JP6565684B2 - 糖液の製造方法 - Google Patents
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Description
[1] セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法であって、
工程(1):セルロース含有バイオマスを、アクレモニウム属またはアスペルギルス属微生物由来のエンドキシラナーゼを用いて加水分解し、エンドキシラナーゼ加水分解物を得る工程、
工程(2):前記エンドキシラナーゼ加水分解物を、エンドキシラナーゼ加水分解固形物とエンドキシラナーゼ加水分解液体とに固液分離する工程、
工程(3):前記エンドキシラナーゼ加水分解固形物を糸状菌由来セルラーゼを用いて加水分解し、セルラーゼ加水分解物を得る工程、および
工程(4):前記セルラーゼ加水分解物を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側から糖液を回収し、非透過液側から酵素成分を回収する工程、
を含む、糖液の製造方法。
[2] 前記セルロース含有バイオマスが、アルカリ処理、水熱処理、および希硫酸処理よりなる群から選択される1以上の方法で前処理されたものである、(1)に記載の糖液の製造方法。
[3] 前記エンドキシラナーゼの酵素活性が、80U/mg−タンパク以上である、(1)または(2)に記載の糖液の製造方法。
[4] 前記エンドキシラナーゼ加水分解物の固液分離が、以下の関係式を満たす、(1)から(3)のいずれか一つに記載の糖液の製造方法。
エンドキシラナーゼ加水分解固形物の重量<エンドキシラナーゼ加水分解液体の重量
[5] 前記エンドキシラナーゼ加水分解液体を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側からキシロオリゴ糖液を回収し、非透過液側からエンドキシラナーゼを回収する工程をさらに含む、(1)から(4)のいずれか一つに記載の糖液の製造方法。
[6] 前記糸状菌由来セルラーゼが、トリコデルマ属微生物由来である、(1)から(5)のいずれか一つに記載の糖液の製造方法。
[7] 工程(4)が、前記セルラーゼ加水分解物を固液分離して得られるセルラーゼ加水分解液体を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側から糖液を回収し、非透過液側から酵素成分を回収する工程である、請求項1から6のいずれか一つに記載の糖液の製造方法。
[8] 前記酵素成分を、工程(3)の糸状菌由来セルラーゼとして使用する、(1)から(7)のいずれか一つに記載の糖液の製造方法。
工程(1)は、セルロース含有バイオマスをアクレモニウム属またはアスペルギルス属微生物由来のエンドキシラナーゼを用いて加水分解し、エンドキシラナーゼ加水分解物を得る工程である。
工程(2)は、エンドキシラナーゼ加水分解物を、エンドキシラナーゼ加水分解固形物とエンドキシラナーゼ加水分解液体とに固液分離する工程である。
エンドキシラナーゼ加水分解固形物の重量<エンドキシラナーゼ加水分解液体の重量
工程(3)は、エンドキシラナーゼ加水分解固形物を糸状菌由来セルラーゼを用いて加水分解し、セルラーゼ加水分解物を得る工程である。
工程(4)は、セルラーゼ加水分解物を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側から糖液を回収し、非透過液側から酵素成分を回収する工程である。非透過液として回収した酵素成分は、工程(3)に再利用することも可能であり、工程(3)での酵素成分の使用量を低減することが可能となる。
本発明においては、工程(4)においてセルラーゼ加水分解物をろ過して得られた非透過液を、工程(3)の糸状菌由来セルラーゼと混合する場合について説明したが、これに限定されるものではない。本発明による糖液の製造方法の他の一例を図2に示す。図2に示すように、例えば、工程(3)で得られたセルラーゼ加水分解物を固液分離し、糖を含む溶液(セルラーゼ加水分解液体)と、固形分である糖化残渣とに分離する。得られたセルラーゼ加水分解液体を、工程(4)において、限外ろ過膜でろ過して、糸状菌由来セルラーゼを含む非透過液と、透過液である糖液とに分離する。これにより、糸状菌由来セルラーゼを含む非透過液が回収されると共に、透過液として糖液が回収される。回収された非透過液は、工程(3)で使用される糸状菌由来セルラーゼに混合して再利用することができる。よって、予めセルラーゼ加水分解物を固液分離して、セルラーゼ加水分解物中の固形分を除去しておくことにより、工程(4)において、セルラーゼ加水分解物に含まれる糸状菌由来セルラーゼの回収を効率良く行うことができる。これにより、糸状菌由来セルラーゼの回収率をさらに向上させつつ糖液を製造することが可能となる。
