MX2012009282A - Polipeptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y usos del mismo. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 o un polipéptido variante o un polinucleótido variante del mismo, en donde el polipéptido variante tiene al menos 93% de identidad de secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO:2 o el nucleótido variante que codifica un polipéptido que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO 2. La invención presenta la secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso así como de la secuencia de aminoácidos del polipéptido funcional de longitud completa y equivalentes funcionales del gen de la secuencia de aminoácidos. La invención también se relaciona con los métodos para el uso de polipéptidos en los procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con polinucleótidos de acuerdo con la invención adecuados para producir estas proteínas.

Description

POLIPEPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD DE CELOBIOHIDROLASA Y USOS DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con secuencias que comprenden genes que codifican polipéptidos que tienen o ayudan en la actividad de degradación de material de carbohidratos. La invención presenta una secuencia codificante de longitud completa del gen novedoso asi como la secuencia de aminoácidos de la proteina funcional de longitud completa, y variantes y fragmentos del gen o de la secuencia de aminoácidos. La invención también se relaciona con métodos para usar estas proteínas en procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención adecuadas para producir estas proteínas. La invención también se relaciona con la expresión exitosa de los genes que codifican los polipéptidos que tienen actividad de degradación de material de carbohidrato en un hospedero. El hospedero puede ser cualquier hospedero adecuado, por ejemplo Aspergillus por ejemplo Aspergillus niger ' o Talaromyces, por ejemplo Talaromyces emersonii.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos más abundantes sobre la tierra. Sin embargo, mucho de este carbohidrato está secuestrado en polímeros complejos incluyendo almidón (el principal carbohidrato de almacenamiento en semillas y granos) , y una combinación de carbohidratos y ligninas conocida como lignocelulosa . Los principales componentes carbohidratos de la lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas. Estos polímeros complejos frecuentemente se denominan de manera colectiva como lignocelulosa.

La bioconversión de la biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que sea fermentada subsecuentemente para producir alcohol (por ejemplo etanol) es una alternativa a los combustibles líquidos que ha atraído intensamente la atención de los investigadores desde la década de 1970 cuando surgió la crisis del petróleo por el descenso en la producción de petróleo por la OPEP. El etanol ha sido usado ampliamente como una mezcla de al 10% en la gasolina en los Estados Unidos o como un combustible puro para vehículos en Brasil en las dos últimas décadas. Más recientemente, el uso del E85, una mezcla de etanol 85% se ha implementado especialmente para aplicaciones de ciudad limpia. La importancia del combustible bioetanol se incrementará en paralelo con el incremento de los precios del petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente, se están utilizando azúcares fermentables para producir plásticos, polímeros y otros productos de base biológica y se espera que esta industria crezca sustancialmente, incrementando por lo tanto la demanda de azúcares fermentables a bajo coste los cuales puedan ser utilizados como materia prima en lugar de las materias primas basadas en el petróleo.

El secuestro de tales grandes cantidades de carbohidratos en la biomasa vegetal provee una fuente abundante de energía potencial en forma de azúcares tanto de azúcares de 5 carbonos como de 6 carbonos que podrían ser utilizados para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial en energía de estos carbohidratos frecuentemente está subutilizado porque los azúcares están retenidos en polímeros complejos, y por lo tanto no son fácilmente accesibles para la fermentación. Métodos que generan azúcares a partir de biomasa vegetal proveerían reservas abundantes económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácidos succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás.

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el coste y la eficiencia hidrolitica de las enzimas son factores principales que restringen la comercialización de los procesos de bioconversión de la biomasa. Los costes de producción de las enzimas producidas por vía microbiana están conectados estrechamente con una productividad de la cepa productora de enzima y del rendimiento de actividad final en el caldo de fermentación. A pesar de la investigación continua de las últimas pocas décadas para entender la degradación enzimática de la biomasa lignocelulósica y producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir o diseñar nuevas celulasas y hemicelulasas altamente activas. También seria altamente deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficientes capaces de llevar a cabo una¦ iodegradación rápida y eficiente de los materiales lignocelulósicos , en particular tales celulasas y hemicelulasas que han incrementado la termoestabilidad.

Adicionalmente es deseable que las celulasas y hemicelulasas tengan buena tolerancia contra los inhibidores.

Tales enzimas pueden ser utilizadas para producir azúcares para producir azúcares para fermentación en productos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás, para ensilado y también como enzimas en otros procesos industriales, por ejemplo en la industria de alimentos y piensos, textiles, de pulpa o papel o de detergentes y otras industrias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la capacidad de degradar (es decir, asistir en la degradación de), un carbohidrato (por ejemplo polisacáridos ) , en particular, lignocelulosa . Los polinucleótidos de la invención codifican típicamente un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa .

La invención también provee polipéptidos producidos por vía natural y recombinante que tienen tal actividad, así como líneas celulares recombinantes que producen tales enzimas. También, se proveen métodos para hacer y usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención.

De acuerdo con la invención, se provee entonces un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1, o un polipéptido variable o un polinucleotido variable de los mismos, en donde el polipéptido variable tiene al menos 93% de identidad de secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO: 2 o el polinucleotido variable codifica un polipéptido que tiene al menos 93% de identidad en secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO: 2.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención tienen propiedades favorables, en particular una actividad de degradación de la . celulasa. En una realización, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene actividad de celobiohidrolasa (abreviado como CBH) .

Preferiblemente los polipéptidos tienen actividad de celobiohidrolasa II (abreviado como CBHII) .

Aquí, la celobiohidrolasa II (CBHII) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1, 4- -D-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa a partir de los extremos no reductores de las cadenas. Esta enzima también puede denominarse como celulasa 1, - ~celobiosidasa, 1, 4-^-celobiohidrolasa, 1, 4- -D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, ß??-1,4-ß-? glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa . Puede tener el código EC 3.2.1.91.

Adicíonalmente los polipéptidos pueden tener una alta termoestabilidad. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden retener una actividad relativamente alta (porcentaje de la actividad inicial) como función del tiempo de incubación (h) por ejemplo 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas o más 20 horas o más, 30 horas o más en particular a altas temperaturas, por ejemplo a 60°C o más, 65°C o más, o a 70°C o más, por ejemplo 8 horas a 65°C o 72 horas a 60°C.

Adicionalmente las celobiohidrolasas de la invención pueden tener una alta tolerancia contra inhibidores. Las celobiohidrolasas son conocidas por ser inhibidos por los productos que producen por catálisis, por ejemplo, celobiosa y glucosa pero también por compuestos inhibidores que encuentran su origen en la ligno (celulosa) , particularmente en (ligno) celulasa pretratada. El proceso de pretratamiento usualmente producirá a partir de las lignocelulosa, productos de degradación que pueden inhibir las enzimas, por ejemplo ácido fórmico. Las celobiohidrolasas de acuerdo con la invención son resistentes en particular a la inhibición por compuestos inhibidores que encuentran su origen en la ligno (celulosa) . Aparte de la verdadera inhibición por parte de los productos de reacción, también puede denotarse la disminución en la actividad enzimática por perdida de enzima debida a una adsorción de tipo a-especifica a componentes en productos lignocelulósicos, por ejemplo productos de degradación de material de paredes celulares vegetales, como resultado de un pretratamiento. Una revisión de la conversión enzimática de la lignocelulosa en azúcares fermentables : retos y oportunidades es dada por H. Joergensen et al, Biofuels, Bioprod. Bioref. 1: 119 - 134 (2007).

La invención también provee un polinucleótido que comprende : (a) la secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO:l; o (b) una secuencia de nucleótidos que hibridiza selectivamente con un polinucleótido siendo el complemento inverso de SEQ ID NO:l; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1; o (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos como el definido en (a) , (b) o (c) con al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; o (e) una secuencia que es degenerada como resultado de la codificación genética a una secuencia tal como se define en cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos tal como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .

También se provee de acuerdo con la invención un vector, tal como un vector de expresión, que incorpora una secuencia de polinucleótidos de la invención y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención .

La invención también provee: un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, método que comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, la recuperación del polipéptido expresado; un polipéptido obtenible por tal método; y una composición que comprende: (i) un polipéptido de la invención y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa .

Los polipéptidos de la invención que tienen actividad de celobiohidrolasa también pueden ser utilizados en procesos industriales. Así, la invención provee un método para el tratamiento de un sustrato que comprende material de carbohidrato método que comprende poner en contacto el sustrato con un polipéptido' o una composición de la invención .

En particular, la invención provee un método para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico método que comprende poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención.

Los azúcares producidos de esta manera pueden ser usados en un proceso de fermentación. De acuerdo con lo anterior, la invención provee un método para producir un producto de fermentación, método que comprende: producir un azúcar fermentable utilizando el descrito anteriormente; y fermentar el azúcar fermentable resultante, para producir por lo tanto un producto de fermentación.

Un polipéptido o una composición de la invención también puede utilizarse, por ejemplo, en la preparación de un producto alimenticio, en la preparación de un detergente, en la preparación de un pienso para animales,. en. el tratamiento de pulpa o en la manufactura de un papel o en la preparación de una tela o textil o en la limpieza de lós mismos.

La invención también provee: un material procesado obtenible poniendo en contacto un material vegetal o un material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención; un alimento o pienso que comprende un polipéptido o una composición de la invención; y una planta o una parte de la misma que comprende un polinucleótido, un polipéptido, un vector o una célula de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: mapa de pGBTOP para la expresión de genes en A. niger. Se representan el gen de interés (GOI) expresado a partir del promotor de glucoamilasa (PglaA) . Además, se representa el- flanco de glucoamilasa (3' glaA) del cásete de expresión. En esta solicitud un gen de interés es la secuencia codificadora de TE ER02270 tal como se define de aquí en adelante.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO:l, define la secuencia codificante de TEMER02270; SEQ ID NO:2, define la secuencia de aminoácidos de TEMER02270; SEQ ID NO: 3, define la secuencia de señales de TEMER02270.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente especificación y de las reivindicaciones acompañantes, las palabras "comprenden" y "incluyen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" deben interpretarse inclusivamente. Es decir, se pretende que estas palabras conlleven la posible inclusión de otros elementos enteros no específicamente citados, donde el contexto lo permita.

Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de un (es decir a uno o al menos uno) del objeto gramatical del articulo. A manera de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

, La presente invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos, por ejemplo enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste de o sustancialmente consiste de uno o más carbohidratos. Las enzimas son aquí una subclase de polipéptidos .

El sustrato (también llamado materia prima) aquí se usa para referirse a una sustancia que comprende material de carbohidrato, la cual puede ser tratada con enzimas de acuerdo con la invención, de tal manera que el material de carbohidrato en la misma es modificado. Además del material de carbohidrato el sustrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo pero no limitándose a material no carbohidrato y almidón.

La presente invención provee polinucleótidos que codifican polipéptidos, por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste de o sustancialmente consiste de uno o más carbohidratos. Las enzimas son aquí una subclase de polipéptidos .

Típicamente, un polipéptido de la invención codifica un polipéptido que tiene al menos actividad de celobiohidrolasa, llamado tentativamente TEMER02270, que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2, o una secuencia que es una variante de la misma, típicamente equivalente en términos funcionales al polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una secuencia que es un fragmento de otra de las mismas.

En una realización, un polipéptido de la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales diferentes a la de la actividad de la celobiohidrolasa como se mencionó anteriormente, por ejemplo una de las otras actividades degradantes de carbohidratos y/o hidrolizadoras de carbohidratos mencionadas aquí hidrolizadora .

Carbohidrato en este contexto incluye todos los sacáridos, por ejemplo polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos o monosacáridos .

Un polipéptido de acuerdo con la invención puede modificar y/o degradar un material de carbohidrato degradando químicamente o degradando físicamente tal material o hidrolizando el carbohidrato. Físicamente incluye la interrupción de . interacción entre microfibrilos de celulosa y/o la apertura de la estructura de fibras de la celulosa. La modificación química del material de carbohidrato puede dar como resultado la degradación de tal material, por ejemplo por hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como mediante la acción de una liasa. La modificación física puede o puede no estar acompañada por modificación química.

Materiales de carbohidrato adecuados Un . carbohidrato no almidonoso adecuado para modificación por un polipéptido de la invención es la lignocelulosa . Los polisacáridos principales que comprenden diferentes residuos lignocelulósicos, los cuales pueden ser considerados como una materia prima renovable potencial, son celulosa (glucanos) , hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ) . Además, una parte de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos , por ejemplo en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, por ejemplo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido D-galacturónico y otras hexosas · y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinasas pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicamente plantas de tejidos vegetales no madereros (aproximadamente un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de residuos de glucosa enlazados por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, asi como la estequiometria de la glucosa enlazada en ß (con respecto a a) genera estructuras más propensas a entrelazar puentes de hidrógeno que las estructuras altamente ramificadas enlazadas en a del almidón. Asi, los polímeros de celulosa son en general menos solubles, y forman fibras enlazadas más apretadamente que las fibras encontradas en el almidón.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición varía frecuentemente de manera amplia de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente general de la hemicelulosa es la xilosa enlazada en ß-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa es ramificada frecuentemente en 0-3 y/o 0-2 y puede ser sustituida por enlaces a arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o poliesterificación a ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico a arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para los azúcares de seis carbonos enlazados en ß (tal como los ß-(1,3) (1,4) glucanos y heteroglucanos mencionados previamente) , y glucomananos adicionalmente- (en los cuales están presentes tanto la glucosa como la mañosa en el esqueleto lineal, enlazados uno a otro por enlaces ß) .

La composición, naturaleza de la sustitución y grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferente en plantas dicotiledóneas (dicotiledóneas, es decir plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones o la semilla sale tal como las habas, maní, almendras, guisantes, frijoles) , en comparación con las plantas monocotiledóneas (monocotiledóneas; es decir plantas que tienen un cotiledón o una hoja de semilla simple tal como maíz, trigo, arroz, pastos, cebada) . En las dicotiledóneas la hemicelulosa está compuesta principalmente de xiloglucanos que son cadenas de glucosa enlazadas 1,4-ß con cadenas laterales enlazada con cadenas lateral xilosilo 1,6-ß. En las monocotiledóneas, incluyendo los principales cultivos de grano, los componentes principales de la hemicelulosa son heteroxilanos . Estos están compuestos primariamente de polímeros de esqueleto de xilosa con enlace 1,4-ß con uniones 1,3-a arabinosa galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido 4-0-metil-glucurónico así como xilosa modificada por ácido acético enlazado por ésteres. También están presentes los ß glucanos compuestos de cadenas de glucosilo enlazadas por 1,3- y 1,4-ß-. También están presente ß glucanos que comprende cadenas de glucosilo de 1,3- y 1, 4-p-glucosilo enlazado. En las monocotiledóneas, la celulosa, los heteroxilanos y 1?e ^1??3??3 pueden estar presentes en cantidades prácticamente iguales, comprendiendo cada uno aproximadamente 15 - 25% de la materia seca de las paredes celulares. También plantas diferentes pueden comprender cantidades diferentes de, y composiciones diferentes de, sustancias pécticas. Por ejemplo, la remolacha de azúcar comprende aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinano sobre base de peso seco.

De acuerdo con lo anterior, una composición de la invención puede ser hecha a la medida en vista de la materia prima ' en particular (también denominado sustrato) que no se va a usar. Esto equivale a decir que el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones enzimáticas o tratamientos físicos pueden administrarse de forma concomitante o secuencial. Las enzimas pueden ser producidas bien sea exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego se aislan y se agregan a la materia prima lignocelulósica . Alternativamente las enzimas se producen, pero no se aislan en un caldo de fermentación de masa celular crudo, o en material vegetal (tal como las cubiertas de maíz), y similares agregados a la materia prima.

Alternativamente, la masa de células crudas o el medio de producción enzimático al materia vegetal puede ser tratado para prevenir crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, calentando o con la adición de agentes microbianos) , siendo agregado entonces a la materia prima. Estas mezclas de enzimas crudas pueden incluir el organismo que produzcan enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utilice materias primas (tales como cubierta de maíz) para proveer nutrición a un organismo que produce una enzima. De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir como la fuente de alimentación lignocelulósica y pueden agregarse en la alimentación lignocelulósica .

Actividad enzimática Las endo-1, 4- ~glucanasas (EG) y las exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble en celooligosacáridos (celulosa como producto principal) , con ß-glucosidasas (BGL) convertidas en oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa en glucosa .

Las xinalasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo, -L-arabinofuranocidasas, estearasas de feruloilo y acetil xilano, glucuronidasas, y ß-xilosidasa) catalizan la hidrólisis de una parte de las hemicelulosas .

Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son unos polisacáridos más complejos en la pared de la célula vegetal. Están constituidas alrededor de una cadena de ácido D-galacturónico enlazado por a (1, ) -intercalado en algún grado con la L-ramnosa. En cualquier par de células hay un cierto número de unidades estructurales que satisfacen esta descripción y generalmente se ha considerado que en una molécula péctica sencilla, las cadenas nucleares de diferentes unidades estructurales son continuas una con otra.

Las pectinasas incluyen, por ejemplo una endopoligalacturonasa, una pectina metilesterasa, una endogalactanasa, una ß-galactosidasa, una pectina acetil estearasa, una endopectina liasa, pectatoliasa, alfa ramnosidasa, una exogalacturonasa, una* epoxigalacturonasa liasa, una ramnogalacturonanohidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil estearasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolaza, una xilogalacturonasa y una a-arabinofuranosidasa .

