BR112014012606B1

BR112014012606B1 - Xilanase mutante, ácido nucleico, vetor de expressão, transformante, método para fabricação de xilanase mutante método para fabricação de um produto sacarificado de lignocelulose, composição, método para branqueamento de uma polpa, detergente, ração animal e modificador para panificação

Info

Publication number: BR112014012606B1
Application number: BR112014012606-2A
Authority: BR
Inventors: Hisaaki Yanai; Hiroki Tamai; Masami Osabe; Fumikazu Yokoyama; Kaoru Okakura; Atsushi Inoue
Original assignee: Mitsui Chemicals, Inc.; Meiji Seika Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2021-12-21
Also published as: TW201329238A; CN104011211A; ES2686288T3; CN106834384B; EP3342867A1; US9567617B2; EP2784161A1; WO2013077432A1; CA2856676C; CN104011211B; CA3012382A1; EP2784161B1; US20140322764A1; EP3342867B1; CN106834384A; JP5889331B2; BR112014012606A2; SG11201402586YA; ES2817574T3; TW201700731A

Abstract

xilanase mutante, método para fabricação e uso do mesmo, e método para fabricação de lignocelulose sacarificada. o objetivo da revelação é a provisão de um método de sacarificação barato e eficiente para lignocelulose empregando uma xilanase termoestável e obtenção de uma xilanase mutante que contenha um substituinte de resíduo de aminoácido que apresente atividade estável, mesmo em condições difíceis, nas quais as enzimas são facilmente inativadas e que forneça uma taxa inicial de reação que não seja significativamente reduzida, em comparação com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à xilanase mutante. é provido um método para fabricação de um produto sacarificado de lignocelulose incluindo contato de uma matéria-prima lignocelulósica com uma xilanase termoestável, e uma xilanase mutante fornecendo uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% da que é provida pela xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, apresentando uma atividade da xilanase, após tratamento térmico a 50°c, durante 24 horas, isto é, pelo menos, 50% da atividade da xilanase, antes do tratamento térmico, e apresentando um substituinte de resíduo de aminoácido.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a um método para a produção eficiente de um produto sacarificado a partir de uma matéria-prima lignocelulósica. A invenção também se refere a uma xilanase mutante, um método de produção de xilanase mutante, e uso da xilanase mutante.

Antecedentes da Invenção

[002] A xilanase é uma enzima que hidrolisa aleatoriamente ligações β-1,4 ligações de xilano, que é um componente da parede celular das plantas. É previsto que a enzima seja utilizada em uma ampla gama de aplicações, tais como: a) sacarificação de matérias-primas lignocelulósicas, b) branqueamento de pasta, c) aditivos para alimentação animal, d) auxiliares de detergente e e) modificadores de panificação.

[003] Com relação a) sacarificação de matérias-primas lignocelulósicas, um método para sacarificação de uma matéria-prima lignocelulósica é conhecido em que um monossacarídeo servindo como um substrato de fermentação é produzido a partir de uma matéria-prima lignocelulósica usando uma enzima. No entanto, o elevado custo das enzimas, tais como as celulases e hemicelulases (xilanase ou análogos) que podem ser usadas para este método de sacarificação impede uma utilização prática do presente método de sacarificação. Para resolver este problema, a reutilização das enzimas empregadas no método de sacarificação tem sido proposta como um meio eficaz para a redução do custo do método de sacarificação (vide, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público (JP- A) Número 2006-87319 (Documento de Patente 1), Publicação Internacional WO2011/065449 (Documento de Patente 10) e WO2011/125056 (Documento de Patente 11)).

[004] A xilanase é uma enzima que quebra a hemicelulose (o principal componente a mesma sendo β-1,4 - xilano), que é um dos principais componentes de uma matéria-prima lignocelulósica. Portanto, a xilanase é uma das enzimas importantes em um método para a sacarificação de uma matéria-prima lignocelulósica. No entanto, a xilanase é conhecida por apresentar baixa estabilidade. Enquanto isso, a sacarificação de uma matéria-prima lignocelulósica requer tratamento em uma região de ácido a partir de pH 4,0 a pH 6,0 a uma alta temperatura de 40°C a 60°C durante alguns dias. Assim, a baixa estabilidade de xilanase é um obstáculo para a reutilização dessa enzima.

[005] A xilanase mutante resistente ao calor proveniente de Trichoderma reesei (doravante abreviado para "T. reesei") (vide, por exemplo, folheto WO 2007/115391 (Documento de Patente 2) e folheto WO 2007/115407 (Documento de Patente 3)) exibiu uma atividade residual de 80% ou superior, mesmo após tratamento térmico de 50°C a 70°C durante 30 minutos. Uma xilanase resistente ao calor derivada de Bacillus (vide, por exemplo, JP-A Número 2004121.257 (Documento de Patente 4)), também é conhecida por exibir uma atividade residual de 90% ou mais após o tratamento térmico a 70°C durante 30 minutos.

[006] Com relação a b) branqueamento da celulose, sabe- se que a quantidade de agente de branqueamento a ser utilizada pode ser reduzida empregando xilanase em um processo de branqueamento de pasta. Em geral, o branqueamento de polpa na indústria de fabricação de papel é constituído por uma primeira fase, que é um processo de tratamento de deslignificação (a partir de um pH de 10 a 12, a 80°C) de remoção de lignina a partir da polpa usando uma enzima, e uma segunda fase, que é um processo de branqueamento. A razão para a realização do processo de branqueamento, na segunda fase, tal como descrito acima é que, alguma porcentagem de lignina permanece como um componente de coloração na polpa, mesmo após o tratamento de deslignificação com uma enzima. A adição de um processo para permitir que a xilanase trabalhe, além do processo de tratamento de deslignificação e o processo de branqueamento, permite a quebra de cadeias de hemicelulose ligadas à lignina e celulose. Como resultado disto, a lignina pode ser eficazmente removida, e espera-se obtenção de um efeito em termos de redução da quantidade de agente de branqueamento a ser utilizado no processo de branqueamento.

[007] A fim de executar com eficiência o processo de modo a permitir que a xilanase trabalhe, é necessário utilizar uma xilanase que tenha propriedades, tal que a xilanase possa tolerar o tratamento com pH de cerca de 10 e 70°C a 80°C realizado por algumas horas. Uma xilanase mutante resistente ao calor derivada de T. reesei (vide, por exemplo, Documentos de Patente 2 e 3, e WO 2001/92487 (Documento de Patente 5) e WO 2003/046169 (Documento de Patente 6)) tem uma temperatura de reação ótima de cerca de 70°C e um pH de reação ótimo de 7 a 8, o que demonstra a possibilidade de que a xilanase mutante resistente ao calor possa ser usada em um processo de branqueamento de pasta.

[008] Com relação a c) aditivos para alimentação animal, a alimentação animal é rica em fibras vegetais e paredes de célula de planta na alimentação animal podem ser decompostas através da adição de xilanase. Portanto, a eficiência de absorção de nutrição das plantas pelos animais pode ser melhorada. Nos casos em que a alimentação animal deve ser esferonizada empregando xilanase, é necessário que a xilanase tenha estabilidade, com o que o tratamento com xilanase pode tolerar desde cerca de 70°C a cerca de 90°C por cerca de 10 minutos. Além disso, a fim de que a xilanase possa atuar nos órgãos digestivos dos animais, a xilanase deve apresentar uma elevada atividade em um ambiente de cerca de 40°C e pH de cerca 4,8. Muitas das xilanases derivadas a partir de fungos filamentosos, tais como, o gênero Trichoderma e o gênero Acremoniumtêm um pH ótimo de 3 a 5 e uma temperatura operável variam em torno de 40°C.

[009] Os xilanases mutantes resistentes ao calor descritos no Documento de Patente 2, Documento de Patente 3, documento WO 2001/27252 (Documento de Patente 7), e WO 2005/108565 (Documento de Patente 8) incluem mutantes que têm um pH ótimo de cerca de 5 a cerca de 5,5. d) Auxiliar de detergente: A utilização de xilanase como auxiliar de detergente pode remover pelos em roupas. Uma vez que as máquinas de lavar roupa mais recentes do tipo tambor são projetadas para economizar água, um bom amaciamento tende a ocorrer conforme o número de vezes de lavagem aumenta. Quando o amaciamento das roupas ocorrer, novos pelos na roupa tende a ocorrer. A penugem pode ser removida empregando xilanase como um auxiliar de detergente, e, por conseguinte, novos pelos podem ser evitados. Além disso, uma vez que os principais componentes de fixação de manchas em roupas e derivados de vegetais ou frutos são as paredes celulares, que são derivadas de legumes ou frutas e as quais os corantes são ligados, a lavagem eficaz pode ser efetuada usando xilanase na lavagem mesmo nos casos em que um tipo de máquina de lavar do tipo tambor que economiza água for usado.

[010] Nos casos em que a xilanase deve ser utilizada como um auxiliar de detergente é necessário utilizar uma xilanase com resistência aos álcalis e resistência ao agente tensoativo. Além disso, nos casos em que xilanase é usada na limpeza de roupa, é necessário usar uma xilanase que trabalhe de forma estável em um intervalo de temperatura elevado de 50°C a 70°C. Uma xilanase mutante derivada de T. reesei possuindo resistência ao calor e resistência aos produtos alcalinos (por exemplo, vide Documento de Patente 2, Documento de Patente 3, Documento de Patente 5, e Documento de Patente 6) tem propriedades, incluindo uma temperatura ótima entre 62°C a 75°C e um pH ótimo entre pH 7 a pH 8. A xilanase mutante descrita no Documento de Patente 8 tem um pH ótimo de 5, que está no lado ácido. No entanto, esta xilanase mutante tem uma temperatura ótima de 70°C, e mantém a atividade de 100% a 60°C e a partir de um pH 8 a um pH 9 durante pelo menos 10 minutos. Cada uma das xilanases resistentes aos álcalis e ao calor do gênero Bacillus (vide, por exemplo, Documento de Patente 4 e JP-A Número 2007-54050 (Documento de Patente 9)) tem propriedades, incluindo uma faixa de temperatura ideal de 50°C a 70°C e uma um pH ótimo de 7 a 8, e mantém 100% da atividade em pH 9 e a partir de 4°C a 5°C durante um período de tempo de 1 a 2 dias.

[011] Com relação a e) modificadores para panificação, a qualidade de fabricação do pão pode ser melhorada com o uso da xilanase como um modificador para panificação. A xilanase tem propriedades capazes de decompor o componente de hemicelulose da farinha. Devido à decomposição do componente de hemicelulose pela xilanase, a umidade ligada a este componente é liberado para a massa, alterando assim as propriedades da massa de pão. Como resultado, a estrutura da partícula e o volume do pão do pão produzido são melhorados, levando à preservação da qualidade favorável do pão produzido. Quando da fabricação da massa, grande impacto físico e carga de pressão são aplicados durante um processo de agitação e amassamento dos ingredientes, e um processo de fermentação requer um período de tempo de 1 a 2 horas a uma temperatura de 35°C a 40°C.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema a ser resolvido pela invenção

[012] No entanto, ainda há espaço para melhorias na reutilização da enzima de sacarificação descrita em (a) sacarificação da matéria-prima lignocelulósica, do ponto de vista de custo de produção de açúcar e da utilização eficaz dos recursos lignocelulósicos. Na reutilização da enzima de sacarificação descrita no Documento de Patente 1 é demonstrado que a ligação de enzima a um resíduo lignocelulósico provoca redução da atividade de sacarificação da mesma. Por esse motivo, as quantidades de adição da enzima e o substrato são significativamente limitados. Em particular, os exemplos de trabalho do Documento de Patente 1 descrevem que a quantidade da enzima é uma quantidade capaz de decomposição de 96% ou mais da lignocelulose em 12 horas, indicando que a alimentação de uma grande quantidade da enzima é necessária. Assim, a partir de um ponto de vista econômico, a reutilização da enzima durante um longo período de tempo é necessária. Além disso, a concentração de material lignocelulósico, como um substrato é tão baixa como cerca de 1%, e a concentração de açúcar produzido também é baixa. Portanto, para a utilização do açúcar em um processo de fermentação de etanol e semelhantes, o investimento para instalações destinadas a eficiência por unidade de volume do tanque de sacarificação, a concentração antes da produção fermentativa de etanol e semelhantes é necessário. Assim, este método dificilmente seria considerado como um método industrial do ponto de vista econômico. Na sacarificação da lignocelulose que contém hemicelulose, pensa-se que uma enzima capaz de decompor a lignocelulose em concentração elevada e tolerando a reutilização durante um longo período de tempo é necessária. Portanto, a inferioridade da estabilidade da xilanase é um problema, tal como descrito acima.

[013] No Documento de Patente 10, é descrito que a atividade de enzimas, tais como, a celulase e hemicelulase são mantidas mesmo após a adsorção sobre resíduos. O documento de Patente 10 também descreve um método pelo qual uma enzima de sacarificação é recuperada por ser adsorvida em lignocelulose após a reação e reutilizada em uma próxima reação de sacarificação. No entanto, no Documento de Patente 10, lignocelulose que será utilizada como um matéria-prima de sacarificação é aquecida, com antecedência, sob condições ácidas, em que a hemicelulose é decomposta em lignocelulose. Portanto, incorre-se em custos de aquecimento, e é necessária a instalação de equipamentos, como um recipiente de pressão com resistência ao ácido. Por conseguinte, este método não é favorável do ponto de vista econômico. Em vista destes, a decomposição da hemicelulose empregando xilanase é desejada. No entanto, uma vez que a reação de sacarificação é realizada durante um longo período de tempo, a pouca estabilidade da xilanase é um problema, semelhante ao descrito acima.

[014] O Documento de Patente 11 descreve que, ao aumentar a quantidade de sacarificação da enzima a ser utilizada em uma reação inicial, a quantidade de enzima a ser fornecida adicionalmente, que corresponde à atividade perdida no momento de reaproveitamento da enzima, pode ser diminuída, e os custos globais para a enzima podem ser diminuídos. No entanto, na verdade, uma quantidade da enzima adicionalmente fornecida é tão grande como 1/3 da quantidade da enzima inicialmente fornecida, e, por conseguinte, este método não é favorável do ponto de vista econômico. Além disso, descreve-se, nos exemplos de trabalho providos no Documento de Patente 11, que os resíduos da reação são eliminados. A perda da enzima adsorvida sobre os resíduos é um fator importante que faz com que seja impossível diminuir a quantidade da enzima que deve ser fornecida adicionalmente. Além disso, os exemplos de trabalho providos no Documento de Patente 11 descrevem apenas a utilização de celulose incluída no material lignocelulósico, ou seja, a utilização de glicose. A palha de trigo usada nos exemplos de trabalho providos no Documento de Patente 11, a qual foi submetida ao pré- tratamento, contém hemicelulose e similares em uma quantidade de 35% ou mais. A partir do ponto de vista de utilização eficaz dos recursos de lignocelulose e de economia é necessário utilizar, como um monossacarídeo, xilose contida na hemicelulose. Neste caso, no entanto, a pouca estabilidade de xilanase é um problema em uma situação em que a enzima é reutilizada depois de longas horas de reação que se espera incluam processos de sacarificação para fermentação de etanol. As soluções para estes podem incluir a utilização de uma xilanase termoestável preparada por melhoria de uma xilanase existente e utilização de uma xilanase resistente ao calor derivada de uma bactéria resistente ao calor. No entanto, até agora, não houve nenhum relatório sobre a utilização de longo prazo de enzima empregando essas xilanases.

[015] É incerto se ou não os xilanases mutantes resistentes ao calor derivados de T. reesei divulgados no Documento de Patente 2 e Documento de Patente 3 mencionados em (a) sacarificação da matéria-prima lignocelulósica satisfaz condições exigidas para a sacarificação de uma matéria-prima lignocelulósica (utilização por longo prazo em uma região ácida a temperaturas elevadas). Além disso, com relação à xilanase resistente ao calor que é derivada do gênero Bacillus e que é descrito no Documento de Patente 4 mencionado em (a), os resultados da atividade residual da mesma quando do tratamento térmico a pH 7,2, que está perto do pH neutro, são divulgados. Portanto, a atividade da xilanase resistente ao calor é susceptível de diminuição quando a xilanase resistente ao calor é empregada em condições ácidas por poucos dias a fim de executar a sacarificação de lignocelulose.

[016] No documento de Patente 2, o Documento de Patente 3, Documento de Patente 5, e no Documento de Patente 6, os quais se referem às xilanases mutantes resistentes ao calor derivadas de T. reesei e mencionados em (b) branqueamento de polpa, os dados sobre a atividade residual das xilanases mutantes resistentes ao calor de T. reeseiapós as xilanases resistentes ao calor derivadas de T. reesei serem tratadas em pH 5 e a partir de 60°C a 80°C por 30 minutos. No entanto, a estabilidade da resistência ao calor das xilanases resistentes ao calor derivadas de T. reesei sob condições simulando o branqueamento de pasta (a um pH de 10 e de 70°C a 80°C durante algumas horas) não foi demonstrada.

[017] As xilanases derivadas a partir de fungos filamentosos, tais como o gênero Trichoderma e a gênero Acremonium mencionadas em (c) aditivos para alimentação animal, não tem estabilidade térmica que possa tolerar a esferonização. Além disso, entre os xilanases mutantes resistentes ao calor descritas no Documento de Patente 2, Documento de Patente 3, Documento de Patente 7 e Documento de Patente 8 mencionados em (c), os mutantes que apresentam um pH ótimo de cerca de 5 a cerca de 5,5 são incluídos. No entanto, todos os mutantes sofrem de inativação térmica significativa em uma faixa de alta temperatura de 60°C ou mais elevada, e, por conseguinte, estes mutantes não podem ser usados como aditivos para ração animal.

[018] Em relação às xilanases mutantes resistentes ao álcali e resistentes ao calor derivadas de T. reesei reveladas no documento de Patente 2, Documento de Patente 3, Documento de Patente 5, e no Documento de Patente 6 mencionado em (d) Auxiliar de detergente, não há informações sobre a estabilidade das xilanases mutantes resistentes aos álcalis em uma região de base ao longo de um período de tempo geralmente necessário para lavagem (de 1 a 2 horas). Portanto, não está claro se ou não essas xilanases mutantes podem ser utilizadas como auxiliares de detergentes. Semelhante ao acima, não está claro se a xilanase mutante divulgada em Documento de Patente 8 e as xilanases resistentes aos álcalis e resistentes ao calor e derivados do gênero Bacillus e divulgadas no Documento de Patente 4 e Documento de Patente 9, que são mencionadas em (d), podem tolerar o uso como um auxiliar de detergente na limpeza de roupa.

[019] Não está claro se ou não as xilanases mutantes resistentes ao calor derivadas de T. reesei divulgadas no documento de Patente 2, Documento de Patente 3, Documento de Patente 5, e no Documento de Patente 6, que são mencionados em (e) modificador para modificação, podem tolerar grandes impactos físicos e cargas de pressão aplicados durante a fabricação de pães. Além disso, processos para panificação incluem um processo de fermentação realizada entre 35°C a 40°C durante 1 a 2 horas. Assim, também é necessária a compatibilidade com este processo.