糸状菌由来セルラーゼ(培養液)は、次の方法で調製した。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるように蒸留水に添加し、上記各成分を含む蒸留水100mLを500mLバッフル付き三角フラスコに張り込み、121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80とを、上記の500mLバッフル付き三角フラスコにそれぞれ0.01%(w/vol)添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイATCC66589を1×105個/mLになるように植菌し、振とう装置(TAITEC社製 BIO−SHAKER BR−40LF)を用いて、28℃の温度で72時間、180rpmで振とう培養し、前培養とした。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、セルロース(アビセル)10%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるように蒸留水に添加し、上記各成分を含む蒸留水2.5Lを5L容撹拌ジャー(ABLE社製、DPC−2A)容器に張り込み、121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80とを、それぞれ0.1%添加し、予め前記の方法で液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイATCC66589を250mL接種した。その後、28℃の温度で87時間、300rpm、通気量1vvmの条件で振とう培養を行い、遠心分離した。その後、上清を膜ろ過(ミリポア社製のステリカップ−GV、材質:PVDF)した。この前述条件で調整した培養液を糸状菌由来セルラーゼとして、以下の実施例に使用した。
糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、セルロースの分解に関与する酵素群の活性として、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼの活性として(1)4−ニトロフェニル−β−D−ラクトピラノシド(pNP−Lac)、βグルコシダーゼの活性として(2)4−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド(pNP−Glc)、ヘミセルロースの主成分であるキシランの分解に関与するエンドキシラナーゼ、キシロシダーゼの活性として(3)4−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシド(pNP−Xyl)の分解活性を、それぞれ以下に示す方法で測定評価した。なお、上記(1)〜(3)の基質をまとめてpNP−糖という。
pNP−Lac分解活性(U/mL)={(ODtest−ODblank)×1.1(mL)×酵素希釈倍率}/{17.2×60(分間)×0.1(mL)}
pNP−Glc分解活性(U/mL)={(ODtest−ODblank)×1.1(mL)×酵素希釈倍率}/{17.2×10(分間)×0.1(mL)}
pNP−Xyl分解活性(U/mL)={(ODtest−ODblank)×1.1(mL)×酵素希釈倍率}/{17.2×60(分間)×0.1(mL)}。
バガス乾燥重量100gに対し、9.3gの苛性ソーダを混合し、121℃、30分間反応させ、アルカリ処理バガスを調製した。
Meiji Seikaファルマ株式会社から販売されている“アクレモニウム セルラーゼ”を以下の方法で精製して得られた酵素を、アクレモニウム由来精製エンドキシラナーゼとした。
1) 強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー:QAE−トヨパール550C(東ソー(株))に、粗酵素を吸着させ、酢酸緩衝液(0.02M、pH5.5)で溶出されるキシラナーゼ活性画分を分取した。
2) 弱塩基性イオン交換クロマトグラフィー:DEAE−トヨパール650S(東ソー(株))に、上記1)の分取画分を0.02M酢酸緩衝液(pH6.0)にて吸着させ、酢酸緩衝液(0.02M、pH5.5)で溶出されるキシラナーゼ活性画分を分取した。
3) 強酸性イオン交換クロマトグラフィー:Mono S(ファルマシア社)に、上記2)の分取画分を酢酸緩衝液(0.1M、pH3.5)で吸着させ、酢酸緩衝液(0.1M、pH3.5)中にNaClを0〜0.05Mを含むリニアグラジエント溶出を行い、キシラナーゼ活性を示した画分を分取した。キシラナーゼ活性だけを示す2画分(画分1、画分2)を回収した。
4) ゲルろ過クロマトグラフィー:Superdex 75(ファルマシア社)に、上記3)の画分1を、NaClを0.1M含む酢酸緩衝液(0.05M、pH3.5)を用いて通過させ、キシラナーゼ活性画分(画分3)を分取した。
