JP4554314B2 - リグノセルロースの連続糖化法 - Google Patents
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バイオマス資源中の多糖類から発酵基質となる単糖や少糖類を作る方法は大きく分けて2つの方法がある。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。
リグノセルロース材料を酵素により糖化するためには、糖化に先立ち、セルロース構造を維持し、微生物などの外敵から該構造を維持しているリグニン等の成分を除去する必要があり、そのための手段としてアルカリ抽出、爆砕、酸処理などが用いられることが報告されている。
このような紙としての再利用が困難な化学パルプ由来の古紙を糖化原料として利用しようという試みは数多く行われているが、いずれの方法でも糖化のコストが高く、実用化は困難である。
Scott, C. D.らは、1994年、古紙の糖化装置として、連続的な磨砕と膜を用いた分離と酵素の再利用、固定化菌体による酵素の生産、高濃度のスラリー状態での処理等により、低コスト化が可能であると予測している。
山下らは、新聞古紙の糖化を検討したなかで、蒸煮、蒸煮爆砕法を試みたが、余り高い効果は得られず、オゾン処理が有効であることを報告している。新聞古紙に含まれるリグニン分解するためにオゾンを検討した。その結果、予めアルカリで膨潤した古紙を洗浄後固形分濃度50%まで絞り、気相でオゾンをパルプ当たり8.8%加えることで糖化率80%を達成している。ただしオゾンの価格がまだ高価であり、実用的ではない(非特許文献2)。
しかしながら、古紙などリグノセルロースから糖類を製造することは、トウモロコシデンプンなどから糖を製造する場合に比べて、酵素による糖化が容易でなく、デンプンを原料とする場合に比べて経済性が劣っていた。
蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を5%の濃度で糖化槽に加え、2万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、8日間で2kgのシラカンバ材から単糖類を630g得ている。この方法で酵素の使用量を20%節約できたと報告している(非特許文献5)。しかし、20%の節約ではまだコストが高すぎて、実用化できない。
このような観点から、糖化装置の設計においても酵素を回収再利用する方法が検討されている(特許文献6、特許文献7、特許文献8)。
化学パルプのみを使用した古紙のように、リグニンを高度に除去したリグノセルロースは、セルラーゼやヘミセルラーゼによって高い効率で繊維成分を加水分解することができ、他のバイオマス資源より容易に糖類を製造できる。しかし、先に述べたように、様々な技術が開発されてはいるものの、糖化に要する酵素のコストが高く、経済性がないことが課題となっている。
この残渣に酵素が強度に吸着することが、酵素回収の際の最大の問題であり、これを解決できれば酵素のリサイクル性は向上し、コストを低下させ、酵素糖化の経済性は大きく改善できる。それ故、本発明は、リグノセルロース材料の酵素糖化のために投入される酵素を無駄なく有効利用することができる方法を提供することを目的とするものである。
また、必要に応じて、ヘミセルロースを分解する酵素、特に、広葉樹のパルプに含まれるキシランを分解する酵素、キシラナーゼ、針葉樹に含まれるマンナンやガラクタンを分解する酵素を追加することができる。一般に、バイオマスの糖化用に開発されている酵素は、これらの酵素も含むので好適である。
1)CMCase活性
1.25%のカルボキシメチルセルロース(CMC)を含む125mM酢酸緩衝液( pH4.0)40μlに、酵素液10μlを加え、50 ℃、10min反応させ、生 成した還元糖をAvicelase活性測定と同様にNelson−Somogyi法 で測定し、1分間21μmolの還元糖を生成する酵素の量を1単位とした。
1.25mM 4-Methyl-umberiferyl-cellobiosideを含む125mM 酢酸緩衝液 (pH4.0)16μlに、酵素液4μlを加え、50℃、10min反応を行ったの ち、500mM glycine−NaOH緩衝液(pH10.0)100 μlを添 加し、反応を停止させた。これを350nmの励起光での460nmの蛍光を測定し、 1分間21μmolのウンベリフェロンを生成する酵素の量を1単位とした。
75mM 酢酸緩衝液(pH 5.0)500μlに250ul の培養上清を添加 し750μlにした。これにワットマンNo.1の濾紙を0.5×6cm にカットし カールさせたものを1つ添加し、37℃にて1時間反応させた。反応終了後、DNS法 で生成した還元糖を測定した。検量線はグルコースで作成し、1分間に1μmolの還 元糖を生成する酵素の量を1単位とした。
溶液中のグルコースの濃度はグルコースセンサー(王子計測機器製BF−400型)で定量した。
糖化反応槽のリグノセルロースの残量は次のように定義する。
「残渣の量」=「投入したリグノセルロースの重量」−(「各槽中に生成した糖を全糖として測定した量の総量」−「各糖の水の分子量分」)