[020] Como descrito acima, a gama de usos nos quais a xilanase podem ser utilizada é ampla. Portanto, as condições necessárias para a xilanase variam amplamente. Exemplos destas incluem 7 condições severas nas quais as enzimas inativam facilmente, como por exemplo, uma condição que envolve um pH de 4 a 10, uma temperatura de 40°C a 80°C, e um tempo de utilização de vários dias. A fim de responder a estas diferentes necessidades, muitos tipos de xilanases mutantes e novas xilanases têm sido relatados. No entanto, xilanases que podem atuar com estabilidade suficiente sob condições severas, nas quais as enzimas inativam facilmente não foram encontradas.

[021] Xilanases mutantes obtidas a fim de melhorar a resistência ao calor apresentam um problema na medida em que a taxa inicial de reação diminui em grande parte. Presume-se que a razão para tal seja uma diminuição na flexibilidade estrutural de toda a proteína causada por mutações ou semelhantes da sequência de aminoácidos que foi introduzida, a fim de melhorar a resistência ao calor.

[022] Em tais circunstâncias, o desenvolvimento de uma xilanase que exibe atividade estável por um período de tempo predeterminado, sob condições severas, nas quais as enzimas facilmente inativam como uma região ácida (pH de 4 a 6), uma região de base (desde pH 8 a 10), ou uma faixa de temperatura elevada (de 40°C a 80°C), e com a qual a taxa inicial de reação não é significativamente reduzida em comparação com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma.

[023] A presente invenção tem como objetivo proporcionar um método de sacarificação barato e eficiente para lignocelulose usando uma xilanase termoestável. A invenção também tem como objetivo fornecer uma xilanase mutante que apresente um resíduo de aminoácido substituto, e que exiba uma atividade estável mesmo sob condições severas em que enzimas as facilmente inativam, e que forneça uma taxa de reação inicial não significativamente reduzida quando comparada com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à xilanase mutante. A invenção também tem como objetivo proporcionar um método de produção capaz de produzir a xilanase mutante de baixo custo, bem como proporcionar várias utilizações da xilanase mutante.

Meios de Resolução de Problemas

[024] A presente invenção inclui o seguinte: [1] Método para fabricação de um produto sacarificado de lignocelulose, o método incluindo contato de uma matéria-prima lignocelulósica com uma xilanase termoestável. [2] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [1], pelo que a matéria-prima lignocelulósica é constituída de polpa. [3] Método para fabricação de um produto sacarificado, o método incluindo: recuperação da xilanase termoestável a partir de uma solução de reação de sacarificação contendo o produto sacarificado de lignocelulose obtido pelo método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [1] ou [2]; e contato da xilanase termoestável recuperada com uma matéria-prima lignocelulósica para obtenção de um produto sacarificado. [4] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [3], em que a solução de reação de sacarificação é submetida à separação sólido- líquido empregando centrifugação ou uma membrana de microfiltração, e o líquido separado é ultrafiltrado empregando uma membrana de ultrafiltração para separar e recuperar o produto sacarificado de lignocelulose e a xilanase termoestável. [5] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [4], em que o método compreende o contato de um sólido obtido por separação sólido-líquido empregando centrifugação ou uma membrana de microfiltração e a xilanase termoestável recuperada utilizando a membrana de ultrafiltração com uma matéria-prima lignocelulósica, de modo a obter um produto sacarificado. [6] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que a xilanase termoestável é uma xilanase mutante que apresenta uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% da que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, apresentando uma atividade da xilanase após tratamento térmico a 50°C, durante 24 horas, que corresponde pelo menos a 50% da atividade da xilanase antes do tratamento térmico, contendo, também, um substituinte de resíduo de aminoácido. [7] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [6], em que a xilanase mutante é uma xilanase mutante compreendendo pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29; um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58; um resíduo de tirosina, substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27; e um resíduo de asparagina de um resíduo de asparagina, substituído por um resíduo de serina na posição 44. [8] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [7], pelo que, na xilanase mutante empregada na obtenção de um produto sacarificado, o resíduo de aminoácido, diferente de um resíduo de tirosina, substituído pelo resíduo de tirosina na posição 27 é um resíduo de fenilalanina e o resíduo de asparagina na posição 44 é um resíduo de serina. [9] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com a [6], pelo que a xilanase mutante é uma xilanase mutante em que pelo menos um resíduo de aminoácido na posição 154 da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências é substituído por outro resíduo de aminoácido. [10] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [9], pelo que a xilanase mutante empregada na obtenção de um produto sacarificado inclui, pelo menos, os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido: um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36; um resíduo de serina substituído por um resíduo de treonina na posição 90; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glutamina na posição 132; um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154; um resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 174; um resíduo de histidina substituído por um resíduo de prolina na posição 195; um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 197; e um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de glicina na posição 217. [11] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [9], pelo que a xilanase mutante empregada na obtenção de um produto sacarificado inclui, pelo menos, os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido: um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30; um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36; e um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154. [12] Método para fabricação de um produto sacarificado de acordo com [9], pelo que a xilanase mutante empregada na obtenção de um produto sacarificado inclui, pelo menos, os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido: um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30; um resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 59; um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154; um resíduo de histidina substituído por um resíduo de tirosina na posição 239; e um resíduo de serina substituído por um resíduo de cisteína na posição 242. [13] Xilanase mutante, pelo que compreende pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29; um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58; um resíduo de tirosina substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27; e um resíduo de asparagina por um resíduo de serina na posição 44. [14] Xilanase mutante de acordo com [13], pelo que o resíduo de aminoácido, diferente de um resíduo de tirosina, substituído pelo resíduo de tirosina na posição 27 na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências é um resíduo de fenilalanina, e o resíduo de asparagina, substituído por um resíduo de serina na posição 44 na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, na Listagem de Sequências é um resíduo de serina. [15] Xilanase mutante, pelo que compreende a substituição de pelo menos um resíduo de leucina na posição 154 com outro resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências. [16] Xilanase mutante de acordo com [15], pelo que a xilanase mutante compreende pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem das Sequências: um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36; um resíduo de serina substituído por um resíduo de treonina na posição 90; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glutamina na posição 132; um resíduo de metionina substituído por um resíduo leucina na posição 154; um resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 174; um resíduo de histidina substituído por um resíduo de prolina na posição 195; um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 197; e um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de glicina na posição 217. [17] Xilanase mutante de acordo com [15], pelo que a xilanase mutante compreende pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências: um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30; um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33; um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36; e um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154. [18] Xilanase mutante de acordo com [15], pelo que a xilanase mutante compreende pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências: um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30; um resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 59; um resíduo de metionina substituído para o resíduo de leucina na posição 154; um resíduo de histidina substituído por um resíduo de tirosina na posição 239; e um resíduo de serina substituído por um resíduo de cisteína na posição 242. [19] Ácido nucleico, pelo que é representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18]. [20] Vetor de expressão, pelo que compreende o ácido nucleico de acordo com [19]. [21] Transformante, pelo que compreende o vetor de expressão de acordo com [20]. [22] Transformante de acordo com [21], pelo que uma célula hospedeira do transformante é uma célula derivada de Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, actinomiceto ou fungo filamentoso. [23] Transformante de acordo com [22], pelo que o fungo filamentoso pertence a um dos gêneros Trichoderma, Acremonium, Humicola ou Aspergillus. [24] Transformante de acordo com [22] ou [23], pelo que o fungo filamentoso é Trichoderma viride, Acremonium cellulolyticus, Humicola insolens ou Aspergillus niger. [25] Método para fabricação de uma xilanase mutante, o método compreendendo cultura do transformante de acordo com qualquer um de [21] a [24] e a recuperação da xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18] a partir de, pelo menos, um dos transformantes da cultura ou um produto de cultura do transformante. [26] Xilanase mutante, produzida pelo método para fabricação de acordo com [25]. [27] Composição incluindo a xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18] e [21]. [28] Método para branqueamento de uma polpa, o método incluindo o contato da xilanase mutante com a polpa de acordo com qualquer de [13] a [18] e [21]. [29] Detergente, pelo que compreende a xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18] e [21]. [30] Ração animal incluindo a xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18] e [21]. [31] Modificador para panificação incluindo a xilanase mutante de acordo com qualquer um de [13] a [18] e [21].

Efeitos vantajosos da Invenção

[025] De acordo com a presente invenção, um método de sacarificação barato e eficiente para lignocelulose usando uma xilanase termoestável pode ser fornecido. Além disso, também pode ser provida uma xilanase mutante que tem um resíduo de aminoácido de substituição, e que exibe uma atividade estável mesmo sob condições severas na qual as enzimas facilmente inativam, e que oferece uma taxa inicial de reação não é significativamente reduzida quando comparada com uma xilanase do tipo selvagem correspondendo à xilanase mutante. Além disso, de acordo com a invenção, um método de produção capaz de produzir a xilanase mutante de baixo custo pode ser fornecido, e vários usos da xilanase mutante podem também ser fornecidos.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

[026] A xilanase termoestável de acordo com a invenção pode ser qualquer xilanase termoestável da qual a atividade da xilanase, após tratamento por calor durante um determinado período de tempo está no mesmo nível que o da atividade da xilanase, antes do tratamento térmico, ou do qual uma redução na atividade de xilanase do mesmo depois do tratamento térmico, em comparação com a atividade da xilanase antes do tratamento térmico é pequena.Exemplos dessas incluem as xilanases obtidas a partir de fungos filamentosos do gênero Aspergillus, o gênero Trichoderma, o gênero Aureobasidium, o gênero Schizophyllum commune, ou semelhantes, e as bactérias do gênero Bacillus, o gênero Clostridium, e o gênero Streptomyces. Entre as xilanases do tipo selvagem acima descritas, as que exibem uma atividade de xilanase após tratamento com calor a 50°C durante 24 horas, isto é pelo menos 50% da atividade da xilanase das mesmas antes do tratamento térmico, são preferíveis. Além disso, a xilanase termoestável de acordo com a invenção pode ser um xilanase mutante obtida através da introdução de uma mutação em uma xilanase do tipo selvagem, tais como as obtidas a partir de fungos filamentosos e de bactérias, de modo a melhorar a estabilidade térmica, como necessário. A xilanase mutante é mais preferencialmente uma xilanase mutante que tem uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% da que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, e da qual a atividade de xilanase, após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, é de pelo menos 50% da sua atividade de xilanase dos mesmos antes do tratamento térmico, e que inclui um aminoácido substituto. Um ácido nucleico de acordo com a invenção é um ácido nucleico representado por uma base a sequência que codifica uma sequência de aminoácidos da xilanase mutante descrita acima. Um vetor de expressão de acordo com a invenção inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando uma sequência de aminoácidos da xilanase mutante. Uma célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula que é transformada com o vetor de expressão incluindo um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando uma sequência de aminoácidos da xilanase mutante. Um método de produção de uma xilanase mutante de acordo com a invenção inclui cultura da célula hospedeira e coleta da xilanase mutante a partir de, pelo menos, uma célula hospedeira cultivada ou um produto da cultura da célula hospedeira. A xilanase mutante de acordo com a invenção também inclui uma xilanase mutante produzida pelo método acima descrito para produzir uma xilanase mutante. Uma composição de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante. Um método de produção de um produto sacarificado de lignocelulose de acordo com a invenção inclui o contato da xilanase mutante com uma matéria-prima lignocelulósica. Um método de branqueamento de polpa de acordo com a invenção inclui o contato da xilanase mutante com a polpa. Um detergente, uma ração para animais, ou um modificador de panificação de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante.

[027] Na invenção, descrições sobre uma sequência de aminoácidos e uma sequência de bases codificando a xilanase mutante ou sequências individuais de iniciadores é aplicável às respectivas sequências acima mencionadas, bem como as sequências complementares às mesmas, com base na relação mutuamente complementar entre elas, salvo indicação em contrário. Quando as descrições da invenção são aplicadas às sequências complementares para as respectivas sequências mencionadas, as descrições devem ser interpretadas, ao longo do relatório descritivo, como se sequências reconhecidas pelas sequências complementares fossem sequências complementares para sequências mencionadas no presente relatório descritivo correspondente, dentro de um intervalo de conhecimentos técnicos comuns dos versados na técnica.

[028] Tal como usado no presente documento, o âmbito do termo "processo" inclui não apenas um processo independente, mas também um processo que não é claramente distinguido de outros processos, desde que a efeito esperado do processo seja alcançado. No relatório descritivo, o intervalo numérico indicado por "(de)... a..." indica uma gama, incluindo os valores numéricos descritos antes e depois de "a" como os valores mínimos e máximos, respectivamente. No relatório descritivo, quando duas ou mais substâncias, cada uma correspondendo a um determinado componente de uma composição, estão presentes, a quantidade do componente particular na composição significa o montante total das duas ou mais substâncias presentes na composição, salvo indicação em contrário. Doravante, a invenção será descrita.

(1) Definições Definições da Atividade da Xilanase e Taxa Inicial de Reação

[029] Na invenção, o termo "atividade da xilanase" significa a

[030] Como usado no presente documento, a expressão "atividade equivalente à do tipo selvagem" significa que a velocidade inicial da reação de uma xilanase mutante é de 0,7 (70%) ou superior, desde que a taxa inicial de reação de uma xilanase do tipo selvagem da mesma seja presumida como 1.

Definição da Faixa na qual as Enzimas Atuam de Forma Estável

[031] Como usado no presente documento, a expressão "faixa na qual as enzimas atual de forma estável" significa uma faixa apresentando uma temperatura superior a 30°C, mas inferior a 40°C e um pH maior que 6, mas menor que 8. Tal como usado no presente documento, o termo "condições severas em que enzimas facilmente inativam" significa uma região acídica (desde pH 4 a pH 6), uma região de base (desde pH 8 a pH 10), e uma região de alta temperatura (de 40°C a 80°C).

Definições de Atividade Residual e Estabilidade

[32] Tal como usado no presente documento, o termo "atividade residual" se refere ao quociente, expresso em percentagem, obtido dividindo uma taxa inicial de reação após uma enzima ser exposta por um certo período de tempo a uma condição fora da faixa na qual a enzima funciona estavelmente, por uma taxa inicial de reação antes da exposição. Um método de medição específico é o seguinte: depois do tratamento de aquecimento ser realizado a 50°C e pH 4,5 por períodos variados de 16 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas, a permanência no gelo ainda é realizada por 5 minutos, e a primeiro velocidade da reação é medida. A taxa inicial atingida pela enzima antes do tratamento de aquecimento também é medida. Em seguida, o cálculo da divisão é realizado e o resultante valor é expresso em porcentagem. Em adição ao acima, as atividades residuais são medidas da mesma maneira com relação às taxas iniciais de reação depois do tratamento de aquecimento ser realizado a 50°C durante 1 hora a pH 8, pH 9 e pH 10, respectivamente, as taxas iniciais de reação após o tratamento de aquecimento ser realizado a 60°C durante 1 hora a pH 8, pH 9 e pH 10, respectivamente, e um taxa inicial de reação, depois do tratamento de aquecimento ser realizado a 70°C e pH 5,5 durante 5 minutos. No presente relatório descritivo, a estabilidade é determinada pelo grau de atividade residual observado quando a enzima tiver sido exposta a condições severas em que as enzimas facilmente inativam.

2) Xilanase Mutante de Acordo com a Invenção

[33] A xilanase mutante de acordo com a invenção proporciona uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, apresenta uma atividade da xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas que é, pelo menos, 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico, e tem um resíduo de aminoácido substituto. Uma vez que a xilanase mutante de acordo com a invenção possui um resíduo de aminoácidos substituto, a xilanase mutante apresenta atividade estável mesmo em condições severas em que as enzimas inativam facilmente, e a velocidade inicial da reação da mesma não fica significativamente reduzida em comparação com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma.

[34] A xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser qualquer xilanase mutante que proporciona uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, e que apresenta uma atividade de xilanase, após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico, e que tem um resíduo aminoácido substituto e não é particularmente limitada em outros aspectos.

[35] A xilanase mutante de acordo com a invenção proporciona de preferência uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma. Quando a velocidade inicial da reação é de 70% ou superior, a quantidade de xilanase mutante a ser utilizada não se torna tão grande em comparação com a quantidade utilizada de uma xilanase do tipo selvagem correspondente à xilanase mutante, e, por conseguinte, uma taxa inicial de reação de 70% ou mais é preferível em aplicações industriais.

[36] A atividade da xilanase mutante de acordo com a invenção, depois do tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, é de preferência de pelo menos 50%, e mais preferencialmente pelo menos 70%, da sua atividade de xilanase, antes do tratamento térmico. A atividade da xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas de pelo menos 50% da sua atividade da xilanase antes do tratamento térmico é preferível porque a xilanase mutante pode ser utilizada em uma faixa em que a enzima funciona estavelmente. Especificamente, nos casos em que uma reação de enzima durante um longo tempo, como sacarificação de lignocelulose ou reutilização de uma enzima é necessária, uma atividade de xilanase, após o tratamento térmico que satisfaz a condição acima elimina a necessidade de adicionar uma grande quantidade da enzima com o fim de manter um taxa inicial de reação da mesma observada no início da reação, evitando assim um aumento do custo; assim, uma atividade de xilanase, após o tratamento térmico que satisfaz a condição acima é preferível também do ponto de vista econômico.

[37] A origem da xilanase mutante de acordo com a invenção não é particularmente limitada. Exemplos de xilanase mutante incluem aquelas derivadas a partir de Bacillus subtilis, uma bactéria do gênero Clostridium, um actinomiceto, um fungo filamentoso, e um basidiomiceto. Do ponto de vista de aplicações industriais, as xilanases mutantes derivadas do gênero Trichoderma, do gênero Acremonium, do gênero Humicola, ou do gênero Aspergillus, entre os fungos filamentosos, são preferidas. Do ponto de vista da produção em massa, xilanases mutantes derivadas de Trichoderma viride, Acremonium cellulolyticus, Humicola insolens, ou Aspergillus nigersão mais preferidas.

[38] Xilanases mutantes mais preferidas incluem as duas xilanases mutantes descritas abaixo, do ponto de vista de que a atividade estável é exibida, mesmo sob condições severas em que as enzimas inativam facilmente, e que uma taxa inicial de reação não é significativamente reduzida quando em comparação com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma é proporcionada.

[39] Uma primeira xilanase mutante preferível é uma xilanase mutante derivada de uma xilanase de um fungo filamentoso do gênero Trichoderma.

[40] A primeira xilanase mutante preferida é preferencialmente uma xilanase mutante derivada da xilanase de Trichoderma viride do ponto de vista de que a velocidade inicial da reação é de pelo menos 70% daquela fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, e que a atividade da xilanase após um tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, é de pelo menos 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico.

[41] A primeira xilanase mutante preferida pode ser uma xilanase mutante apresentando, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 na Listagem de Sequências, os resíduos substitutos de aminoácidos que se seguem: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29; um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58; um resíduo de aminoácido, que não seja um resíduo de tirosina, substituído por um resíduo de tirosina na posição 27; e um resíduo de asparagina, substituído por um resíduo de serina na posição 44 do ponto de vista de proporcionar uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela fornecida por uma do tipo de xilanase selvagem correspondente à mesma e facilitando a realização de uma atividade de xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase antes da tratamento térmico.

[42] A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências é uma sequência de aminoácidos codificando a xilanase II de Trichoderma viride.

[43] Uma segunda xilanase mutante preferida pode ser uma xilanase mutante derivada da xilanase de um fungo filamentoso que pertence ao gênero Acremonium.