5) ゲルろ過クロマトグラフィー:Superdex 75(ファルマシア社)に、上記3)の分取画分2を、NaClを0.1M含む酢酸緩衝液(0.05M、pH3.5)を用いて通過させ、キシラナーゼ活性画分を2画分(画分4、画分5)を分取した。
糖液に含まれるグルコースおよびキシロースの各濃度は、下記に示す高速液体クロマトグラフィー(High performance liquid chromatography:HPLC条件)で、標品との比較により定量した。
(HPLC条件)
カラム:Shodex SH1011(昭和電工株式会社製)
移動相:硫酸5mM(流速0.6mL/分)
反応液:なし
検出方法:RI(示差屈折率)
温度:65℃。
[工程(1)]
参考例3で調整したアルカリ処理バガス1gに対し、水を19g添加し、固形分濃度5%となるように調整した。調製したセルロース含有バイオマスに参考例4で調製したアクレモニウム属微生物由来エンドキシラナーゼを添加して加水分解を行った。アクレモニウム属微生物由来エンドキシラナーゼの添加量は、0.1mg/gの前処理物を添加し、塩酸でpHが5となるように調整し、エンドキシラナーゼ加水分解を行った。エンドキシラナーゼ加水分解は、50℃で、24時間反応を行った。
エンドキシラナーゼ反応後、12メッシュのステンレス製ザルで固液分離し、エンドキシラナーゼ加水分解液体を10g、エンドキシラナーゼ加水分解固体を10g回収した。
固液分離固体側10g(固形分濃度10%)に参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解を行った。糸状菌由来セルラーゼの添加量は、8mg/gの前処理物を添加し、塩酸でpHが5となるように調整し、加水分解を開始した。加水分解は、50℃で、24時間反応を行った。
セルラーゼ糖化後、遠心分離(4500G、10分)にて固液分離し、セルラーゼ加水分解固体とセルラーゼ加水分解液体とに分離した。更に、セルラーゼ加水分解液体を膜ろ過(ミリポア社製 ステリカップ−GP、材質:PES)し、得られた上清は、分画分子量10,000の限外ろ過膜(Sartorius stedim biotech社製 VIVASPIN 20、材質:PES)を用い、限外ろ過膜の非透過液側が1mLになるまで4500Gで遠心した。蒸留水10mLを膜画分に添加し、再度、非透過側画分が1mLになるまで4500Gにて遠心したものを回収酵素とし、参考例2の方法で酵素活性を測定し、添加酵素の活性を100としたときの相対値を求めた。
[工程(1)]
参考例3で調整したアルカリ処理バガス1gに対し、水19gを添加し、固形分濃度5%となるように調整した。調製したセルロース含有バイオマスにアスペルギルス属微生物由来エンドキシラナーゼ(Megazyme社製、活性80U/mg)を添加して加水分解を行った。アスペルギルス属微生物由来エンドキシラナーゼの添加量は、0.13mg/gの前処理物を添加し、塩酸でpHが5となるように調整し、エンドキシラナーゼ加水分解を行った。エンドキシラナーゼ加水分解は、50℃で、24時間反応を行った。
エンドキシラナーゼ反応後、12メッシュのステンレス製ザルで固液分離し、エンドキシラナーゼ加水分解液体を10g、エンドキシラナーゼ加水分解固体を10g回収した。
固液分離固体10gに参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解を行った。セルラーゼによる加水分解は、比較例1と同様に行った。
実施例1と同様に行った。
実施例1と同様に工程(1)、工程(2)、工程(3)、および工程(4)を実施した。この時、工程(2)で得られるエンドキシラナーゼ加水分解液体を膜ろ過(ミリポア社製 ステリカップ−GP、材質:PES)し、得られた上清は、分画分子量10,000の限外ろ過膜(Sartorius stedim biotech社製 VIVASPIN 20、材質:PES)を用い、限外ろ過膜の非透過液側が1mLになるまで4500Gで遠心した。蒸留水10mLを膜画分に添加し、再度、非透過側画分が1mLになるまで4500Gで遠心したものをエンドキシラナーゼ回収酵素とし、バーチウッドキシラン(Birchwood xylan)を基質として、50℃、pH5、10分間の反応後、ジニトロサリチル酸法(DNS法)を使用し、540nmの吸光度を測定することで、添加したエンドキシラナーゼの活性を100としたときの回収エンドキシラナーゼの相対値をエンドキシラナーゼ回収率とした。エンドキシラナーゼ回収率は、73%であった。また、エンドキシラナーゼ加水分解液体の透過液中のキシロオリゴ糖濃度を参考例5に従って測定したところ、アルカリ処理バガスg重量当たり、80mgのキシロオリゴ糖を回収した。
参考例3で調整したセルロース含有バイオマス1gに対し、水を9g添加し、固形分濃度が10%となるように調製した。調製したセルロース含有バイオマスに参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解を行った。加水分解の条件は、実施例1と同様に行った。得られた加水分解物から実施例1の工程(4)に準じて酵素を回収し、参考例2の方法で酵素活性を測定した。
