进行。由于将处理条件设置得严酷有时会产生原料中的纤维素向液体一侧溶出或过分解的情况，因而优选处理时间为70分钟以下、处理温度为180℃以下。更优选处理时间为30分钟～1小时、处理温度为80℃～130℃。
作为前述机械处理，可列举出破碎、裁切、磨碎等任意的机械手段，是将木质纤维素制成在下一工序的糖化发酵处理工序中易于被糖化的状态的处理。对所使用的机械装置没有特别限定，例如可以使用单螺杆破碎机、双螺杆破碎机、锤式破碎机、精磨机、捏合机等。
对于施加了预处理的木质纤维素系原料而言，优选的是，在用于制备木质纤维素系原料悬浮液之前，进行杀菌处理，其中，所述预处理用于制成适合于酶解糖化反应处理的原料。木质纤维素系生物质原料中混入有杂菌时，会产生进行利用酶的糖化时杂菌消耗糖而导致产物的收量降低这样的问题。
杀菌处理可以采用将原料暴露于酸、碱等菌难以生长的pH的方法，也可以采用在高温下处理的方法，还可以将两者组合。对于酸、碱处理后的原料，优选的是，调整为中性附近或适合于糖化处理或糖化发酵处理的pH下后作为原料而使用。另外，在高温杀菌的情况下，也优选降温至室温或适合于糖化发酵工序的处理的温度后作为原料而使用。像这样，通过调整温度、pH后将原料送出，可以使酶暴露于适合的pH、适合的温度以外，从而可以防止失活。
施加了预处理的木质纤维素系原料与适量的水、酶以及水溶性盐、根据情况进一步与发酵所需的酵母等微生物混合而制成原料悬浮液，以电导率调整至规定数值的状态供给至酶解糖化处理工序，其中，所述预处理用于制成适合于利用酶解糖化反应进行的处理的原料。用于实施酶解糖化处理方法的代表性工序示于图1。
＜酶解糖化处理＞
在按照图1的工序的酶解糖化处理方法的情况下，在图1中示作“糖化”的酶解糖化处理工序中，将从示作“预处理”的预处理工序中供给的木质纤维素系原料、糖化酶和作为电解质的水溶性盐类添加到适量的水中而制备的原料悬浮液在搅拌下进行酶解糖化处理。原料悬浮液中的木质纤维素原料浓度优选为1～30质量%。不足1质量%时，会产生最终产物的浓度过低、产物的浓缩成本变高这一问题。另外，超过30质量%时，随着浓度变高，会产生原料的搅拌变得困难、生产率降低这一问题。
酶解糖化处理工序中的原料悬浮液的电导率优选维持在5mS/cm～25mS/cm的范围内。
pH可以在所使用的酶不会失活的3.5～10.0的范围内选择，更优选维持在3.5～7.5的范围内。
糖化工序或同步糖化发酵工序中的pH优选维持在3.5～10.0的范围内，更优选维持在4.0～7.5的范围内。
酶解糖化处理的温度只要在酶的最适温度的范围内就没有特别限定，通常为25～50℃，优选为30～40℃。
另外，作为酶解糖化反应方式，优选为连续式，也可以为半间歇式、间歇式。
反应时间根据酶浓度而异，在间歇式的情况下，通常为10～240小时，优选为15～160小时。在连续式的情况下，通常的平均滞留时间为10～150小时，优选为15～100小时。
酶解糖化处理或同步糖化发酵中使用的纤维素分解酶可以从具有纤维二糖水解酶活性、内切葡聚糖酶活性、β葡萄糖苷酶活性的所谓总称为纤维素酶的酶群中适当选择。
对于各纤维素分解酶，可以以适当的量添加具有各种活性的酶，市售的纤维素酶制剂中，具有上述各种纤维素酶活性的同时还具有半纤维素酶活性的纤维素酶较多，因而还可以使用市售的纤维素酶制剂。
作为市售的纤维素酶制剂，为源自Trichoderma属、Acremonium属、Aspergillus属、Phanerochaete属、Trametes属、Humicola属、Bacillus属等的纤维素酶制剂。作为这种纤维素酶制剂的市售品，全部以商品名计，例如可列举出CellulosinT2(HBIEnzymesInc.制)、Meicelase(明治制果株式会社制)、Novozyme188(Novozymes公司制)、MULTIFECTCX10L(Genencor公司制)、GC220(GenencorInternational制)等。
纤维素酶制剂相对于100质量份原料固体成分的用量优选为0.5～100质量份，特别优选为1～50质量份。
作为以电解质的形式添加的水溶性盐，可以单独或组合使用选自酸式盐、碱式盐、中性盐或乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液之类的含盐缓冲液等中的水溶性盐。水溶性盐的浓度只要在不会对酶解糖化反应造成不优选的影响的范围内就可以自由地设定。
其中，优选为选自碱金属盐和碱土金属盐的水溶性盐类。作为碱金属盐和碱土金属盐，可列举出选自由碱金属、碱土金属的卤化物、硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、乙酸盐、柠檬酸盐组成的组中的水溶性盐。
本发明中，可以在酶解糖化处理工序内添加作为电解质的水溶性盐。
在酶解糖化处理工序中，优选在原料悬浮液中添加电解质，使原料悬浮液的电导率维持在5～25mS/cm的范围内。通过使电导率维持在5～25mS/cm的范围内，可以抑制酶吸附于木质纤维素原料的未反应成分、反应残渣等，因而可以维持酶解糖化处理工序内的酶的循环率长期维持在高水平。酶解糖化处理工序内，只要是在操作上能够添加电解质的工序，则在任意工序中均可无限制地添加电解质。添加到一次糖化发酵工序内的操作容易，因而优选。
＜固液分离＞
完成“糖化工序”的处理悬浮液被送至图1中示作“固液分离”的、具有过滤装置的固液分离工序，固体残渣被去除。固液分离工序中利用过滤装置而分离出的固体残渣包含木质素、半纤维素、纤维素，纤维素在被木质素等保护的状态下，处于无法促进进一步糖化的状态，因而通常被排出至工序外。