[44] A segunda xilanase mutante preferida é preferencialmente uma xilanase mutante derivada da xilanase de Acremonium cellulolyticus do ponto de vista de que a velocidade inicial da reação é de pelo menos 70% da prevista por uma xilanase de tipo selvagem correspondente e que a mesma atividade da xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, é de pelo menos 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico.

[45] A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 na listagem de sequências é uma sequência de aminoácidos codificando a xilanase I de Acremonium cellulolyticus.

[46] A segunda xilanase mutante preferível inclui, de preferência, pelo menos, um resíduo de aminoácidos substituto na posição 154 que é um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina, a partir do ponto de vista de facilitar a obtenção de uma taxa inicial de reação de, pelo menos, 70% daquela fornecida por uma xilanase do tipo selvagem que corresponde à mesma, e obtenção de uma atividade de xilanase após um tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, isto é, pelo menos, 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico.

[47] Os exemplos específicos da xilanase mutante de acordo com a invenção incluem aqueles apresentando um resíduo de aminoácidos substituto representado pelos números de clone 1 a 17 mostrados na Tabela 1. No entanto, a xilanase mutante de acordo com a invenção não se limita aos mesmos. Tabela 1

[48] Na Tabela 1, a partir do ponto de vista de provisão de uma taxa inicial de reação que é, pelo menos 70% daquela fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma e uma atividade de xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase antes do tratamento térmico, um xilanase mutante TVX01 (Clone número 1), uma xilanase mutante ACX01 (Clone número 15), uma xilanase mutante ACX02 (clone número 16), ou uma xilanase mutante ACX03 (clone número 17) é preferível.

[49] A xilanase mutante TVX01 inclui os seguintes resíduos de aminoácidos substitutos incorporados na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29, um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58, um resíduo de tirosina substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27 e um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 44. A xilanase mutante TVX01é preferível do ponto de vista de fornecimento de uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma e uma atividade de xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase, antes do tratamento térmico.

[50] A xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção tem uma atividade de uma variedade de preferência, de 30°C a 90°C, e mais preferencialmente, de 30°C a 70°C. Além disso, a xilanase mutante TVX01 tem atividade em uma faixa de pH de preferência de 3 a 9, e mais preferivelmente a partir de um pH de 4 a 7.

[51] A xilanase mutante ACX01 inclui um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33, um resíduo de aminoácidos substituto, que é um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de serina substituído por um resíduo de treonina na posição 90, um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glutamina na posição 132, um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154, um resíduo de aminoácidos que é um substituto de resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 174, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de histidina substituído por um resíduo de prolina na posição 195, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 197, e um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de ácido glutâmico substituído por um resíduo de glicina na posição 217. A xilanase mutante ACX01 é preferível do ponto de vista de um taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem que corrrespondente e uma atividade de xilanase após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase, antes do tratamento térmico.

[52] A xilanase mutante ACX01 de acordo com a invenção tem uma atividade na faixa de 20 de preferência, de 30°C a 80°C, e mais preferencialmente de 30°C a 65°C. Além disso, a xilanase mutante ACX01 tem atividade em uma faixa de pH de preferência de 2 a 8, e mais preferivelmente de pH de 2 a 5.

[53] A xilanase mutante ACX02 inclui um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de ácido aspártico substituído por um resíduo de asparagina na posição 33, um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de arginina substituído por um resíduo de glicina na posição 36, e um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154. A xilanase mutante ACX02 é preferível do ponto de vista de provisão de uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase de tipo selvagem correspondente e uma atividade de xilanase após tratamento térmico a 50°C por 24 horas que é pelo menos 50% da sua atividade de xilanase, antes do tratamento térmico.

[54] A xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção tem atividade em uma faixa de preferência, de 30°C a 80°C, e mais preferencialmente, de 30°C a 65°C. Além disso, a xilanase mutante ACX02 tem atividade em uma faixa de pH de preferência de 2 a 8, e mais preferivelmente de pH de 2 a 5.

[55] A xilanase mutante ACX03 inclui um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de valina substituído por um resíduo de isoleucina na posição 30, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de treonina substituído por um resíduo de serina na posição 59, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de metionina substituído por um resíduo de leucina na posição 154, um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de histidina substituído por um resíduo de tirosina na posição 239, e um resíduo de aminoácidos substituto que é um resíduo de serina substituído por um resíduo de cisteína na posição 242. A xilanase mutante ACX03 é preferível do ponto de vista de que proporciona uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% daquela que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente e uma atividade de xilanase, após tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, isto é, pelo menos, 50% da sua atividade de xilanase, antes do tratamento térmico.

[56] A xilanase ACX03 mutante de acordo com a invenção tem uma atividade em uma faixa de preferência, de 30°C a 80°C, e mais preferencialmente, de 30°C a 65°C. Além disso, a xilanase mutante ACX03 tem atividade em uma faixa de pH de preferência de 2 a 8, e mais preferivelmente a partir do pH de 2 a 5.

[57] O âmbito da xilanase mutante de acordo com a invenção também inclui xilanases mutantes que consistem em sequências de aminoácidos homólogas à xilanase mutante TVX01. As "sequências de aminoácidos homólogas à mesma" podem ser, por exemplo, sequências de aminoácidos sequências que exibem nível aproximadamente equivalente de atividade de xilanase como o da xilanase mutante TVX01. Os exemplos preferidos incluem xilanases mutantes possuindo uma homologia de 80% ou superior, mais preferencialmente 90% ou superior, e ainda mais preferencialmente 95% ou superior, com a sequência de aminoácidos da xilanase mutante TVX01. Uma homologia de 80% ou mais é considerada como proporcionando uma maior similaridade entre as estruturas estéricas das xilanases, proporcionando assim uma vantagem na medida em que, por exemplo, uma xilanase mutante exibe nível aproximadamente equivalente de atividade que, de acordo com a invenção, pode ser desenvolvido através da introdução de um ou mais sítios de mutação clarificadas pela invenção. O mesmo se aplica às xilanases mutantes ACX01, ACX02, e ACX03, em adição à xilanase mutante TVX01.

[58] O âmbito da xilanase mutante TVX01de acordo com a invenção também engloba xilanases mutantes nos quais a inserção, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos foi introduzida na sequência de aminoácidos que codifica o xilanase mutante TVX01, e que exibem nível aproximadamente equivalente de atividade a da xialanase mutante TVX01.

[59] Nos casos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos, eliminados, ou substituídos a posição(ões) da inserção, eliminação ou substituição pode ser livremente selecionada, desde que os efeitos exercidos pela invenção não sejam prejudicados. O número de resíduos de aminoácidos que são inseridos, deletados ou substituídos pode ser um resíduo de aminoácido, dois ou mais resíduos de aminoácidos, por exemplo, a partir de um resíduo de aminoácidos a dez resíduos de aminoácido, de preferência a partir de um resíduo de aminoácidos a cinco resíduos de aminoácidos. Exemplos específicos incluem: uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como substituição de um resíduo de glicina na posição 47 por um resíduo de cisteína foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de glutamina na posição 52 com um resíduo de lisina foram introduzidas nas sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como substituição de um resíduo de valina na posição 59 por um resíduo de isoleucina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; um xilanase mutante, em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de asparagina na posição 67 por um resíduo de ácido aspártico foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de sequências; uma xilanase mutante na qual as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de asparagina na posição 69 com um resíduo de isoleucina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Sequência de Listagem; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como substituição de um resíduo de serina na posição 80 com um resíduo de alanina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de asparagina na posição 97 por um resíduo de ácido aspártico foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de leucina na posição 105 com um resíduo de metionina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de uma resíduo de treonina na posição 109 por um resíduo de alanina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de treonina na posição 120 com um resíduo de arginina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em Listagem de Sequência; uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como substituição de um resíduo de treonina na posição 143 por um resíduo de isoleucina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências ; uma xilanase mutante, em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de asparagina na posição 151 por um resíduo de serina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na sequência Listagem; uma xilanase mutante na qual as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de serina na posição 161 com um resíduo de leucina foram introduzidas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de sequências; e uma xilanase mutante em que as mutações nos quatro sítios, bem como a substituição de um resíduo de serina na posição 186 por um resíduo de treonina foram introduzidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências.

[60] O mesmo se aplica às xilanases mutantes ACX01, ACX02, e ACX03, além da xilanase mutante TVX01. Os exemplos específicos incluem uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos na ACX01, bem como a substituição de um resíduo de serina na posição 133 com um resíduo de asparagina foram introduzidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências, e uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos na ACX01, bem como a substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 por um resíduo de arginina foram introduzidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências.

[61] Da mesma forma, em relação à xilanase mutante ACX02, muitos mutantes, com todos os sítios de mutação definidos em ACX02 exibem propriedades aproximadamente equivalentes aquelas da ACX02. Os exemplos específicos destes incluem: uma xilanase mutante na qual os sítios de mutação definidos em ACX02, bem como a substituição de um resíduo de treonina na posição 90 com um resíduo de serina foram introduzidas na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem das Sequências; uma xilanase mutante, em que os sítios de mutação definidos em ACX02, bem como substituição de um resíduo de glutamina na posição 132 por um resíduo de arginina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO:2 na Listagem de Sequências; uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos na ACX02, bem como a substituição de um resíduo de serina na posição 133 por um resíduo de asparagina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem das Sequências; uma xilanase mutante em que o sítios de mutação definidos em ACX02, bem como a substituição de um resíduo de serina na posição 174 com um resíduo de treonina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem de sequências; uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos em ACX02 bem como substituição de um resíduo de prolina na posição 195 por um resíduo de histidina, foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem das Sequências; uma xilanase mutante na qual os sítios de mutação definidos na ACX02, bem como a substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 com um resíduo de arginina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem das Sequências; uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos em ACX02, bem como substituição de uma resíduo de serina na posição 197 por um resíduo de asparagina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO. 2 na Listagem de Sequências; e uma xilanase mutante em que os sítios de mutação definidos em ACX02, bem como a substituição de um resíduo glicina na posição 217 com um ácido glutâmico resíduo foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem de Sequências.

[62] Além disso, muitos mutantes com todos os sítios de mutação definidos na xilanase mutante ACX03 exibem propriedades aproximadamente equivalentes às de ACX03. Exemplos específicos dos mesmos incluem uma xilanase mutante na qual os sítios de mutação definidos em ACX03, bem como a substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 por um resíduo de arginina foram introduzidos na sequência de aminoácido SEQ ID: NO: 2 na Listagem de Sequências.

[63] A xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser sintetizada de acordo com métodos conhecidos. Exemplos de um método para gerar uma mutação de um gene incluem mutagênese dirigida ao sítio (Kramer, W. and frita, H.J., Methods in Enzymology, vol. 154, P. 350 (1987)), PCR recombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)), a síntese química do DNA de um sítio específico, o tratamento de hidroxilamina do gene, e um método incluindo tratamento de um microrganismo com o gene com irradiação UV, ou um agente químico tal como nitrosoguanidina ou ácido nitroso. Entre os métodos de obtenção da xilanase mutante de acordo com a invenção, os métodos preferidos incluem o método de produção de um xilanase mutante descrita abaixo.

(3) Método de Produção da Xilanase Mutante

[64] Um método de produção de uma xilanase mutante de acordo com a invenção (a seguir referido simplesmente como "método de produção") inclui a cultura de um transformante e recuperação da xilanase mutante a partir de, pelo menos, um dos transformantes cultivados ou um produto da cultura do transformante. No presente documento, o termo "transformante" se refere a um transformante transformado com um vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante. Em um método de produção uma xilanase mutante de acordo com a invenção inclui a cultura de um transformante que foi transformado com um vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante, para produzir a xilanase mutante. Com este método de produção, uma xilanase mutante que exibe atividade estável mesmo em condições severas em que enzimas facilmente inativam e que proporciona uma taxa inicial de reação não é significativamente reduzida quando comparada com uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, pode ser produzida a baixo custo.

[65] Os processos que podem ser incluídos no método de produção encontram-se descritos abaixo. O método de produção de uma xilanase mutante de acordo com a invenção inclui um processo de cultura de um transformante que foi transformado com um vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante (um processo de cultivo da célula hospedeira), e um processo de recuperação da xilanase mutante a partir de pelo menos uma cultura do transformante ou um produto de cultura do transformante (processo de recuperação de xilanase mutante). O método de produção de uma xilanase mutante de acordo com a invenção pode incluir ainda outros processos, quando necessário.

A. Processo de Cultivo do Transformante

[66] O processo de cultivo do transformante é um processo de cultura de um transformante que foi transformado com um vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante.

Transformante

[67] No método de produção de acordo com a invenção, o transformante que foi transformado com um vetor de expressão inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante, e o transformante não está particularmente limitado em outros aspectos. Exemplos de transformante incluem células hospedeiras derivadas de Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, actinomicetos, fungos filamentosos ou semelhantes. Entre eles, os transformantes dos quais as células hospedeiras são derivadas de Bacillus subtilis, leveduras, actinomicetos, ou fungos filamentosos, cada um permitindo a produção da enzima alvo por secreção para fora de suas células, são preferíveis do ponto de vista das aplicações industriais.

[68] Exemplos de leveduras incluem as que pertencem ao gênero Saccharomyces, o gênero Hansenula, ou do gênero Pichia. Um exemplo de levedura preferível é Saccharomyces cerevisiae.

[69] Exemplos de fungos filamentosos incluem os que pertencem ao gênero Humicola, do gênero Aspergillus, do gênero Trichoderma, ou do gênero Acremonium. Exemplos preferíveis de fungos filamentosos são Humicola insolens, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma viride, ou Acremonium cellulolyticus. Do ponto de vista industrial aplicações, Trichoderma viride, Acremonium cellulolyticus, Humicola insolens, ou Aspergillus nigeré mais preferível.

Ácido Nucleico

[70] O ácido nucleico acima descrito é representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante. Exemplos de métodos para sintetizar a sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante incluem um método de introdução de um ou mais sítios de mutação em uma sequência de bases codificando uma xilanase de tipo selvagem correspondente, e um método de sintetização química da sequência de bases inteira, que inclui um ou mais sítios de mutação. O método de introdução de um ou mais sítios de mutação a uma sequência de bases codificando um de tipo selvagem correspondente de xilanase é descrito a seguir, utilizando uma sequência de bases codificando uma xilanase I de Acremonium cellulolyticus e uma sequência de bases codificando uma xilanase II de Trichoderma viride. No entanto, o ácido nucleico de acordo com a invenção não é limitado às mesmas.

Introdução de Sítios de Mutação na Sequência de Bases Codificando Xilanase do Tipo Selvagem

[71] Exemplos das sequências de bases que codificam as xilanases do tipo selvagem incluem uma sequência de bases codificando a xilanase I de Acremonium cellulolyticus representada pela SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequências e uma sequência de bases codificando a xilanase II de Trichoderma viride representada pela SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequências. Exemplos de método de geração de uma mutação em um gene utilizando uma sequência de bases codificando uma xilanase de tipo selvagem, tais como as mencionadas acima como modelo incluem um método de mutagênese dirigida ao local (Kramer, W. e frita H.J., Methods in Enzymology, vol. 154, p 350 (1987)), um método de PCR recombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)), um método de síntese química de uma porção específica de um DNA, um método de tratamento de um gene com hidroxilamina, um método de sujeição de um microrganismo que possui o gene para tratamento por irradiação IV ou tratamento com um agente químico tal como nitrosoguanidina ou nitroso e kits comercialmente disponíveis para a introdução de mutações. Uma mutação pode ser introduzida na sequência de bases usando esses métodos. As posições e tipos de mutações introduzidas não são particularmente limitadas. Os sítios de mutação dos clones representados pelos clones números 1 a 17 são indicados como exemplos específicos na Tabela 2 abaixo. No entanto, as posições e os tipos de mutações introduzidos não são limitados a estes. Tabela 2

Vetor de Expressão

[72] O vetor de expressão inclui um ácido nucleico representado por uma sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante, e não é particularmente limitado em outros aspectos. Do ponto de vista de melhorar a eficiência de transformação ou eficiência de tradução, o vetor de expressão é mais preferivelmente um vetor plasmídico ou um vetor de fago, cada um dos quais apresentando uma estrutura tal como discutido abaixo.

Estrutura Básica do Vetor de Expressão

[73] O vetor de expressão inclui uma sequência de bases codificando a xilanase mutante e é capaz de transformar a célula hospedeira, e o vetor de expressão não é particularmente limitado a outros aspectos. Em adição à sequência de bases acima descrita, o vetor de expressão pode incluir ainda uma sequência de base que constitui outra região (a seguir referida simplesmente como "outra região") se necessário. Exemplos de outra região incluem uma região de controle necessária para que o transformante produza a xilanase mutante e uma região necessária para replicação autônoma. Do ponto de vista de facilitar a seleção do transformante, o vetor de expressão pode incluir ainda uma sequência de bases codificando um gene para seleção que pode servir como um marcador de seleção. Exemplos da região de controle necessária para produzir a xilanase mutante incluem uma sequência promotora(incluindo uma sequência de operador que controla a transcrição), uma sequência de ligação de ribossoma (sequência SD), e uma sequência do terminador da transcrição.

Vetor de Expressão no Caso onde a Célula Hospedeira é Levedura

[74] Nos casos em que a levedura é usada como uma célula hospedeira, o vetor de expressão inclui de preferência uma sequência promotora além da sequência de bases codificando a xilanase mutante, do ponto de vista de eficiência de produção da xilanase mutante. A sequência promotora pode ser qualquer sequência que permita a expressão da xilanase mutante em um transformante do qual a célula hospedeira é a levedura.

[75] Por exemplo, sequências de promotor, tais como um promotor de álcool desidrogenase (ADH1), um promotor de fosfoglicerato cinase (PGK1), um promotor de fator de alongamento da cadeia peptídica (TEF), um promotor de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD), promotor de galactoquinase (GAL1), promotor de metalotioneína (CUP1), promotor de fosfatase ácida repressível (PHO5), e promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), são usados. As origens das sequências promotoras não se limitam a levedura, que serve como a célula hospedeira. Promotores exógenos, tais como um promotor de citomegalovírus (CMV) podem ser utilizados. Estes promotores podem ser selecionados, conforme o caso, de acordo com a origem e o tipo de a enzima a ser utilizada.

[76] O vetor de expressão pode também incluir um sinal de secreção. Inclusão do sinal de secreção permite que a xilanase mutante segregada para fora da célula, quando o transformante produzir a xilanase mutante. O sinal de secreção deve permitir que a xilanase mutante seja segregada a partir da levedura servindo como a célula hospedeira, e não é particularmente limitado em outros aspectos. Do ponto de vista de eficiência de secreção, é preferível utilizar uma sequência de sinal do fator α, uma sequência de sinal da invertase, uma sequência de sinal da fosfatase ácida, uma sequência de sinal de glucoamilase, ou semelhantes.

[77] Exemplos específicos de vetores de expressão que incluem uma sequência promotora ou um sinal de secreção, tais como aqueles descritos acima, incluem pRS423, pRS424 e YEplac195.