Los principales tipos de unidades estructurales son galacturonano (homogalacturonano) , el cual puede ser sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en el 0-2 y 0-3. El ramnogalacturonano y (RGI), en el cual las unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades radanosa que portan galactano enlazado a (1,4) y cadenas laterales de arabinano enlazadas con (1,5). Las cadenas laterales de arabinado pueden ser unidas, directamente a la ramnosa o indirectamente a través de las cadenas galactano; xilogalacturonano, con unidades xilosilo sencillas sobre 0-3 de los residuos de ácido galacturónico (asociados cercanamente con RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII), una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares inusuales como por ejemplo apiosa. Una RGII puede contener incluso dos residuos apiosilo, bajo condiciones iónicas estables, que pueden reversiblemente formar ésteres con borato .

Como se definió más arriba, un polipéptido de la invención es típicamente uno que tiene actividad de celobiohidrolasa. Sin embargo, un polipéptido de la invención puede tener una o más de las actividades definidas arriba además de o en alternativa a esa actividad. También, una composición de la invención tan como se describe aquí puede tener una o más de las actividades mencionadas anteriormente además de que se provee por parte del polipéptido de la invención que tiene actividad de celobiohidrolasa.

Secuencia de polinucleótido La invención provee secuencias de polinucleótidos genómicas que comprenden el gen que codifica el TEMER02270 asi como su secuencia codificante. De acuerdo con lo. anterior, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos genómicos de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de codificación de acuerdo con SEQ ID N0:1 y con variantes, tales como equivalentes funcionales', de los mismos.

En particular, la invención se relaciona con un polinucleótido aislado el cual es capaz de hibridar selectivamente, por ejemplo bajo condiciones de restricción, preferiblemente bajo condiciones de alta restricción, con el complemento reverso de un polinucleótido que comprende la secuencia definida en SEQ ID N0:1.

Más específicamente, la invención se relaciona con un polinucleótido que comprende o consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos de. acuerdo con SEQ ID N0:1.

La invención también se relaciona con un polinucleótido aislado que comprende o consiste esencialmente de una secuencia que codifica al menos un dominio funcional de un polinucleótido de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante del mismo, tal como un equivalente funcional, o un fragmento del mismo.

Tal como se utilizan aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que pueden ser aisladas a partir de ADN cromosómico, las cuales incluyen un marco de lectura abierto que codifica una proteina, por ejemplo, la proteina celobiohidrolasa de acuerdo con la presente invención.

Un gen puede incluir secuencias de codificación, secuencias de no codificación, intrones y/o secuencias reguladoras. Además, el término "gen" puede referirse a una molécula de ácido nucleico aislada tal como se define aquí.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1 o una variante de la misma, tal como un equivalente funcional, puede aislarse utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencias provista aquí. Por ejemplo, usando toda o una porción de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID N0:1 como sonda de hibridación moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden aislarse utilizando técnicas de hibridación y clonación estándar (por ejemplo, como las descritas en Sambrook, J. , Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de SEQ ID N0:1 puede ser aislada por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores sintéticos de oligonucleótidos diseñados con base en las información de secuencia contenida en SEQ ID N0:1.

Un ácido nucleico de la invención puede ser amplificado utilizando ADNc, ARNm o alternativamente ADN genómico, como molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico amplificado asi puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencias de ADN.

Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a o hibridables a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención pueden preparase por técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado .

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID N0:1.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico la cual es el complemento reverso de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID N0:1 o una variante, tal como un equivalente funcional, de bien sea tal secuencia de nucleótidos.

Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es aquella que es suficientemente complementaria a otra secuencia de nucleótidos de tal forma que puede hibridar a la otra secuencia de nucleótidos formando por lo tanto un dúplex estable .

Un aspecto de la invención es pertinente a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como un equivalente funcional de la misma, por ejemplo, un fragmento o dominio biológicamente activo, asi como moléculas de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácido nucleico adecuadas para uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico .

Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser "aislado". En el contexto de la invención un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo a una o a ninguna de las secuencias de codificación con las cuales ' es inmediatamente contiguo (una sobre el extremo 5' y otra sobre el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo a partir del cual es derivado. Asi, en una realización, un ácido nucleico asilado incluye algunas o todas las secuencias no codificadoras 5' (por ejemplo, promotoras) que son inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. El término por lo tanto incluye, ¦ por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector en un plásmido o virus autónomamente replicante, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe en una molécula separada (por' ejemplo un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o por tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u otros agentes químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Además, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no ocurre de forma natural como fragmento y que no se> encontraría en estado natural.

Tal como se utilizan .aquí, los términos "polinucleótidos" o "molécula de ácido nucleico" se entiende que incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de los ADN o ARN generados utilizando análogos de los nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble pero preferiblemente es ADN de cadena doble. El ácido nucleico puede ser sintetizado utilizando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos de inosina o fosforotioato) . Tales oligonucleótidos pueden ser utilizados, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades de apareamiento de bases alteradas o una resistencia incrementada a las nucleasas.

Otra realización de la invención provee a la molécula de ácido .nucleico TEMER02270, por ejemplo, la cadena de codificación de una molécula de ácido nucleico TEMER02270. También se incluyen dentro del alcance de la invención las cadenas complementarias de las moléculas de ácido nucleico descritas aquí.

A menos que se indique otra cosa, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por el secuenciamiento de una molécula de ADN aquí se determinaron utilizando un secuenciador de ADN automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos modificados por las moléculas de ADN determinadas aquí fueron predichas por traducción de una secuencia de ADN determinada como se dijo anteriormente. Por lo tanto, tal como es conocido en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por esta metodología automatizada, cualquier secuencia de nucleótidos determinada aquí puede ' contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la automatización son típicamente al menos 90% idénticas, más típicamente al menos 95% hasta al menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia de nucleótidos actual de la molécula de ADN secuénciada .

La secuencia real puede ser determinada con mayor precisión mediante otras metodologías que incluyen métodos de secuenciamiento de ADN manuales bien conocidos en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una inserción o supresión en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real producirá un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos de tal forma que la secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN secuénciada, comenzando en punto de tal inserción o supresión.

La persona experimentada en la técnica es capaz de identificar tales bases identificadas erróneamente y conoce como corregir tales errores.

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender solamente una porción o un fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID N0:1 (o de una variante bien sea de la misma), por ejemplo un fragmento el cual puede ser utilizado como una sonda o cebador de un fragmento que codifica una porción de un polipéptido TEMER02270.

La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen TEMER02270 y del ADNc permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de TEMER02270, asi como de homólogos de TEMER02270 de otras especies .

La sonda/cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado el cual comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que híbrida preferiblemente bajo condiciones de alta recesión a por lo menos desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 15, preferiblemente de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 20, preferiblemente desde aproximadamente 22 hasta aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, o aproximadamente 75% o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID N0:1 o de una variante, tal como un equivalente funcional, de bien sea del mismo.

Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos TE ER02270 pueden utilizarse para traducir transcriptos o secuencias genómicas de TEMER02270 que codifican los mismos polipéptidos u homólogos de los mismos por ejemplo en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Tales sondas también pueden ser utilizadas como parte del juego de prueba diagnostico para identificar células que expresan un polipéptido TEMER02270.

Los polinucleótidos aquí pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos pueden ser optimizados en el uso de codones, preferiblemente de acuerdo con los métodos descritos en WO2006/077258 y/o PCT/EP2007/055943, los cuales se incorporan aquí como referencia. La PCT/EP2007/055943 apunta a la optimización de pares de codones. La optimización de pares de codones es un método donde las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido han sido modificadas con respecto a su uso del codón, en particular los pares de codones que se utilizan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos y/o mejoran la producción de los polipéptidos codificados. Los pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes subsecuentes (codones) en una secuencia codificante.

La invención se relaciona adicionalmente con un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido tal como se describe aquí. "Constructo de ácido nucleico" se define aquí como una molécula de ácido nucleico, bien sea de cadena sencilla o doble, la cual se aisla a partir de un qen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico que se combina y yuxtaponen de una manera que no existiría de otra forma en la naturaleza. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene todas secuencias de control requeridas para expresión y una secuencia codificante. El término "secuencia codificante" tal como se define aquí es una secuencia la cual se transcribe en ARNm y se traduce hacia un nuevo activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invención. Las fronteras de la secuencia codificante están determinadas frecuentemente por el codón de inicio ATG en el extremo 5' del ARNm y una secuencia de codón de detención de la traducción que termina el marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes . Preferiblemente, el ácido nucleico tiene un alto contenido de GC. El contenido de GC indica el número de nucleótidos G y C en el constructo, divididos por el número total de nucleótidos, expresado en porcentaje. El contenido de GC es preferiblemente 56% o más, 57% o más 58% o más, 59% o más, 60% o más, o en el rango de 56 - 70% o en el rango de 58 - 65%.

Preferiblemente el constructo de ADN comprende una secuencia de ADN promotora, una secuencia codificante en asociación operativa con dicho promotor de la secuencia de ADN y secuencias de control tales como: una secuencia de terminación de traducción orientada en 5' hacia la dirección 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, preferiblemente TAAA, y/o una secuencia codificante- iniciadora de traducción orientada en 5' hacia la dirección 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTC; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, preferiblemente GCT TCC TTC, y/o una secuencia de iniciador de traducción se selecciona de la siguiente lista de secuencias: 5' -mwChkyCAAA-3' ; 5'-mwChkyCACA-3' o 5' -mwChkyCAAG-3' , utilizando códigos de ambigüedad para los nucleótidos: m (A/C) ; w (A/T) ; y (C/T) ; k (G/T); h (A/C/T), preferiblemente 5' -CACCGTCAAA-3' o 5'-CGCAGTCAAG-3' .

En el contexto de esta invención, el término "secuencia codificante del iniciador de la traducción" se define como los nueve nucleótidos corriente abajo inmediatamente del iniciador o del codón de iniciación del marco de lectura abierta de la secuencia codificante de ADN. El iniciador o el codón de inicio codifica para los aminoácidos metionina. El codón iniciador es típicamente' ATG pero también puede ser cualquier codón de inicio tal como CTG.

En el contexto de esta invención, el término "secuencia de terminación de traducción" se define como los cuatro nucleótidos comenzando desde el codón de detención de traducción en el extremo 3' del marco de lectura abierta o la secuencia de nucleótidos como se oriente en 5' hacia la dirección de 3' .

En el contexto de esta invención, el término "secuencia del iniciador de traducción" se define como los diez nucleótidos inmediatamente corriente arriba del iniciador o del codón de inicio del marco de lectura abierta de una secuencia de ADN que codifique un polipéptido. El iniciador o el codón de inicio codifican para el aminoácido metionina. Cuando el codón de iniciador es típicamente ATG pero también puede ser un codón de inicio funcional tal como GTG. Es bien conocido en la técnica que el uracilo, U, reemplaza el desoxinucleótido timina, T, en ARN.

Homología e identidad Las secuencias de aminoácidos o nucleótidos se denominan homologas cuando exhiben un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homologas están relacionadas cercanamente o relacionadas de manera más distante esto se indica por un "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", el cual es alto o bajo respectivamente. Aunque está en disputa, indicar un "porcentaje de identidad" o un "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología" se utilizan frecuentemente de manera intercambiable.

Los términos "homología", "porcentaje de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se utilizan de forma intercambiable aquí. Para el propósito de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias completas para propósitos de comparación óptima. Con el fin de utilizar el alineamiento entre las dos secuencias pueden introducirse brechas en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando. Tal alineamiento se lleva a cabo en la longitud completa de las secuencias que están siendo comparadas.

Alternativamente, el alineamiento puede ser llevado a cabo durante un periodo más corto, por ejemplo, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/con base o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada. Una comparación de secuencias y de terminación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático. La persona experimentada estará advertida del hecho de que hay disponible varios programas de ordenador diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre las dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp. 1 - 44 Addison Wesley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443 - 453). El algoritmo alinea las secuencias de aminoácidos asi como las secuencias de nucleótidos. El algoritmo Needleman-Wunsch ha sido implementado en el programa de ordenador NEEDLE. Para el propósito de esta invención se ha utilizado el programa NEEDLE para el paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp. 276 - 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para secuencias de polipéptidos, se usa EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos se usa EDNAFULL. Pueden especificarse otras matrices.

Los parámetros opcionales utilizados para el alineamiento de la secuencia de aminoácidos son una penalidad de brecha abierta de diez y una penalidad de extensión de brecha de 0.5. La persona experimentada notará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

Definición de la homología global La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre dos secuencias completas sobre la región total alineada incluyendo cualquier brecha o extensión. La homología o identidad entre dos secuencias alineadas se calcula como sigue: el número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total del alineamiento incluyendo las brechas. La identidad definida como aquí puede obtenerse a partir de NEEDLE y está marcada a la salida del programa como "IDENTITY".

Definición de identidad más larga La homología o identidad entre dos secuencias alineadas se calcula como sigue: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por el número total de alineamiento después de la sustracción del número total de brechas del alineamiento. La identidad definida como aquí puede obtenerse a partir de NEEDLE utilizando la opción NOBRIEF y está marcada a la salida del programa como "identidad más larga". Para propósitos de la invención el nivel de identidad (homología) entre dos secuencias (aminoácidos o nucleótidos) se calcula de acuerdo con la definición de "identidad más larga" tal como puede ser llevada a cabo utilizando el programa NEEDLE.

Las secuencias de polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como una "secuencia de requerimiento" para llevar a cabo una búsqueda contra bases de datos de secuencias, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ejecutarse utilizando los programas BLAST. El software para ejecutar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). El BLASTP se utiliza para las secuencias de aminoácidos y el BLASTN para secuencias de nucleótidos. El programa BLAST utiliza como parámetros de fondo : costo para brecha abierta: de fondo = 5 para nucleótidos/ 11 para polipéptidos costo para brecha de extensión: de fondo = 2 para nucleótidos/1 para polipéptidos penalidad para no coincidencia de nucleótidos: de fondo = -3 - recompense para coincidencia en el nucleótido: de fondo = 1 valor esperado: de fondo = 10 tamaño de palabra: de fondo = 11 para nucleótidos/28 para megablast/3 para polipéptidos Además, el grado de identidad local (homología) entre las secuencias de aminoácidos de requerimiento o secuencias de nucleótidos de requerimiento y las secuencias homologas recuperadas se determina mediante el programa BLAST. Sin embargo, solo se comparan aquellos segmentos de secuencia que dan una coincidencia por encima de un cierto umbral. De acuerdo con lo anterior el programa calcula solamente para estos segmentos coincidentes. Por lo tanto la identidad calculada de esta manera se denomina como identidad local.

Hibridación Tal como se utiliza aquí, el término "hibridación selectiva", "híbrida selectivamente" y términos similares pretenden describir condiciones para hibridación y lavado bajo los cuales las secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, o más preferiblemente al menos aproximadamente 99% de homología uno con otro permanecen hibridados típicamente uno a otro. Es decir, tales secuencias hibridantes pueden compartir al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al- menos aproximadamente 98%, o más preferiblemente al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia .

Un ejemplo preferido no limitante de tales condiciones de hibridación es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguido por 1 o más lavados en SSC IX, SDS al 0.1% a aproximadamente 50°C, preferiblemente a aproximadamente 55°C, preferiblemente a aproximadamente 60°C y aún más preferiblemente a aproximadamente 65°C.

Condiciones de alta restricción incluyen, por ejemplo, hibridación aproximadamente 68°C en 5 X SSC/5 X solución de Denhardt/ SDS al 1.0% y lavado en 0.2 X SSC/SDS al 0.1% a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado puede ejecutarse a 42°C.

La persona experimentada en la técnica ' sabrá cuales condiciones aplicar para condiciones de hibridación con restricción y altamente restrictivas. En la técnica hay disponible una guia adicional con respecto a tales condiciones fácilmente, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds. ) , 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

Desde luego, un polinucleótido que hibridiza solamente a una secuencia poliA (tal como el segmento 3' terminal poli (A) de ARNm) , o con un estiramiento complementario de residuos T (o U) no se incluiría en un polinucleótido de la invención utilizado para hibridar específicamente a una porción del ácido nucleico de la invención, puesto que tal polinucleótido hibridaría a una molécula de ácido nucleico que contiene un estiramiento poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de doble cadena) .

En una metodología típica, las bibliotecas de ADNc construidas a través de otros organismos, por ejemplo, un hongo filamentoso, en particular de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo del género Penicillium puede ser seleccionado como Penicillium decumbens .

Por ejemplo, las cepas de Penicillium pueden seleccionarse para polinucleótidos homólogos TEMER02270- por análisis de inmunoprecipitación Northern. Por detección de' los transcriptos homólogos a los polinucleótidos' de acuerdo con la invención, las bibliotecas de ADNc pueden construirse a partir de ARN aislado de la cepa apropiada, utilizando técnicas estándar bien conocidas para los experimentados en el arte. Alternativamente, una biblioteca de ADN genómica total puede ser seleccionada utilizando una sonda capaz de hibridar a un polinucleótido TEMER02270 de acuerdo con la invención .