図1の連続糖化装置において、符号1は基質調整槽を示し、2は糖化反応槽、3はスピンフィルター、4は反応液貯留槽、5は糖貯留槽、6は限外濾過装置、7は窒素ボンベ、8はフィードコントローラー、P1〜P3は送液ポンプ、11〜15は送液ラインを示している。
(基質調整槽1)
容量は7L、コピー用紙 1.25%(w/w, 絶乾)となるように懸濁し、撹拌速度180rpmで攪拌した。基質の送り出しは、窒素ボンベを接続し、窒素ガスの圧力により容器内を加圧し、基質をライン11を通して糖化反応槽に1時間に50g(フィードコントローラーにより自動制御)の速度で連続的に圧送した。
反応液量3kg、Genencor社製GC220酵素液を濾紙分解活性でコピー用紙1gについて260単位、コピー用紙 0.25%(w/w, 絶乾)を加えて、希釈率0.083h-1,滞留時間12時間、50℃、250−300rpm;ライン12からの流入量1時間に 200 g(固定流速)となるように運転し、スピンフィルター3を通してライン13 からの流出量を1時間に250 gとなるようにフィードコントローラーで自動制御した。連続運転開始後200時間で定常状態に達した。200時間後からの経時変化を図2に示した。
糖化反応槽からスピンフィルター3を通しての流出液量では、限外濾過装置に必要な流速、圧力が不足するために、緩衝作用を持たせるために反応液貯留槽4を設置した。
(Minimate TFF Capsule,10K membrane,日本ポール社)を使用し、ライン14の流出量が1時間に50gとなるようにフィードコントローラーでライン15の流量、圧力を自動制御した。
その結果、残渣の量が減り、500時間まで酵素の追加をせずに100%の糖化率を維持することができた(図2)。
600時間目に新たな基質の添加を止め、残渣の分解を促進すると、それに伴って図4に示したようにCBHIの活性が回復し、糖化率が100%に回復した。
しかし、酵素の活性が元の水準まで回復しないため、744時間目にCBHIの活性を指標に元の水準まで酵素を追加した。
実施例1で、Genencor社製GC220酵素液を濾紙分解活性で260単位/L用いる代わりに、酵素の添加量を130単位で行った。
糖化率は反応初期より下降し続けており(図5参照)、短期間に糖化残渣の上昇が起こっている(図6参照)。これに伴い、酵素の回収率の低下が起こり(図7参照)、糖化率が下がるという悪循環が起こっている。そのため、生成した糖に対する酵素のコストを安価にするためには残渣を分離し、残渣に吸着する酵素を回収する必要がある。
実施例1で、クラフトパルプを主成分とする古紙の代わりに新聞古紙を用いる以外は実施例1と同様に行った。糖化率は60%であり、急激に残渣の量が増加、酵素の回収率が下がり、48時間以降の連続糖化の続行は実質的に不可能であった。
2:糖化反応槽
3:スピンフィルター
4:反応液貯留槽
5:糖貯留槽
6:限外濾過装置
7:窒素ボンベ
8:フィードコントローラー
P1〜P3:送液ポンプ
11〜15:送液ライン
Claims (5)
- 基質としてのリグノセルロース材料と糖化酵素とを含有する分散液を連続糖化反応槽に通じることによってリグノセルロース材料を連続的に糖化し、糖化反応液から未反応リグノセルロース材料及び糖化酵素を回収して前記糖化反応槽に仕込まれる分散液における基質及び糖化酵素として循環する連続糖化方法であって、基質としてリグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料を使用し、連続糖化反応槽に供給される前記分散液における全基質量と、循環される糖化酵素と新たに添加される糖化酵素を含む全糖化酵素量の割合を、該分散液に含まれる前記循環される未反応リグノセルロース材料を含む全基質の少なくとも96質量%が滞留時間内に糖化される割合に維持することによって、循環される未反応リグノセルロースの蓄積を防止しつつ連続的に糖化反応を行うことを特徴とするリグノセルロースの連続糖化方法。
- 前記滞留時間が48時間〜8時間である請求項1記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
- 前記連続糖化反応槽に供給される分散液に新たに添加される酵素量が、分散液中の全基質1g当たり酵素200〜1000単位に維持される量である請求項1又は請求項2に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
- 前記リグニンの除去操作を施したリグノセルロース材料が化学パルプを主成分とする古紙であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
- 前記連続糖化反応槽に供給される分散液における全基質量と全糖化酵素量の前記割合が、新たに分散液中に添加される基質の量を増減するか、又は新たに添加される糖化酵素量を増減することによって維持されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のリグノセルロースの連続糖化方法。
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