另外，完成一次同步糖化发酵工序的培养液被转移到固液分离工序，被分离为液体成分(滤液)和残渣(一次残渣)。作为进行固液分离的装置，使用筛网尺寸为1.0～2.0mm的螺旋压力机。螺旋压力机从结构上来说不易发生由纤维导致的网眼堵塞，是用较少能量即可高效地进行固液分离的装置。为了提高固液分离效率，也可以施加反压力。
固液分离工序中分离出的残渣包含木质素、半纤维素、纤维素，木质素吸附于纤维素，呈现利用酶进行的糖化变得困难的状态。固液分离工序后的残渣包含大量没有被一次同步糖化发酵工序分解的纤维成分，通过施加机械处理、化学处理，糖化变得容易(专利文献6)。
固液分离工序中分离出的滤液(液体成分)被转移至接下来的筛分处理工序。
＜离心分离工序＞
通过固液分离工序去除了固体残渣的液体馏分接着被送至示作“离心分离”的离心分离工序，来自固体成分离工序的液体馏分中混杂的残留残渣被去除，并被送至图1中示作“膜分离”的糖液和酶液的回收工序。
另外，蒸馏残液被转移至离心分离工序，通过离心分离去除残留的残渣(二次残渣)后，将液体馏分循环至一次同步糖化发酵工序(参照图3)。该液体馏分中包含酶，在一次同步糖化发酵工序中再利用。另一方面，残渣中包含木质素，可以作为燃烧原料回收而作为能量利用，也可以回收木质素来有效利用。
＜膜分离工序＞
通过离心分离工序去除了残留残渣的液体馏分为含有酶和生成的糖类的液体馏分，通过图1中示作“膜分离”的膜分离工序而分离为含酶液体和含糖液体，含酶液体被送至示作“回收酶”的酶液贮槽，由贮槽作为酶源进行循环。含糖类液体直接以制品的形式去除。
含糖类液体中不仅包含6碳糖、5碳糖等单糖类，还包含寡糖类，因此在以制造单糖类为目的时，还可以将寡糖类分离而供给至“糖化工序”，进而进行酶处理来分解成单糖类。
＜一次同步糖化发酵处理工序＞
图1中示作“糖化工序”的酶解糖化处理工序能够同时进行以酶解糖化反应中生成的糖类作为原料(发酵基质)的、利用微生物进行的发酵处理，即所谓的同步糖化发酵处理工序。此时，原料悬浮液中除了糖化酶之外，还一起加入以生成的糖类作为发酵基质(发酵原料)的发酵用微生物。用于实施同步糖化发酵处理方法的典型的工序示于图2。
图2中，将通过预处理工序而处理成适合于酶解糖化处理的状态的木质纤维素系原料、作为电解质的水溶性盐类、纤维素分解酶和醇酵母等发酵用微生物一起添加到适量的水中，以电导率调整至规定值的原料悬浮液的形式在同步糖化发酵工序中同时进行利用酶解糖化反应进行的纤维素的糖化处理以及以生成的糖类作为发酵基质的醇发酵等发酵处理。
施加了适合于糖化发酵的预处理的木质纤维素系原料与适量的水、酶以及发酵所需的酵母等微生物混合，并供给至一次同步糖化发酵工序。同步糖化发酵处理方法的典型工艺示于图1。
图3中，通过预处理工序而处理成适合于糖化发酵处理的状态的木质纤维素系原料被酶糖化(纤维素→葡萄糖)，接着通过酵母而发酵(葡萄糖→乙醇)。
作为发酵用途中使用的微生物，可以使用酵母等。微生物可以与用于其培养的培养基等一起添加。作为酵母，可以使用专利文献3等记载的公知的酵母，例如，Sacharomiycescerevisae、Pichiastipitis、Issatchenkiaorientalis、Candidabrassicae、Rhizopusjavanicus等酵母类(yeast)。
可以预先将微生物固定化。若预先将微生物固定化，则在接下来的工序中可以省略回收微生物这一工序，或者至少可以减轻回收工序的负担，还可以减轻损失微生物的风险。另外，没有达到将微生物固定化那种程度的优点，但通过选择具有凝集性的微生物，可以容易地回收微生物。
图2的工序中，来自同步糖化发酵工序的处理悬浮液被送至固液分离工序，固体成分被去除后，含有发酵产物和糖类的液体馏分为了分离回收发酵产物而被送至图2中示作“蒸馏”的“蒸馏工序”。蒸馏工序中，发酵产物通过减压蒸馏装置而被蒸馏分离。根据减压蒸馏，可以在低温度下分离发酵产物，因而可以防止酶的失活。作为减压蒸馏装置，可以使用旋转蒸发仪、闪蒸器等。
蒸馏温度优选为25～60℃。低于25℃时，产物的蒸馏费时且生产率降低。另外，高于60℃时，酶发生热变性而失活，由于新追加的酶量增加，因而经济性恶化。
蒸馏后的蒸馏残液中残留的发酵产物的浓度优选为0.1质量%以下。通过制成这样的浓度，可以降低在后段的离心分离工序中与残留残渣一起排出的发酵产物的量，可以提高收率。
来自蒸馏工序的蒸馏残液接着被送至图2中示作“离心分离”的离心分离工序，蒸馏残液中混杂的残留残渣被去除，从而可以得到含有酶和糖类的液体馏分。
该含有酶和糖类的液体馏分被送至图2中示作“膜分离”的膜分离工序，被分离为含酶液体和含糖类液体，含酶液体经由图2中示作“回收酶”的酶液贮槽而循环供给至“同步糖化发酵工序”。另外，含糖液体被收集于图2中示作“糖”的糖液贮槽中，作为糖制品。
同步糖化发酵工序中，除了生成属于纤维素的酶分解产物的六碳糖，即葡萄糖、甘露糖、半乳糖等；源自半纤维素的五碳糖，即木糖等之外，还生成寡糖类，以葡萄糖等六碳糖类作为主要发酵基质而生成乙醇之类的醇等。另外，五碳糖、寡糖不会成为发酵基质，因此直接与酶一起被送至酶回收工序。在这种情况下，对于五碳糖，可以将确实以其作为发酵基质的酵母也添加到原料悬浮液中，或者通过其它工序进行发酵处理。另外，也可以根据需要以制品的形式回收。
另外，对于寡糖类，可以根据需要以制品的形式回收，也可以与按照图1的工序的酶解糖化处理方法中说明同样地用作在同步糖化发酵工序中利用酶而分解成单糖类的原料。
木质纤维素系原料的悬浊浓度优选为1～30质量%。不足1质量%时，会产生最终产物的浓度过低、产物的浓缩成本变高这一问题。另外，超过30质量%时，随着浓度变高，会产生原料的搅拌变得困难、生产率降低这一问题。