Las secuencias genéticas homologas pueden aislarse, por ejemplo, llevando a cabo PCR utilizando dos reservas de cebadores dé oligonucleótidos degenerados diseñados sobre la base de secuencias de nucleotidos tal como se explica aquí.

El molde para la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción reversa de ARNm preparado a partir de cepas conocidas o de las que se sospecha expresan un polinucleótido de acuerdo con la invención. El producto del PCR puede ser subclonado y secuenciado para asegurar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico TEMER02270 o un equivalente funcional de las mismas. El fragmento PCR puede ser utilizado para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de métodos, conocidos.. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede ser marcado y usado para seleccionar una biblioteca de bacteriófago o ADNc cósmido. Alternativamente, el fragmento marcado puede ser utilizado para seleccionar una biblioteca genómica.

La tecnología de PCR también puede ser utilizada para aislar secuencias de ADN de longitud completa a partir de otros organismos. Por ejemplo, el ARN puede ser aislado, siguiendo procedimientos estándar, a partir de una ' fuente celular o tisular apropiada. Puede llevarse a cabo una reacción de transcripción reversa sobre el ARN utilizando un cebador específico de oligonucleótidos para el extremo 5 ' para el extremo más 5 ' del fragmento amplificado para cebar la síntesis de la primera cadena.

Al híbrido de ARN/ADN resultado se le puede ser añadir una "cola" (por ejemplo, con guanina) usando una reacción de transferasa terminal estándar, el híbrido puede ser digerido con RNasa H, y la síntesis de la segunda cadena puede ser cebada (por ejemplo, con un cebador poli-C) . Así, las secuencias de ADNc corriente arriba del fragmento amplificado pueden aislarse fácilmente. Para una revisión de las estrategias de clonación útiles véase por ejemplo, Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra.

Vectores Otro aspecto de la invención es pertinente a vectores, incluyendo vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido TEMER02270 o un equivalente funcional del mismo y métodos para hacer crecer, transformar o transfectar tales vectores en una célula hospedera adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las cuales ocurre la expresión de un polipéptido de la invención. Tal como se utiliza aquí, el 'termino "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazada .

Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector puede ser usado para replicar el ácido nucleico en una célula hospedero compatible. Asi, en una realización adicional, la invención provee un método para hacer polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedero compatible y haciendo crecer la célula hospedera bajo condiciones que generan la replicación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula hospedera. Más adelante. se describen células hospederas adecuadas.

El vector en el cual el cásete de expresión o el polinucleótido de la invención se inserta puede ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimiento de ADN recombinante, y la selección del vector dependerá frecuentemente de la célula hospedera en la cual va a ser introducido.

Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, introduce una célula hospedera, se integre en el genoma de la célula hospedera y se replique junto con el o los cromosomas en los cuales ha sido integrado.

Un tipo de vector es un "plásmido" el cual se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular en el cual pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedera por introducción- en la célula hospedera, y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" pueden ser utilizados aquí de forma intercambiable puesto que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión tales como cósmidos, vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos de replicación) y vectores fago que prestan funciones equivalentes.

La mayoría de los hongos filamentosos y las levaduras, el vector o constructo de expresión está integrado preferiblemente en el genoma' de la célula hospedera con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también hay disponibles vectores episomales adecuados en los cuales el constructo de expresión puede ser incorporado para expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los cuales incluyen vectores derivados de los plásmidos 2µ y pKDl de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMÁ1 de Aspergillus) . En el caso de que los constructos de expresión estén integrados en el genoma de las células hospederas, los constructos se integran bien en lugares aleatorios del genoma, o en lugares objetivo predeterminados utilizando recombinación homologa, en cuyo caso, los lugares objetivo comprende preferiblemente un gen altamente expresado .

De acuerdo con lo anterior, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, virus papova, virus de vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de seudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.

· Los vectores de acuerdo con la invención pueden utilizarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN utilizarse para transfectar o transformar una célula hospedera. El vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo, utilizando secuencias reguladoras promotoras T7 y T7 polimerasa.

Un vector de la invención puede comprender dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo para sobreexpresión .

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprende un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedera, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospederas que se van a utilizar para la expresión, las cuales están enlazadas operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que se va a expresar.

Dentro de un vector, tal como un vector de expresión, "enlazado operativamente" se entiende con el significado que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la secuencia regladora o secuencias reguladoras de una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedera donde se introduce el vector en. la célula hospedera) , es decir, el término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar a su manera prevista. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de expresión (enlazado operativamente) a una secuencia codificante se posiciona de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se alcanza bajo condiciones compatibles con las secuencias de control o las secuencias están dispuestas de tal manera que funcionan en concierto para su propósito buscado, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

Un vector o constructo de expresión para una célula hospedera dada puede comprender asi los siguientes elementos enlazados operativamente uno a otro en un orden consecutivo desde el extremo 5' hasta el extremo 3' con respecto a la cadena de codificación de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en una célula hospedera dada; (2) opcionalmente, una secuencia de señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula hospedera dada hasta un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN de la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa; y preferiblemente también (4) una región de terminación de la transcripción (terminadora) capaz de terminar la corriente de transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

Corriente abajo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención puede haber una región 3' no traducida que contiene uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo un terminador) . El origen' del terminador es menos critico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo para la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente se utiliza un terminador de levadura en células hospederas de levadura y se usa un terminador fúngico filamentoso en células hospederas fúngicas filamentosas. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula hospedera (en la cual se va a expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido) . En la región transcrita, puede estar presente un sitio de enlazamiento de ribosoma para la traducción. La porción de codificación de los transcriptos maduros expresada por los constructos incluirá una AUG de iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación apropiadamente posicionado en el extremo del polipéptido que se va a traducir .

La expresión potenciada del polinucleótido de la invención también puede ser lograda mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, guías de secreción y/o terminadoras , las cuales pueden servir para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de los polipéptidos de interés a partir del hospedero de expresión y/o para proveer el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.

Será evidente para las personas experimentadas en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula hospedera que se va a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, tales como los vectores de expresión, de la invención pueden ser introducidos en células hospederas para producir así proteínas objetivo, codificados por ácidos nucleicos tal como se describe aquí (por ejemplo, polipéptidos TEMER02270, formas mutantes de polipéptidos TEMER02270, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos. Los vectores, tales como los vectores de expresión recombinantes de la expresión pueden diseñarse para la expresión de polipéptidos de TEMER02270 en células procariotas o eucariotas.

Por ejemplo, los polipéptidos TEMER02270 pueden ser expresados en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) , hongos filamentosos, células de levadura o células de mamíferos. Células hospederas adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Aquí más adelante se describen ejemplos representativos de hospederos adecuados.

Los medios de cultivo y condiciones adecuadas para las células hospederas antes descritas son conocidas en la técnica.

El término "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se definen aquí para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser nativa o foránea para la secuencia de ácidos nucleicos de la invención que codifica un polipéptido. Tales secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, una guía, unas secuencias de iniciación óptima de la traducción (tal como lo describe ozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867 - 19870), una secuencia de señal de secreción, una secuencia propéptido, una secuencia de poliadenilación, un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen típicamente un promotor, y señales de detención transcripcional y de traducción. Tal como se definió más arriba, el término "enlazado operativamente" se define aquí como una configuración en la cual una secuencia de control es colocada apropiadamente en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de tal manera que la secuencia de control dirija la producción de un polipéptido.

Las secuencias de control pueden proveerse con enlazantes para el propósito de introducir sitios de restricción específicos' que faciliten la unión de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido. El término "enlazado operativamente" se define aquí como una configuración en la cual una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición con respecto a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de tal manera que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos la cual es reconocida por una célula hospedera para expresión de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales, las cuales median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos la cual muestra actividad transcripcional en la célula incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien sea homólogos o heterólogos para la célula .

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por células fúngicas filamentosas para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador, .el cual sea funcional en la célula, puede utilizarse en la presente invención.

La secuencia de control puede ser también un terminador. Los terminadores preferidos para células fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes que codifican la A. oryzae TAKA amilasa, A. niger glucoamilasa (glaA) , A. nidulans antranilato sintasa, A. niger alfa-glucosidasa, gen trpC y Fusarium oxysporum proteasa similar a la tripsina.

La secuencia de control también puede ser una secuencia guia adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por parte de la célula fúngica filamentosa. La secuencia guia está enlazada operativamente al terminal 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia guia, la cual es funcional en la célula puede ser utilizada en la presente invención. Guias preferidas para células fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes que codifican A. oryzae TAKA amilasa y A. nidulans triosafosfatoisomerasa y A. niger glaA.

Otras secuencias de control pueden aislarse a partir del gen Penicillium IPNS, o del gen pcbC, el gen beta tubulina. Todas las secuencias de control citadas en WO 01/21779 se incorporan aquí como referencia.

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y la cual, cuando se transcribe, es reconocida por la célula fúngica filamentosa como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación, la cual es funcional en la célula, puede utilizarse en la presente invención. Secuencias de poliadenilación preferidas para células fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes que codifican A. oryzae TAKA amilasa, A. niger glucoamilasa, A. nidulans antranilato sintasa, Fusarium oxisporum proteasa similar a la tripsina y A. niger alfa-glucosidasa .

Cuando el polipéptido de acuerdo con la invención va a ser secretado desde la célula hospedera hacia el medio de cultivo puede agregarse una secuencia de señal apropiada al polipéptido con el fin de dirigir el polipéptido sintetizado de novo a la ruta de secreción de la célula hospedera. La persona experimentada en la técnica sabe seleccionar una secuencia de señal apropiada- para un hospedero especifico. La secuencia de señal puede ser nativa para la célula hospedera, o puede ser foránea para la célula hospedera. Como ejemplo, puede usarse una secuencia de señal a partir de un polipéptido nativo para la célula hospedera. Preferiblemente, dicho polipéptido nativo es un polipéptido altamente segregado, es decir, un polipéptido que es secretado en cantidades superiores al 10% de la cantidad total de polipéptido que está siendo secretada. Las secuencias de señal usadas preferiblemente de acuerdo con la invención son por ejemplo: pmeA.

Como alternativa para una secuencia de señal, el polipéptido de la invención puede ser fusionado para secretar un polipéptido transportador o una parte del mismo. Tal constructo quimérico está dirigido a la ruta de secreción por medio de la secuencia de señal del polipéptido transportador, o parte del mismo. Además, el polipéptido transportador proveerá un efecto estabilizante al polipéptido de acuerdo con la invención y/o puede potenciar la solubilidad. Tal polipéptido transportado puede ser cualquier polipéptido. Preferiblemente, se usa como polipéptido transportador un polipéptido altamente secretado. El polipéptido transportador puede ser nativo o foráneo para el polipéptido de acuerdo con la invención. El polipéptido transportador puede ser nativo o puede ser foráneo para la célula hospedera. Ejemplos de tales polipéptidos transportadores son glucoamilasa, la secuencia prepro del factor alfaCoincidente, dominio de enlazamiento de celulosa de la proteina A de enlazamiento a celulosa de Clostridium cellulovorans, glutationa S-transferasa, dominio de enlazamiento a la quitina de la quitinasa Al del Bacillus circulans, domini de enlazamiento a la maltosa codificado por el gen malE de E. coli K12, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Un polipéptido transportador preferido para expresión de tal constructo quimérico en células de Aspergillus es la glucoamilasa. La proteina portadora y el polipéptido pueden contener una estructura de aminoácido especifica para facilitar el aislamiento del polipéptido. El polipéptido de acuerdo con la invención puede ser liberado mediante un agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de tal estructura de aminoácido es el sitio de escisión de proteasa KEX, el cual es bien conocido para una persona experimentada en la técnica.

Puede utilizarse una secuencia de señal para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias de señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos, los cuales son escindidos generalmente a partir de la proteína madura durante la secreción en uno o más eventos de escisión. Tales péptidos de señal contienen sitios de procesamiento que permiten la escisión de la secuencia de señal a partir de las proteínas maduras a medida que pasan a través de la ruta excretora. La secuencia de señal dirige la secreción de la proteína, tal como a partir de una hospedera eucariota en el cual es transformado el vector de expresión, y la secuencia de señal es escindida subsecuente o concurrentemente. La proteína puede ser purificada entonces fácilmente a partir del medio extracelular por métodos conocidos. Alternativamente, la señal de secuencia puede estar enlazada a la proteína de interés utilizando una secuencia, lo cual facilita la purificación, tal como con un dominio GST. Así, por ejemplo, la secuencia que codifica el polipéptido puede ser fusionada a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido, lo cual facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, así como el marcador provisto en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente . Tal como se describe en Gentz et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821 - 824 (1989), por ejemplo, la hexahistidina provee una purificación conveniente de la proteina de fusión. El .marcador HA es otro péptido útil para la purificación la cual corresponde a un epitopo derivado de la proteina hemaglutinina de la influenza, lo cual ha sido descrito por Wilson et al., Cell 37: 767' (1984), por ejemplo.

Preferiblemente, una proteina de fusión TEMER02270 de la invención es. producida por técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptido se ligan entre si en-marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando términos romos o extremos escalonados para ligación, digestión de enzimas de restricción para proveer términos apropiados, llenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede ser sintetizado por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de los fragmentos de gen pueden llevarse a cabo utilizando cebadores ancla, los cuales dan lugar a excedentes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos los cuales pueden ser fusionados subsecuentemente y rearaplificados para generar una secuencia de genes quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John iley & Sons: 1992). Por otra parte, muchos vectores de expresión están disponibles comercialmente que ya codifican una unidad estructural de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica TEMER02270 puede ser clonado en tal vector de expresión de tal manera que la unidad estructural de fusión esté unida en marco a la proteina TEMER02270.

Preferiblemente, la eficiencia de la integración direccionada hacia el genoma de la célula hospedera, es decir la integración en un sitio objetivo predeterminado, se incrementa por las capacidades de recombinación homologas aumentadas de la célula hospedera. Tal fenotipo de la célula involucra preferiblemente un gen hdfA o hdfB deficiente tal como se describe en O2005/095624. La WO2005/095624 divulga un método preferido para obtener una célula fúngica filamentosa que comprende una eficiencia incrementada de la integración direccionada.

Opcionalmente, la célula hospedera comprende una respuesta de proteina no plegada elevada (UPR) en comparación con la célula tipo silvestre para potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. La UPR puede ser incrementada por técnicas descritas en US200 /0186070A1 y/o US2001/0034045A1 y/o WO01/72783A2 y/o WO2005/123763. Más específicamente, el nivel de proteína de HACl y/o IRE1 y/o PTC2 ha sido modulado, y/o la proteína SEC61 ha sido manipulada con el fin de obtener una célula hospedera que tenga una UPR elevada.

Alternativamente, en combinación con una UPR elevada, la célula hospedera se modifica genéticamente para obtener un fenotipo que despliega expresión de proteasa y/o secreción de proteasa inferior en comparación con la célula tipo silvestre con el fin de potenciar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. Tal fenotipo puede ser obtenido por supresión y/o modificación y/o inactivación de un regulador transcripcional de la expresión de las proteasas. Tal regulador transcripcional es por ejemplo prtT. La disminución de la expresión de las proteasas por modulación del prtT puede llevarse a cabo por técnicas descritas en US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que despliegue expresión de proteasa y/o secreción de proteasa y/o secreción de proteasa inferiores, la célula hospedera despliega un fenotipo deficiente en oxalato con el fin de potenciar el rendimiento, de la producción de un polipéptido de interés. Un fenotipo deficiente en oxalato puede obtenerse por técnicas descritas Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que despliegue expresión de proteasa y/o secreción de proteasa inferiores y/o deficiencia en oxalato, la célula hospedera despliega una combinación de diferencias fenotipicas comparadas con la célula silvestre para potenciar el rendimiento de la producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir, pero no se limitan a, expresión disminuida de glucoamilasa y/o alfa amilasa A neutra y/o alfa amilasa B neutra, proteasa, y ácido oxálico hidrolasa. Dichas diferencias fenotipicas desplegadas en la célula hospedera pueden obtenerse por modificación genética de acuerdo con las técnicas descritas en US2004/0191864A1.

Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que despliega expresión de proteasa y/o . secreción de proteasa inferiores y/o deficiencia de oxalato y una combinación de diferencias fenotipicas en comparación con la célula silvestre para potenciar el rendimiento de la producción del polipéptido de interés, la célula hospedera despliega una eficiencia en genes de toxina, desactivando la capacidad de la célula hospedera fúngica filamentosa para expresar toxinas. Tales toxinas incluyen, pero no se limitan a ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazónico, ácido 3-nitropropiónico, emodina, malformina, aflatoxinas y ácidos secalónicos. Tal deficiencia es preferiblemente tal como la que se describe en WO2000/039322.

(Sobre) expresión En una realización preferida, los polinucleótidos de la presente invención tal como se describen aquí pueden ser sobreexpresados en una cepa microbiana de la invención en comparación con la cepa microbiana progenitora en la cual dicho gen no ' está sobreexpresado . La sobreexpresión de una secuencia de polinucleótidos se define aquí como la expresión de dicho gen de secuencia que es el resultado de una actividad de la enzima codificada por dicha secuencia en una cepa microbiana que tiene al menso aproximadamente 1.5 veces la actividad de la enzima en el progenitor microbiano. Preferiblemente, la actividad de dicha enzima es al menos aproximadamente 2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 3 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces la actividad de la enzima en el microbioprogenitor .