Vetor de expressão no caso em que a célula hospedeira é um fungo filamentoso

[78] Nos casos em que um fungo filamentoso é usado como uma célula hospedeira, o vetor de expressão inclui, de preferência, uma sequência promotora além da sequência de bases codificando a xilanase mutante, a partir do ponto de vista da eficiência de produção da xilanase mutante. A sequência promotora pode ser qualquer sequência que permita a expressão da xilanase mutante em um transformante do qual a célula hospedeira é um fungo filamentoso.

[79] Os vetores de expressão adequados para fungos filamentosos são descritos em van den Hondel, C. A. M. J. J. e outros (1991) In: Bennett, J.W. e Lasure, L.L. (eds.) More gene manipulations in fungi. Academic Press, pp 396428. Além disso, outros vetores de expressão vulgarmente utilizados são também utilizáveis, tais como pUC18, pBR322, pUC100, pSL1180 (fabricado por Pharmacia, Inc.), pFB6, Aspergillus Prax, e Trichoderma pTeX. Vetor de expressão no caso onde a célula hospedeira é procariota Nos casos em que a célula hospedeira é um procariota, tal como Escherichia coli, Bacillus subtilis, ou um actinomiceto, o vetor de expressão inclui uma sequência promotora, além da sequência de bases codificando a xilanase mutante, a partir do ponto de vista da eficiência de produção da xilanase mutante. Além da sequência promotora, a vetor de expressão podem incluir uma sequência de ligação ao ribossoma, uma sequência terminadora da transcrição ou outros semelhantes.

[80] Exemplos de sequência promotora incluem um óperon de triptofano (trp) e um óperon de promotor da lactose (lac), que são derivados a partir de Escherichia coli, um promotor PL e um promotor PR, que são derivados de fago lambda, um promotor de ácido glicônico sintetase (gnt), um promotor de protease alcalina (apr), um promotor de protease neutra (npr), e um promotor de α-amilase (amy), que são derivados de Bacillus subtilis. Independentemente, sequências promotoras modificadas ou projetadas, tais como um promotor tac também são usadas.

[81] A sequência de ligação ao ribossoma pode ser uma sequência derivada a partir de Escherichia coli ou Bacillus subtilis. A sequência de ligação ao ribossoma deve funcionar em uma célula hospedeira pretendida, tal como em Escherichia coli ou Bacillus subtilis, mas não é particularmente limitado, em outros aspectos. Exemplos da sequência de ligação ao ribossoma inclui uma sequência de consenso que consiste em quatro ou mais bases consecutivas de uma sequência complementar à região 3' do RNA de ribossoma 16S e que foi produzido por síntese de DNA. A sequência de terminação da transcrição não é essencial. A sequências terminadoras de transcrição que não são dependentes do fator p, como por exemplo, um terminador de lipoproteína e um terminador de óperon trp podem ser utilizados. A ordem em que estas regiões de controle estão dispostas no vetor de expressão não é particularmente limitada. Levando-se em consideração a eficiência da transcrição, é preferível que um sequência promotora, uma sequência de ligação ao ribossoma, um gene que codifica uma proteína alvo, e uma sequência terminadora de transcrição estejam dispostas nesta ordem a montante no lado de término 5'.

[82] Com relação aos exemplos específicos de vetores de expressão, tal como usado no presente documento, pBR322, pUC18, Bluescript II SK (+), pKK223-3, e pSC101, que têm uma região capaz de replicação autônoma em Escherichia coli, e pUB110, pTZ4, pC194, p11, Φ1, e Φ105, que tem um região capaz de replicação autônoma em Bacillus subtilis, podem ser utilizados como os vetores de expressão. Além disso, com relação aos exemplos de vetores de expressão capazes de replicação autônoma em dois ou mais tipos de células hospedeiras, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 e semelhantes podem ser usados como vetores de expressão.

Método de Produção de Transformante

[83] O transformante de acordo com a invenção pode ser produzido por métodos conhecidos. Exemplos destes incluem um método que inclui a construção de um vetor de expressão que inclui uma sequência de bases codificando a xilanase mutante de acordo com a invenção e que facultativamente inclui a outra região, e transformando uma célula hospedeira desejada com o vetor de expressão. Especificamente, os métodos gerais conhecidos nos campos da biologia molecular, bioengenharia e engenharia genética podem ser utilizados, tais como os descritos em Sambrook, J., e outros, " Molecular Cloning a Laboratory Manual, 3a Edição", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001).

[84] O transformante de acordo com a invenção pode ser produzido, por exemplo, incorporando uma mutação silenciosa, de tal modo que um códon apresentando baixa frequência de utilização na célula hospedeira é substituído por um códon apresentando alta frequência de utilização na célula hospedeira, de acordo com a necessidade, além de incorporar o vetor de expressão na célula hospedeira. Existe uma possibilidade de que a quantidade de produção de proteína derivada da xilanase mutante incorporada ao vetor de expressão seja, assim, aumentada.

[85] A Tabela 3 abaixo ilustra um exemplo das maneiras em que as mutações silenciosas são introduzidas. Os métodos para a introdução de mutações silenciosas não são particularmente limitados em relação à técnica, os sítios de mutação, os tipos de bases que devem ser alterados, e outros semelhantes, desde que os métodos permitam a modificação dos códons do gene da xilanase no vetor de expressão e os códons da sequência de sinal para provocar a secreção do gene da xilanase para o exterior de da célula, com base nas frequências de utilização de códons na célula hospedeira. A Tabela 3 abaixo indica as posições de base em que as mutações silenciosas são adicionadas a fim de permitir a expressão da xilanase mutante ACX02 com elevada frequência em T. viride, e os tipos de bases a serem alteradas. Na Tabela 3, as "posições de base" para a denominação da sequência "ACX02" indicam as posições das bases na SEQ ID NO: 4. As "posições de bases" para a denominação da sequência "sequência de sinal A. cellulolyticus" indicam as posições de bases na SEQ ID NO: 73. Tabela 3

Método de Cultivo do Transformante

[86] As condições para a cultura de um transformante obtido por transformação com o vetor de expressão são como descritas na explicação das condições para o cultivo de uma célula hospedeira antes da transformação, as condições conhecidas podendo ser utilizadas. Com relação ao meio de cultura, tanto um meio sintetizado quanto um meio natural são utilizáveis, desde que o meio contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma substância inorgânica e outros nutrientes em quantidades adequadas. Componentes conhecidos para meios de cultura podem ser usados. Por exemplo, fontes nutricionais orgânicas, tais como, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, peptona, amina NZ e batatas, fontes de carbono, tais como glicose, maltose, sacarose, amido e ácidos orgânicos, fontes de nitrogênio, tais como, sulfato de amônio, ureia, e cloreto de amônio, fontes de nutrientes inorgânicos, tais como, sais de fosfato, magnésio, potássio, ferro, e vitaminas, podem ser utilizados em combinações apropriadas. No cultivo de um transformante que foi transformado com o vetor de expressão que inclui um marcador de seleção, por exemplo, nos casos em que o marcador de seleção for um marcador de seleção resistente aos fármacos, um meio que contém um medicamento correspondente ao marcador de seleção resistente aos fármacos será usado, enquanto que, nos casos em que o marcador de seleção for um marcador de seleção auxotrófica, de um meio que não contém um nutriente correspondente ao marcador de seleção auxotrófica será usado. O pH do meio pode ser selecionado dentro de uma faixa de pH 4 a pH 8. O cultivo pode ser realizado através da cultura do transformante em um meio líquido que contém o meio descrito acima, utilizando um método de cultivo normal, tal como, agitação da cultura, agitação-aeração da cultura, cultura contínua ou cultura em bateladas. Condições de cultura podem ser selecionadas, conforme o caso, de acordo com o tipo de transformante, o tipo de meio, e o tipo de método de cultura. As condições de cultura devem permitir que o transformante cresça e produza a xilanase mutante de acordo com a invenção, e as condições de cultivo não são particularmente limitadas em outros aspectos. A temperatura da cultura é de 20°C a 45°C, e de preferência de 24°C a 37°C, e o cultivo é realizado em condições aeróbias. O período de cultivo pode ser ajustado para um período na faixa de 1 dia a 7 dias, e o cultivo pode ser continuado até que o teor de proteína apresentando a atividade da xilanase mutante alcance o máximo.

B. Processo de Recuperação da Xilanase Mutante

[87] O processo de recuperação da xilanase mutante é um processo de recuperação da xilanase mutante a partir de, pelo menos, um dos transformantes cultivados ou um produto da cultura do transformante.

[88] O método para a recuperação da xilanase mutante de acordo com a invenção após o cultivo do transformante obtido por transformação pode ser um método comumente utilizado na arte. Nos casos em que a xilanase mutante de acordo com a invenção for secretada para fora do transformante obtido por transformação, a solução de enzima em bruto pode ser facilmente obtida por sujeição do produto de cultivo do transformante à centrifugação, filtração, ou semelhantes. Nos casos em que a xilanase mutante de acordo com a invenção for acumulada no transformante obtido por transformação, a solução de enzima em bruto pode ser obtida por recuperação do transformante cultivado utilizando um meio, tal como a centrifugação, suspensão do transformante recuperado em uma solução tampão, e ruptura da membrana celular da célula transformante utilizando um método conhecido, tal como tratamento com lisozima, congelamento e descongelamento ou desintegração ultrassônica.

[89] A solução de enzima bruta pode ser utilizada como uma enzima concentrada, sendo concentrada por um método de ultrafiltração ou outros semelhantes e suplementada com um conservante ou semelhantes. Uma enzima em pó da xilanase mutante pode ser obtida usando, por exemplo, um método de aspersão-secagem após a concentração. Nos casos em que a solução de enzima em bruto recuperada com uma atividade de xilanase precisar ser separada e purificada, por exemplo, dessalinizada utilizando sulfato de amônio ou semelhantes, os métodos de precipitação de solvente orgânico utilizando álcool ou semelhantes, métodos de separação com membrana usando diálise, ultrafiltração ou outros semelhantes, e métodos de separação cromatográfica conhecidos, tais como, cromatografia em trocador de calor, cromatografia em alta velocidade de fase reversa, cromatografia por afinidade e cromatografia por filtração em gel podem ser realizados em combinações apropriadas.

(4) Utilização de Xilanase Mutante

[90] Como descrito acima, a xilanase mutante de acordo com a invenção apresenta atividade estável durante um longo período de tempo mesmo sob condições em que as enzimas facilmente inativam. Portanto, a xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser empregada em uma vasta gama de utilizações. Uma composição de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima, e pode também incluir componentes livremente selecionadas adequadas para a aplicação desejada, caso necessário. A composição de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima, a qual funciona de forma estável durante um longo período de tempo mesmo sob condições em que as enzimas facilmente inativam. Portanto, a composição de acordo com a invenção pode ser empregada em várias utilizações. O conteúdo da xilanase mutante pode ser ajustado, caso apropriado, de acordo com o uso da composição e não é particularmente limitado.

[91] A xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser usada para vários usos. A xilanase mutante é de preferência utilizada na forma descrita abaixo.

Método para Produção de Sacarídeo de Matéria-Prima Lignocelulósica

[92] O método para produção de um produto sacarificado de lignocelulose de acordo com a invenção inclui o contato da xilanase mutante com uma matéria-prima lignocelulósica. No método de produção de um produto sacarificado de lignocelulose de acordo com a invenção é empregada a xilanase mutante descrita acima, que é capaz de funcionar de forma estável durante um longo período de tempo, mesmo sob uma condição em que as enzimas inativam facilmente; por conseguinte, a produção pode ser realizada sob condições em que as enzimas inativam facilmente e a sacarificação de lignocelulose pode ser obtida de forma eficiente.

[93] Matérias-primas lignocelulósicas conhecidas apresentando um baixo teor de lignina podem ser utilizadas como a matéria-prima lignocelulósica. A expressão "baixo teor de lignina" se refere a um teor de lignina inferior a 30% em peso considerando-se que o teor médio de lignina nas matérias-primas lignocelulósicas é de cerca de 30% em peso, em relação à quantidade total de matéria-prima lignocelulósica. Matérias-primas lignocelulósicas que apresentam um teor de lignina de 20% em peso ou inferior, são preferidas e matérias-primas lignocelulósicas que possuem um teor de lignina de 10% em peso ou inferior são mais preferidas. Exemplos de matéria-prima lignocelulósica incluem fibras de celulose que contêm celulose e hemicelulose como componentes principais, e que são obtidas através de remoção de lignina de alto grau a partir de materiais lignocelulósicos, como madeira macia, madeira de lei, resíduos de madeireira, madeira residual de construção, resíduos de poda, serragem, kenaf, e resíduos agrícolas, tais como, palha de arroz e palha de trigo usando um método de produção de pasta química, tal como extração com álcali ou digestão alcalina ou utilizando um método tal como organosolve. Exemplos preferidos incluem pasta de polpa kraft de madeira de lei, pasta de polpa kraft de madeira macia, pasta de polpa mecânica, pasta de polpa derivada de planta herbácea, tal como, cânhamo, papel residual ou pasta de papel (incluindo teor de fibras de celulose recuperadas de uma fábrica de pasta de papel), ou qualquer mistura dos mesmos. Em particular, a pasta de polpa kraft de madeira macia e pasta de polpa kraft de madeira de lei são mais preferidas. Cada uma dessas matérias-primas lignocelulósicas está disponível nas empresas de fabricação de pasta de polpa em geral.

[94] Exemplos de métodos para contatar a xilanase mutante com uma matéria-prima lignocelulósica incluem: um método que inclui a adição de xilanase mutante à matéria- prima lignocelulósico e permitindo que a reação prossiga, enquanto em agitação; um método incluindo permissão para que a reação prossiga enquanto em agitação e um método incluindo mistura suficiente da xilanase mutante e lignocelulose e então permitindo que a mistura repouse o suficiente de modo a permitir que a reação seja processada. Do ponto de vista de eficiência de reação, um método preferível é um método, incluindo a adição da xilanase mutante a uma matéria-prima lignocelulósica e permitindo que a reação prossiga, sob agitação. Tanques de reação utilizáveis para a reação não são particularmente limitados. O tanque de reação é de preferência um tanque de reação capaz de agitação, de modo a misturar suficientemente a matéria-prima lignocelulósica e a xilanase mutante que foram adicionadas no seu interior, e tendo uma função de controle de temperatura com o que a temperatura pode ser mantida à temperatura ótima da xilanase mutante. A temperatura de reação pode ser qualquer temperatura na qual a xilanase mutante pode atuar, sem restrições específicas. Por exemplo, a temperatura de reação pode ser desde 40°C a 60°C, e de preferência de 40°C a 55°C. O pH da solução no tanque de reação de sacarificação, pode ser qualquer pH no qual a xilanase mutante possa atuar, sem restrições específicas. Por exemplo, o pH pode ser a partir de pH 4 a pH 7, e de preferência de pH 4 a pH 6.

[95] No método de produção de um produto sacarificado de lignocelulose de acordo com a invenção, em adição à xilanase mutante de acordo com a invenção, outras enzimas podem ser utilizadas em combinação com a xilanase mutante, se necessário. Em relação às outras enzimas, enzimas, por exemplo, celulase, xilosidase, mananase, pectinase, galactosidase, glucuronidase, e arabinofuranosidase podem ser utilizadas em combinação com a xilanase mutante. Do ponto de vista da produção eficiente de um produto sacarificado de lignocelulose, celulase é empregada de preferência em combinação com a xilanase mutante.

[96] Celulases conhecidas que decompõem a celulose em glicose podem ser usadas como a celulase, sem restrições. Exemplos de celulases incluem a celulase que possui pelo menos uma atividade selecionada a partir de uma atividade de endoglucanase, uma atividade de celobiohidrolase ou uma atividade β-glicosidase. Além disso, do ponto de vista da atividade enzimática, a celulase é de preferência um mistura de enzimas tendo essas atividades.

[97] A origem da celulase não é limitada, e as celulases de fungos filamentosos, basidiomicetos, bactérias, e similares podem ser usados. Por exemplo, é possível utilizar uma, ou uma mistura de duas ou mais, selecionadas dentre o grupo consistindo em: celulases derivadas de várias fontes, tais como fungos filamentosos do gênero Trichoderma, gênero Acremonium, gênero Aspergillus ou semelhantes, basidiomicetos do gênero Irpex ou semelhantes, bactérias do gênero Aeromonas, gênero Clostridium, gênero Bacillus, gênero Pseudomonas, gênero Penicillium, gênero Humicola ou semelhantes; e as celulases produzidas por recombinação genética utilizando celulases derivadas destas fontes como modelos. Também é possível usar diretamente uma formulação de celulase disponível no mercado em geral, um produto de cultura de qualquer dos microrganismos acima mencionados, ou um filtrado obtido a partir do produto cultivado. Entre estes, a celulase derivada do gênero Trichoderma ou celulase derivada do gênero Acremoniumé preferível em consideração ao seu forte poder de decompor a celulose.

[98] Exemplos de celulases disponíveis comercialmente que podem ser utilizadas incluem Accellerase 1000 (fabricada pela Genencor Co., Ltd.), Accellerase 1500 (fabricada pela Genencor), Accellerase XC (fabricada pela Genencor), Accellerase XY (fabricada pela Genencor), Accellerase Duet (fabricada por Genencor), Accellerase Trio (fabricada pela Genencor), Celluclast (fabricada pela Novozymes), Cellic Ctec (fabricada pela Novozymes), Cellic Htec (fabricada pela Novozymes), Cellic Ctec2 (fabricada pela Novozymes), Cellic Htec2 (fabricada pela Novozymes), celulase Acremonium (fabricada por Meiji Seika Pharma Co., Ltd.), Meicellase (fabricada por Meiji Seika Pharma Co., Ltd.), Cellulase Amano A (fabricada por Amano Enzyme Co., Ltd.), Celulase Amano T (fabricada por Amano Enzyme Co., Ltd.), Cellulase Daiwa (fabricada por Daiwa Fine Chemicals Co., Ltd.), Cellulizer (fabricada por Nagase Biochemicals Ltd.), Driselase (fabricada por Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), Celulase Onozuka (fabricada por Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.), e Cellulosin (fabricada pela Hankyu Bioindustry Co., Ltd.).

[99] A proporção de mistura da xilanase mutante para a celulase pode ser qualquer proporção de mistura na que a quantidade de produção de açúcares redutores é maximizada. De preferência, a xilanase mutante é misturada em uma proporção de 20% a 60% com relação à celulase.

[100] A concentração de matéria-prima lignocelulósica como um substrato a ser adicionada ao tanque de reação e a concentração total de enzimas incluindo a xilanase mutante e outras enzimas (doravante simplesmente "enzimas") não são particularmente limitadas. Para operações como transferência, carga e formas semelhantes de matéria-prima lignocelulósica, uma concentração de teor de sólidos de 8% a 30% em peso é preferível. As enzimas a serem utilizadas podem ser adicionadas em uma quantidade suficiente para a decomposição eficiente do substrato, tendo em conta a atividade das enzimas. A quantidade das enzimas pode ser ajustada, conforme apropriado, de acordo com, por exemplo, os tipos de enzimas. O produto sacarificado produzido pelo método de produção de um produto sacarificado a partir de uma matéria-prima lignocelulósica de acordo com a invenção e o método de produção de um produto sacarificado de uma matéria-prima lignocelulósica envolvendo reutilização de enzimas de sacarificação, de acordo com a invenção pode ser qualquer produto sacarificado derivado a partir da lignocelulose. Exemplos específicos do produto sacarificado incluem monossacarídeos e oligossacarídeos, que consistem em duas ou mais unidades de açúcar. Exemplos de monossacarídeos incluem glicose, xilose, arabinose, frutose, manose e galactose. O produto sacarificado pode ser utilizado para produzir produtos químicos, combustíveis, plásticos e outros produtos ou intermediários. O produto sacarificado também pode ser usado como uma matéria-prima pode fermentação para a produção destas substâncias utilizando microrganismos. Exemplos de produtos químicos, combustíveis, plásticos e outros produtos incluem o etanol, isopropanol, acetona, acetato, 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol, aminoácidos, ácidos orgânicos, furfural, polihidroxialcanoatos, rações animais, e xilose. Em particular, o produto sacarificado é altamente adequado para utilização na produção fermentativa de etanol, isopropanol, ácido láctico ou semelhantes.