＜筛分处理工序＞
对固液分离后的滤液进行筛分处理而分离为微细纤维和滤液(液体成分)。作为筛分处理的方法，只要是能够分离微细纤维的筛分处理装置就可以没有特别限定地使用。作为筛分处理装置，可以使用筛网、压滤机等。筛的目(网眼)优选为80目～600目(28～182μm)，进一步优选为150目～400目(39～97μm)。为了提高处理效率，也可以在筛上安装振动装置来施加振动。通过以上处理而分离出的微细纤维与一次残渣、二次残渣相比木质素含量低、容易通过酶而糖化。另外，通过利用筛分处理去除微细纤维，具有能够减轻后段的蒸馏工序中使用的减压蒸馏装置内附着的固体成分量、装置能够长时间运转的优点。所回收的微细纤维可以转移到一次糖化发酵工序而用作糖化发酵的原料(参照图3)。另外，所回收的微细纤维也可以转移到后述的二次糖化发酵工序(不同于一次糖化发酵工序的糖化发酵工序)而用作糖化发酵的原料(参照图4)。进而，还可以在其它工序中仅进行糖化。通过像这样将微细纤维糖化或糖化发酵，可以有效地利用微细纤维所吸附的酶。
另一方面，通过筛分处理而分离出的滤液被转移至蒸馏工序。
＜二次同步糖化发酵处理工序＞
二次同步糖化发酵处理工序是独立于一次同步糖化发酵处理工序的糖化发酵工序，可以以新的木质纤维素作为原料而使其糖化发酵，也可以以工序内排出的残渣作为原料而使其糖化发酵。另外，还可以使在一次同步糖化发酵工序中未发酵成乙醇的糖通过二次同步糖化发酵处理工序而发酵。一次同步糖化发酵工序中，源自纤维素的六碳糖即葡萄糖、甘露糖、半乳糖等进行了乙醇发酵，而源自半纤维素的五碳糖即木糖还存在以未反应的状态残留的成分。在这种情况下，还可以在二次同步糖化发酵处理工序中添加使五碳糖更确实地发酵的酵母来使五碳糖发酵。本发明中，可以将通过前述筛分处理而回收的微细纤维转移至二次同步糖化发酵处理工序，从而使其糖化发酵。
＜蒸馏工序＞
筛分处理后的滤液或二次同步糖化发酵处理工序后的处理液(培养液)被转移至蒸馏工序(参照图3、图4)。
蒸馏工序中，发酵产物通过减压蒸馏装置而被蒸馏分离。在减压下可以在低温度下分离发酵产物，因而可以防止酶的失活。作为减压蒸馏装置，可以使用旋转蒸发仪、闪蒸器等。
实施例
以下，通过实施例来说明本发明，但本发明不限定于这些实施例等。各实施例和比较例中的“%”为“质量%”、“份”为“质量份”。
(实施例A1)
在包含20g48%苛性钠的水1000ml中投入已破碎的林地废料100g，在90℃下处理30分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将其用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。
以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、并且氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为11.8mS/cm的木质纤维素悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加10ml酶(商品名：GC220，Genencor公司制)。
在30℃、120rpm的搅拌下进行糖化反应，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
将被视为酶回收中最重要的β-葡萄糖苷酶的活性作为指标，算出回收率。活性测定按照如下所示的方法进行。(β-葡萄糖苷酶活性)
β-葡萄糖苷酶活性的测定如下进行：在包含1.25mM4-甲基伞形酮葡糖苷的125mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)16μl中加入酶液4μl，在37℃下进行10分钟的反应后，添加500mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0)100μl，使反应终止，测定350nm的激发光下的460nm的荧光强度。酶回收率由以下的计算式而求出。
酶回收率(%)=(上清的酶活性/所添加的酶活性)×100
(实施例A2)
在实施例A1的方法中，除了添加碳酸氢钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A1同样进行。此时的反应体系内的电导率为8.6mS/cm。
(实施例A3)
在包含20g48%苛性钠的水1000ml中投入已破碎的林地废料100g，在90℃下处理30分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将其用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。
以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为12.0mS/cm的原料悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加10ml酶(商品名：GC220，Genencor公司制)。
进而，将市售酵母(商品名：Maurivin，MauriYeastAustraliaPtyLimited)添加到如上那样制备的原料悬浮液中，在30℃、120rpm的搅拌下进行糖化发酵培养，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
(实施例A4)