El vector puede incluir adicionalmente secuencias que flanquean el polinucleótido que da lugar a ARN el cual-comprende secuencias homologas a la secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedera.

Un vector de clonación integrador puede integrarse aleatoriamente o en un sitio objetivo predeterminado en el cromosoma de la célula hospedera en el cual se va a integrar. En una realización preferida de la invención, un vector de clonación integrador puede comprender un fragmento de ADN que es homólogo a una secuencia de ADN en un sitio objetivo predeterminado en el genoma de la célula hospedera para direccionar la integración del vector de clonación a este sitio predeterminado. Con el fin de promover la integración direccionada, el vector de clonación puede ser linealizado preferiblemente antes de la transformación de la célula hospedera. La linealización puede ser ejecutada preferiblemente de tal forma que al menos uno pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonación esté flanqueado por secuencias homologas al sitio objetivo. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el sitio objetivo es preferiblemente al menos 0,1 kb, tal como aproximadamente al menos 0.2 kb, más preferiblemente al menos 0.5 kb aproximadamente, incluso más preferiblemente al menso aproximadamente 1 kb, lo más preferiblemente al menos aproximadamente 2 kb. Preferiblemente, las cepas hospederas progenitoras pueden ser modificadas para obtener una frecuencia mejorada de la integración de ADN direccionada tal como se describe en WO05/095624 y/o WO2007/115886.

El ejemplo de supresión provisto en la presente invención, utiliza el promotor del gen como flanco 5' y el gen como el flanco 3' para insertar un marcador de selección entre el promotor y el gen, perturbando con ello (por ejemplo, inactivando la funcionalidad) la transcripción del gen. Las secuencias genéticas dadas más arriba pueden ser utilizadas para hacer genes inactivados funcionalmente similares. Los genes pueden ser divididos en dos, produciendo un flanco 5' y un flanco 3' , pero el gen también puede ser utilizado para clonar un trozo más grande, del ADN genómico que contiene el promotor y las regiones terminadoras del gen, las cuales pueden funcionar como flanco 5' y flanco 3' .

El sistema vector puede ser un vector sencillo, tal como un plásmido sencillo, o dos o más vectores, tal como dos o más plásmidos, los cuales juntos contienen el ADN total que va a ser introducido en el genoma de la célula hospedera.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proveer la producción del ARN antisentido.

El vector de ADN puede ser introducido en células procariotas o eucariotas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal como se utilizan aquí, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo ADN) en una célula hospedera, incluyendo coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio. La transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección catiónica mediada por lipidos o electroporación . ' Métodos adecuados para transformar o transfectar células hospederas pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) , Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

Para - una transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección utilizados, solamente una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce en general un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospederas junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a aquellos que confieren resistencia a fármacos o que complementan un defecto en la célula hospedera. Incluyen, por ejemplo, genes marcadores versátiles que pueden ser utilizados para la transformación de la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras tales como genes de acetamilasa o ADNc (los genes amdS, niaD, facA o ADNc a partir de A. nidulans, A. oryzae o A. niger) , o genes que proveen resistencia a antibióticos tales como G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, metotrexato, resistencia a la fleomicina orbenomil (benA) . Alternativamente, los marcadores de selección específica pueden ser utilizados tales como marcadores auxotróficos los cuales requieren cepas hospederas mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (a partir de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (a partir de A. nidulans o A. niger) , argB (a partir de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida el marcador de selección se suprime de la célula hospedera transformada después de la introducción del constructo de expresión de tal manera que se tengan células hospederas transformadas capaces de producir el -polipéptido las cuales están libres de genes marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC) , orotidina-5 ' -fosfatodecarboxilasa (pvrA) , el gen de resistencia bacteriana G418 (este también puede ser utilizado en levaduras pero no en hongos), el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) , el gen de resistencia a la nurceotricina natl de Streptomyces nursei, el gen resistente a la piritiamina ptrA de Aspergillus oryzae y el gen uidA de E. coli, que codifica ß-glucuronidasa (GUS) . Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizados para transfectar o transformar una célula hospedera.

La expresión de las proteínas en procariotas se ejecuta frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de bien sea la expresión de proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, por ejemplo, al terminal amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína recombinante 3) para ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en purificación por afinidad. Frecuentemente, en vectores de expresión de fusión se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión de la unidad estructural de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante a partir de la unidad estructural de fusión subsecuente a la purificación de la proteína de fusión.

Tal como se indicó, los vectores de expresión contendrán preferiblemente marcadores seleccionables . Tales marcadores incluirán resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomisina para cultivos de células eucariotas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivos en E. coli y otras bacterias .

Los vectores preferidos para uso en bacterias se divulgan por ejemplo en WO-A1-2004 /074468 , los cuales se incluyen aquí como referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para la persona experimentada en la técnica .

La secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio plasmático o en el ambiente extracelular, puede incorporarse una señal de secreción apropiada en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas .

El polipéptido TEMER02270 puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solamente señales de secreción si no también regiones funcionales heterólogas adicionales. Asi, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados puede agregarse al terminal N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedera, durante la purificación o durante la manipulación y almacenamiento subsecuente. También pueden agregarse unidades estructurales péptido al polipéptido para facilitar la purificación.

La invención provee «un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos obtenible por la expresión del polinucleótido de SEQ ID NO : 1 en un hospedero apropiado. También un péptido o polipéptido que comprende una variante de los polipéptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, está comprendido dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en el término "polipéptidos de acuerdo con la invención".

El término "péptido variable" o "polipéptido variable" se define aquí como un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamiento de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido o polipéptido, respectivamente. De acuerdo con lo anterior, un péptido de señal variable es un péptido de señal que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamiento de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en el péptido de señal.

El término "polinucleótido" es idéntico al término "molécula de ácido nucleico" y pueden leerse aquí de manera intercambiable. El término se refiere a una molécula de polinucleótido, la cual es un ácido ribonucleico (ARN) o una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) , bien sea de cadena sencilla o cadena doble. Un polinucleótido puede estar presente bien sea en forma aislada, o puede estar comprendido en moléculas de ácidos nucleicos recombinantes o vectores, o puede estar comprendido en una célula hospedera.

El término "polinucleótido variante" se define aquí como un polinucleótido que contiene una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamiento de uno o más nucleótidos en una o más posiciones específicas en el polinucleótido.

Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (tal como se le conoce comúnmente) y cada término puede ser utilizado de manera intercambiable, según el contexto lo requiera, para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados por enlaces peptidilo. La palabra "polipéptido" se utiliza aquí para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos aquí están escritos de izquierda a derecha y en la dirección del terminal amino al terminal carboxi. El código de una letra de los aminoácidos usados aquí es conocido comúnmente en la técnica y puede encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .

Por polipéptido o proteína "aislado" se entiende un polipéptido o proteína retirado de su ambiente nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas producidos por vía recombinante expresados en células hospederas se consideran aislados para el propósito de la invención puesto que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola etapa descrito en Smith and Johnson, Gene 67: 31 - 40 (1988).

El polipéptido TEMER02270 celobiohidrolasa de acuerdo con la invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en la técnica. Más preferiblemente, la cromatografía líquida de alto rendimiento ("HPLC") se emplea para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados de manera natural, productos de procedimientos sintéticos químicos y productos producidos' por técnicas recombinantes a partir de un hospedero procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados . Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de un proceso mediado por el hospedero ..

La invención también representa fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la invención .

Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas a partir de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER02270 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2), la cual incluye menos aminoácidos que el polipéptido de longitud completa pero exhibe al menos una actividad biológica del polipéptido de longitud completa correspondiente. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o estructura con al menos una actividad de polipéptido TEMER02270.

Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la invención puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más aminoácidos en longitud o al menos aproximadamente 100 aminoácidos, al menos aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos de longitud, o de una longitud hasta el número . total de aminoácidos de polipéptidos de la invención. Además, otras porciones biológicamente activas, en las cuales se suprimen otras regiones de polipéptido, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse para una o más actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención .

La invención también representa fragmentos de ácidos nucleicos que codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores del polipéptido TEMER02270.

Polipéptidos En otro aspecto de la invención, se proveen polipéptidos TEMER02270 mejorados. Los polipéptidos TEMER02270 mejorados son polipéptidos donde al menos se mejora una actividad biológica. Tales polipéptidos pueden obtenerse por mutaciones de introducción aleatoria junto con toda la parte de la secuencia codificante de TE ER02270, tal como por ejemplo mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser expresados recombinantemente o seleccionados en cuanto a su actividad biológica.

Variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención que llevan a una función mejorada de celobiohidrolasa pueden obtenerse mediante los genes correspondientes de la presente invención. Entre tales modificaciones se incluyen: 1. PCR susceptible de error para introducir mutaciones aleatorias, seguido por una selección de variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cinéticas mej oradas . 2. Confusión familiar de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima celobiohidrolasa, seguida por una selección de las variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cinéticas mejoradas.

Las variantes de los genes de la presente invención que llevan a un nivel incrementado de ARNm y/o polipéptido que dan como resultado más actividad de celobiohidrolasa, pueden obtenerse mediante las secuencias de polinucleótidos de dichos genes. Entre dichas modificaciones se incluyen: 1. Mejorar la utilización del codón de tal manera que los codones estén (óptimamente) adaptado al hospedero microbiano progenitor. 2. Mejorar el uso del par de codones de tal .manera que los codones estén adaptados (óptimamente) al hospedero microbiano progenitor. 3. Adición de secuencias de estabilización a la información genómica que codifica polipéptidos celobiohidrolasa que da como resultado moléculas de ARNm con una vida media incrementada.

Métodos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas o niveles incrementados de ARN o polipéptidos se describen en WO03/010183 en WO03/01311. Métodos preferidos para utilizar la utilización de codón en cepas microbianas padre se describen en PCT/EP2007/0559 . Los métodos preferidos para la adición de la estabilización de los elementos de los genes que codifican la celobiohidrolasa polipéptido de la invención se describen en WO2005/059149.

En una realización preferida, el polipéptido TEMER02270 proporciona una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polipéptido TEMER02270 es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos que codifican -para SEQ ID NO: 2 y retiene al menos una actividad biológica de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID N0:2, si bien difiere en secuencia de aminoácidos debido a la variación natural o mutagénesis como -se describió.

En una realización adicional . preferida, el polipéptido TEMER02270 tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácidos nucleicos aislado capaz de hibridar a un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N0:1, preferiblemente bajo condiciones de hibridación altamente restrictivas.

De acuerdo con lo anterior, el polipéptido TEMER02270 es preferiblemente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o más homólogo a la .secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y, típicamente, retiene al menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2.

Equivalentes funcionales de un polipéptido de acuerdo con la invención también pueden ser identificados' por ejemplo por bibliotecas combinacionales de selección de mutante, por ejemplo, mutantes de truncado o de polipéptido de la invención en cuanto a la actividad de celobiohidrolasa . En una realización, se genera una biblioteca de variantes variegada por mutagénesis combinacional en el nivel de ácido nucleico. Una biblioteca variegada de variantes puede ser producida por, por ejemplo, enzimáticamente ligando una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes tales que un conjunto de secuencias degeneradas potenciales de polipéptido es expresable como polipéptido individual o alternativamente, como una proteina de fusión más grande (por ejemplo, para despliegue de fagos) . Hay una variedad de métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la invención a partir de un oligonucleótido degenerado. A partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerado. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (.véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477) . .

Además, las bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la invención pueden utilizarse para generar una población ' variegada de polipéptidos para seleccionar una selección subsecuente de variantes. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de secuencias codificadoras pueden generarse tratando un fragmento de PCR de cadena doble de la secuencia codificante de interés con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre el muescado solamente de forma aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble cadena, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble cadena la cual puede incluir pares sentido/antisentido a partir de diferentes productos muescados, eliminando porciones de cadena sencilla de dúplex reformados por tratamiento con SI nucleasa, y ligando la biblioteca de fragraento resultante en un vector de expresión. Mediante este, método, puede derivarse una biblioteca de expresión la cual codifica fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteina de interés .

Se conocen varias técnicas en el arte para seleccionar productos genéticos de bibliotecas combinacionales hechas por mutaciones puntuales de truncado, y para seleccionar bibliotecas de ADNc para productos genéticos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son adecuadas para análisis de alto rendimiento, .para bibliotecas genéticas grandes de selección incluyen típicamente la clonación de la biblioteca del gen en- vectores de expresión replicables, células de transformación apropiadas con la biblioteca apropiada de vectores, y expresión de los genes combinaciones, bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Mutagénesis de ensamblajes recursivos (REM) una técnica que potencia la frecuencia de los imitantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con ensayos de selección para identificar variantes de un polipéptido de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7811 - 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327 - 331).

Además de la secuencia genética del TEMER02270 mostrada en SEQ ID N0:1, será evidente para la persona experimentada en la técnica que pueden existir polimorfismos en la secuencia de ADN dentro de una población dada, los cuales pueden llevar a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER02270. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en .células de diferentes poblaciones o dentro de una población debido a una variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales .

Los fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención también pueden comprender polinucleótidos que no codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales pueden utilizarse como cebadores de hibridación o cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tenga una actividad TEMER02270 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen que codifica el polipéptido TEMER02270, o variantes alélicas del mismo a partir de una biblioteca de ADNc por ejemplo a partir de microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (por ejemplo, FISH) para dispersiones cromosómicas en metafase para proveer una localización cromosómica precisa del gen TEMER02270 tal como se describe en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) análisis de inmunoprecipitación Norther para detectar la expresión de ARNm de TEMER02270 en tejidos y/o células específicos y (4) sondas y cebadores que pueden ser utilizados como herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable a la sonda TEMER02270 en una muestra biológica dada (por ejemplo un tejido).

También se abarca con la invención un método para obtener un equivalente funcional de un gen TEMER02270. Tal método involucra obtención de una sonda marcada que incluye un ácido nucleico aislado el cual codifica toda o una porción de la secuencia de polipéptidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma. La selección de una biblioteca de fragmentos de ácidos nucleico con la sonda marcada bajo condiciones que permiten la hibridación de la sonda a fragmentos de ácidos nucleicos en la biblioteca, formando por lo tanto dúplex de ácidos nucleicos y preparando una secuencia genética de longitud completa para los fragmentos de ácidos nucleicos en cualquier dúplex marcado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER02270.

En una realización, un acido nucleico TE ER02270 de la invención es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 05%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al ménos 99% o más homólogo a una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO:l o el complemento de la misma.

Se proveen adicionalmente : células hospederas que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedera. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula hospedera significa que el polinucleótido no se presenta de manera natural en el genoma de la célula hospedera o que el polipéptido no es producido de manera natural por esa célula.

En otra realización, la invención presenta células, por ejemplo, células hospederas transformadas o células hospederas recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la cual (o en uno de cuales ancestros se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen tanto células eucariotas como procariotas, -por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras y similares, siendo especialmente preferidas de hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger ,o Talaromyces emersonii .

Una célula hospedera puede ser escogida de tal manera que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto genético en una forma deseada, específica. Tales modificaciones, (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteínicos pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.

Diversas células hospederas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación translacional de proteínas y productos genéticos. Líneas celulares o sistemas hospederos apropiados familiares para los experimentados en la técnica de la biología molecular y/o la microbiología pueden ser escogidos para asegurar la modificación deseada y correcta y el procesamiento de la proteína foránea expresada. Con este fin, pueden usarse las células hospederas eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto genético. Tales células hospederas son bien conocidas en la técnica.

Si se desea, puede utilizarse una célula como la descrita anteriormente en la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención. Tal método comprende típicamente cultivar una célula hospedera (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente) bajo condiciones para proveer expresión (por medio de un vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y recuperar opcionalmente el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de expresión. El vector puede ser utilizado para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. Así en una realización adicional, la invención provee un método para hacer un polinucleótido de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedera compatible y cultivando la célula hospedera bajo condiciones que lleven a la replicacion del vector. El vector puede ser recuperado a partir de la célula hospedera.

Preferiblemente el polipéptido se produce como una proteina secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura de polipéptido en el constructo de expresión se enlaza operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal.

Preferiblemente la secuencia de señal es nativa (homologa) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Alternativamente la secuencia de señal es foránea (heteróloga) a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia de señal es preferiblemente endógena a la célula hospedera en la cual se expresa la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. Ejemplos de secuencias de señal adecuadas para células hospederas de levaduras son secuencias de señales derivadas a partir de genes de levadura de factor a. De la misma forma, una secuencia de señal adecuada para células hospederas fúngicas filamentosas es, por ejemplo, una secuencia de señal derivada a partir de un gen de amiloglucosidasa (AG) fúngico filamentoso, por ejemplo, el gen glaA de A. niger. Éste puede utilizarse en combinación con el promotor de amiloglucosidasa (también denominado (gluco) amilasa ) mismo, asi como en combinación con otros promotores. También pueden utilizar secuencias de señal híbridas dentro del contexto de la presente invención.

Secuencias de guía de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngico (versiones de ambos aminoácidos 18 y 24 de glaA por ejemplo de Aspergillus) , el gen del factor a (levaduras, por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de a-amilasa {Bacillus) .