Método de Produção de Xilanase Mutante para Reutilização

[101] O método de produção de uma xilanase mutante para reutilização de acordo com a invenção inclui a recuperação da xilanase mutante de acordo com a invenção a partir de uma solução da reação de sacarificação, que contém um produto sacarificado de lignocelulose obtido pelo método de manufatura de um produto sacarificado de lignocelulose; este processo doravante também será referido como "processo de recuperação", e a solução da reação de sacarificação mencionada acima será doravante também referida simplesmente como "solução de reação de sacarificação". De acordo com este método, a xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser produzida a baixo custo.

[102] No processo de recuperação, o método de recuperação a ser usado pode ser um método conhecido. Exemplos destes incluem um método compreendendo a realização de separação sólido-líquido, e recuperação da enzima utilizando um dispositivo de membrana ou outro dispositivo conhecido capaz de recuperar a enzima. Exemplos de métodos para a separação sólido-líquido incluem a centrifugação ou filtração grosseira da solução da reação de sacarificação. Com relação às condições para a centrifugação ou filtração grosseira, métodos normalmente utilizados na arte podem ser usados como estão. Por exemplo, no caso de centrifugação, a mesma pode ser realizada a partir de 500 x g a 10.000 x g. No caso de uma filtração grosseira, a filtração pode ser realizada usando um filtro de aço inoxidável, um filtro de cerâmica, ou uma membrana de filtro de resina, cada uma das quais tendo um tamanho de abertura desde 0,1 μm a 2 mm. Microfiltração usando uma membrana de microfiltração pode ser realizada. Neste caso, membranas de microfiltração com um tamanho médio de poros de 0,01 μm a 10 um são preferencialmente utilizadas. Exemplos de métodos para a microfiltração através de uma membrana de microfiltração incluem filtração por pressão, filtração a vácuo, filtração de fluxo cruzado, e filtração centrífuga. Entre elas, a filtração de fluxo cruzado permite a redução de incrustações de membrana.

[103] No caso de recuperação das enzimas de uma solução, após a separação sólido-líquido, exemplos de métodos incluem, portanto, um método em que uma coluna de resina é usada e um método no qual um dispositivo de membrana é utilizado. Exemplos de método no qual uma coluna de resina é utilizada incluem métodos conhecidos de separação cromatográfica, tais como, cromatografia de permuta iônica, cromatografia de fase inversa de alta velocidade, cromatografia por afinidade, e cromatografia de filtração em gel. Com relação ao dispositivo de membrana, a recuperação pode ser realizada utilizando, por exemplo, um dispositivo de membrana tendo uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de diálise, ou semelhantes. Entre as mesmas, o uso de uma membrana de ultrafiltração, possuindo um tamanho de poro médio de 0,001 μm a 0,01 μm é mais preferido. Existem membranas de ultrafiltração, por exemplo, do tipo de membrana plana, do tipo de múltiplos estágios e do tipo de fibra oca. A ultrafiltração descrita acima pode ser de qualquer destes tipos. No caso do tipo de membrana plana, uma velocidade de filtração apropriada pode ser obtida por aplicação de pressão para o interior do tanque de reação. Gás nitrogênio, gás hélio, ar, ou semelhante, é de preferência utilizado para a aplicação de uma pressão. É preferível instalar um impulsor no tanque de reação de acordo com a necessidade. A agitação do líquido usando um rotor evita as incrustações da superfície da membrana e possibilita a manutenção de uma velocidade de filtração mais favorável. Nos casos do tipo de membrana plana de múltiplos estágios e do tipo de fibra oca, o líquido pode ser fornecido a partir de um tanque de fornecimento de substrato ao tanque de reação utilizando uma bomba, por meio do que uma pressão de filtração apropriada e uma velocidade linear apropriada são mantidas, e uma velocidade de filtração mais favorável pode ser mantida. Exemplos de métodos de filtração incluem um método de membrana imersa, uma método de ultrafiltração, e um método de microfiltração. Filtração por pressão, filtração a vácuo, filtração de fluxo cruzado, filtração centrífuga, e semelhantes podem ser utilizados em ambos o método de ultrafiltração método e o método de microfiltração. Operações de filtração são aproximadamente classificadas em filtração por pressão constante, filtração em fluxo constante, e filtração a uma pressão inconstante e um fluxo inconstante; não havendo limitações particulares nas operações de filtração na invenção. Exemplos do material de membrana utilizado no processo de recuperação da invenção incluem o acetato de celulose, poliamida aromática, álcool polivinílico, polissulfona, fluoreto de polivinilideno, polietileno, poliacrilonitrila, cerâmica, polipropileno, policarbonato e politetrafluoroetileno (Teflon (marca registada)). Entre estes materiais, é mais preferível a utilização de uma membrana obtida de material não celulósico resistente a ácido, tal como poliacrilonitrila ou polissulfona, considerando-se a utilização de uma celulase e reação sob condições ácidas. A solução da reação de sacarificação imediatamente após a sua produção pode ser utilizada como a solução de reação de sacarificação para utilização no processo de recuperação, sem qualquer pré- tratamento, tal como, a separação sólido-líquido. Uma xilanase mutante para reutilização produzida pelo método de produção de um xilanase mutante para reutilização de acordo com a invenção pode ser empregada em diversas utilizações, como no caso da xilanase mutante de acordo com a invenção descrita acima. A xilanase mutante para reutilização é também utilizável no método de produção de um monossacarídeo descrito abaixo.

Método para Produção de Monossacarídeo

[104] Um método para produção de um monossacarídeo de acordo com a invenção inclui: recuperação da xilanase mutante de acordo com a invenção a partir de uma solução de reação de sacarificação contendo um produto sacarificado de lignocelulose obtido pelo método de produção de um produto sacarificado de lignocelulose descrito acima (a recuperação da xilanase mutante doravante será referida como "processo de recuperação"e a solução da reação de sacarificação mencionada acima doravante será referida simplesmente como "solução de reação de sacarificação"); e produção de um monossacarídeo, contatando a xilanase mutante recuperada com uma matéria-prima lignocelulósica (a seguir designado simplesmente como "processo de resacarificação processo"). Deste modo, a xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser utilizada de forma eficaz.

[105] O processo de recuperação descrito acima é aplicado a esse processo de recuperação. No processo de ressacarificação, a matéria-prima lignocelulósica e água são adicionadas à solução de enzima contendo xilanase mutante recuperada, e uma reação de ressacarificação é realizada com agitação enquanto se controla o pH e a temperatura. As condições do pH e a temperatura de reação podem ser as mesma descritas na explicação do método de produção de um produto a partir de uma matéria-prima lignocelulósica sacarificada. No processo de ressacarificação, além da matéria-prima lignocelulósica e água serem alimentadas adicionalmente, um sólido obtido por separação sólido-líquido no processo de recuperação é preferivelmente adicionado. Isto faz com que seja possível utilizar de forma eficaz a celulose não reagida contida no sólido, como um resultado da separação sólido-líquido usando um dispositivo de membrana ou uma coluna de resina, e a xilanase mutante que é adsorvida na lignocelulose que não reagiu. No processo de ressacarificação de acordo com a invenção, tanto a xilanase mutante quanto o produto sólido obtido, como um resultado da separação de sólidos ou ambos, podem ser adicionalmente alimentados.

[106] No método de produção de um monossacarídeo de acordo com a invenção, o processo de recuperação e o processo de ressacarificação podem ser realizados repetidamente. Isto faz com que seja possível reduzir o custo de catalisador durante um período de tempo durante o qual a atividade da xilanase mutante recuperada é mantida. No método de produção de um monossacarídeo de acordo com a invenção, nos casos em que o processo de recuperação e o processo de ressacarificação são repetidos, o xilanase mutante de acordo com a invenção pode ser novamente adicionado ao processo de ressacarificação. A quantidade da xilanase mutante a ser adicionada recentemente não é particularmente limitada, e é de preferência, não mais do que 50% em peso da quantidade da xilanase mutante usada na primeira reação de sacarificação, do ponto de vista econômico. A quantidade do xilanase mutante a ser recentemente adicionada é mais preferivelmente não superior a 20% em peso da quantidade da xilanase mutante utilizada na reação de sacarificação inicial do ponto de vista econômico, e a quantidade da xilanase mutante a ser recentemente adicionada não é de preferência superior a 10% em peso da quantidade da xilanase mutante usada na primeira reação de sacarificação. O monossacarídeo produzido pelo método de produção de um monossacarídeo de acordo com a invenção pode ser qualquer monossacarídeo derivado de lignocelulose. Os exemplos específicos destes incluem glicose, xilose, arabinose, frutose, manose e galactose.

Método de Branqueamento da Celulose

[107] Um método de branqueamento de uma polpa de acordo com a invenção inclui o contato da xilanase mutante com uma polpa. No método de branqueamento de uma polpa de acordo com a invenção, a xilanase mutante descrita acima que funciona de forma estável durante um longo período de tempo, mesmo sob uma condição em que as enzimas inativam facilmente, é usada, e, por conseguinte, o branqueamento pode ser realizado sob uma condição em na qual as enzimas geralmente inativam facilmente e a polpa pode ser branqueada com alta eficiência.

[108] A pasta de papel utilizada no processo de contato da xilanase mutante com uma pasta de papel pode ser uma polpa de madeira ou uma polpa não lenhosa. Exemplos de polpa de madeira incluem aquelas obtidas a partir de madeira macia ou matérias-primas de madeira. Exemplos de celulose não lenhosa incluem aquelas obtidas de matérias- primas como o bagaço, que é um resíduo da cana de açúcar que resta após ser espremida, palha, cânhamo e algodão. Outros exemplos de celulose não lenhosa incluem pasta de resíduos de papel obtida a partir de resíduos de papel, tais como jornais ou revistas. Estas polpas são grosseiramente classificadas em polpas mecânicas obtidas por extração de fibras a partir de uma matéria-prima, utilizando uma força física e pastas químicas obtidas por extração de fibras por tratamento químico. Exemplos de polpas mecânicas incluem polpa tritrurada, polpa triturada em refinador, polpa termomecânica e polpa quimio-termo- mecânica. Exemplos de polpas químicas incluem polpa kraft, polpa alcalina e polpa sulfito.

[109] No processo de contato da xilanase mutante com uma pasta de papel, em adição à xilanase mutante, outra hemicelulase ou lignase pode ser adicionalmente empregada. Isto aumenta o grau de branqueamento da celulose. As origens da hemicelulase e da lignase não são particularmente limitadas, e exemplos de origens incluem fungos filamentosos, basidiomicetos e bactérias.

[110] O método de branqueamento de uma polpa de acordo com a invenção ainda inclui, de preferência, um processo de tratamento de deslignificação e um processo de branqueamento além do processo de contato da xilanase mutante com uma polpa. No presente relatório descritivo, o processo de tratamento de deslignificação pode ser qualquer método que visa eliminar positivamente a lignina da polpa, e métodos que foram praticados no passado podem ser utilizados. Exemplos destes incluem um método descrito na JP - A número 2004-263310.

[111] No presente relatório descritivo, o processo de branqueamento pode ser qualquer processo que executa tratamento clareador na polpa, e o seu âmbito de aplicação abrange geralmente processo visando no, por exemplo, a remoção da lignina remanescente na polpa ou melhoria na brancura da polpa. O processo de branqueamento é um processo que se segue o tratamento de deslignificação e processos e métodos que foram praticados no passado podem ser utilizados. Exemplos dos mesmos incluem um método descrito na JP-A Número 2010-1594.

[112] Nos casos em que o processo de contatar a xilanase mutante de acordo com a invenção com uma pasta é realizada em combinação com o processo de tratamento de deslignificação e o processo de branqueamento, o processo de contato da xilanase mutante com uma pasta de papel pode ser realizado em qualquer ponto no tempo durante os processos do processo de tratamento de deslignificação e o processo de branqueamento. Especificamente, o processo de contato da xilanase mutante com uma polpa de celulose pode ser realizado antes ou depois do processo de tratamento de deslignificação, antes ou depois do processo de branqueamento. Alternativamente, o processo de contatar a xilanase mutante com polpa de celulose pode ser realizado em simultâneo com o processo de tratamento de deslignificação ou processo de branqueamento. De preferência, o processo de contatar a xilanase mutante de acordo com a invenção com uma polpa é realizado como parte do processo de branqueamento. Em particular, do ponto de vista de permitir que a capacidade da xilanase mutante de acordo com a invenção de ser exercida em sua totalidade, o processo de contatar a xilanase mutante com uma polpa de celulose é mais preferencialmente realizado em uma fase do processo de branqueamento a qual o teor de lignina é pequeno.

[113] Alternativamente, o processo de contatar a xilanase mutante com uma polpa de celulose pode também ser utilizado, por exemplo, como uma parte do processo de branqueamento em que, dentre os processos de branqueamento descritos acima, o branqueamento químico é realizado com utilização de cloro, dióxido de cloro, dióxido de nitrogênio, hipoclorito, oxigênio, peróxido de hidrogênio, ozônio ou semelhantes.

Detergente

[114] Um detergente de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima e pode incluir ainda outros componentes, conforme necessário. O detergente de acordo com a invenção apresenta um melhor desempenho devido à inclusão da xilanase mutante, que exibe uma atividade estável mesmo sob condições severas, em que as enzimas facilmente inativam.

[115] O âmbito de aplicação do detergente de acordo com a invenção abrange vários detergentes, tais como, detergentes para lavagem de roupa e detergentes para máquinas de lavar louça automática. O detergente de acordo com a invenção pode ser utilizado como detergente para uso doméstico e uso industrial. O detergente de acordo com a invenção também é utilizado como um modificador de produtos para fibras de roupa. Quando o detergente de acordo com a invenção é utilizado como um modificador de produto para fibras de roupa, o produto para fibra de roupa ao qual o detergente é aplicado pode ser, por exemplo, fibras de algodão, fibras de cânhamo, fibras contendo celulose, tais como o raiom ou tencel.

[116] O detergente de acordo com a invenção pode incluir ainda outras enzimas além da xilanase mutante, de acordo com as utilizações. As enzimas conhecidas na arte podem ser usadas como as outras enzimas. Exemplos das mesmas incluem protease, celulase, amilase e lipase. As origens de outras enzimas não são limitadas, e os seus exemplos incluem fungos filamentosos, basidiomicetos e bactérias.

[117] O detergente de acordo com a invenção também pode incluir componentes, com exceção das outras enzimas acima mencionadas, que são normalmente utilizadas em detergentes, cujos exemplos incluem agentes tensoativos, auxiliares de limpeza, agentes de branqueamento e agentes fluorescentes. Exemplos dos agentes tensoativos incluem agentes tensoativos aniônicos, não iônicos, anfotéricos e catiônicos. Exemplos de agente tensoativo incluem agentes tensoativos aniônicos, não iônicos, anfotéricos e catiônicos. Agentes tensoativos aniônicos e agentes tensoativos não iônicos são preferidos. Exemplos de agentes tensoativos aniônicos incluem sais de sódio de ácidos graxos (sabão), éster do ácido graxo α-sulfonado sódio, alquil benzeno sulfonato de sódio alquila linear (LAS), alquil sulfato de sódio (AS), alquil éter sulfato de sódio (AES), alfa-olefina sulfonato de sódio (AOS) e alquil sulfonato de sódio. Exemplos de agentes tensoativos não iônicos incluem éter alquil polioxialquileno (AE), alquil fenil éter de polioxietileno (APE), ésteres de ácidos graxos de sal de sacarose, ácidos graxos de ésteres sorbitano, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano, ésteres de ácidos graxos de polioxietileno, e amidas alcanol.

[118] Exemplos de auxiliares de limpeza incluem tampões alcalinos, sequestrantes de íons de metal bivalente, e agentes anti-redeposição. Os exemplos específicos destes incluem os polifosfatos, tais como tripolifosfato e pirofosfato, aluminossilicatos, tais como um tipo de zeólitos, carbonatos, tais como carbonato de sódio, sesquicarbonato de sódio, e carbonato de hidrogênio sódio, polímeros tais como polietileno-glicol, polímeros à base de ácido carboxílico, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, e sais de ácido de poliglicidila, derivados de celulose tais como carboximetil celulose, e polímeros à base de ácidos aminocarboxílicos como o ácido poliaspártico.

[119] Exemplos de agentes de branqueamento incluem hipoclorito de sódio, dicloroisocianuratos, clorito de sódio, peróxido de hidrogênio, percarbonato de sódio, perborato de sódio, ácido peracético, hidrossulfito e dióxido de ácido tioúrico. Exemplos dos agentes fluorescentes incluem derivados do ácido bis- (triazinilamino)estilbeno dissulfônico e derivados de bis- estiril bifenila.

[120] O detergente de acordo com a invenção pode ser combinado com o agente tensoativo, auxiliar de limpeza, agente de branqueamento, agente fluorescente ou semelhante, e produzido de acordo com métodos comuns. A forma do detergente pode ser selecionada em conformidade com os usos, e pode ser, por exemplo, líquida, em pó, grânulos, pasta ou sólido.

Ração Animal

[123] A ração animal de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima e pode incluir ainda outros componentes, conforme necessário. A ração de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante que exibe atividade estável mesmo em condições severas em que enzimas facilmente inativam. Como resultado, a eficiência da absorção de nutrientes de plantas, em animais que tenham consumido a ração animal de acordo com a invenção é melhorada, e a digestibilidade dos mesmos no estômago dos animais também é melhorada, devido à decomposição de fibras vegetais abundantes na ração animal. O conteúdo da xilanase mutante na alimentação animal de acordo com a invenção deve ser uma quantidade capaz de melhorar a digestibilidade da ração no estômago dos animais, mas o conteúdo não é particularmente limitado em outros aspectos.

[124] Exemplos de rações para animais incluem rações prontas contendo xilana e grãos. Entre os cereais, trigo, milho, centeio, cevada, aveia, triticale, arroz e sorgo são particularmente preferidos.

[125] A xilanase mutante na ração animal de acordo com a invenção pode ser utilizada em combinação com outros aditivos para a alimentação animal e/ou outras enzimas. Exemplos de outros aditivos incluem aditivos vitamínicos, aditivos minerais para a alimentação, aditivos de aminoácidos, e os agentes de proteção permeável. Exemplos de outras enzimas incluem a celulase, amilase e protease. As origens destas enzimas não são limitadas e as enzimas derivadas de fungos filamentosos, basidiomicetos, bactérias ou semelhantes podem ser utilizadas.