在实施例A3的方法中，除了添加氯化钾至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为13.3mS/cm。
(实施例A5)
在实施例A3的方法中，除了添加碘化钾至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为14.5mS/cm。
(实施例A6)
在实施例A3的方法中，除了添加硫酸钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为14.7mS/cm。
(实施例A7)
在实施例A3的方法中，除了添加亚硫酸钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为13.6mS/cm。
(实施例A8)
在实施例A3的方法中，除了添加硫代硫酸钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为16.9mS/cm。
(实施例A9)
在实施例A3的方法中，除了添加碳酸钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为12.6mS/cm。
(实施例A10)
在实施例A3的方法中，除了添加磷酸氢二钾至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为15.0mS/cm。
(实施例11)
在实施例A3的方法中，除了添加磷酸氢二钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为11.9mS/cm。
(实施例A12)
在实施例A3的方法中，除了添加碳酸氢钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为8.9mS/cm。
(实施例A13)
在实施例A3的方法中，除了添加柠檬酸三钠至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为15.4mS/cm。
(实施例A14)
在实施例A3的方法中，除了添加乙酸盐缓冲液(pH5.0)至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为7.1mS/cm。
(实施例A15)
在实施例A3的方法中，除了添加柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)至其终浓度达到100mM来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。此时的反应体系内的电导率为10.9mS/cm。
(实施例A16)
在包含20g48%苛性钠的水1000ml中投入已破碎的蓝桉树皮100g，在90℃下处理30分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将来自该精磨机的磨碎处理液用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。
以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、并且氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为11.8mS/cm的木质纤维素悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加酶(商品名：GC220，Genencor公司制)。
在30℃、120rpm的搅拌下进行糖化反应，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
(实施例A17)
在包含20g48%苛性钠的水1000ml中投入已破碎的蓝桉树皮100g，在90℃下处理30分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将来自该精磨机的磨碎处理液用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。
以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、并且氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为11.8mS/cm的木质纤维素悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加酶(商品名：GC220，Genencor公司制)。进而，将市售酵母(商品名：Maurivin，MauriYeastAustraliaPtyLimited)添加到如上那样制备的木质纤维素悬浮液中，在30℃、120rpm搅拌下进行糖化发酵培养，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
(实施例A18)
在包含20g97.0%亚硫酸钠和1g苛性钠的水700ml中投入已破碎的林地废料100g，在170℃下处理60分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将其用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、并且氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为8.9mS/cm的木质纤维素悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加10ml酶(GC220，Genencor公司)。