Los vectores pueden ser transformados o transíectados en una célula hospedera adecuada tal como se describió anteriormente para proveer la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender el cultivo de una célula hospedera transformada con un vector de expresión según se describe más arriba bajo condiciones para proveer la expresión por parte del vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.

Células hospederas La invención provee así células hospederas transformadas o transíectadas con o que comprende un polinucleótido o un vector de la invención. Preferiblemente, el polinucleótido es portador de un vector para la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se escogerán de manera que sean compatibles con dicho vector y puedan ser por ejemplo procariotas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, levaduras o plantas vegetales.

También puede escogerse un hospedero heterólogo en donde el polipéptido de la invención es producido en una forma tal que está sustancialmente libre de otras enzimas degradantes de la celulosa o la hemicelulosa . Esto puede lograrse escogiendo un hospedero que normalmente no produzca tales enzimas.

La invención abarca procesos para la producción del polipéptido de la invención por medio de la invención recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito la secuencia de ADN de la invención puede usarse para la amplificación de genes y/o intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias de señales de secreción, con el fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula hospedera homologa o heterologa adecuada. Una célula hospedera homologa es una célula hospedera que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie que la especie de la cual se deriva la secuencia de ADN. Células hospederas adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. En general, se prefieren las células de levadura sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son ya sea pobremente secretadas a partir de las levaduras o en algunos casos no son procesadas apropiadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levaduras) . En estos casos, debería seleccionarse un organismo hospedero fúngico.

La célula hospedera puede sobreexpresar el polipéptido y las técnicas para la manipulación de la sobreexpresión son bien conocidas. El hospedero puede tener así dos o más copias del polinucleótido que codifica (y el vector puede tener así dos o más copias concordantemente) .

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como hospederos heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas hacia el medio del cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospederos son aquellas de los géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedera de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowía , y Schizosaccharomyces .

Más preferiblemente se selecciona una célula hospedera de levadura del grupo consistente de las especie Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica y Schizosaccharomyces pombe.

Las más preferidas son, sin embargo, células hospederas fúngicas (por ejemplo filamentosas) . Células hospederas fúngicas filamentosas se seleccionan del grupo consistente de los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora , Sporotrichum, Thielavia , Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .

Más preferiblemente una célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie que incluye pero no se limita a Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii , Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris.

Las células hospederas de acuerdo con la invención incluyen células vegetales, y la invención por lo tanto se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas y partes de las mismas, los cuales contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar de forma heteróloga el polipéptido de la invención o pueden contener de forma heteróloga uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o modificada genéticamente) puede por lo tanto tener insertada (por ejemplo de manera estable) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La trasformación de las células vegetales puede llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas, por ejemplo utilizando un plásmido Ti' o Ri de Agrojacteriufl! turnefaciens . El plásmido (o vector) puede contener así secuencias necesarias para infectar una planta, y pueden emplearse derivados de los plásmidos Ti y/o Ri .

Alternativamente, puede efectuarse la infección directa de una parte de una planta tal, como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica la planta que se va a infectar puede ser lesionada, por ejemplo, cortando la planta con una cuchilla o haciendo una punción en la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. Esta herida es inoculada entonces con Agrobacterium. La planta o parte de la planta puede ser cultivada entonces sobre un medio de cultivo adecuado y se deja en desarrollo hasta que se convierta en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en plantas modificadas genéticamente puede lograse utilizando técnicas conocidas, por ejemplo, seleccionando brotes transformados utilizando . un antibiótico y subcultivando los brotes sobre un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas vegetales y similares.

La invención también incluye células que han sido modificadas para expresar el polipéptido de celobiohidrolasa de la invención o una variante del mismo. Tales células incluyen líneas celulares transientes o, preferiblemente eucarióticas superiores estables, tales como células de mamíferos o células de insectos, células eucariotas inferiores, tales como levaduras y células fúngicas (por ejemplo filamentosas) o células procariotas tales como células bacterianas.

También es posible para los polipéptidos de la invención ser expresados de manera transiente en una línea celular en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas los cuales están adaptados para expresar los polipéptidos de acuerdo con la invención también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede efectuarse cultivando los hospederos de expresión microbiana, los cuales han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación con nutrientes convencionales.

Producción de polipéptido/enzima Las células hospederas recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser cultivadas utilizando procedimientos conocidos en el arte. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedera hay disponible condiciones de cultivo que son conducentes a la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad o titulo celular deseados del polipéptido el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera utilizando procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo glucosa, maltosa, melasas, almidón, celulosa, xilano, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelulitica, etc.) una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.), y fuentes nutritivas inorgánicas (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, puede incluirse un inductor (por ejemplo, celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina, oxilogalacturonano) .

La selección del medio apropiado puede estar basada en la selección de la expresión y/o basada en los requerimientos regulatorios del constructo de expresión. Tales medios son conocidos por los experimentados en la técnica. El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorecen los hospederos de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes .

La producción del polipéptido por el hospedero transformado (fermentación) puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. El tiempo de producción puede extenderse sobre un periodo desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 30 días. Puede ser un proceso por lotes, continuo o por lotes alimentados, adecuadamente una temperatura en el rango de 0 - 100°C o 0 - 80°C, por ejemplo, a partir de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 60°C y/o a un pH de, por ejemplo, aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, o desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el rango de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 55°C y/o un pH desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5.

Las condiciones apropiadas' se seleccionan generalmente con base en la selección del hospedero de expresión y el polipéptido que se va a expresar.

Después de la fermentación, si es necesario, las células pueden retirarse del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de que se ha detenido la fermentación o después de retirar las células, el polipéptido de la invención puede recuperarse entonces y, si se desea, se puede purificar y aislar por medios convencionales.

Composiciones polipéptido/enzima La invención provee una composición que comprende un polipéptido de la invención y una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa.

Cuando el polipéptido de la invención es una celulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención es una hemicelulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.

Cuando el polipéptido de la invención es una pectinasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una hemicelulasa además del polipéptido de la invención.

Una composición de la invención puede comprender una, dos o tres o más clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas las de una endo-1 , 4- -glucanasa (EG) , una exocelobiohidrolasa (CBH) y una ß- glucosidasa (BG) .

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tenga la misma actividad enzimática, por ejemplo, el mismo tipo de actividad de celulasa, hemicelulasa y/o pectinasa tal como es provisto por un polipéptido de la invención .

Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tenga 'un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que la provista por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa provisto por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa provisto por una hemicelulasa/pectinasa adicional.

Aquí, una celulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la celulosa en unidades más pequeñas, bien sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrina y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis.

Aquí, una celulasa es un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, bien sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente a manera de una reacción de hidrólisis.

Aquí, una pectinasa es un polipéptido que es capaz de degradar una pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de ruptura de la pectina en unidades más pequeñas, bien sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente a manera de una reacción de hidrólisis.

De acuerdo con lo anterior, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-ß-? , 4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- (1, 3) (1, ) -glucanasa.

Aquí, una celobiohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1,4-ß-0-glucosídicos en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa a partir de los extremos de las cadenas. Esta enzima también puede denominarse como celulasa 1, 4- -celobiosidasa, 1,4-ß-celobiohidrolasa, 1, 4^-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1, 4^-D-glucanasa, exoglucanasa o exoglucanasa . Puede tener el código EC 3.2.1.91.

Aquí, una endo-ß-?, -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 4-p-D-glucosidico en celulosa, liquenina o ß-Q-glucanos de cereales. Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que contienen también enlaces 1,3. Esta enzima también puede ser denominada como celulasa, avicelasa, ß-1 , 4-endoglucano hidrolasa, ß-1 , 4-glucanase, carboximetil celulasa, celudextrinas, endo-1, 4^-D-glucanas, endo-1 , 4-ß-?-glucanohidrolasa, endo-1, 4^-glucanasa o endoglucanasa . La CEA es aquí una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basada en su estructura 3D se clasifica bajo la familia de las Glicosil Hidrolasa 5 (GH5) . Las actividades conocidas para miembros de la familia GH5 incluyen la quitosanasa (EC 3.2.1.132); ß-manosidasa (EC 3.2.1.25); Celulasa (EC 3.2.1.4); glucano 1,3-, ß-glucosidasa (EC 3.2.1.58); licheninasa (EC 3.2.1.73); glucan endo-1, ß-ß-glucosidasa (EC 3.2.1.75); manan endo-ß-1, 4-mannosidasa (EC 3.2.1.78); endo-ß-?, -xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa ß-l, 4-cellobiosidase (EC 3.2.1.91); endo-ß-l, 6-galactanase (EC 3.2.1.-); ß-l, 3-mananasa (EC 3.2.1.-); endo-ß-?, -glucanasa especifica para xiloglucano (EC 3.2.1.151); manan transglicosilasa (EC 2.4.1.-). CEB es aquí una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que basada en su estructura 3D se clasifica bajo la familia de Glicosil Hidrolasa 7 (GH7) . Actividades conocidas para miembros de la familia GH7 incluyen endo-ß-?, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4); celobiohidrolasa [finalizadora de reducción] (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132); endo-ß-?, 3-1 , -glucanasa (EC 3.2.1.73 ) .

Aquí, una ß-glucosidasa (abreviada BG) (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de residuos ß-D-glucosa no reductores terminales con liberación de ß-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucosidasa y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un -L-arabinósido, a ß-D-xilósido or a ß-D-fucósido . Esta enzima también puede denominarse como amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa.

Aquí, una ß- ( 1 , 3) ( 1 , ) -glucanasa (EC 3.2.2.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4^-glucosidicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3- y 1,4-. Tal polipéptido puede actuar sobre liquenina y ß-D-glucanos de cereales, pero no sobre ß-D-glucanos que contengan solamente enlaces 1,3- o 1,4-. Esta enzima también puede denominarse como liquninasa, 1,3-1,4-ß-D-glucan 4-glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo-ß-?, 3-1, 4 glucanasa, liquenasa o ß-glucanasa de enlace mixto. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, la cual está descrita como endo-1 , 3 ( 4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza los enlaces 1,3- o 1,4- en los beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo de reductor está involucrado en la unión que se va a hidrolizar es sustituido en si mismo en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1, 3-beta-glucanase, laminarinasa, 1, 3- (1, 3; 1, 4) -beta-D-glucan 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Una composición de acuerdo con la invención puede comprender una enzima de la familia GH61 o cualquier otra enzima que tenga actividad potenciadora de la celulasa.

La actividad potenciadora de la celulasa se define aquí como la potenciación de la actividad de al menos una celulasa, y preferiblemente es actividad de GH61. Cuando una actividad de potenciación de la celulasa está presente en una mezcla con una o más celulasas, por ejemplo en una mezcla con celobiohidrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG) potenciará la actividad de estas celulasa lo cual dará como resultado una actividad mayor de la mezcla para degradar la celulosa. Las enzimas en la familia GH61 se clasificaron originalmente como familia dé glicósido hidrolasa con base en la medición de una actividad muy débil de endo-1, -b-D-glucanasa en un miembro de la familia (endoglucasana (EC 3.2.1.4)). La estructura y modo de acción de estas < enzimas es ciertamente no canónica y no pueden considerarse como glicosidasas bona fide. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy sobre la base de su capacidad para potenciar la ruptura de la lignocelulosa cuando se utiliza en conjunción con una celulasa o una mezcla de celulasa. Una revisión de los miembros conocidos de la familia GH61 se da en la Figura 5 de Harris, PV et al, Biochemistry 2010, 49, 3305 - 3316.

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilan esterasa, una feruloil esterasa, a cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .

Aquí, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 4^-D-xilosidicos en xilanos. Esta enzima puede ser denominada también como endo-1, 4^-xilanasa o 1 , 4-p-D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilan endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosidicos en glucuronoarabinoxilanos .

Aquí, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-ß-?-xilanos, para eliminar residuos sucesivos de D-xilosa del término no reductor. Tales enzimas también pueden hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima también puede denominarse como 1,4-ß-xilosidase, 1, 4-^-D-xilan xilohidrolasa, 6??-1,4-ß-xilosidase o xilobiasa.

Aquí, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5)-, arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede ser denominada como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, una -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de los siguiente a partir de: alfa-D-glucuronósido + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también puede denominarse como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosidulonasa . Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónico metilado en 4-0-, el cual también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1 , 2-glucuronosidasa, el cual cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1, 2- (4-0-metil) glucuronosilo.

Aquí, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Tal polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo a partir de xilano polimérico, xilisa acetilada, glucosa acetilada, alfanaftil acetato o p-nitrofenil acetato pero, típicamente, no de triacilglicerol . Tal polipéptido típicamente no actúa sobre mañano acetilado o pectina.

Aquí, _ una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Puede catalizar típicamente la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (feruloilo) a partir de un azúcar esterificado, el cual es usualmente arabinosa en sustratos "naturales". El acetato de p-nitrogenoide ferulato de metilo son sustratos típicamente más pobres. Esta enzima también puede ser denominada como cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico estearasa o hidroxicinamoil esterasa. También puede denominarse como una enzima accesoria de la hemicelulasa, puesto que puede ayudar a las xilanasas y las pectinasas a romper la hemicelulosa y pectina de las paredes celulares de las plantas.

Aquí, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)0 = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también puede denominarse como trans-4-cumailesterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroyl esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también cae dentro de EC 3.1.1.73 de tal manera que puede denominarse como una feruloil esterasa.

Aquí, una -galactosidasa (EC 3.2.1.22) es un polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en cx-D-galactósidos, incluyen oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-flucosidos . Esta enzima también puede denominarse como melibiasa.

Aquí, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-galactosa no reductores terminales en ß-D-gal'actósido . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar OÍ-L-arabinósidos . Esta enzima también puede denominarse como exo- ( l->4 ) -ß-D-galactanasa o lactasa.

Aquí, una ß-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1, -^-D-manosidicos en mananos, galactamananos y glucomananos . Esta enzima también puede denominarse como endo-1, 4^-manosidasa o endo-1, 4-mananasa .

Aquí, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-manosa no reductores terminales en ß-D-manósidos. Esta enzima también puede denominarse como mananasa o manasa.

Una composición de la invención puede comprende cualquier pectinasa, por ejemplo una endopoligalacturonasa, una pectinmetilester.asa, una endogalactanasa, una ß-galactosidasa, una pectinacetil esterasa, una endopectinliasa, pectatoliasa, alfa ramnosidasa, una exogalacturonasa, una e.xopoligalacturonasa, un exopoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa .

Aquí, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1, 4-ot-D-galactosiduronicos en pectatos y otros galacturonatos . Esta enzima también puede denominarse como poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli- -1, -galacturonido glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli (1, 4-a-D-galacturonido) glicanohidrolasa.

Aquí, una pectin metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima también puede ser conocida como pectinesterasa, pectina demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa .

Aquí, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-ß-D-galactosidico en arabinogalactanos . La enzima también puede ser conocida como arabinogalactano endo-1, - ~galactosidasa, endo-1, - ~galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4- -D-galactanohidrolasa .

Aquí, una pectin acetil esterasa se define como una enzima que tiene una actividad de acetil esteras la cual cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos GalUA de la pectina.

Aquí, una endo-pectin liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminadora de (1 4 ) -a-D-galacturonano metil éster para dar oligosacáridos con grupos 4-deoxi-6-0-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como pectinliasa, pectin trans-eliminasa; endo-pectinliasa, polimetilgalacturonico transeliminasa, pectin metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 4 ) -6-O-metil-a-D-galacturonano liasa .

Aquí, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es una enzima capaz de catalizar la escisión eliminadora de (1 4) -a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como poligalacturónico transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina . metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, ácido OÍ-1, 4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo- -?, -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectin trans-eliminasa, ácido poligalacturónico acid trans-eliminasa o (1 4)-a-D-galacturonan liasa.

Aquí, una alfa ramnosidasa (EC · 3.2.1. 0) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la hidrólisis de residuos no reductores terminales de -L-ramnosa en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano. Esta enzima puede ser conocida también como -L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa .

Aquí, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrólisis del ácido péctico desde el extremo no reductor, liberando digalacturonato . La enzima puede ser conocida también como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .

Aquí, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1, 4-a-D-galacturónido) n + H20 = ( 1, 4-a-D-galacturónido) n-1 + D-galacturonato . La enzima también puede ser conocida como galacturano 1,4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli ( 1, 4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa .

Aquí, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminadora de 4- (4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato a partir del extremo reductor del pectato, es decir pectina desesterificada . Esta enzima puede ser conocida como pectato disacárido liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o (1 4 ) -oí-D-galacturonan disacárido-liasa terminadora de reducción.

Aquí, la ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo en una forma endo en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes, consistentes del disacárido [ácido (1, 2-alfa-L-ramnoil- (1, 4) -alfa-galactosilurónico] .

Aquí, ramnogalacturonano liasa es un polipéptido que es capaz de escindir los enlaces a-L-Rhap- (1 4 ) -a-D-GalpA en una forma endo en ramnogalacturonano por beta-eliminación.

Aquí, ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que caracteriza la desacetilación del esqueleto de residuos alternantes de ramnosa y ácido galacturónico en ramnogalacturonano .

Aquí, ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar ácido galacturónico a partir del extremo no reductor de estructuras ramnogalacturonano estrictamente alternantes en una forma endo .