参考例3で調整したセルロース含有バイオマス1gに対し、水19gを添加し、固形分濃度5%となるように調整した。これを12メッシュのステンレス製ザルで固液分離し、液体側を10g、固体側を10g回収した。固液分離固体10gに参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して、実施例1の工程(3)に準じて加水分解を行った。得られた加水分解物から実施例1の工程(4)に準じて酵素を回収し、参考例2の方法で酵素活性を測定した。
参考例3で調整したセルロース含有バイオマス1gに対し、水9gを添加し、固形分濃度が10%となるように調整した。調製したセルロース含有バイオマスに参考例4で調製したアクレモニウム属微生物由来エンドキシラナーゼを添加して加水分解を行った。アクレモニウム属微生物由来エンドキシラナーゼの添加量は、0.1mg/g前処理物で添加し、塩酸でpHが5となるように調整し、エンドキシラナーゼ加水分解を行った。エンドキシラナーゼ加水分解は、50℃で、24時間反応を行った。エンドキシラナーゼ反応後、固液分離を実施せずに、参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して、実施例1の工程(3)に準じて加水分解を行った。得られた加水分解物から実施例1の工程(4)に準じて酵素を回収し、参考例2の方法で酵素活性を測定した。
参考例3で調整したセルロース含有バイオマス1gに対し、水19gを添加し、固形分濃度が5%となるように調整した。調製したセルロース含有バイオマスに、トリコデルマ・ビリデ由来エンドキシラナーゼ(Megazyme社製、活性250U/mg)を0.04mg/g前処理物で添加し、塩酸でpHが5となるように調整し、エンドキシラナーゼ加水分解を行った。エンドキシラナーゼ加水分解は、50℃で、24時間反応を行った。エンドキシラナーゼ反応後、12メッシュのステンレス製ザルで固液分離し、エンドキシラナーゼ加水分解液体を10g、エンドキシラナーゼ加水分解固体を10g回収した。固液分離固体10gに参考例1で調製した糸状菌由来セルラーゼを添加して、実施例1の工程(3)に準じて加水分解を行った。得られた加水分解物から実施例1の工程(4)に準じて酵素を回収し、参考例2の方法で酵素活性を測定した。
Claims (8)
- セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法であって、
工程(1):セルロース含有バイオマスを、アクレモニウム属またはアスペルギルス属微生物由来のエンドキシラナーゼを用いて加水分解し、エンドキシラナーゼ加水分解物を得る工程、
工程(2):前記エンドキシラナーゼ加水分解物を、エンドキシラナーゼ加水分解固形物とエンドキシラナーゼ加水分解液体とに固液分離する工程、
工程(3):前記エンドキシラナーゼ加水分解固形物を糸状菌由来セルラーゼを用いて加水分解し、セルラーゼ加水分解物を得る工程、および
工程(4):前記セルラーゼ加水分解物を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側から糖液を回収し、非透過液側から酵素成分を回収する工程、
を含む、糖液の製造方法。 - 前記セルロース含有バイオマスが、アルカリ処理、水熱処理、および希硫酸処理よりなる群から選択される1以上の方法で前処理されたものである、請求項1に記載の糖液の製造方法。
- 前記エンドキシラナーゼの酵素活性が、80U/mg−タンパク以上である、請求項1または2に記載の糖液の製造方法。
- 前記エンドキシラナーゼ加水分解物の固液分離が、以下の関係式を満たす、請求項1から3のいずれか一項に記載の糖液の製造方法。
エンドキシラナーゼ加水分解固形物の重量<エンドキシラナーゼ加水分解液体の重量 - 前記エンドキシラナーゼ加水分解液体を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側からキシロオリゴ糖液を回収し、非透過液側からエンドキシラナーゼを回収する工程をさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の糖液の製造方法。
- 前記糸状菌由来セルラーゼが、トリコデルマ属微生物由来である、請求項1から5のいずれか一項に記載の糖液の製造方法。
- 工程(4)が、前記セルラーゼ加水分解物を固液分離して得られるセルラーゼ加水分解液体を限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液側から糖液を回収し、非透過液側から酵素成分を回収する工程である、請求項1から6のいずれか一項に記載の糖液の製造方法。
- 前記酵素成分を、工程(3)の糸状菌由来セルラーゼとして使用する、請求項1から7のいずれか一項に記載の糖液の製造方法。
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