在30℃、120rpm的搅拌下进行糖化反应，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
(实施例A19)
在包含20g97.0%亚硫酸钠和1g苛性钠的水700ml中投入已破碎的林地废料100g，在170℃下处理60分钟后，用精磨机(间隙0.5mm)磨碎。将其用螺旋压力机脱水、清洗而作为基质原料。
以基质原料的终浓度达到5%、CSL(玉米浆)的终浓度达到1%、硫酸铵的终浓度达到0.5%、氯化钠的终浓度达到100mM的方式进行添加，从而制备电导率为9.4mS/cm的木质纤维素悬浮液400ml。
将这样制备的木质纤维素悬浮液在120℃下蒸汽灭菌20分钟，冷却至40℃后，添加10ml酶(商品名：GC220，Genencor公司制)。
进而，将市售酵母(商品名：Maurivin：MauriYeastAustraliaPtyLimited)添加到上述那样制备的木质纤维素悬浮液中，在30℃、120rpm的搅拌下进行糖化发酵培养，回收24小时后、48小时后的反应液1ml，测定以10000rpm离心分离5分钟后的上清的酶活性。
(实施例A20)
在实施例A16的方法中，除了将包含20g48%苛性钠的水1000ml变更为包含20g97.0%亚硫酸钠和1g苛性钠的水700ml以外，与实施例A16同样进行。此时的反应体系内的电导率为11.2mS/cm。
(实施例A21)
在实施例A17的方法中，除了将包含20g48%苛性钠的水1000ml变更为包含20g97.0%亚硫酸钠和1g苛性钠的水700ml以外，与实施例A17同样进行。此时的反应体系内的电导率为11.2mS/cm。
(比较例A1)
在实施例A1的方法中，除了添加硫酸而将反应体系的电导率调整为6.5mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A1同样进行。
(比较例A2)
在实施例A1的方法中，除了添加氢氧化钠而将反应体系的电导率调整为8.0mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A1同样进行。
(比较例A3)
在实施例A3的方法中，除了不添加氯化钠以外，与实施例3同样进行。此时的反应体系内的电导率为4.2mS/cm。
(比较例A4)
在实施例A3的方法中，除了添加硫酸而将反应体系内的电导率调整为6.3mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。
(比较例A5)
在实施例A3的方法中，除了添加盐酸而将反应体系内的电导率调整为6.6mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。
(比较例A6)
在实施例A3的方法中，除了添加氢氧化钠而将反应体系内的电导率调整为8.2mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A3同样进行。
(比较例A7)
实施例A1的方法中，除了添加氯化钠至其终浓度达到5mM而将反应体系的电导率调整为4.6mS/cm来代替添加氯化钠至其终浓度达到100mM以外，与实施例A1同样进行。
实施例A1～A21以及比较例A1～A7的结果示于表A1。
(表A1)
表A1的结果显示出：实施例的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法通过在酶解糖化反应体系中添加水溶性盐，进而对电导率调整至规定数值范围内的木质纤维素系原料悬浮液进行酶解糖化处理，糖化处理液的酶回收率不仅在初始阶段高、且经时稳定并处于高水平。
与此相对，在酶解糖化反应体系中不添加水溶性盐而通过硫酸(比较例A1、比较例A4)、盐酸(比较例A5)、氢氧化钠(比较例A2、比较例A6)来调整电导率的情况下显示出：糖化处理液的酶回收率在初始阶段就低、经时的回收率降低也显著。另外，在不添加盐或即使添加盐酶反应体系的电导率也低的情况下(比较例A3、比较例A7)，糖化处理液的酶回收率在初始阶段也低且经时进一步降低。
(实施例B1)
按照图3所示的制造流程而实施了乙醇的制造。
[预处理]
将片状的蓝桉的树皮用安装有20mm的圆孔筛网的单螺杆破碎机(西邦机工公司制，SC-15)进行破碎，作为原料使用。
将以氢氧化钙相对于上述原料100kg(绝干重量)达到12.5质量%的方式悬浮在水中而成的氢氧化钙溶液添加到原料中后(相对于原料的液比为8)，在120℃下加热1小时(碱处理)。将碱处理后的原料用精磨机(熊谷理器工业株式会社制，KRK高浓度盘式精磨机：间隙0.5mm)磨碎。在磨碎处理后的原料中添加等量的纯水后，在搅拌下使用硫酸将pH调整至5。接着，使用20目(847μm)的筛网进行固液分离(脱水)，用水清洗至溶液的电导率达到30μS/cm。以固液分离后的固体物(预处理物)作为原料而供给至糖化发酵工序。
[一次同步糖化发酵]
在一次同步糖化发酵槽中分别添加原料浓度达到10质量%的原料100kg(绝干重量)、达到5g/L的聚胨、达到3g/L的酵母提取液、达到3g/L的麦芽提取液后，添加水而将最终容量调整为1m3。将用液体培养基(葡萄糖30g/L、聚胨5g/L、酵母提取液3g/L、麦芽提取液3g/L、pH5.6)50L在30℃下进行24小时预培养而成的包含酵母菌体的培养液以及市售纤维素酶(AccelleraseDUET，Genencor公司制)50L添加到发酵槽中，在30℃下进行24小时的一次同步糖化发酵。将糖化发酵中的培养液的pH调整至5.0。