Aquí, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre el xilogalacturonano escindiendo el esqueleto del ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa en una forma endo. Esta enzima también puede ser conocida como xilogalacturonanhidrolasa .

Aquí, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido capaz de actuar sobre los a-L-arabinofuranósidos, -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5)-, arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede ser denominada como oí-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, la endo-arabinasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1, 5-oí-arabinofuranosidicos en 1, 5-arabinanos . La enzima también puede ser conocida como endo-arabinasa, arabinan endo-1, 5-a-L-arabinosidase, endo-1, 5-a-L-arabinanasa, endo- -1, 5-arabanase; endo-arabanasa o 1 , 5-a-L-arabinan 1,5-a-L-arabinanohidrolasa .

Una composición de la invención comprenderá típicamente al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (uno de los cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa . Tal composición puede comprender una o más hemicelulasa y/o una o más pectinasas.

Una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composición de la invención.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas) , así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otras unidades estructurales, tales como azúcares (glicopeptidasas) . Muchas proteasas están caracterizadas bajo EC 3.4, y son adécuadas para uso en la invención e incorporadas aquí como referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen las proteasas pepsina, papaína y serina incluyendo quimiotripcinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas . "Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lipidos, ácidos grasos y acilgricéridos, incluyendo fosfoglicéridos, ligoproteinas, diacilgliceroles y similares. En las plantas, los lipidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lipidos incluyen ceras derivados de ácidos grasos, asi como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden romper la lignina incluyen las ligninperoxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocidas por despolimerizar o de otra manera romper los polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (principalmente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan al grupo siguiente de enzimas: ligninperoxidasas (EC 1.11.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de transferir grupos glicosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además . de transferir un grupo glicosilo de un donante que contiene glicosilo a otro compuesto que contiene glicosilo, el aceptador, las enzimas también pueden transferir el grupo glicosilo al agua como un aceptador. Esta reacción también es conocida como reacción de hidrólisis en vez de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede ser utilizada en una invención es una ß-glucanosiltransferasa . Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de. (1,3) (1,4) glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de la celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronosido, por ejemplo, ß-glucuronósido para producir un alcohol. Muchas glucuronidasas han sido caracterizadas y pueden ser adecuadas para uso en la invención, por ejemplo, ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31) hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato ß-glucuronidasa (3.2.1.128) o -D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición de la invención puede comprender una expansina o una proteina similar a la expansina, tal como swolenina (véase Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202 -4211, 2002) o una proteina similar a la swolenina.

Las expansinas están implicadas en el aflojamiento de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal. Las expansinas han sido propuestas para perturbar los puentes de hidrógeno entre la célula, la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolitica. De esta manera, se cree que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y el agrandamiento de la pared celular. La swolenina, una proteína similar a la expansina contiene un dominio de familia 1 del módulo de enlazamiento de carbohidratos N-terminal (CBD) y un dominio similar a la expansina de C-terminal. Para los propósitos de esta invención, una proteína similar a la expansina o una proteína similar a la swolenina pueden comprender uno o ambos de tales dominios y/o pueden perturbar la estructura de las paredes celulares (tal como perturbar la estructura de celulosa) , opcionalmente se introducen cantidades detectables de azúcares reductores.

Una composición de la invención puede comprender el producto de polipéptido de una proteína que integra celulosa, escafoldina o una proteína similar a la escafoldina, por ejemplo CipA o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum respectivamente.

Las escafoldinas y las proteínas integradas de celulosa son subunidades integradoras multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático . Esto se logra mediante la integración de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión sobre la escafoldina y un dominio de aglomeración sobre cada unidad enzimática. La subunidad escafoldina también porta un módulo enlazante a la celulosa (CB ) que media la unión de celulosoma a su sustrato. Una proteina de integración de escafoldina o celulosa para los propósitos de esta invención puede comprender uno o ambos de tales dominios .

Una composición de la invención puede comprender una proteina inducida por celulosa o una proteina moduladora, por ejemplo, la codificada por el gen cipl o cip2 o agentes similares de Trichoderma reeseico/Hypocrea jecorina (véase Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988 - 31997, 2003). El producto polipeptidico de estos genes son proteínas bimodulares las cuales contienen un modulo enlazante a celulosa y un dominio cuya función o actividad no puede estar relacionada con las familias conocidas de glicosil hidrolasa. Aún así, la presencia de un módulo enlazante de celulosa y la corregulación de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indican actividades no reconocidas previamente con papel potencial en la degradación de la biomasa.

Una composición de la invención puede estar compuesta de un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptidos, o cualquier combinación de esta clase de polipéptidos.

Una composición de la invención puede estar compuesta de polipéptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan polipéptidos, por ejemplo enzimas; (3) caldos complejos (tales como los resultantes del cultivo de una cepa microbiana en los medios, en donde ' las cepas secretan proteínas y enzimas hacia los medios; (4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3); y/o (5) material vegetal que expresa polipéptidos, por ejemplo enzimas. Diferentes polipéptidos, por ejemplo enzimas en una composición de la invención pueden obtenerse a partir de fuentes diferentes.

Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y composiciones de polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo pueden ser utilizados para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables pueden entonces, como parte de un proceso de biocombustibles, ser convertidos en biogás o etanol, butanol, isobutanol, 2-butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente los polipéptidos y sus composiciones pueden utilizarse como enzimas, por ejemplo en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y la pulpa y en formulaciones antibacterianas, en productos farmacéuticos tales como tabletas para la garganta, pastas dentales y enjuagues bucales. Algunos de los usos se ilustraran en más detalle más adelante .

En los usos y métodos descritos más abajo, los componentes de las composiciones descritas más arriba pueden proveerse de manera concomitante (es decir, una composición simple per se) o separada o secuencialmente .

La invención también se relaciona con el uso del polipéptido de celobiohidrolasa de acuerdo con la invención de las composiciones que comprende tal enzima en procesos industriales .

A pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, el polipéptido de celobiohidrolasa de acuerdo con la invención puede representar un cierto número de ventajas significativas sobre enzimas utilizadas actualmente. Dependiendo de la aplicación especifica, estas ventajas pueden incluir aspectos tales como costes de producción más bajo, especificidad más alta hacia el sustrato, antigenicidad reducida, actividades laterales indeseables más bajas, rendimientos más altos cuando se producen en un microorganismo adecuado, rangos de pH y temperatura más adecuados, no inhibición por productos hidrófobos, derivados de la lignina o al menos inhibición del producto o, en el caso de la industria de los alimentos un mejor sabor o textura de un producto final asi como aspectos de grado alimenticio y kosher.

En principio, un polipéptido de celobiohidrolasa o una composición de la invención puede ser utilizada en cualquier proceso que requiera el tratamiento de un material que comprende polisacáridos . Asi, un polipéptido o composición de la invención puede usarse en el tratamiento de material de polisacáridos. Aquí, un material de polisacáridos es un material que comprende o consiste 'esencialmente de uno o, más típicamente más de un polisacárido .

Típicamente, las plantas y los materiales derivados de las mismas comprenden cantidades significativas de materiales de polisacáridos no almidonosos. De acuerdo con lo anterior, un polipéptido de la invención puede ser utilizado en el tratamiento de una planta o un material fúngico o un material derivado de los mismos.

Lignocelulosa Un componente importante del material polisacárido no almidonoso de las plantas es la lignocelulosa (también denominada aquí como biomasa lignocelulolítica) . La lignocelulosa es un material vegetal que comprende celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros de carbohidratos (celulosa y hemicelulosa) están enlazados estrechamente a la lignina por puentes de hidrógeno y covalentes. De acuerdo con lo anterior, un polipéptido de la invención puede ser utilizado en el tratamiento del material lignocelulolitico . Aquí, el material lignocelulolitico es un material que comprende o consiste esencialmente de lignocelulosa . Asi, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido no almidonoso, el polisacárido no almidonoso puede ser un material/biomasa lignocelulósico.

De acuerdo con lo anterior, la invención provee un método para tratar un sustrato que comprende un polisacárido no almidonoso en el cual el tratamiento comprende la degradación y/o hidrólisis y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.

Degradación en este contexto indica que el tratamiento da como resultado la generación de productos de hidrólisis de la celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, es decir sacáridos de longitud más corta están presentes como resultado de tratamiento con respecto a los que están presentes en un polisacárido no almidonoso similar no tratado. Asi, la degradación en este contexto puede dar como resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcares.

Todas las plantas contienen polisacáridos no almidonosos como sucede virtualmente con todos los materiales de polisacárido derivado de plantas. De acuerdo con lo anterior, en un método de la invención para el tratamiento de un sustrato que comprende un polisacárido no almidonoso, dicho sustrato puede estar provisto en la forma de una planta o , de un material derivado de una planta o un material que comprende una planta o un material derivado de una planta, por ejemplo, una pulpa de planta, un extracto de una planta, un alimento o un ingrediente del mismo, una tela, un textil o un articulo de vestuario.

La biomasa lignocelulolitica adecuada para uso en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, productos orgánicos comerciales, residuos de la construcción y la demolición, residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de parques. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, ramas y pastos, trigo, espigas de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, mazorcas de maíz, cubiertas de maíz, grano de maíz, fibras de granos de maíz, productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda húmeda y molienda en seco) denominado frecuentemente "salvado o fibras" así como residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de parques. La biomasa también puede ser pero no se limita a material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos municipales, papeles residuales y residuos de pulpa y molienda del papel. "Biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y mazorcas de maíz, cultivos para energía, residuos forestales, frutos, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, agujas, troncos, raíces, renuevos, cultivos madereros de rotación corta, aserrín, pastos de cambio, árboles, vegetales, cáscaras de frutas, viñas, pulpa de remolacha de azúcar, residuos de trigo, cáscaras de avena, y maderas duras y suaves (no incluyendo maderas con materiales nocivos) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales de residuos orgánicos generados a partir de procesos agrícolas que incluyen actividades de granja y forestales, especialmente residuos de madera de origen forestal. La biomasa agrícola también puede ser cualquiera de las anteriormente citadas singularmente o en cualquier combinación o mezcla de las mismas. Ejemplos adicionales de biomasas adecuadas son preparación de huertos, chaparral, residuos de molino, residuos de madera urbanos, residuos municipales, residuos de troncos, limpieza de bosques, cultivos madereros de corta rotación, residuos industriales, espigas de trigo, espigas de avena, espigas de arroz, espigas de cebada, espigas de centeno, espigas de linaza, cáscaras de soja, cáscaras de arroz, espigas de arroz, alimento de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, residuos de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, bagazo de maíz, césped de la pradera, maicillo, alopecuro; pulpa · de remolacha de azúcar, pulpa de fruta cítrica, cáscaras de semillas, residuos animales celulósicos, poda de césped, algodón, algas, árboles, ramas, pastos, trigo, espigas de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, bagazo de maíz, mazorcas de maíz, granos de maíz, fibras de granos de maíz, productos y subproductos de la molienda húmeda o seca de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, desechos de parques, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pulpa, residuos de la molienda del papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, bagazo de maíz, un cultivo para energía, residuos de forestales, una fruta, una flor, un grano, un césped, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un renuevo, un arbusto, pasto varilla, un árbol, un vegetal, una cáscara de fruta, una viña, pulpa de remolacha de azúcar, mezclas de salvado de trigo, cáscaras de avena, madera dura o suave, material residual orgánico generado a partir de un proceso agrícola, residuos de madera forestales o una combinación de cualesquiera dos o más de los anteriores.

Aparte de la biomasa virgen o materias primas ya procesadas en las industrias de alimentos y piensos o de papel y pulpa, la biomasa/materia prima puede ser retratada adicionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métodos con el fin de potenciar la degradación enzimática.

Pretratamiento Antes del tratamiento enzimático, la materia prima puede ser pretratada opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métocios con el fin de potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o liquinina, en cualquier forma conocida en la técnica. El pretratamiento puede comprender la exposición del material lignocelulósico a agua (caliente) , vapor (explosión de vapor) un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, rallado mecánico, trituración, molienda o despresurización rápida, o una combinación de cualesquiera dos o más de los anteriores. Un pretratamiento químico se combina frecuentemente con un pretratamiento por calor, por ejemplo, en 350 - 220°C durante 1 a 30 minutos.

Presacarificación Después de la etapa de pretratamiento, puede utilizarse una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que involucra la incubación con una enzima o mezcla de enzimas. La etapa de presacarificación puede ejecutarse a muchas temperaturas diferentes pero se prefiere que la etapa de presacarificación ocurra a la temperatura más adecuada para la mezcla enzimáticá que está siendo aplicada o la enzima predicha óptima de las enzimas que se van a aplicar. La temperatura de la etapa de presacarificación puede variar desde aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 95°C, aproximadamente 20 hasta aproximadamente 85°C, aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60°C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 50°C, preferiblemente aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 80°C, más preferiblemente alrededor de 60 - 70°C aún más preferiblemente alrededor de 65°C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 10.0, pero preferiblemente es aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 7.0, más preferiblemente alrededor de 4.0 hasta alrededor de 6.0, aún más preferiblemente alrededor de 4.0 hasta aproximadamente 5.0. De nuevo, el pH puede ser ajustado para maximizar la actividad enzimática y puede ajustarse con la adición de la enzima.

La reacción de licuefacción/hidrólisis o etapa de presacarificación puede ocurrir desde varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente una horas hasta aproximadamente 120 horas, preferiblemente desde aproximadamente hasta aproximadamente 48 horas, más preferiblemente desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 25 horas, lo más preferiblemente desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 6 horas. El tratamiento con celulasa puede ocurrir desde varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 120 horas, preferiblemente desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 72 horas, más preferiblemente desde aproximadamente 24 hasta 48 horas.

Sacarificación La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de un material lignocelulósico método que comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con una composición de la invención con el material lignocelulósico.

Tal método permite que azúcares libres (monómeros) y/o oligosacáridos sean generados a partir de biomasa lignocelulósica . Estos métodos involucran la conversión de biomasa lignocelulósica a azúcares libres y pequeños oligosacáridos con un polipéptido o una composición de la invención. El proceso de convertir un carbohidrato complejo tal como una lignocelulosa en azúcares preferiblemente permite la conversión en azúcares fermentables . Tal proceso puede denominarse como "sacarificación". De acuerdo con lo anterior, un método de la invención puede dar como resultado la liberación de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tales como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.

De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la invención incluyen métodos que utilizan el polipéptido de la composición de la invención descrito anteriormente junto con enzimas o tratamientos físicos adicionales tales como la temperatura y el pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos.

Mientras que la composición ha sido discutida en una mezcla sencilla se reconoce que las enzimas pueden agregarse secuencialmente cuando la temperatura, pH y otras condiciones puedan alterarse para incrementar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, pueden determinarse un pH y temperatura óptimos para la mezcla enzimática.

Las enzimas se hacen reaccionar con un sustrato bajo cualquier condición apropiada. Por ejemplo, las enzimas pueden incubarse a aproximadamente 25°C aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65oC, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C o mayor. Es decir, pueden ser incubados a una temperatura desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 95°C, por ejemplo en reguladores de fuerza iónica baja a media y/o desde pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica medio" se entiende que el regulador tiene una concentración iónica de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente iónico individual. El pH puede varias desde aproximadamente pH 2.5, aproximadamente pH 3.0, aproximadamente pH 3.5, aproximadamente pH 4.0, aproximadamente pH 4.5, aproximadamente pH 5, aproximadamente pH 5.5, aproximadamente pH · 6, aproximadamente pH 6.5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7.5, aproximadamente pH 8.0, hasta aproximadamente pH 8.5. En general, el rango de pH será desde aproximadamente pH 3.0 hasta aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol se prefiere un medio ácido, por ejemplo pH = 4, mientras que para la producción de biogás es deseable un pH neutro, por ejemplo pH = 7. La incubación de las combinaciones enzimáticas bajo estas condiciones da como resultado la producción o liberación de cantidades sustanciales del azúcar a partir de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial se entiende al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.

Los polipéptidos, tales como enzimas pueden producirse bien sea exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislarse y agregarse, por ejemplo, a materia prima lignocelulósica . Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan y el caldo de fermentación de la masa celular crudo, o material vegetal (tal como residuos de maíz) y similares pueden agregarse, por ejemplo, a la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción de enzimas o el material vegetal puede ser tratado para evitar crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, calentando o adicionando agentes antimicrobianos) , y luego agregándolo, por ejemplo, a una materia prima. Estas mezclas enzimáticas crudas pueden incluir el mecanismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utilice materia prima (tal como residuos de maíz) para proveer nutrición aun organismo que produce una enzima o enzimas. De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden por si mismas servir como materia prima lignocelulósica y 'pueden ser añadidas en la materia prima1ignocelulósica .

Fermentación de los azúcares Los azúcares fermentables pueden convertirse en productos de fermentación útiles de valor agregado, ejemplo no limitantes de los cuales incluyen* aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, productos químicos especiales, materias · primas químicas, plásticos, solventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico, y etanol, incluyendo etanol para combustible. En particular los azúcares pueden ser utilizados como materia prima para la fermentación en productos químicos, plásticos, tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogás.

Por ejemplo, en el método de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, sirviendo como materia prima, de tal manera que se convierte este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol y otros productos de fermentación útiles.

