JP6447126B2 - 糖液の製造方法 - Google Patents
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Description
[1]以下の工程(1)〜(3)を含む、糖液の製造方法。
工程(1):セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼのスラリーを調製する工程、
工程(2):工程(1)のスラリーに糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解する工程、
工程(3):工程(2)の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程。
[2]失活セルラーゼがアルカリ処理失活セルラーゼである、[1]に記載の糖液の製造方法。
[3]失活セルラーゼが工程(3)の加水分解残渣をpH11以上のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、[1]または[2]に記載の糖液の製造方法。
[4]失活セルラーゼが工程(3)の加水分解残渣を65℃未満のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、[3]に記載の糖液の製造方法。
[5]失活セルラーゼが少なくとも失活β−グルコシダーゼを含む、[1]から[4]のいずれかに記載の糖液の製造方法。
[6]工程(1)のスラリーがpH3.0〜7.0の範囲である、[1]から[5]のいずれかに記載の糖液の製造方法。
[7]糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来である、[1]から[6]のいずれかに記載の糖液の製造方法。
[8]工程(1)の前処理が希硫酸処理である、[1]から[7]のいずれかに記載の糖液の製造方法。
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを挙げることができる。セルロース含有バイオマスは糖から構成されるセルロースおよびヘミセルロースの他に、芳香族高分子であるリグニンなどを含有しているため、前処理を施すことによりセルラーゼによる加水分解効率を向上させることができる。
本発明では、セルロース含有バイオマスの加水分解に糸状菌由来セルラーゼを使用する。糸状菌としては、トリコデルマ属(Trichoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)、セルロモナス属(Cellulomonas)、クロストリジウム属(Clostridium)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、フミコラ属(Humicola)、アクレモニウム属(Acremonium)、イルペックス属(Irpex)、ムコール属(Mucor)、タラロマイセス属(Talaromyces)、などの微生物を挙げることができる。また、これら微生物に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。
工程(2)の加水分解物を固液分離して得られる溶液成分には糸状菌由来セルラーゼ成分および糖成分が含まれ、これらは限外濾過膜を用いた濾過によって分離することができる。
セルロース含有バイオマス(コーンコブ)をその2倍重量の硫酸1%水溶液に浸し、150℃で30分オートクレーブ(日東高圧株式会社製)にて処理したものをセルロース含有バイオマス前処理物とし、以下の実施例に使用した。
タンパク質濃度は、市販のタンパク質濃度測定試薬(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio−Rad製)を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬250μLに希釈したセルラーゼ溶液を5μL添加し、室温で5分間静置後の595nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー(POWERSCAN HT、大日本住友製薬株式会社製)で測定した。牛血清アルブミン水溶液を標準液とし、検量線に照らし合わせてセルラーゼ溶液のタンパク質濃度を算出した。
糸状菌由来セルラーゼの活性はβ−グルコシダーゼ活性を指標とし、以下に示す方法で測定した。
β−グルコシダーゼ活性(U/mL)={(ODtest−ODblank)×1.1(mL)×酵素希釈倍率}/{17.2×10(分間)×0.1(mL)}。
(工程1:セルロース含有バイオマス前処理物のスラリーの調製)
参考例1に従い調製したセルロース含有バイオマス前処理物1.0g(絶乾重量)を50mL容遠沈管に秤量し、7.0mLの水に懸濁した。pHを測定したところpH2.3であったため、スラリーのpHが5.0になるまで10%アンモニア水溶液を添加し、さらに総重量が10gになるまで水を添加して固形物濃度10%のスラリーを調製した。
糸状菌由来セルラーゼとして、市販のセルラーゼ酵素液(“アクセルレースデュエット”ジェネンコア製)を使用した。参考例2に従ってセルラーゼ酵素液のタンパク質濃度を測定したところ、その濃度は40g/Lであった。工程(1)のスラリーにセルラーゼ酵素液0.2mLを添加し、50℃で24時間、ハイブリダイゼーションローテーター(日伸理化株式会社製 SN−06BN)を用いて回転混和した。