[固液分离]
将前述第一次同步糖化发酵中得到的培养液用螺旋压力机(富国工业株式会社制SHX-200x1500L、筛网尺寸1.2mm)固液分离，分离残渣(一次残渣)和滤液。所回收的一次残渣为19.4kg(绝干重量)。
[筛分处理]
使固液分离后的滤液通过400目(39μm)的筛网，回收培养液中的微细纤维。所得微细纤维的回收量总计为15.6kg(绝干重量)。使所回收的微细纤维全部(15.6kg)返回到一次同步糖化发酵槽中。
[乙醇制造]
将前述筛分处理中得到的滤液用减压蒸馏装置(エバポールCEP-1，大川原制作所)在蒸馏温度：40℃、加热温度：80℃、供给液量：150L/h的条件下分离为包含乙醇的水溶液和浓缩培养液。测定所得包含乙醇的水溶液的体积和乙醇浓度，算出乙醇的回收量。溶液中的乙醇浓度用葡萄糖传感器(王子计测机器公司制BF-400型)进行测定。
[离心分离]
将从减压蒸馏装置中分离出的浓缩培养液用倾析器式离心机(IHI公司制，HS-204L形)以转速4500rpm、差速5.0rpm进行运转，分离为残渣(二次残渣)和滤液。将滤液转移至一次同步糖化发酵槽。所回收的二次残渣为18.6kg(绝干重量)。
(实施例B2)
按照图4所示的制造流程实施了乙醇的制造。
[预处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[一次同步糖化发酵]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[固液分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的一次残渣为19.2kg(绝干重量)。
[筛分处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。用总计100kg的原料通过一次同步糖化发酵进行处理而得到的微细纤维的回收量总计为15.5kg(绝干重量)。
[二次同步糖化发酵]
将筛分处理中得到的微细纤维15.5kg(绝干重量)作为原料添加到二次同步糖化发酵槽中。在二次同步糖化发酵槽中分别添加达到5g/L的聚胨、达到3g/L的酵母提取液、达到3g/L的麦芽提取液，用水将最终容量调整为150L。用液体培养基(葡萄糖30g/L、聚胨5g/L、酵母提取液3g/L、麦芽提取液3g/L、pH5.6)50L在30℃下对市售酵母(商品名：Maurivin，MauriYeastAustraliaPtyLimited)培养24小时。将培养后的包含酵母的培养液50L以及市售纤维素酶(AccelleraseDUET，Genencor公司制)10L添加到发酵槽中，在30℃下进行24小时的二次同步糖化发酵。将糖化发酵中的培养液的pH调整至5.0。
[乙醇制造]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[离心分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的二次残渣为18.6kg(绝干重量)。
＜比较例B1＞
按照图5所示的制造流程实施了乙醇的制造。将省略了实施例B1中的[筛分处理]的试验作为比较例B1(下述)。
[预处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[一次同步糖化发酵]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[固液分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的一次残渣为19.3kg(绝干重量)。
[乙醇制造]
将前述固体成分离中得到的滤液用与实施例B1所述的同样的方法分离为包含乙醇的水溶液和浓缩培养液。测定所得的包含乙醇的水溶液的体积与乙醇浓度，算出乙醇的回收量。
[离心分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的二次残渣为34.2kg(绝干重量)。
(表B1)
乙醇产量（kg)
实施例B1 13.9
实施例B2 14.1
比较例B1 10.5
乙醇的产量的结果示于表B1。实施例B1(将微细纤维回收并返回至一次同步糖化发酵槽的情况)以及实施例B2(将微细纤维回收并返回至二次同步糖化发酵槽的情况)与比较例B1(不回收微细纤维的情况)相比，乙醇产量提高。
(实施例B3)
[糖化发酵试验]
使用实施例B1中得到的微细纤维作为原料，在试管内进行糖化发酵试验，按照下述方法测定乙醇产量。
在将100ml液体培养基A(聚胨5g/L、酵母提取液3g/L、麦芽提取液3g/L、葡萄糖30g/L、溶解于蒸馏水、pH5.6)以及20ml液体培养基B(聚胨15g/L、酵母提取液10g/L、麦芽提取液10g/L、溶解于蒸馏水)混合而成的培养基中，在30℃下对市售酵母(商品名：Maurivin:MauriYeastAustraliaPtyLimited)进行24小时的培养。将培养后的培养液100ml离心分离(5000rpm、20分钟)，去除上清，制备至培养液的容量为10ml(收集酵母菌)(浓缩酵母菌体)。
在300ml容积锥形瓶(已灭菌)中添加原料(微细纤维)至其最终浓度达到5质量%。接着，添加10ml浓缩酵母菌体、2.5ml市售纤维素酶(AccelleraseDUET，Genencor公司制)，用蒸馏水将最终容量定容为100ml。将该混合液在30℃下培养24小时(糖化发酵)。将培养后的培养液离心分离(5000rpm、20分钟)，测定上清液的乙醇浓度。另外，微细纤维的卡巴值(木质素含量的指标)用按照JISP8211的测定方法进行测定。