Los azúcares liberados a partir de la biomasa pueden convertirse en productos de fermentación útiles tales como los que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, agentes farmacéuticos, suplementos para alimentación vegetal, suplementos para alimentación vegetal, productos químicos especiales, material primas químicas, plásticos y etanol, incluyendo etanol para combustible.

De acuerdo con lo anterior, la invención provee un método para la preparación de un producto de fermentación, método que comprende: a. degradar la lignocelulosa utilizando un método como el descrito aquí; b. fermentación del material resultante, para preparar de esa manera un producto de fermentación.

La fermentación puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas. Preferiblemente el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerofílicas o con limitación de oxígeno.

Un proceso de fermentación anaeróbico se define aquí como un proceso de fermentación que se desarrolla en ausencia de oxígeno o en el cual sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2.5 o menos o aproximadamente 1 mmol/L/h o menos, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como acertadores de electrones.

Un prpceso de fermentación limitado en oxigeno es un proceso en el cual el consumo de oxigeno está limitado por la transferencia de oxigeno desde el gas al liquido.. El grado de limitación en oxigeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante asi como en las propiedades de transferencia reales de mezcla/masa del equipo de fermentación usado. Preferiblemente en un proceso bajo condiciones con limitación de oxigeno, la velocidad de consumo de oxigeno es al menos aproximadamente 5.5, más preferiblemente al menos aproximadamente 6 e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 7 mmol/L/h.

Un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente la recuperación del producto de fermentación.

SSF La fermentación y la sacarificación también pueden ejecutarse en el modo de Sacarificación y Fermentación Simultáneas (SSF) . Una de las ventajas de este modelo es la reducción de la inhibición por azúcares sobre la hidrólisis enzimática (la inhibición por azúcares sobre la celulasa está descrita por Caminal B&B Vol XXVII Pp 1282 - 1290) .

Productos de fermentación Los productos de fermentación que pueden ser producidos de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimentáción animal, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol para combustible (el término "etanol"' se entiende que incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos de valor agregado específicos que pueden ser producidos por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biogás) ; ácido láctico; un plástico; un producto químico especial; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, acido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y acido maléico; ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico; acido acético; 1, 3-propanodiol; etileno, glicerol; un solvente; un suplemento para alimentación animal; un producto farmacéutico; tal como un antibiótico de ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

Biogás La invención provee también el uso de un polipéptido o composición tal como se describe aquí en un método para la preparación de biogás. Biogás se refiere típicamente a un gas producido por la ruptura biológica de la materia orgánica, por ejemplo, material que contiene carbohidratos no almidonosos, en la ausencia de oxígeno. El biogás se origina a partir de material biogénico y es un tipo de combustible. Un tipo de biogás es producido por la digestión anaeróbica o fermentación de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o desechos, residuos municipales, y cultivos energéticos. Este tipo de biogases está compuesto primariamente de metano y dióxido de carbono. El gas metano puede usado como combustible u oxidado con oxígeno. El aire contiene 21% de oxigeno. Esta liberación de energía permite que el biogás sea utilizado como combustible. El biogás puede ser utilizado como un combustible de bajo coste en cualquier país y para cualquier propósito de calentamiento, tal como cocción. También puede ser utilizado en instalaciones modernas de manejo de residuos donde puede ser utilizado para operar cualquier tipo de motor de calentamiento, bien sea para generar potencia mecánica o eléctrica.

La primera etapa en la producción de biogás microbiano consiste en la degradación esquemática de polímeros y sustratos complejos (por ejemplo carbohidratos no almidonosos) . De acuerdo con lo anterior, la invención provee un método para la preparación de un biogás en el cual un sustrato que contiene carbohidratos no almidonosos es puesto en contacto con un polipéptido o composición de la invención, para producir de esta manera material fermentable el cual puede ser convertido en un biogás por parte de un organismo tal como un microorganismo. En tal método, un polipéptido de la invención puede ser provisto a manera de un organismo, por ejemplo, un microorganismo que exprese tal polipéptido.

Uso de enzimas en productos alimentación Los polipéptidos y composiciones de la invención pueden utilizarse en un método para procesar material vegetal para degradar o modificar los constituyentes la celulosa o hemicelulosa o sustancias pécticas de las paredes celulares de la planta o material fúngico. Tales métodos pueden ser útiles en la preparación de un producto alimenticio. De acuerdo con lo anterior, la invención provee un método para preparar un producto alimenticio método que comprende incorporar un polipéptido o composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.

La invención también provee un método para procesar un material vegetal, método que comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material (vegetal) . Preferiblemente, el material vegetal es pulpa.de planta o extracto de una planta, tal como jugos.

La planta y los materiales que contienen sustancias de celulosa/hemicelulosa/pécticas incluyen pulpa de plantas, partes de plantas y extractos de plantas. En el contexto de esta invención un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que puede ser derivada del material vegetal por extracción (mecánica y/o química) , procesamiento u otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base o concentrados hechos a partir los mismos. El material vegetal puede comprender o puede derivarse a partir de vegetales, por ejemplo zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, frijoles de soja, guisantes) o frutos, por ejemplo, drupas o frutas de semillas (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosella negra, grosella roja, frambuesas, fresas, arándanos, piñas y otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo, polen de árboles de pino) , o cereales (avena, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (que se va a hidrolizas) también pueden ser residuos agrícolas, tales como pulpa de remolacha de azúcar, mazorcas de maíz, espigas de trigo, cáscaras de nuez (trituradas) o materiales reciclables, por ejemplo, papel (residual) .

Los polipéptidos de la invención pueden así ser utilizados para tratar materiales vegetales incluyendo pulpa de plantas y extractos de plantas. También pueden ser utilizados para tratar ingredientes de alimentos o alimentos comestibles líquidos sólidos, usados en la extracción de aceites vegetales, almidón o como espesantes en alimentos.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se utilizan como una preparación composición/enzima tal como se describió anteriormente. La composición generalmente se agregará a pulpa vegetal obtenible por, por ejemplo, procesamiento mecánico tal como trituración o molienda de material vegetal. La incubación de la composición con la planta se llevará a cabo típicamente durante un tiempo desde 10 minutos hasta 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento va preferiblemente desde aproximadamente 10°C hasta aproximadamente 55°C, por ejemplo desde aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 25°C, de manera óptima aproximadamente 20 °C y se pueden usar desde aproximadamente 10 g hasta aproximadamente _300 g, ¦ preferiblemente desde aproximadamente 30 g hasta aproximadamente 70 g, de manera óptima aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material que se va a tratar.

Todas las enzimas o sus composiciones usadas pueden agregarse secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa vegetal. Dependiendo de la composición de la preparación de la enzima el material vegetal puede ser macerado inicialmente (por ejemplo hasta un puré) o licuado. .Utilizando los polipéptidos de la invención puede mejorarse los parámetros del procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, la viscosidad del extracto y/o calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención puede ser agregado al jugo crudo obtenido a partir de la prensa o licuefacción de la pulpa vegetal. El tratamiento del jugo crudo será llevado a cabo de manera similar a la pulpa vegetal con respecto a dosificación, temperatura y tiempo de mantenimiento. De nuevo, pueden incluirse otras enzimas tales como las discutidas previamente. Las condiciones de incubación típicas son como se describen en el parágrafo previo.

Una vez que el jugo crudo ha sido incubado con los polipéptidos de la invención, el jugo se centrifuga o (ultra) filtra para producir el producto final.

Después del tratamiento con el polipéptido de la presente invención, el producto (final) puede ser. tratado con calor, por ejemplo a aproximadamente 100°C durante un tiempo de aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 1 hora bajo condiciones que inactiven parcial o completamente los polipéptidos de la invención.

Una invención que contiene un polipéptido de la invención puede ser usada -también durante la preparación de purés de frutas o vegetales.

En el horneado el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su adhesividad o flexibilidad, mejorar el volumen ' de la hogaza y/o la estructura de la miga o impartir mejores características texturales como ruptura, desgarre o calidad de la miga.

La presente invención se relaciona así con métodos para preparar una masa o un producto alimenticio basado en un cereal que comprende incorporar en la masa un polipéptido o composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la masa o del producto alimenticio basado en el cereal obtenido a partir de la masa con respecto a una masa o a un producto alimenticio basado en el cereal en el cual no se incorpora el polipéptido.

La preparación del producto alimenticio basado en el cereal de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente etapas conocidas en la técnica tales como ebullición, secado, freído, vaporización u horneado de la masa obtenida.

Los productos que se hacen a partir de una masa que es hervida son por ejemplo fideo hervidos, pudín de pasta relleno, productos que son hechos a partir de masa frita son por ejemplo donas, buñuelitos, fideos fritos, productos que se hacen a partir de masa vaporizada son por ejemplo, bollos vaporizados, y fideos vaporizados, ejemplos de productos hechos a partir de masa seca son fideos de pasta y secos y ejemplos de productos hechos a partir de masa horneada son por ejemplo pan, galletas, tortas.

El término "propiedad mejorada" se define aquí como una propiedad de una masa y/o un producto obtenido a partir de la masa, particularmente un producto alimenticio basado en un cereal, el cual se mejora por la acción del polipéptido de acuerdo con la invención con respecto a una masa o un producto en el cual no se incorpora el polipéptido de acuerdo con la invención. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita a resistencia incrementada en la masa, elasticidad incrementada en la masa, estabilidad incrementada de la masa, comportamiento en máquina mejorado de la masa, resistencia mejorada de la masa a permeabilidad, adhesividad reducida de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, volumen incrementado del producto alimenticio basado en cereal, ampollamiento reducido del producto alimenticio basado en cereal, estructura mejorada de la miga del producto horneado, suavidad mejorada del producto alimenticio basado en cereal, sabor mejorado del producto alimenticio basado en cereal, antiañej amiento mejorado del producto alimenticio basado en cereal. Propiedades mejoradas relativas a la pasta y al tipo de fideos de los productos basados en cereales son por ejemplo firmeza mejorada, adhesividad reducida, cohesividad mejorada y pérdida reducida por cocción.

La propiedad mejorada puede ser determinada por comparación de una masa y/o un producto alimenticio basado en cereales preparados con y sin adhesión de un polipéptido de la presente invención. Las cualidades organolépticas pueden ser evaluadas utilizando un procedimiento bien establecido én la industria de la panadería, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de degustadores entrenados.

El término "masas" se define aquí como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes suficientemente firmes para amasar o enrollar. Ejemplos de cereales son trigo, centeno, maíz, cebada, arroz, avena pelada, trigo sarraceno y avena. Se entiende que trigo aquí y en lo sucesivo abarca todas las especies conocidas del género Triticum, por ejemplo aestivum, durum y/o espelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipéptido de celobiohidrolasa de acuerdo con la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o auxilia'res del procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o prehorneada. La preparación de una masa a partir de los ingredientes descritos anteriormente es bien conocida en la técnica y comprende la mezcla de dichos ingredientes y auxiliares del procesamiento y una o más etapas de moldeo y opcionalmente fermentación. La preparación de masa congelada está descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.

El término "producto alimenticio basado en cereal" se define aquí como cualquier producto preparado a partir de una masa, bien sea de un carácter suave o crujiente. Ejemplos de productos alimenticios basados en cereales, bien sea de un tipo blanco, claro u oscuro, pueden ser producidos ventajosamente mediante la presente invención y son panes (en particular pan blanco, pan entero o pan de centeno) , típicamente en la forma de hogazas o rollos, pan francés tipo baguette, pasta, fideos, donas, rosquillas, tortas, pan pita, tortillas, tacos, tortas, hojuelas, bizcochos, galletas, cubiertas para tortas, pan vaporizado y pan crujiente y similares.

El término "producto horneado" se define aquí como cualquier producto alimenticio basado en cereales preparado por horneado de la masa.

Los polisacáridos no almidonosos (NSP) pueden incrementar la viscosidad de la digesta lo cual, a su vez hace disminuir la disponibilidad de nutrientes y el rendimiento de los animales. El uso del polipéptido celobiohidrolasa de la presente invención puede mejorar la utilización de fórmulas asi como los minerales catiónicos y polipéptidos durante la digestión de los animales.

Al agregar nutrientes específicos al alimento se mejora la digestión en los animales y por lo tanto se reducen los costos de alimentación. Se usa actualmente una cantidad de aditivos para los alimentos y se están desarrollando continuamente nuevos conceptos. El uso de enzimas específicas tales como enzimas degradadoras de los carbohidratos no almidonosos podría disminuir la cantidad de energía para la liberación de las fibras e incrementar la digestibilidad de las proteínas debido a su mejor accesibilidad de la proteína cuando la fibra se rompe. De esta manera el costo de la alimentación disminuiría así como podrían reducirse también los niveles de proteína en el alimento.

Los polisacáridos no almidonosos (NPS) están presentes también virtualmente en todos . los ingredientes alimenticios de origen vegetal. Los NSP se utilizan pobremente y pueden, cuando se solubilizan, ejercer efectos adversos sobre la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSP y como consecuencia reducir cualquier efecto antinutricional . Las enzimas degradadoras de carbohidratos no almidonosos de la presente invención pueden utilizarse para este propósito en dietas basadas en cereales para aves, y en menor grado para cerdos y otras especies.

Un polipéptido/enzima degradador de carbohidratos no almidonosos de la invención (de una composición que comprende el polipéptido/enzima de la invención) puede utilizarse en la industria de los detergentes, por ejemplo, para eliminación en lavandería de manchas originadas por carbohidratos. Una composición de detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la invención y, además, una o más de celulosa, hemicelulasa, pectinasa, proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa o carbohidrása .

Usos de enzimas en composiciones detergentes · Una composición detergente que comprende un polipéptido o composición de la invención puede ser en cualquier forma conveniente, por ejemplo una pasta, un gel, un polvo o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente hasta aproximadamente 70% de agua y desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 30% del solvente orgánico o material no acuoso.

Tal composición detergente por ejemplo, puede formularse como una composición detergente para lavado a mano o en máquina que incluye una composición con aditivos de lavandería adecuados para el tratamiento de textiles manchados . y una composición suavizante de los textiles agregada en enjuague, o puede formularse como una composición detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas en general, o puede formularse para operaciones de lavado de platos manual o con máquina.

En general, las propiedades de la enzima deben ser combatidas con el detergente seleccionador (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etc.) y las enzimas deberían estar presentes en una cantidad efectiva.

Una composición detergente puede comprender un surfactante, por ejemplo, un surfactante aniónico o no iónico, un conformador detergente o agente de acomple amiento, uno o más polímeros, un sistema de blanqueado (por ejemplo una fuente de H202) o un estabilizador enzimático. Una composición detergente también puede comprender cualquier otro ingrediente de detergente . convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador que incluye una arcilla, un potenciador de la espuma, un supresor de sud, un agente anticorrosivo, un agente de suspensión de la suciedad, un agente de redeposición de la suciedad, un colorante, un bactericida, un abrillantador óptico, un hidrótropo, un inhibidor de decoloración o un perfume.

Uso de enzimas en procesamiento de papel y pulpa Un polipéptido o composición de la presente invención ' puede usarse en la industria del papel y la pulpa, entre otros en el proceso de blanqueado para potenciar el brillo de las pulpas blanqueadas con lo cual la cantidad de cloro utilizada en las etapas de blanqueado puede reducirse y para incrementar la liberación de las pulpas en los procesos de papel reciclado (Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 ( 1990) : 79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988): 235 - 239 and Pommier et al., Tappi Journal (1989) : 187 - 191) . Adicionalmente, un polipéptido o composición de la invención puede utilizarse para el tratamiento de pulpa lignocelulósica de manera que se mejore la capacidad de blanqueo para la misma. Por lo tanto la cantidad de cloro necesaria para obtener un blanqueado satisfactorio de la pulpa puede reducirse.

Un polipéptido o composición de la invención puede usarse en un método de reducción de la rata a la cual los textiles que contienen celulosa se hacen ásperos o para reducir la aspereza de los textiles que contienen celulosa, comprendiendo el método de tratamiento de los textiles que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se describió más arriba. La presente invención se relaciona adicionalmente con un método para proveer clarificación de color de textiles coloreados que contienen celulosa, comprendiendo el método de tratar los textiles coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se describió más arriba, y un método para proveer una variación localizada en color de textiles coloreados que contienen celulosa, comprendiendo el método del tratamiento de textiles coloreados que contienen celulosa con un polipéptido o composición como se describió anteriormente. El método de la invención puede ejecutarse tratando los textiles que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de los textiles también puede llevarse a cabo durante la inmersión o enjuague o simplemente agregando el polipéptido o composición como se describió anteriormente al agua en el cual los textiles están o serán inmersos .

Otros usos de las enzimas Además, un polipéptido o composición de la presente invención puede utilizarse en formulaciones antibacterianas tal como en productos farmacéuticos tales como tabletas para la garganta, pastas dentales y enjuagues bucales.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención: Ejemplos Materiales y métodos Procedimientos con ADN Se llevaron a cabo procedimientos estándar con ADN tal como se describe en otros lugares (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) a menos que se establezca otra cosa. El ADN se amplificó utilizando la enzima polimerasa Physion de prueba de lectura (Finnzymes) . Las enzimas de restricción eran de Invitrogen o New England Biolabs.