[126] A ração animal de acordo com a invenção é utilizável para uma ampla variedade de animais. Como exemplos preferíveis de animais estão incluídos aves de capoeira, tais como galinhas, perus, patos e gansos, os ruminantes, como vacas, cavalos e ovelhas, javalis e porcos, roedores, tais como coelhos e peixes.

[127] A ração animal de acordo com a invenção pode ser produzida por qualquer método desde que a alimentação animal inclua a xilanase mutante e o método para produzir a ração animal não seja particularmente limitado. A adição da xilanase mutante na ração animal pode ser realizada em qualquer fase selecionada a partir de antes da produção da ração animal, durante a produção da ração animal, ou na fase final da produção da ração animal. A xilanase mutante pode ser diretamente adicionada a uma ração animal pronta que foi conformada em esferas ou uma forma de massa. Alternativamente, a xilanase mutante pode ser incorporada a uma ração para animais por ser adicionada diretamente em água potável.

Modificador para Panificação

[128] Um modificador de panificação de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima, e pode incluir ainda outros componentes, conforme necessário. O modificador para panificação de acordo com a invenção inclui a xilanase mutante descrita acima, a qual exibe uma atividade estável mesmo sob condições severas, em que as enzimas facilmente inativam. Devido à inclusão de xilanase mutante, o modificador para panificação de acordo com a invenção apresenta uma atividade estável, mesmo durante o processo de fermentação na fabricação de pão, a qual é realizada de 35°C a 40°C durante 1 hora a 2 horas, pelo que hemicelulose contida na farinha pode ser decomposta, e a qualidade de fabricação do pão pode ser modificada.

[129] O modificador para panificação de acordo com a invenção pode incluir outros modificadores de panificação, em adição à xilanase mutante. Exemplos de outros modificadores de panificação incluem monoglicerídeos, monoglicerídeos de ácidos orgânicos, ésteres de ácido graxo de glicerina, ésteres de ácidos graxos de propileno glicol, ésteres sorbitano de ácidos graxos, fosfolipídeos de ácido ascórbico e seus derivados, ácidos orgânicos, aminoácidos e sais.

[130] Com relação ao tipo de pão ao qual o modificador para panificação de acordo com a invenção deve ser adicionado, o pão pode ser qualquer alimento que seja produzido através da mistura de ingredientes para pão e amassamento posterior, fermentação, conformação do pão e assim por diante. Exemplos dos mesmos incluem, além de pão branco, pão especial, pão recheado, pão doce, pão cozido no vapor, panquecas e bolinhos. Exemplos de ingredientes para estes pães incluem farinha, teor de água e produtos lácteos, fermento, açúcar, sal comum além de óleos e gorduras (como gordura, banha de porco, margarina, manteiga e óleo líquido). Se necessário, ovos, temperos (como os ácidos glutâmico e ácidos nucleicos), fermento em pó, aromas, ou outros semelhantes também podem ser adicionados. Nos casos em que farinha é uma matéria-prima principal, farinha de centeio, farinha de arroz, ou outros semelhantes também podem ser usados em combinação com a farinha. No presente relatório descritivo, o termo "massa", significa um material obtido por mistura e amassamento dos ingredientes do pão mencionados acima.

[131] Os métodos para a produção de pão podem ser métodos comumente usados que incluem um processo de fermentação, sem limitações específicas. Por exemplo, um método de massa direta, um método de esponja e massa, e um método de pré-fermentação e massa podem ser usados. Para o processo de fermentação, podem ser usados métodos comumente usados. O processo de fermentação é realizado, preferencialmente, a partir de 35°C a 40°C, durante 1 hora e 2 horas desde que o tempo de fermentação possa ser encurtado por ajuste da temperatura de fermentação relativamente elevado, em comparação com a temperatura ambiente.

[132] O modificador de panificação de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, misturado na forma de pó com uma matéria-prima tal como farinha de trigo, ou dissolvido na água antes da sua utilização, ou adicionado como em pó ou líquido a uma determinada fase do processo. Embora as modalidades da invenção sejam descritas acima, estas formas de realização são meros exemplos da invenção, e várias configurações, diferentes das descritas acima, também podem ser empregadas.

EXEMPLOS

[133] A invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos que se seguem. No entanto, a invenção não está de forma alguma limitada aos exemplos abaixo. As porcentagens que indicam as quantidades dos componentes incluídos nas composições dos exemplos são porcentagens em peso, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1: Método de Medição da Atividade da Xilanase (Ensaio padrão)

[134] A quantidade de açúcares de redução liberados a partir da hidrólise de xilano foi medida pelo método DNS (Bailey e outros, 1992), para determinar a atividade de xilanase. O substrato utilizado para a avaliação foi um sobrenadante preparado por mistura vigorosa em conjunto uma solução tampão de citrato de sódio 100 mM (pH 4,5) com 1% (peso/peso) de xilano de bétula (fabricada por Sigma - Aldrich Corporation), seguido de centrifugação a 5.000 x g durante 15 minutos. A xilanase foi misturada com esta solução de substrato, tal que a quantidade de xilanase foi de 0,1% (peso/peso) de que a solução de substrato, e a reação foi deixada prosseguir com agitação a 45°C durante 30 minutos. A quantidade de açúcares de redução na solução de reação resultante foi medida, para determinar a atividade da xilanase. Exemplo 2: Produção de Xilanase Mutante por Mutagênese Direcionada ao Sítio e Avaliação da Mesma (1) Construção de vetores de expressão: YEp-GAPDHp - GAs-TVX e YEp-GAPDHp-GAs-ACX (a) Obtenção de Sequência Promotora

[135] Utilizando uma sequência de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae como modelo, um sequência promotora (número de acesso ao GenBank: A35397.1) de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (doravante referida como "GAPDH") foi obtida por PCR. As sequências iniciador utilizadas na PCR estão apresentadas como SEQ ID NOs: 55 e 56 na Tabela 4 abaixo. (b) Obtenção da Sequência de Sinal

[136] Utilizando uma sequência de DNA genômico de Rhizopus oryzae como um modelo, uma sequência de sinal de um gene da glucoamilase (Número de Acesso ao GenBank: D00049.1) foi obtida por PCR. As sequências iniciador utilizadas na PCR estão apresentadas como SEQ ID NOs 57 e 58 na Tabela 4 abaixo. (c) Ligação da Sequência Promotora e Sequência de Sinal

[137] As sequências de DNA amplificado por PCR foram purificadas utilizando uma solução de fenol/clorofórmio e recuperadas através de precipitação com etanol. A sequência promotora purificada e sequência de sinal foram digeridas com uma enzima de restrição BglII e posteriormente individualmente submetida a eletroforese em agarose, e os fragmentos de DNA desejados foram incluídos em separado e purificado. Os fragmentos assim obtidos foram ligados utilizando uma DNA ligase (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd). O produto ligado é doravante abreviado como "GAPDHp- GAS". (d) Amplificação de Gene de Xilanase II Derivada de T. viride

[138] Utilizando uma sequência de DNA genômico de T. viride como um modelo, o comprimento total de um gene de xilanase II derivado de T. viride (uma sequência de bases codificando o gene de xilanase, assim como uma sequência sinal de secreção) foi obtido por PCR. As sequências iniciador utilizadas na PCR são apresentadas como SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO 60 na Tabela 4 abaixo. A sequência obtida é apresentada como SEQ ID NO: 74 na Listagem de Sequências. (e) Amplificação do Gene de Xilanase Derivada de A. cellulolyticus

[139] Utilizando uma sequência de DNA genômico de A. cellulolyticus como um modelo, o comprimento total de um gene de xilanase derivada de A. cellulolyticus (uma sequência de bases codificando o gene da xilanase, bem como uma sequência de sinal de secreção) foi obtido por PCR. As sequências iniciador utilizadas na PCR são apresentadas como SEQ ID NOs : 61 e 62 na Tabela 4 abaixo. A sequência obtida está apresentada como SEQ ID NO: 75 na Listagem de Sequências.

[140] (f) Ligação da sequência Promotora, sequência de Sinal e gene de xilanase

[141] Usando uma xilanase II derivada de T. viride obtido em (d) como um modelo, a sequência de base codificando o gene de xilanase, excluindo a sequência de sinal, foi obtida por PCR. Os iniciadores utilizados na PCR são apresentados como SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO 64 na Tabela 4 abaixo. Após isso, o fragmento obtido foi purificado e digerido com uma enzima de restrição SacI, e depois ligado ao fragmento GAPDHp-GAS. O produto de ligação será doravante abreviado para "GAPDHp-GAS-TVX". Semelhante ao acima, também em relação à xilanase I derivada de A. cellulolyticus obtida em (e), o gene na porção de proteína de secreção da mesma foi obtida por PCR, e, após purificação, digerido com uma enzima de restrição SacI e ligado ao fragmento GAPDHp-GAs. O produto de ligação será abreviado doravante como "GAPDHp-GAs-ACX". Os iniciadores utilizados na PCR são apresentados como SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO 66 na Tabela 4 abaixo. No presente documento, os métodos para a purificação e ligação de fragmentos de DNA, nesta etapa são os mesmos como aqueles na etapa (c). (g) Introdução ao Vetor de Expressão

[142] O fragmento GAPDHp-GAs-TVX e um vetor de expressão de multicópia YEp24 (ATCC 7769) para obtenção de levedura foram digeridos com as enzimas de restrição XmaI e BamHI (o primeiro produzindo um fragmento de cerca de 1,3 kpb e o último produzindo de um fragmento de cerca de 7,4 kpb), e, após purificação, ligados um ao outro para obter um plasmídeo para a produção de uma xilanase mutante II derivada de T. viride (doravante abreviado como YEp-GAPDHp -GAs-TVX). Semelhante ao acima, os fragmentos GAPDHp-GAs- ACX e YEp24 foram digeridos com as enzimas de restrição XmaI e BamHI (o primeiro produzindo um fragmento de cerca de 1,5 kpb e o último produzindo um fragmento de cerca de 7,4 kpb), e, após purificação, ligados uns aos outros para obter um vetor de expressão para a produção de uma xilanase mutante I derivada de A. cellulolyticus (doravante abreviado como YEp-GAPDHp-GAs-ACX). Os métodos para a purificação e ligação dos fragmentos de DNA nesta etapa são os mesmos que os da etapa (c). O YEp24 está disponível na American Type Culture Collection, que é um banco de células e microrganismos. Tabela 4

(2) Mutagênese direcionada ao Sítio

[143] Os mutantes utilizados nos exemplos da invenção tinham mutações introduzidas utilizando um kit de Mutagênese in vitro LA PCR fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. e usando os vetores de expressão construídos na etapa (1) como modelos. Os iniciadores utilizados eram oligonucleotídeos sintetizados. A PCR foi realizada utilizando o vetor de expressão YEp-GAPDHp-GAs-TVX como um modelo e utilizando as SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO 10 e SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO 12, que são fornecidas na Tabela 5 abaixo, como iniciadores, para obter um vetor de expressão de xilanase mutante YEP-GAPDHp-GAs-TVX01. Além disso, utilizando o vetor de expressão YEp-GAPDHp-GAs-ACX como um modelo e usando as sequências de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO 22, que são apresentadas na Tabela 5 abaixo, como iniciadores, YEp-GAPDHp-GAs-L154M foi obtido e apresentando um resíduo de aminoácido substituído que era uma metionina substituída por um resíduo de leucina na posição 154 da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências. Semelhante ao anterior, YEp-GAPDHp-GAs-ACX01 foi obtido através do vetor de expressão YEp-GAPDHp-GAs-ACX como modelo e utilizando as sequências de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO 14, sequências de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO 16, sequências de SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO 18, sequências de SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO 20, sequências de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO 22, sequências de SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO 24, sequências de SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO 26, as sequências de SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO 28, e as sequências de SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO 30, as quais são apresentadas na Tabela 5 abaixo, como iniciadores.

[144] Semelhante ao anterior, YEp-GAPDHp-GAs-ACX02 foi obtido através do vetor de expressão YEp-GAPDHp-GAs-ACX como modelo e utilizando as sequências SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO 16, sequências de SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO 22, sequências de SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO 32, e as sequências de SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO 34, as quais são apresentadas na Tabela 5 abaixo, como iniciadores.

[145] Semelhante ao anterior, YEp-GAPDHp-GAs-ACX03 foi obtido através da vetor de expressão YEp-GAPDHp-GAs-ACX como modelo e utilizando as sequências da SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO 22, sequências de SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO 32, sequências de SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO 36, sequências de SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO 38, e sequências de SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO 40, que são apresentadas na Tabela 5 abaixo, como iniciadores. As células competentes de Escherichia coli HB101 (fabricadas por Toyobo Co., Ltd.) foram transformadas com os plasmídeos que continham as xilanases mutantes para obter transformantes. Os plasmídeos foram preparados a partir das células bacterianas utilizando um método de extração alcalina - SDS, e as sequências de base das porções dos genes de xilanase dos mesmos foi determinada usando um sequenciador de DNA, como resultado de que foi confirmada a introdução de substituições de aminoácidos na região de codificação do gene de xilanase de cada um dos YEp-GAPDHp-GAs-TVX e YEP-GAPDHp-GAs-ACX, que são modelos. Tabela 5

(3) Transformação em Leveduras e Produção de Xilanase Mutante

[146] As células competentes de Saccharomyces cerevisiae BY4741 foram transformadas com os vetores de expressão contendo xilanase mutante construídos na etapa (2) utilizando um kit de transformação rápida em levedura (G-Biosciences) e cultivadas em um meio ágar SD-Ura (0,67% Base de levedura-nitrogênio sem aminoácidos (Difco Co., Ltd.), 2% de glicose, 0,5% de ácido casamínico, 0,077% Suplemento Ura DO (Clontech Co., Ltd.), 2% de ágar e água deionizada) a 30°C para 48 horas. Os mutantes resultantes são listados na Tabela 6. Tabela 6

(4) Avaliação da Estabilidade das Xilanases Mutantes

[147] A colônia obtida foi inoculada em meio líquido SD-Ura (a composição do meio sendo a mesma que a composição do meio acima mencionado, exceto que o conteúdo de glicose foi 4%, o ágar não foi contido, e o meio SD-Ura era um meio líquido), e foi submetida a um pré-cultivo a 30°C durante 24 horas. Depois disso, a pré-cultura resultante foi inoculada em uma quantidade de 2%, e submetida à cultura principal durante 48 horas. Em seguida, o sobrenadante, que continha a xilanase mutante foi centrifugado e em seguida, submetido a um tratamento térmico de 50°C a 55°C, e a atividade residual da enzima foi medida de acordo com o método de medição descrito no Exemplo 1.

TVX01

[148] A xilanase mutante produzida pelo método descrito na etapa (2) do Exemplo 2 foi submetida ao tratamento térmico a 50°C durante um período de tempo variando de 0 hora a 72 horas, e então medida com relação à atividade residual, utilizando para tal o método de medição descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 7. O WT símbolo representa o tipo selvagem e os símbolos F, G, S, e R representam, respectivamente, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências, a substituição de um resíduo de tirosina na posição 27 por fenilalanina, a substituição de um resíduo de asparagina na posição 29 por um resíduo leucina, substituição de um resíduo de asparagina na posição 44 por um resíduo de serina, e substituição de um resíduo de lisina na posição 58 por um resíduo de arginina. Para a produção de uma xilanase mutante (Tabela 7 (e)) em que um resíduo de tirosina na posição 27 foi substituído por um resíduo de fenilalanina, foram utilizados os iniciadores das SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO 42 indicados na Tabela 8. Tabela 7

Tabela 8

[149] As xilanases mutantes em um resíduo de aminoácido específico ou resíduos de aminoácido específicos foram substituídas por resíduos de aminoácidos substitutos que se acredita forneçam estabilização contra o calor e descritos no documento WO 2007/115391, documento WO 2001/27252, e documento WO 2005/108565 completamente inativados após 24 horas, conforme demonstrado nas linhas (d), (f) e (h) da Tabela 7. Além disso, como mostrado nas linhas (e) e (g) da Tabela 7, a xilanase mutante com um resíduo aminoácido substituto que é um resíduo de tirosina substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27 ou a xilanase mutante possuindo um resíduo de aminoácido substituto que é um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 44 também completamente inativado depois de 24 horas.

[150] No entanto, no caso da xilanase mutante com substituição de resíduos de aminoácidos que é um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29 e um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58 (linha (d), na Tabela 7), uma nova substituição de um resíduo de tirosina na posição 27 por um resíduo de fenilalanina resultou em uma melhoria na atividade residual e provisão de uma atividade residual de 50% ou mais, mesmo depois de 72 horas (linha (c) na Tabela 7). Além disso, a substituição de um resíduo de asparagina na posição 44 dessa xilanase mutante por um resíduo de serina resultou na disponibilização de uma atividade próxima a do tipo selvagem (linha (a) na Tabela 7) e uma atividade residual de 70%, mesmo após 72 horas (linha (b) da Tabela 7). Muitos dos mutantes que incluem os quatro sítios de mutação de acordo com a invenção tinham propriedades quase equivalentes as do TVX01. Exemplos específicos desses mutantes incluem mutantes que incluem os quatro sítios de mutação, bem como incluem, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências, a substituição de um resíduo de glicina na posição 47 por um resíduo de cisteína, a substituição de um resíduo de glutamina na posição 52 com um resíduo de lisina, a substituição de um resíduo de valina na posição 59 por um resíduo de isoleucina, substituição de um resíduo de asparagina na posição 67 por um resíduo de ácido aspártico, substituição de um resíduo de asparagina na posição 69 por um resíduo de isoleucina, substituição do resíduo de serina na posição 80 por um resíduo de alanina, substituição de um resíduo de asparagina na posição 97 por um resíduo de ácido aspártico, a substituição de um resíduo de leucina na posição 105 por um resíduo metionina, substituição de um resíduo de treonina na posição 109 por um resíduo de alanina, substituição de um resíduo de treonina na posição 120 por um resíduo de arginina, substituição de um resíduo de treonina na posição 143 por um resíduo de isoleucina, a substituição de um resíduos de asparagina na posição 151 por um resíduo de serina, substituição de um resíduo de serina na posição 161 por um resíduo de leucina, ou substituição de um resíduo de serina na posição 186 por um resíduo de treonina resíduo.

L154M

[151] Usando o método descrito na etapa (3) no Exemplo 2, a levedura foi transformada com o vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado pela sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos de uma xilanase mutante, e que foi produzida pelo método descrito em a etapa (2) do Exemplo 2. A levedura que produz a xilanase mutante foi submetida a cultivo em líquido. O sobrenadante da solução de cultura foi submetido ao tratamento térmico a 50°C durante 24 horas, e, em seguida, a atividade residual foi medida pelo método de medição descrito no Exemplo 1. A atividade residual da xilanase mutante foi de 50%. A xilanase mutante também exibiu uma taxa inicial de reação antes do tratamento térmico que é 1,13 vezes maior que aquela do tipo selvagem.