＜比较例B2＞
使用实施例B1中得到的一次残渣作为原料，用与实施例B3同样的方法进行糖化发酵试验，测定乙醇产量和一次残渣的卡巴值。
＜比较例B3＞
使用实施例B1中得到的二次残渣作为原料，用与实施例B3同样的方法进行糖化发酵试验，测定乙醇产量和二次残渣的卡巴值。
(表B2)
表B2中示出乙醇浓度和卡巴值。与将一次残渣(比较例B2)和二次残渣(比较例B3)作为原料的情况相比，将微细纤维(实施例B3)作为原料的情况下，培养液中的乙醇浓度高。另外，微细纤维(实施例B3)的卡巴值为低于一次残渣(比较例B2)和二次残渣(比较例B3)的卡巴值的值。由以上结果可知：微细纤维与一次残渣和二次残渣相比木质素的含量低，其结果，使用微细纤维作为糖化发酵的原料时，与一次残渣和二次残渣相比，乙醇产量提高。判明了：微细纤维即使不实施预处理(机械处理等)也容易进行糖化发酵，适合作为糖化发酵的原料。
(实施例B4)
实施例B1中，使用蓝桉的林地废料(树皮70%、枝叶30%)作为原料来代替使用蓝桉的树皮作为原料，将该试验作为实施例B4。
除了使用林地废料以外，全部按照与实施例B1同样的方法进行试验(制造流程与图1相同)。
＜比较例B4＞
将省略了实施例B4中的[筛分处理]的试验作为比较例B4。除了省略了筛分处理以外，全部按照与实施例B4同样的方法进行试验(制造流程与图5相同)。
(表B3)
乙醇产量(kg)
实施例B4 12.4
比较例B4 10.2
乙醇的产量的结果示于表B3。与比较例B4(不回收微细纤维的情况)相比，实施例B4(将微细纤维回收并返回至一次同步糖化发酵槽的情况)的乙醇产量提高。
(实施例B5)
按照图6所示的制造流程实施了乙醇的制造。
[预处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[一次同步糖化发酵]
除了在培养液中添加作为电解质的氯化钠以外，用与实施例B1同样的方法进行实施。在按照与实施例B1同样的方法调整的培养液中添加氯化钠(电解质)至其最终浓度达到100mM(原料悬浮液的电导率：12.2mS/cm)。接着，按照与实施例B1同样的方法在发酵槽中添加酵母菌体和市售纤维素酶，进行一次同步糖化发酵。
[固液分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的一次残渣为15.3kg(绝干重量)。
[筛分处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的微细纤维总计为13.4kg(绝干重量)。使所回收的微细纤维全部(13.4kg)返回至一次同步糖化发酵槽。
[乙醇制造]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[离心分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的二次残渣为14.7kg(绝干重量)。
(表B4)
乙醇产量(kg)
实施例B5 14.3
乙醇产量的结果示于表B4。与不添加氯化钠的情况(实施例B1)相比，培养液中添加了氯化钠时(实施例B5)的乙醇产量提高。
(实施例B6)
按照图7所示的制造流程实施了乙醇的制造。
[预处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[一次同步糖化发酵]
除了在培养液中添加作为电解质的氯化钠以外，用与实施例B1同样的方法进行实施。在按照与实施例B1同样的方法调整的培养液中添加氯化钠(电解质)至其最终浓度达到100mM(原料悬浮液的电导率：12.2mS/cm)。接着，按照与实施例B1同样的方法在发酵槽中添加酵母菌体和市售纤维素酶，进行一次同步糖化发酵。
[固液分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的一次残渣为14.8kg(绝干重量)。
[筛分处理]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的微细纤维总计为13.0kg(绝干重量)。使所回收的微细纤维全部(13.0kg)返回至一次同步糖化发酵槽。
[二次同步糖化发酵]
用与实施例B2同样的方法进行实施。
[乙醇制造]
用与实施例B1同样的方法进行实施。
[离心分离]
用与实施例B1同样的方法进行实施。所回收的二次残渣为14.2kg(绝干重量)。
(表B5)
乙醇产量(kg)
实施例B6 14.5
乙醇产量的结果示于表5。与不添加氯化钠的情况(实施例B2)相比，培养液中添加了氯化钠时(实施例B6)的乙醇产量提高。
产业上的可利用性
根据本发明的酶解糖化处理方法，可以抑制糖化酶吸附于木质纤维素系原料的未反应成分、反应残渣等，容易从酶解糖化处理液中分离酶，酶解糖化处理工序内的糖化酶的循环率长期维持在高水平，因而能够在工业上生产利用木质纤维素系原料的酶解糖化处理得到的糖类、乙醇等。
另外，通过本发明，将糖化发酵后的培养液中所含的微细纤维作为糖化发酵的原料而进行再利用，从而能够提高乙醇产量。另外，通过将电解质添加到培养液中，能够提高乙醇产量。

Claims (12)