工程2の加水分解物を遠心分離(8,000G、10分間)にて固液分離し、上清8gと加水分解残渣2gを得た。加水分解残渣を8mLの水で再懸濁し、再度遠心分離(8,000G、10分間)を行うことで、加水分解残渣に残った溶液成分を回収した。回収した上清を合一し、ポアサイズ0.22μmの精密濾過膜(Millex−GV 材質:親水性PVDF、メルクミリポア製)に通じて微粒子を除いた後、分画分子量10,000の限外濾過膜(VIVASPIN20 材質:PES、Sartorius stedim biotech製)を用いて濾過した。非透過液が1mL以下になるまで8,000Gにて遠心濾過し、脱塩のため非透過液を超純水で10倍以上に希釈し、再度、非透過液が1mL程度になるまで8,000Gにて遠心濾過した。透過液は糖液として回収し、非透過液は回収セルラーゼ液として回収した。
pH11.0のアンモニア水溶液7.0mLにセルラーゼ酵素液0.1mL(“アクセルレース(登録商標)デュエット”、ジェネンコア製)を添加し、50℃で1時間保温することにより失活セルラーゼ溶液を調製した。参考例3に従って失活セルラーゼのβ−グルコシダーゼ活性測定を行ったところ、活性は検出されず、β−グルコシダーゼ活性が100%消失したことを確認した。
pH11.0のアンモニア水溶液1.0mLに0.075mLのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来β−グルコシダーゼ(品番:E−BGLUC、Megazyme製)を添加し、約25℃の室温下で1時間静置することにより失活β−グルコシダーゼ溶液を調製した。参考例3に従って失活β−グルコシダーゼ溶液の活性を測定したところ、残存活性は処理前に対し2.1%を示し、失活β−グルコシダーゼが得られたことを確認した。
参考例4に従い糖液を製造し、加水分解残渣をpH11.0またはpH11.5のアンモニア水溶液7.0mLで懸濁し、約25℃の室温下で回転混和した。1時間後、遠心分離(8,000G、10分間)を行い、上清を失活セルラーゼ溶液として回収した。参考例3に従ってβ−グルコシダーゼ活性測定を行ったところ、活性は検出されず、β−グルコシダーゼ活性が100%消失したことを確認した。
参考例4に従って糖液の製造を行い、回収セルラーゼ液を得た。ただし、工程(1)の固形物濃度10%のスラリー(pH5.0)を調製する際に、水またはpH11.0のアンモニア水溶液を使用した。回収セルラーゼ液は参考例3に従って活性測定を行った。
参考例4の工程(1)において、固形物濃度10%のスラリー(pH5.0)を調製する際に、参考例5または参考例7で調製した失活セルラーゼ溶液、あるいは参考例6で調製した失活β−グルコシダーゼ溶液を水の代わりに使用した。他は参考例4と同様に糖液の製造を行い、回収セルラーゼ液を得た。回収セルラーゼ液は参考例3に従って活性測定を行った。
参考例7において、加水分解残渣の浸漬を水またはpH9.0〜11.5のアンモニア水溶液で行い、その上清を回収した。上清に含まれる糸状菌由来セルラーゼの量を調べるため、SDSポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)を行った[ゲル濃度15%の標準ミニスラブサイズゲル(e−PAGEL E−T/R15L、アトー製)使用、サンプルアプライ量:5μL、20mA、75分間](図3)。その結果、pH11.0以上のアンモニア水溶液を使用した場合に加水分解残渣から糸状菌由来セルラーゼが多く溶出することが確かめられた。
参考例7において、pH11.0のアンモニア水溶液を使用し、加水分解残渣の浸漬を約25℃の室温〜95℃の範囲で実施した。得られた失活セルラーゼ溶液について、実施例2と同様の方法でSDS−PAGEを実施したところ、65℃以上で徐々に失活セルラーゼのバンドがぼやけ、分解を受けていることが示唆された。
参考例7において、加水分解残渣を浸漬する際、pH11.0の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、またはリン酸三ナトリウム水溶液を使用して失活セルラーゼ溶液を調製した。その他は実施例1と同様の方法で回収セルラーゼ液を得、参考例3に従って活性測定を行った。その結果を相対活性として表3に示した。いずれのアルカリを使用した場合にも、回収セルラーゼ液の相対活性はアンモニアを使用した場合と同等であった。
Claims (5)
- 工程(1):セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼのスラリーを調製する工程、
工程(2):工程(1)のスラリーに糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解する工程、
工程(3):工程(2)の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
を含み、失活セルラーゼが工程(3)の加水分解残渣を、pH11以上、65℃未満のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、糖液の製造方法。 - 失活セルラーゼが少なくともβ−グルコシダーゼを含む、請求項1に記載の糖液の製造方法。
- 工程(1)のスラリーがpH3.0〜7.0の範囲である、請求項1または2に記載の糖液の製造方法。
- 糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来である、請求項1から3のいずれかに記載の糖液の製造方法。
- 工程(1)における前処理物が希硫酸処理物である、請求項1から4のいずれかに記載の糖液の製造方法。
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