ACX01, ACX02, e ACX03

[152] Usando o método descrito na etapa (3) do Exemplo 2, a levedura foi transformada com o vetor de expressão que inclui um ácido nucleico representado pela sequência de bases codificando a sequência de aminoácidos de uma xilanase mutante, e que foi produzida pelo método descrito em a etapa (2) do Exemplo 2. A levedura que produz a xilanase mutante foi submetida ao cultivo em líquido. O sobrenadante da solução de cultura foi submetido ao tratamento térmico a 50°C durante um período de tempo variando de 0 a 48 horas, e, em seguida, a atividade residual foi medida pelo método de medição descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 9. Na Tabela 9, WT representa o tipo selvagem. O meio líquido utilizado no presente processo é um meio SD (sem Ura), que continha 4% de glicose. Tabela 9

[153] A xialanase derivada de A. cellulolyticus do tipo selvagem completamente inativada após tratamento térmico durante 16 horas (linha (i) na Tabela 9). Em contraste, as xilanases mutantes exibiram uma melhora na atividade residual, e as xilanases mutantes exibiram uma atividade residual de 50% ou mais elevada, mesmo após 48 horas (linhas (j), (k) ou (l) da Tabela 9). ACX02 e ACX03 (linhas (k) e (l) na Tabela 9) também exibiram velocidades iniciais de reação antes do tratamento térmico que são quase equivalentes às da xilanase do tipo selvagem, e ACX01 exibiu uma atividade cerca de duas vezes tão elevada quanto à da xilanase do tipo selvagem (linha (j) na Tabela 9). Muitos dos mutantes que apresentam todos os sítios de mutação contidos em ACX01 exibiram propriedades quase equivalentes às de ACX01. Os exemplos específicos de mutantes incluem mutantes que compreendem os sítios de mutação contidos em ACX01, e inclui ainda, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequências, a substituição de um resíduo de serina na posição 133 por um resíduo de asparagina e substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 por um resíduo de arginina. Semelhante ao acima, no caso de ACX02, muitos dos mutantes com todos os sítios de mutação contidos em ACX02 apresentam propriedades quase equivalentes às de ACX02. Exemplos específicos de mutantes incluem um mutante que inclui os sítios de mutação contidos em ACX02, e incluem ainda, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência, a substituição de um resíduo de treonina na posição 90 por um resíduo de serina, a substituição de um resíduo de glutamina na posição 132 por um resíduo de arginina, a substituição de um resíduo de serina na posição 133 por um resíduo de asparagina, a substituição de um resíduo de serina na posição 174 por um resíduo de treonina, a substituição de um resíduo de prolina na posição 195 por um resíduo histidina, substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 por um resíduo de arginina, a substituição de um resíduo de serina na posição 197 por um resíduo de asparagina, e substituição de um resíduo glicina na posição 217 por um resíduo de ácido glutâmico. Além disso, muitos dos mutantes que incluem todos os sítios de mutação contidos em ACX03 apresentam propriedades quase equivalentes às de ACX03. Os exemplos específicos de mutantes incluem um mutante que inclui todos os sítios de mutação contidos em ACX03, e ainda inclui a substituição de um resíduo de glutamina na posição 176 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 na Listagem das Sequências, com um resíduo de arginina.

Exemplos Comparativos

[154] Sabe-se que a introdução de mutações para melhorar a resistência ao calor de uma enzima geralmente diminui largamente a taxa inicial de reação, ou inativa completamente a enzima. Também neste pedido, verificou-se que os mutantes obtidos exibiram diminuição da taxa inicial de reação, na maioria dos casos, embora a resistência ao calor tenha sido melhorada. Um exemplo disso é fornecido na Tabela 10, na qual WT representa tipo selvagem e MT representa um mutante. Estes mutantes foram produzidos utilizando a técnica descrita na etapa (2) no Exemplo 2. MT1 foi obtido usando o plasmídeo YEp-GAPDHp-GAs-TVX como um modelo e usando as sequências da SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO 44, sequências de SEQ ID NO: 45 56 e SEQ ID NO 46, e as sequências de SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO 48, que são fornecidas na Tabela 11 abaixo, como iniciadores. MT2 foi obtido usando o plasmídeo YEp-GAPDHp-GAs-TVX como um modelo e usando as sequências de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO 8, sequências de SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO 48, e sequências de SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO 50, que são fornecidas na Tabela 11 abaixo, como iniciadores. MT3 foi obtido usando o plasmídeo YEp-GAPDHp-GAs-ACX como um modelo e usando as sequências SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO 52 e as sequências de SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO 54, que estão apresentadas na Tabela 11 abaixo, como iniciadores.

[155] Os sítios de mutação de MT1 na Tabela 10 indicam que, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências, um resíduo de fenilalanina é substituído por um resíduo de tirosina na posição 13 (Tyr13Phe), um resíduo de cisteína é substituído por um resíduo de glicina na posição 47 (Gly47Cys), e um resíduo de serina é substituído por um resíduo de asparagina na posição 151 (Asn151Ser). Os sítios de mutação de MT2 indicam que, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências, um resíduo de isoleucina é substituído por um resíduo de valina na posição 46 (Val46Ile), um resíduo de lisina é substituído por um resíduo de arginina na posição 58 (Lys58Arg), e um resíduo de serina é substituído por um resíduo de asparagina na posição 151 (Asn151Ser).

[156] Os sítios de mutação de MT3 indicam que, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequências, um resíduo de cisteína é substituído por um resíduo de serina na posição 100 (Ser100Cys), e um resíduo de cisteína é substituído por um resíduo de asparagina na posição 144 (Asn144Cys). Tabela 10

Tabela 11

Exemplo 3: Produção em Massa de TVX01 e ACX02 Usando T. viride como Hospedeiros (1) Produção em Massa de TVX01 usando T. viride (a) Construção do plasmídeo TVX01-pCB1

[157] Usando a sequência de bases codificando o xilanase mutante TVX01 obtida no Exemplo 2 como um modelo, a sequência de DNA da porção de xilanase foi obtida por PCR. Os iniciadores utilizados na PCR foram apresentados como SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68 na Tabela 12 abaixo. Usando o comprimento total do gene da xilanase derivada de T. viride obtida na etapa (1) (d) no Exemplo 2 como um modelo, a sequência de DNA da porção de sinal foi obtida por PCR. Os iniciadores utilizados na PCR são apresentados como SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 70 na Tabela 12 abaixo. A sequência de DNA da porção da sequência de sinal e a sequência de DNA da porção de xilanase foram ligadas em conjunto, utilizando um método de PCR, para se obter uma sequência que inclui sítio StuI em uma sequência a montante do códon de início da porção da sequência de sinal e sítio XhoI de uma sequência a jusante do códon de parada. Os iniciadores utilizados na PCR são apresentados como SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO 72 em Tabela 12 abaixo. O fragmento de 0,7 kpb de DNA amplificado foi inserido dentro de uma vetor de expressão pCR2.1-TOPO utilizando um kit de clonagem TOPO TA (fabricado pela Invitrogen Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexo ao kit, como resultado disso um plasmídeo TOPO-TVX01 foi obtido. Tabela 12

[158] O plasmídeo TOPO-TVX01 foi clivado com StuI e XhoI, para obter um fragmento de gene TVX01-N apresentando cerca de 0,7 kbp. Separadamente, o PCB1-Eg3X - hphless (documento WO 2011/021616) foi clivado com StuI e XhoI, e um fragmento que apresenta um comprimento de cerca de 7 kbp foi recuperado. O fragmento recuperado foi ligado ao fragmento do gene TVX01-N com um comprimento de cerca de 0,7 kpb utilizando uma DNA ligase (fabricada pela Takara Shuzo Co., Ltd.), para produzir um plasmídeo TVX01-PCB1. Em relação às condições de reação para a enzima e outros semelhantes, as condições especificadas no manual de instruções que acompanha o kit foram adotadas. O plasmídeo TVX01-PCB1 foi construído de forma a expressar TVX01 usando seu próprio códon de iniciação no hospedeiro T. viride. (b) Produção do transformante de T. viride Usando Plasmídeo TVX01-PCB1

[159] A transformação de T. viride com o plasmídeo TVX01-PCB1 obtido na etapa (1) (a) no Exemplo 3 foi realizada de acordo com o método descrito no documento WO 2011/021616. A transformação foi realizada de acordo com um método de co-transformação com T. viride cepa 2, que é uma cepa que não possui genes da biossíntese de uracila (pyr4), como um hospedeiro e um gene pyr4 de Neurospora crassa como um marcador de seleção. A cepa 2 de T. viride pode ser obtida de acordo com a um método apresentado no parágrafo número [0102] do relatório descritivo da Patente Japonesa número 4.644.603. Especificamente, como descrito no parágrafo [0102] do relatório descritivo da Patente Japonesa número 4644603, uma suspensão de esporos de Trichoderma viride cepa MC300-1(FERM BP-6047) em cerca de 109CFU/mL foi irradiada, enquanto em agitação suave, com radiação emitida a partir de duas lâmpadas de UV colocadas a uma altura de 30 cm. A suspensão de esporos após a irradiação UV foi aplicada a um meio de seleção e foi cultivada durante 7 dias a 28°C. A cepa que cresceu foi selecionada, obtendo assim T. viride cepa 2 como uma cepa exigindo uracila de Trichoderma viride. O meio de seleção teve uma composição de um meio mínimo de 0,2% di- hidrogenofosfato de potássio, 0,4% sulfato de amônio, 0,03% de ureia, 0,03% de sulfato de magnésio hepta-hidrato, 0,03% de cloreto de cálcio, 0,5% de glicose, 2,5% de ágar e 0,01% de elementos de traço (preparado por dissolução de 5 mg de sulfato de ferro hepta-hidratado, 1,56 mg de sulfato de manganês hepta-hidrato, hepta-hidrato de sulfato de zinco a 1,4 mg, e 2 mg de cloreto de cobalto em 1 L de água) suplementado com 10 μg/mL de uridina e de 1 mg/mL de ácido 5-fluorótico. A cepa 2 de T. viridefoi suspensa em uma solução de enzima de formação de protoplastos (1 mg/mL β- glicuronidase, 0,3 mg/mL de quitinase, 0,3 mg/mL de Zymolyase, e 0,5 mol/L de sacarose), para fornecer protoplastos dos micélios. A suspensão obtida foi filtrada e centrifugada e posteriormente lavada com uma solução tampão de SUTC (0,5 mol/L de sacarose, 10 mmol/L de cloreto de cálcio, e 10 mmol/L Tris - HCl (pH 7,5)).

[160] Os protoplastos foram suspensos em 100 mL de uma solução tampão de SUTC, e, em seguida, uma solução de DNA em uma quantidade de 10 mL que continha 10 μg do plasmídeo TVX01-PCB1 e uma solução de DNA em uma quantidade de 10 mL que continha o gene pyr4 foram adicionadas. A mistura resultante foi deixada em repouso em gelo durante 5 minutos. Em seguida, 400 mL de uma solução de PEG (que contém PEG4000 a 60%, 10 mmol/L de cloreto de cálcio e 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7,5)) foram adicionados a mesma e deixados em repouso em gelo durante 20 minutos. Em seguida, uma solução tampão em uma quantidade de 10 mL foi adicionada, e a mistura resultante foi centrifugada. Os protoplastos recolhidos foram suspensos em 1 mL de solução tampão de SUTC, e porções de 200 μL do mesmo foram sobrepostas individualmente, juntamente com ágar mole, em um meio mínimo que continha 0,5 mol/L de sacarose. Após o cultivo a 28°C por 5 dias, colônias que cresceram foram inoculadas novamente em um meio mínimo, e as colônias formadas no seu interior foram utilizadas como transformantes.

(c) Cultivo e Identificação de Transformante que foi Transformado com TVX01-PCB1

[161] As cepas que cresceram em meio mínimo, após a introdução do plasmídeo TVX01-PCB1 foram selecionadas e cultivadas de acordo com um método descrito no documento WO 98/11239. A solução de cultura obtida foi centrifugada para separar o sobrenadante da cultura a partir das células microbianas e o sobrenadante de cultura passou através de um filtro (tamanho de poro : 0,2 μm) para filtração e esterilização, preparando-se assim uma solução sobrenadante de cultura. A solução sobrenadante de cultura preparada foi separada por eletroforese usando GEL SDS-PAGE mini a 12 (fabricado pela TEFKO Co., Ltd.), e um sobrenadante de cultura a partir do qual um banda de TVX01 foi detectada e também foi selecionada. A solução de sobrenadante de cultura selecionada foi denominada produção em massa de TVX01. (2) Produção em Massa de ACX02 Usando T. viride (a) A modificação de Códon do Gene de ACX02 Apropriada para Expressão em T. viride

[162] A fim de permitir que o gene ACX02 seja fortemente expresso como uma proteína ativa em T. viride, um DNA foi produzido com alterações em bases em 24 posições no total na sequencia de sinal de A. cellulolyticus e gene ACX02. Na Tabela 13, as posições de base para o nome da sequência ACX02 se refere às posições de base de um gene de A. cellulolyticus toda xilanase do tipo selvagem que é apresentado como SEQ ID NO: 4. As posições de base para o nome da sequência da sequência de sinal de A. cellulolyticus se referem às posições de bases da SEQ ID NO: 73. Tabela 13

[163] Este gene modificado ACX02 era um gene que foi concebido em consideração a distribuição das frequências de uso de códons em T. viride. Este gene ACX02 modificado foi artificialmente sintetizado pela Gene Design, Inc. Na síntese artificial, foi realizado um projeto tal que EcoRI e StuI foram incluídos na sequência a montante do início códon e tal que XhoI e HindIII foram incluídos a jusante do códon de parada. Como resultado foi obtido um plasmídeo pACX02, em que o gene ACX02 alterado com códons foi inserido no EcoRI/HindIII de pUC19. (b) Construção do Plasmídeo ACX02-PCB1

[164] O plasmídeo pACX02 foi clivado com StuI e XhoI, para obter um fragmento do gene ACX02-N com um comprimento de cerca de 850 pb. Separadamente, o PCB1-Eg3X -hphless (documento WO 2011/021616) foi clivado com StuI e XhoI, e um fragmento que tem um comprimento de cerca de 7 kbp foi recuperado. O fragmento recuperado foi ligado ao fragmento do gene ACX02-N com um comprimento de cerca de 850 pb utilizando uma ligase de DNA (Takara Shuzo Co., Ltd.), para produzir um plasmídeo ACX02-PCB1. As condições de reação para a enzima e outros semelhantes foram ajustadas para as condições especificadas no manual de instruções anexado ao kit. O plasmídeo ACX02-PCB1 tinha uma configuração tal que ACX02 seria expresso no hospedeiro Trichoderma viride utilizando o seu próprio códon de iniciação. (c) Produção de Transformante de Trichoderma viride Transformado com Plasmídeo ACX02-PCB1

[165] A transformação de Trichoderma viride com o plasmídeo ACX02-PCB1 obtido na etapa (2) (b) no Exemplo 3 foi realizada de acordo com o método descrito no documento WO 2011/021616. A transformação foi realizada de acordo com um método de co-transformação utilizando T. viride cepa 2, que é a cepa faltando o gene de biossíntese de uracila (pyr4), como um hospedeiro e um gene pyr4 de Neurospora crassa como um marcador de seleção. A cepa 2 do Trichoderma viride foi suspensa em uma solução de enzima de formação de protoplastos (1 mg/mL de β-glicuronidase, 0,3 mg/mL de quitinase, 0,3 mg/mL de Zymolyase, e 0,5 mol/L de sacarose), para fornecer protoplastos dos micélios. Esta suspensão foi filtrada e centrifugada e posteriormente lavada com uma solução tampão de SUTC (0,5 mol/L de sacarose, 10 mmol/L de cloreto de cálcio, e 10 mmol/L Tris- HCl (pH 7,5)). Os protoplastos foram suspensos em 100 mL de uma solução tampão de SUTC, e, em seguida, uma solução de DNA em uma quantidade de 10 mL que continha 10 μg do plasmídeo ACX02-PCB1 e uma solução de DNA em uma quantidade de 10 mL que continha o gene pyr4 foram adicionadas. A mistura resultante foi deixada em repouso em gelo durante 5 minutos. Em seguida, 400 mL de uma solução PEG (que contém PEG4000 a 60%, cloreto de cálcio a 10 mmol/L, e Tris - HCl 10 mmol/L (pH 7,5)) foram adicionados a mistura, e repousaram em gelo durante 20 minutos. Em seguida, uma solução tampão SUTC em uma quantidade de 10 mL foi adicionada, e a mistura resultante foi centrifugada. Os protoplastos coletados foram suspensos em 1 mL de solução tampão de SUTC, e porções de 200 μL do mesmo foram sobrepostas individualmente, juntamente com ágar mole, em um meio mínimo que continha 0,5 mol/L de sacarose. Após o cultivo a 28°C por 5 dias, colônias que cresceram foram inoculadas novamente em um meio mínimo, e as colônias formadas no seu interior foram utilizadas como transformantes. (d) Cultivo e Identificação de Transformante que foi Transformado com ACX02-PCB1

[166] As cepas que cresceram em meio mínimo, após a introdução do plasmídeo ACX02-PCB1 foram selecionadas, e cultivadas de acordo com um método descrito no documento WO 98/11239. A solução de cultura obtida foi centrifugada para separar o sobrenadante da cultura a partir das células microbianas, e o sobrenadante de cultura foi passado através de um filtro de tamanho (poro : 0,2 μm) para a filtração e esterilização, preparando-se assim uma solução sobrenadante de cultura. A solução sobrenadante de cultura preparada foi submetida ao SDS-PAGE, e um sobrenadante da cultura a partir do qual um grupo de ACX02 foi bem detectado foi selecionado. A solução sobrenadante de cultura selecionada foi denominada produção em massa de ACX02. Exemplo 4: Transição de Estabilidade de TVX01 Junto com

Alterações na Temperatura e pH

[167] O seguinte experimento foi realizado usando o TVX01 produzido em massa pelo método utilizado no Exemplo 3. Uma solução tampão de 200 mM (abaixo especificada) e xilanase foram misturadas em conjunto em uma proporção de 1:1, e a mistura foi tratada por um período predeterminado de tempo a várias temperaturas, e em seguida repousou em banho de gelo durante 5 minutos. Em seguida, a atividade residual foi medida de acordo com o método utilizado no Exemplo 1. As soluções de tampão usadas no processo eram uma solução tampão de citrato de sódio (pH : 4,5), uma solução tampão Tris-HCl (pH 8-9), e uma solução de glicina de sódio (pH : 10). O TVX01 reteve uma atividade de 86%, mesmo após tratamento térmico a pH 4,5 e 50°C durante 72 horas. Além disso, TVX01 retida uma atividade de 68%, mesmo após tratamento térmico a pH 5,5 (o pH da solução de xilanase mutante) e a uma temperatura mais elevada, de 70°C, durante 5 minutos. Ambas as condições são as condições em que o tipo selvagem perderia completamente sua atividade; em contraste, o mutante exibiu uma melhor atividade residual em condições ácidas de alta temperatura. Após o tratamento térmico a 50°C e um pH de 8 a 10 por 60 minutos, a atividade residual do tipo selvagem era de 28% em pH 8, de 8% em pH 9, e a inativação completa foi observada a um pH de 10, enquanto que a atividade residual do mutante foi de 83% em pH 8, 60% em pH 9, e de 56%, mesmo em pH 10. Além disso, mesmo após tratamento térmico a 60°C durante 60 minutos, em que o tipo selvagem perde completamente a sua atividade, a xilanase mutante manteve uma atividade de 30% em pH 8, uma atividade de 17% em pH 9, e uma atividade de 10%, em pH 10, a qual demonstra que a xilanase mutante exibe uma atividade residual melhorada também sob a, as condições básicas de alta temperatura.