1.一种木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其特征在于，将木质纤维素系原料与由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，由此制备电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液，将该原料悬浮液的电导率维持在5～25mS/cm的范围内，并且通过酶解糖化反应进行酶解糖化处理，从酶解糖化处理后的处理悬浮液中分离回收反应产物和含酶液体，将所回收的含酶液体作为所述酶解糖化处理用的酶而循环，其中，所述木质纤维素系原料施加了制成适合于酶解糖化反应的原料的预处理。
2.根据权利要求1所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述制成适合于酶解糖化反应的原料的预处理包括化学处理，所述化学处理中，将木质纤维素系原料浸渍于含有选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠以及碳酸氢钠的碱性化学品中的1种或它们的混合物、或者亚硫酸钠与这些碱性化学品的混合物的溶液中。
3.根据权利要求1所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述木质纤维素系原料为林地废料。
4.根据权利要求1所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述木质纤维素系原料为树皮。
5.根据权利要求1所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述水溶性盐类为选自碱金属盐和碱土金属盐中的至少1种水溶性盐。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述水溶性盐类为选自由碱金属或碱土金属的、卤化物、硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、乙酸盐、柠檬酸盐组成的组中的盐类。
7.一种木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其是按照一系列的工序进行木质纤维素系原料的酶解糖化处理，所述工序包括：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；酶解糖化处理工序，将该施加了预处理的木质纤维素系原料与由水溶性盐类形成的电解质一起添加至含纤维素糖化酶的水中，由此制备电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液，将该原料悬浮液的电导率维持在5～25mS/cm的范围内，并且通过酶解糖化反应进行酶解糖化处理；固液分离工序，从来自该酶解糖化处理工序的处理悬浮液中去除固体残渣；离心分离工序，将来自该固液分离工序的液体馏分离心分离，得到去除了残留残渣的、含有酶和糖类的液体馏分；膜分离工序，将来自该离心分离工序的液体馏分分离为含酶液体和含糖液体；以及，酶循环工序，将由该膜分离工序得到的含酶液体作为酶源循环供给至酶解糖化处理工序。
8.根据权利要求7所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，所述酶解糖化处理工序是组合使用纤维素糖化酶和以糖类作为发酵基质的发酵用微生物，同步进行木质纤维素系原料的酶解糖化处理和生成的糖类的发酵处理，从而一并生成糖类和发酵产物的同步糖化发酵处理工序。
9.根据权利要求8所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其是按照一系列的工序进行木质纤维素系原料的同步糖化发酵处理，所述工序进一步包括：蒸馏工序，通过蒸馏从来自所述固液分离工序的液体馏分中分离回收发酵产物，所述离心分离工序是将来自所述蒸馏工序的蒸馏残液离心分离，由此去除残留残渣，得到含有酶和糖类的液体馏分的工序。
10.根据权利要求9所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，从所述膜分离工序中分离回收的含糖液体为以寡糖为主体的含糖液体。
11.根据权利要求9所述的木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其中，将来自所述离心分离工序的液体馏分不经由所述膜分离工序而作为含有糖类的含酶液体循环供给至酶解糖化处理工序。
12.一种木质纤维素系原料的酶解糖化处理方法，其是按照一系列的工序进行木质纤维素系原料的同步糖化发酵处理，所述工序包括：预处理工序，施加将木质纤维素系原料制成适合于酶解糖化反应的原料的处理；同步糖化发酵处理工序，将该施加了预处理的木质纤维素系原料、与以糖类为发酵基质的发酵用微生物、以及由水溶性盐类形成的电解质添加至含纤维素糖化酶的水中，由此制备电导率调整至5～25mS/cm的原料悬浮液，将该原料悬浮液的电导率维持在5～25mS/cm的范围内，并且同步进行木质纤维素系原料的酶解糖化处理和生成的糖类的发酵处理；固液分离工序，将来自该同步糖化发酵处理工序的处理悬浮液用筛网尺寸为1.0～2.0mm的螺旋压力机分离为残渣和液体馏分；筛分处理工序，将来自该固液分离工序的液体馏分通过80～600目的筛分处理分离为微细纤维和液体馏分；蒸馏工序，通过蒸馏从通过该筛分处理去除了微细纤维的液体馏分中分离回收发酵产物；离心分离工序，将来自该蒸馏工序的蒸馏残液离心分离，去除残留残渣，得到含有酶和糖类的液体馏分；以及，将来自该离心分离工序的液体馏分不经由所述膜分离工序而作为含有糖类的含酶液体循环供给至同步酶解糖化处理工序的工序。
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