[168] Como descrito acima, TVX01 de acordo com a invenção exibiu uma significativa melhoria da atividade residual em condições em que a enzima do tipo selvagem consideravelmente inativa, tais como um pH de 4,5 ou pH de 8 a 10, com uma temperatura de 50°C a 70°C. Exemplo 5: Alteração de Estabilidade de ACX02 Devido as Alterações de Temperatura e pH

[169] Um experimento foi realizado da mesma maneira como no Exemplo 4, mas usando o ACX02 produzido em massa com o método utilizado no Exemplo 3. O ACX02 produzido em massa reteve uma atividade de 84%, mesmo após tratamento térmico em pH 4,5 e 50°C durante 72 horas. A xilanase de tipo selvagem tratada da mesma forma manteve uma atividade que era tão baixa quanto 45%. Assim, foi demonstrado que a xilanase mutante exibe uma atividade residual melhorada, em condições ácidas de alta temperatura ácidas, em comparação com a xilanase do tipo selvagem. O tipo selvagem perdeu completamente sua atividade após o tratamento térmico a 50°C e pH de 8 a 10, durante 60 minutos, considerando-se que ACX02 reteve uma atividade de 34% em pH de 8, um atividade de 5% em pH 9, e uma atividade de 2% mesmo em pH 10, o que demonstra que ACX02 mantém atividade residual melhorada, mesmo sob as condições básicas de temperatura alta. Como descrito acima, ACX02 de acordo com a invenção exibiu uma significativa melhoria da atividade residual em condições em que as enzimas do tipo selvagem consideravelmente inativa, tais como um pH de 4,5 ou pH de 8 a 10, com uma temperatura de 50°C. Exemplo 6: Reação de Sacarificação (1) da Matéria-Prima Lignocelulósica

[170] Polpa kraft em folha branqueada(LBKP) com um peso a seco de 2 g, foi colocada em frascos Erlenmeyers. Em seguida, uma solução aquosa de celulase que continha o ACX02 produzido em massa pelo método do Exemplo 3, uma solução aquosa de celulase que continha o TVX01 produzido em massa pelo método do Exemplo 3, uma solução aquosa de celulase que continha uma xilanase selvagem derivada de T. viride como controle experimental, e uma solução aquosa de celulase que continha uma xilanase do tipo selvagem derivada de A. cellulolyticus como um controle experimental foram adicionados individualmente nos respectivos frascos de Erlenmeyer, tal que a quantidade de cada solução aquosa de celulase adicionado fosse de 52 mg, em termos de proteína em peso. Em seguida, a solução tampão de citrato de sódio 20 mM (pH 4,5) foi adicionada a cada Erlenmeyer, para preparar uma solução de reação, em uma quantidade de 20 g. Cada um dos frascos de Erlenmeyer foi vedado com um tampão de silicone. Depois disso, a solução de reação foi suavemente agitada a 50°C, e uma reação de sacarificação prosseguiu. Os resultados são apresentados na Tabela 14, na qual WT representa xilanase do tipo selvagem. Tabela 14

[171] Após 72 horas, as xilanases do tipo selvagem derivadas de A. cellulolyticus e T. viride exibiram atividade residual que tinha descido para cerca de 30% (linhas (m) e (o) na Tabela 14); em contraste, o ACX02 produzido em massa e o TVX01 produzido em massa exibiram atividades residuais de 90% ou superiores (linhas (n) e (p) na Tabela 14).

Exemplo 7: Reação de Sacarificação (2) de Matéria-Prima Lignocelulósica (1) Reação de Sacarificação

[172] Polpa kraft em folha branqueada (LBKP) com um peso seco de 40 g foi colocada em frascos separáveis. Em seguida, uma solução aquosa de celulase que continha TVX01 produzido em massa pelo método do Exemplo 3 e uma solução aquosa de celulase que continha o ACX02 produzido em massa foram adicionadas individualmente pelo método do Exemplo 3, em uma quantidade de 347 mg em termos de proteína em peso em seus respectivos frascos separáveis. Em seguida, 20 mM de solução tampão de citrato de sódio (pH 4,5) foi adicionada em cada balão separado, para se preparar uma solução de reação em uma quantidade de 400 g. Depois disso, a solução de reação foi agitada suavemente a 50°C, e uma reação de sacarificação prosseguiu. A quantidade de monossacarídeo produzido após a reação foi trabalhada por 72 horas sendo analisada por HPLC. Condições de Análise de HPLC - Analisador: HPLC disponível na JASCO Corporation; Coluna: ULTRON PS-80H (300 x 8 mm; fabricado pela Shinwa Chemical Co., Ltd.); Temperatura da Análise : 50°C; Fase móvel : solução aquosa de ácido perclórico a pH 2,1.

(2) Recuperação da Enzima

[173] A solução da reação de sacarificação (a solução de reação após 72 horas de reação) foi centrifugada a 7.000 x g, e o precipitado foi recuperado. A solução sobrenadante centrífuga remanescente foi tratada com uma membrana de UF comercialmente disponível (nome do produto: Microza UF Pencil module AIP-0013d fabricado pela Asahi Kasei Chemicals Corporation), para se obter uma fração concentrada.

(3) Reação de Ressacarificação Empregando Enzima Recuperada

[174] O precipitado obtido por centrifugação 7.000 x g da solução de reação de sacarificação e a fração concentrada obtida pelo tratamento com a membrana de UF foram colocados em um frasco separável. Em seguida, polpa kraft em folha branqueada kraft (LBKP) foi adicionada em uma quantidade de 40 g em termos de teor de sólidos final, e a mistura resultante foi suavemente agitada a 50°C e uma reação de sacarificação pode prosseguir. Em seguida, a quantidade de monossacarídeo produzida após 72 horas de reação foi analisada por HPLC. (4) Resultados da Reação de Sacarificação

[175] Depois de 72 horas a partir do início da primeira reação (o número de vezes de reutilização da enzima : zero vezes), a concentração de glicose e xilose acumulada na solução da reação de sacarificação, que continha TVX01 era de 79,1 g/L, onde a concentração de glicose acumulada na solução de reação de sacarificação foi 65,1 g/L. A concentração de glicose e xilose acumulada na solução de reação de sacarificação que continha xilanase do tipo selvagem derivada de T. viride foi de 78,0 g/L, em que o concentração de glicose acumulada na solução de reação de sacarificação foi de 64,7 g/L. Na solução de reação de sacarificação que continha ACX02, a concentração de glicose e xilose acumulada foi de 61,3 g/L, em que a concentração de glicose acumulada foi de 49,9 g/L. As enzimas contidas nestas soluções de reação de sacarificação foram reutilizadas para reações de sacarificação, pelo método descrito acima.

[176] A concentração de glicose e xilose acumulada no primeiro ciclo de reutilização foi de 70,7 g/L na solução de reação de sacarificação que continha TVX01, 53,3 g/L na solução de reação de sacarificação que continha a xilanase derivada de T. viride do tipo selvagem e 53,1 g/L na solução de reação de sacarificação que continha ACX02. A concentração de glicose acumulada no primeiro ciclo de reutilização foi de 58,7 g/L na solução de reação de sacarificação que continha TVX01, 45,0 g/L na solução de reação de sacarificação, que continha a xilanase derivada de T. viride do tipo selvagem e 43,5 g/L na solução de reação de sacarificação que continha ACX02.

[177] A concentração de glicose e xilose acumulada no segundo ciclo de reutilização foi de 63,6 g/L na solução de reação de sacarificação que continha TVX01, 42,3 g/L na solução de reação de sacarificação que continha xilanase derivada de T. viride do tipo selvagem e 42,6 g/L na solução de reação de sacarificação que continha ACX02. A concentração de glicose acumulada no segundo ciclo de reutilização era 53,0 g/L na solução de reação de sacarificação que continha TVX01, 35,8 g/L no solução da reação de sacarificação, que continha a xilanase derivada de T. viride do tipo selvagem e 34,6 g/L na solução de reação de sacarificação que continha ACX02. Os resultados obtidos são apresentados como valores relativos, assumindo que a concentração de açúcares acumulados no ciclo 0 de reaproveitamento é de 100%. Os resultados são apresentados nas Tabelas 15 e 16, em que WT. representa xilanase do tipo selvagem. Tabela 15

Tabela 16

[178] Como demonstrado na Tabela 15, foi esclarecido que as xilanases mutantes TVX01 e ACX02 de acordo com a invenção são altamente adequadas para utilização na reação de sacarificação em que a reutilização das enzimas é realizada. Como demonstrado na Tabela 16, foi esclarecido que, não só o rendimento da produção de xilose, mas também da eficiência da produção de glicose são aumentados através da utilização da xilanase mutante de acordo com a invenção. Além disso, efeitos semelhantes ao acima foram obtidos também nos casos em que TVX01 e ACX02 de acordo com a invenção foram utilizados com polpa kraft branqueada (NBKP).

Exemplo 8: Método de branqueamento de celulose (1) Tratamento da Polpa com Xilanase

[179] Uma embalagem de leite disponível no mercado é usada como uma polpa. A matéria-prima das caixas de leite é a parte lenhosa da madeira macia reduzida, madeira remanescente gerada das toras de madeira ou semelhante e é uma polpa virgem que contém lignina que é um componente corante. Uma embalagem de leite bem lavada é cortada em pedaços quadrados de cerca de 5 cm, os quais são imersos em água para um período de tempo de cerca de 2 dias a cerca de 5 dias. Depois disso, uma película de polietileno sobre a sua superfície é removida. Água na qual os pedaços de papel foram imersos é aquecida a 50°C, e a xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção e a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção são adicionadas individualmente à mesma. O mesmo tratamento é realizado, mas utilizando suas respectivas xilanases do tipo selvagem como controle, para comparação. Cada uma das xilanases utilizadas neste exemplo são derivados de um fungo filamentoso. A quantidade de xilanase a ser adicionada é controlada de modo a fornecer uma relação de mistura ótima. Além disso, o tempo de tratamento também é controlado de modo a proporcionar um tempo de tratamento ótimo. Além disso, uma amostra que não seria tratada com xilanase também é preparada.

[180] Depois disso, um agente de branqueamento contendo cloro disponível comercialmente é adicionado e os pedaços de papel são deixados em repouso ainda durante meio dia a um pH de 7 a 10. Os pedaços de papel são bem lavados com água, e rasgados em pequenos pedaços e agitados com uma quantidade adequada de água em um misturador doméstico até que os pedaços de papel não sejam mais distinguidos. As fibras são transformadas em papel usando um aparelho para fabricação de papel disponível comercialmente, e, em seguida, a água é removida do mesmo, e o papel é seco.

(2) Medição da Brancura

[181] Brancura (JIS Z 8715) do papel produzido como acima descrito é medida usando um medidor de brancura espectral UV visível. (3) Nos casos em que a xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção e a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção são adicionadas, a polpa pode ser branqueada até sob as condições de pH 7 a pH 10.

Exemplo 9: Detergente (1) Limpeza de Tecido Felpudo

[182] Tecido felpudo velho é usado como um material a ser lavado. O detergente a ser utilizado é preparado através da adição de xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção ou xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção, a um detergente disponível comercialmente. O tratamento é realizado da mesma maneira que anteriormente, mas utilizando suas respectivas xilanases do tipo selvagem como controle para comparação. Cada uma das xilanases utilizadas neste exemplo é derivada a partir de um fungo filamentoso. Além disso, o tecido felpudo velho não tratado com xilanase é também preparado. A quantidade de xilanase a ser adicionada é controlada de modo a proporcionar uma ótima proporção de mistura. O sincronismo da adição é definido para ser simultânea com a adição do detergente.

[183] 800 mL de água são adicionados a um frasco separável e o detergente e a xilanase são adicionados. A lavagem é conduzida a 50°C e um pH de 7 a 10, durante 1 hora, enquanto girando o frasco separável a 60 rpm. Depois disso, é realizada a secagem natural.

(2) Medição do grau de remoção de felpas

[184] O estado de remoção de felpas é observado sob um microscópio estereoscópico. Além disso, o grau de remoção da felpa no tecido após a lavagem é medida utilizando um espectrofotômetro. (3) Nos casos em que a xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção e a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção são adicionadas, a formação de felpas é suprimida sob a condições de pH 7 a 10 e uma temperatura de 50°C.

Exemplo 10: Ração Animal (1) Produção de Ração Animal

[185] A xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção ou a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção, é adicionada a um alimento em pó para animais experimentais. O tratamento é realizado da mesma maneira, mas utilizando as suas respectivas xilanases do tipo selvagem como controles para comparação. Cada uma das xilanases utilizadas neste exemplo é derivada de fungos filamentosos. Além disso, o alimento em pó não tratado com xilanase também é preparado. A quantidade de xilanase a ser adicionada é controlada de modo a fornecer uma relação de mistura ótima, e a mistura é esferonizada.

(2) Medição do Grau de Decomposição da Parede Celular na ração Animal Conformada

[186] Após a ração para animais conformada ser deixada em repouso durante a noite, a ração animal é cortada com uma lâmina de barbear disponível comercialmente e submetida à coloração de Gram na lâmina preparada e o grau de coloração da parede celular é observada sob um microscópio óptico. Além disso, a ração animal que foi deixada em repouso durante a noite é vigorosamente misturada com uma solução tampão de citrato de sódio 100 mM (pH 4,5), e centrifugada a 5.000 x g durante 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante é removido, e a quantidade de açúcares de redução no sobrenadante é medida usando o método de DNS (Bailey e outros, 1992).

Exemplo 11: Modificador para Panificação (1) Fabricação de Pão

[187] O pão é fabricado usando o método de massa direta. A formulação de ingredientes é fornecida na Tabela 17 abaixo. São utilizados materiais domésticos disponíveis comercialmente para todos os ingredientes. Tabela 17

[188] A xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção ou a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção é adicionada como um modificador de panificação. O tratamento é realizado do mesmo modo, mas utilizando suas respectivas xilanases do tipo selvagem como selvagens seus respectivas xilanases do tipo selvagem como controles para comparação. O momento da adição da mesma é definido para ser simultâneo com a mistura de ingredientes. A quantidade de xilanase é controlada de modo a proporcionar uma relação de mistura ótima. Além disso, a massa não tratada com xilanase também é preparada. A massa obtida foi deixada fermentar a cerca de 37°C por um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 2 horas até que o tamanho da mesma aumentasse para cerca do dobro do tamanho original e, em seguida, cozida em um forno de micro-ondas.

(2) Observação da Estrutura de Partícula do Pão

[189] O pão cozido é cortado com uma lâmina de barbear disponível comercialmente, e a estrutura da partícula é observada sob um microscópio estereoscópico. (3) Medição do Volume do Pão - O pão cozido é deixado em repouso ainda durante a noite, e, em seguida, o volume do pão é medido usando um método de deslocamento de semente. (4) Nos casos em que a xilanase mutante TVX01 de acordo com a invenção e a xilanase mutante ACX02 de acordo com a invenção são adicionadas, as xilanases mutantes são capazes de reação estável sob as condições a partir de 35°C a 40°C durante 1 a 2 horas em o processo de fermentação.

[190] A revelação dos Pedidos de Patente Japonesa números 2011-257389 depositado em 25 de novembro de 2011, e a revelação do Pedido de Patente Japonesa número 2012099096, depositado em 24 de abril, 2012, são aqui incorporadas como referência em sua totalidade. Todas as publicações, pedidos de Patentes e normas técnicas mencionadas nesse relatório descritivo são incorporados ao presente documento como referência, na medida em que cada publicação, publicação, pedido de Patente ou padrão técnico tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

Claims

1. Método para fabricação de um produto sacarificado de lignocelulose, o método caracterizado pelo fato de que compreende contato de uma matéria-prima lignocelulósica com uma xilanase termoestável; em que a xilanase termoestável é uma xilanase mutante que apresenta uma taxa inicial de reação que é, pelo menos, 70% da que é fornecida por uma xilanase do tipo selvagem correspondente à mesma, apresentando uma atividade da xilanase após tratamento térmico a 50°C, durante 24 horas, que corresponde pelo menos a 50% da atividade da xilanase antes do tratamento térmico; e em que a xilanase mutante é uma xilanase mutante compreendendo pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29; um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58; um resíduo de tirosina, substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27; e um resíduo de asparagina, substituído por um resíduo de serina na posição 44.

2. Método para fabricação de um produto sacarificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matéria-prima lignocelulósica é constituída de polpa.

3. Método para fabricação de um produto sacarificado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, o método caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende: recuperação da xilanase termoestável a partir de uma solução de reação de sacarificação contendo o produto sacarificado de lignocelulose obtido pelo contato da matéria-prima lignocelulósica com a xilanase termoestável; e contato da xilanase termoestável recuperada com uma matéria-prima lignocelulósica para obtenção de um produto sacarificado.

4. Método para fabricação de um produto sacarificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a solução de reação de sacarificação é submetida à separação sólido-líquido empregando centrifugação ou uma membrana de microfiltração, e o líquido separado é ultrafiltrado empregando uma membrana de ultrafiltração para separar e recuperar o produto sacarificado de lignocelulose e a xilanase termoestável.

5. Método para fabricação de um produto sacarificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método compreende o contato de um sólido obtido por separação sólido-líquido empregando centrifugação ou uma membrana de microfiltração e a xilanase termoestável recuperada utilizando a membrana de ultrafiltração com uma matéria-prima lignocelulósica, de modo a obter um produto sacarificado.

6. Xilanase mutante, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos os seguintes substituintes de resíduos de aminoácido em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequências: um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de leucina na posição 29; um resíduo de lisina substituído por um resíduo de arginina na posição 58; um resíduo de tirosina substituído por um resíduo de fenilalanina na posição 27; e um resíduo de asparagina substituído por um resíduo de serina na posição 44.

7. Ácido nucleico, caracterizadopelo fato de que é representado por uma sequência de bases da SEQ ID NO: 76, codificando a sequência de aminoácidos da xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6.

8. Vetor de expressão, caracterizadopelo fato de que compreende o ácido nucleico definido na reivindicação 7.

9. Transformante, caracterizadopelo fato de que compreende o vetor de expressão definido na reivindicação 8.

10. Transformante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que uma célula hospedeira do transformante é uma célula derivada de Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, actinomiceto, ou fungo filamentoso.

11. Transformante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o fungo filamentoso pertence a um dos gêneros Trichoderma, Acremonium, Humicola ou Aspergillus.

12. Transformante, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizadopelo fato de que o fungo filamentoso é Trichoderma viride, Acremonium cellulolyticus, Humicola insolens ou Aspergillus niger.

13. Método para fabricação de uma xilanase mutante, o método caracterizadopelo fato de que compreende cultura do transformante definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12 e a recuperação da xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6 a partir de, pelo menos, um dos transformantes da cultura ou um produto de cultura do transformante.

14. Composição, caracterizadapelo fato de que compreende a xilanase mutante definida na reivindicação 6.

15. Método para branqueamento de uma polpa, o método caracterizadopelo fato de que compreende o contato da xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6 com a polpa.

16. Detergente, caracterizadopelo fato de que compreende a xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6.

17. Ração animal, caracterizadapelo fato de que compreende a xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6.

18. Modificador para panificação, caracterizadopelo fato de que compreende a xilanase mutante conforme definida na reivindicação 6.