Método para la determinación de la hidrólisis de celulosa Una solución de · sustrato de materia seca (DM) de espigas de trigo (PWS) pretratadas por lavado ácido al 2% se preparan en regulador de acetato de sodio 50 mM de pH 4.5 a partir de la espiga de trigo pretratada lavada con agua. Para la incubación se utiliza una raicroplaca de titulación de 96 pozos profundos. Cada pozo se transfiere con pipeta un 1 mi del sustrato. Se agrega un nivel base de 1 mg/g de fibra dm Filtrase® NL a cada pozo. Además del Filtrase® se agrega una cantidad de 0.8 y 2.4 mg de polipéptido por gramo de fibra PWS dm.

Las muestras se pretratan por ultrafiltración (Vivaspin 2, Sartorius, 10, 000 WCO PES) . Se transfieren con pipeta 2 mi de muestra de enzima hacia el tubo de ultrafiltración. El tubo se centrifuga entonces durante 20 minutos a 3220 rcf (fuerza centrifuga relativa) . El retenido se lava dos veces con 2 mi de solución reguladora de acetato de sodio (y se centrifuga durante 20 minutos a 3220 rcf) .

La placa se incuba a 40°C durante 18 - 20 horas. Después de la incubación la reacción de la enzima se detiene agregando 50 µ? de una solución de hidróxido de sodio 1 M. La placa se centrifuga entonces durante 15 minutos a 3220 rcf y el sobrenadante se diluye hasta una concentración de glucosa entre 40 y 100 µ?.

Se transfieren con pipeta 50 µ? de muestra diluida en una placa de PCR y se agregan 150 µ? de reactivo BCA. El reactivo BCA se prepara fresco mezclando dos soluciones de reserva A y B 1:1 v/v. La solución A consistía de 54.3 g de Na2C03, 24.2 de NaHC03 y 1.9 g de Na2BCA (Sigma D8284) por litro de agua (MQ) . La solución B contenia 31.24 mL CuS04.5H20 en solución al 4% (Pierce 185 9078) y 1.26 g de L-Lisina (Sigma L5501) por litro de agua (MQ) . (Concentración final: BCA 2.5 mM, Cu 2.5 mM, L-Lisina 4.3 mM, carbonato 400 mM) . La placa se calienta a 80°C durante 60 minutos. Después de enfriamiento se transfieren con pipeta 150 µ? en una segunda placa y se mide la absorbancia a 560 nm.

En cada placa se analiza el fondo del sustrato, incubando el sustrato sin adición de Filtrase® NL. Para cada adición se analizan un estándar de glucosa de 55 µ? contra regulador de acetato para calcular el coeficiente de extinción molar de la glucosa.

Las incubaciones se ejecutan utilizando un bloque ciclizador térmico de PCR Peltier (PTC200) y las mediciones se realizan utilizando un lector de placas de microtitulación (TECAN Sunrise) .

El grado de hidrólisis de celulosa se calcula, como se indica a continuación: * Potencial de glucosa en sustrato (mmol/L) = WPWS * dm * glucan * 1000 *1000 total * Mw * Vpozo WPWS = consumo de sustrato PWS (g) dm = contenido de sustrato de fibra en materia seca PWS glucan = contenido de glucano del sustrato 1.11 = corrección de la glucosa enlazada frente a glucosa libre Wtotal = peso del sustrato total (g) Mw = peso molecular de la glucosa (g/mol) Vpozo = volumen de sustrato/pozo (mL) 1000 = corrección mL -> L 1000 = corrección mol -> mmol (As - Ablk) * Densayo * Vensayo* Dincubado * Glucosa liberada (mmol/L) = 1 * e *Vsustrato As = absorbancia de la muestra 560 nm Ablk = absorbancia del sustrato blanco a 560 nm Densayo = dilución en el ensayo Vensayo = volumen total de ensayo (µ?,) Dincubado = dilución de los incubados 1 = longitud de recorrido (cm) e = coeficiente de extensión molar de la glucosa-BCA (mmol*L-l*cm-l) Vsustrato = volumen total del sustrato (\i ) Este valor tiene que ser corregido para el contenido de reducción de azúcar/proteina en la muestra (analizado mediante el ensayo BCA) .

A partir de estos valores puede calcularse el grado de hidrólisis con la siguiente fórmula: Glucosa liberada (mmol/L) Grado de hidrólisis (%) = Glucosa potencial en el sustrato (mmol/L) *100% Ejemplo 1 1.1 Construcción de los plásmidos de expresión La secuencia que tiene SEQ ID NO:l fue clonada en el vector pGBTOP (Figura 1) utilizando los sitios EcoRi y SnaBI, que comprenden el promotor del glucoamilasa y la secuencia terminadora. La parte de E. coli fue retirada por digestión con NOTL antes de la transformación de A. niger CBS 513.88. 1.2 Transformación de A. niger A. niger WT-1: esta cepa de A.- niger es CBS 513.88 que comprende supresiones de los genes que codifican glucoamilasa (glaA) , amilasa fúngica y amilasa ácida. El A. niger WT-q se construye utilizando la metodología "MARKER-GENE FREE" tal como se describe en EP0635574B1.

Los constructos de expresión son cotransformados a la cepa A. niger WT-1 de acuerdo con el método descrito por Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205 - 221 y Kelly, J. & Hynes, . (1985) EMBO J. , 4, 475 - 479 con las siguientes modificaciones : Las esporas se hacen germinar y cultivan durante 16 horas a 30°C en un matraz con agitación colocado en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio mínimo para- Aspergillus (100 mi) . El medio mínimo para Aspergillus contienen por litro: 6 g de NaN03, 0.52 g de KC1, 1.52 g de KH2P04, 1.12 mi 4 M de KOH, 0.52 g de MgSO'4.7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04.7H20, 1.7 mg de CoC12.6H20, 1.6 mg de CuS04.5H20, 5 mg de MnC12.2H20, 1.5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCL, 0.2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de penicilina (5000 IU/ml) estreptomicina (5000 UG/ml) en solución (Gibco) .

Se usa Novozym 234™ (Novo Industries) en vez de helicasa para la preparación de los protoplastos; Después de la formación de los protoplastos (60 - 90 minutos) se agrega regulador KC (KCl 0.8 , ácido cítrico 9.5 mM, pH 6.2) a un volumen final de 45 mi, la suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4°C en un rotor de recipiente oscilante. Los protoplastos se suspenden en 20 mi de regulador KC y subsecuentemente se agregan en 25 mi de regulador STC (1.2 M de sorbitol, 10 mM de Tris-HCl pH 7.5, 50 mM de CaC12). La suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4°C en un rotor de recipiente oscilante, se lava con regulador RT6 y se resuspende en regulador STC a una concentración de 10E8 protoplástos/ml.

A 200 microlitros de la suspensión de protoplastos, se agrega el fragmento de ADN, disuelto en 10 µ? de regulador TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA) y 100 microlitros de solución PEG (20% PEG 4000 (Merck), 0.8 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM CaC12); Después de la incubación de la suspensión de ADN-protoplasto durante 10 minutos a temperatura ambiente, se agrega lentamente 1.5 mi de solución de PGE (60% PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH.'7.5, 50 mM CaC12), con mezcla repetida de los tubos. Después de incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente se diluyen las suspensiones con 5 mi de sorbitol 1.2 M se mezcla por inversión y se centrifuga durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden cuidadosamente en 1 mi de sorbitol 1.2 M y se siembran en una placa sobre medio de regeneración sólido reselectivo consistente de medio mínimo para Aspergillus sin riboflavina, tiamina.HCL, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa. En el caso de selección con acetamida en medio contiene acetamida 10 mM como única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 M como fuente osmótica y de carbono. Alternativamente, los protoplastos se siembran sobre placas PDA (Papa Dextrosa Agar, Oxoid) , suplementado con 1 -50 ug/ml de fleomicina y sacarosa 1 M como osmótico. Las placas de regeneración se solidifican utilizando agar al 2% (agar No. 1, Oxoid Lll) . Después de la incubación durante 6 -10 días a 30°C, se transfieren las comidioesporas de los transformantes a placas consistentes de medio selectivo para Aspergillus (medio mínimo que contiene acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de una selección por acetamida o PDA suplementado con 1 - 50 \iq/ml de fleomicina en el caso de la selección de la fleomicina) , con glucosa al 2% y agarosa al 1.5% (Invitrogen) y se incubaron durante 5 - 10 días a 30°C. Los transformantes simples se aislan y esta etapa de purificación selectiva se repite una vez después de lo cual se almacenan los transformantes purificados.

Después de la transformación, los transformantes fueron seleccionados en medios que comprendían acetamida como única fuente de nitrógeno y purificados de colonias. El número de copias se estimaron mediante PCR cuantitativo y se seleccionaron transformantes con números bajos y altos de copias. Los transformantes con número altos de copias fueron cultivados en matraces con agitación en 100 mi de medio CS -MES como se describe en EP635574 a 34 °C a 170 rpm en un agitador incubado utilizando un matraz d agitación de 500 mi. Después de 3 y 4 días de fermentación, se recolectaron las muestras de sobrenadante para determinar expresión por SDS-PAGE . 1.3 Contenido de proteínas Los sobrenadantes de las fermentaciones en los matraces de agitación de los transformantes que expresan celobiohidrolasa fueron recolectados después de 6 días, la biomasa y los sobrenadantes fueron separados por centrifugación y el sobrenadante fue filtrado sobre un filtro de 0.2 µ? en el tope de una botella (Nalgene) .

El contenido de proteína del sobrenadante recuperado fue determinado de acuerdo con el método Bradford. El contenido de proteína en las muestras de enzima fue determinado con el ensayo de proteína Bradford, utilizando el reactivo de proteína, utilizando Coomassie. 25 µ? de una muestra de enzima apropiadamente diluida fue mezclada con 1.2 mi del reactivo de Coomassie. Después de 10 minutos . a temperatura ambiente se midió la absorbancia de la mezcla de 595 nM utilizando un espectrofotómetro (Uvikon XL) . El contenido de proteína se calculó en comparación con el estándar BSA. El contenido de proteína de TEMER02270 fue de 2 mg/ml .

Ejemplo 2 Efecto de suplementación con el polipéptido CBH-II con la hidrólisis de espigas de trigo Un producto de enzima de Talaromyces emersonii, comercializado como Filtrase® NL, producto de DSM fue utilizado para la hidrólisis de espigas de trigo pretratadas con lavado ácido (denominado de aquí en adelante PWS) .

La dosis de enzima aplicada para este producto clásico fue 1 y 3 mg de proteína Bradford por g de dm. Adicionalmente se suplemento el TE ER02270 a una mezcla de hidrólisis que contenía un 1 mg de proteína Bradford de Filtrase® NL por gramos de masa seca PWS a una concentración de 4.5 mg de proteína Bradford por gramos de masa seca PWS. El grado de hidrólisis de la celulosa en el PWS lavado fue determinado utilizando una prueba de azúcares reductores, tal como se describió más arriba.

El grado de hidrólisis determinado por Filtrase® NL a 1 mg de dosis de proteína Bradford fue 12%. La suplementación con 4.5 mg de proteína Bradford de la enzima del Ejemplo 1 dio como resultado un grado de hidrólisis de 16.5%.

Método para la determinación de actividad de la celobiohidrolasa II Se incubaron 70 µ? de la solución enzimática con para-nitrofenil-^-D-celotriósido, a una concentración final de 10 µ?? en el incubado, en regulador de acetato de sodio 0.2 M de pH 4.5 a 40°C en presencia de glucono-5-lactona 10 µ??. Las muestras fueron tomadas en intervalos de tiempo de 10 minutos hasta 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de . carbonato de sodio 1 M fría a una solución de 1:1. La absorbancia de las soluciones finales se mide a 405 mM. El cambio en absorción por minuto de incubación en 1 aparte lineal de la curva de tiempo se utiliza como medida de la actividad de la enzima.

Ejemplo 3 y experimento comparativo A En el Ejemplo 3, el TEMER02270 y el experimento comparativo A (EBA5) , los inhibidores contra tolerancia de TEMER02270 fueron comparados contra EBA5. El EBA5 fue construido de acuerdo con el Ejemplo 1, sin embargo el gen usado fue el gen EBA5 , que es CS356873 (459AA) de T. emersonii, descrito en WO2006074005, SEQ ID NO: 91. La secuencia de EBA5 tal como está dada en O2006074005 tiene una identidad de 92.7% con la SEQ ID NO:l divulgada aquí.

El sobrenadante filtrado de las fermentaciones en matraces de agitación de los transformantes que expresan CBH-II (TEMER02270 y EBA5) fueron desalinizados utilizando una columna de rotación. Las soluciones desalinizadas fueron incubadas con cantidades diferentes de material solubilizado del pretratamiento ácido de la espiga de trigo. · Los componentes solubilizados durante el pretramiento ácido de la espiga de trigo fueron aislados lavando 1 kg de espiga de trigo pretratado que contenia 33% de materia seca, con 20 litros de agua. El agua fue separada de la espiga de trigo sólida por filtración, y subsecuentemente se concentró 20 veces. Esta solución de reserva de material solubilizado fue utilizada en las incubaciones con las enzimas, a concentraciones que variaban desde 0 a 100 g/1, cuando se normalizaban con la concentración de la espiga de trigo pretratada original, con el fin de verificar los . efectos inhibidores de la material solubilizados sobre estas enzimas. La actividad relativa de la enzima fue expresada como porcentaje de la actividad por g/1 de espiga de trigo pretratada (PWS) equivalentes del material solubilizado sobre la actividad a 0 g/1 de equivalentes de espiga de trigo pretratados del material solubilizado.

Material TEMER02270 EBA5 solubilizado expresado en equivalente PWS (g/L) 0 100 100 17 89 82 34 68 51 Es claro a partir de esta tabla que al menos en concentraciones de 17 - 34 g/l de los equivalentes de espiga de trigo pretrados de los materiales solubilizados el TE ER02270 se afecta menos que el EBA5. Esto indica que el polipéptido TEMER02270 tiene tolerancia mejorada a la inhibición.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleotidos de SEQ ID N0:1 o un polipéptido variante o un polinucleótido variante del mismo, en donde el polipéptido variante tiene al menos 93% de identidad de secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO: 2 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene al menos 93% de identidad de secuencia con la secuencia definida en SEQ ID NO: 2. 2. Un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 1, donde el polipéptido tiene actividad de celobiohidrolasa. 3. Un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleotidos definida en SEQ ID N0:1; o (b) una secuencia de nucleotidos que híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento reverso de SEQ ID N0:1; en condiciones de hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC IX, SDS al 0.1% a aproximadamente 50 °C; o (c) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1; o (d) un fragmento que tiene al menos aproximadamente 100 nucleotidos de longitud de una secuencia de nucleotidos tal como se define en (a) , (b) o (c) el cual tiene al menos aproximadamente 100 nucleotidos de longitud; o (e) una secuencia la cual es degenerada como resultado del código genético frente a una secuencia tal como se define en cualquiera de (a), (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleotidos que es el complemento reverso de una secuencia de nucleotidos tal como se define en (a) , (b) , '(c) , (d) o (e) . 4. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 el cual codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2. 5. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 el cual es una secuencia de ADN. constructo de ácido nucleico que comprende polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 7. Un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el contenido de GC es 56% o más, 58% o más, o de 58-65%. 8. Un vector que incorpora una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 9. Una célula que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, o un vector de acuerdo con la reivindicación 8. 10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la célula es una célula eucariota. 11. Una célula de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula es una célula fúngica. 12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula fúngica se selecciona del grupo consistente de los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora , Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces . 13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula fúngica es de las especie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o Aspergillus niger. 14. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 - 13, en donde uno o más genes son suprimidos, inhabilitados o interrumpidos en su totalidad o en parte, en donde opcionalmente el gen codifica para una proteasa . 15. Una planta transgénica o una parte de la misma que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, un vector de acuerdo con la reivindicación 8 o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde opcionalmente la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta leguminosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de cebada, un pasto, o una planta de tabaco; o una planta de los géneros Anacardium, Arachis, ragus, Atropa, Avena, Brassica , Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus , Cocos, Coffea, ferae, Cucumis, Cucúrbita , Daucus, Elaeis, Fragaria , Glycine, Gossypium, Helianthus , Ocallis, Hordeu , Hyoscyamus , Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Majorana, Medicago, Nicotiana , Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, eolus, Pistachio, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Sorghum, Theobromus, Trigonella , Triticum, Vicia, Vitis, Vigna o Zea. 16. Un método para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que tiene una actividad ¦ de degradación de material de carbohidrato y/o hidrólisis de carbohidrato, método que comprende cultivar una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, la recuperación del polipéptido expresado. 17. Una composición que comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o un polipéptido que pertenece a la familia GH61. 18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la célula es una celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una endo-ß-1,4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß- ( 1 , 3 ) ( 1 , 4 ) -glucanasa . 19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en donde la hemicelulasa es una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una -L-arabinofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterase, una coumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa. 20. Una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la pectinasa es una endo poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, un expoligalacturonato liasa, un ramnogalacturonano hidrolasa, un ramnogalacturonano liasa, un ramnogalacturonano acetil esterasa, un ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo-arabinanasa . 21. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 que comprende una ligninasa, una expansina, un polipéptido similar a expansina, una swolenina o el producto polipéptido de un gen que codifica una proteina de integración de celulosa o una proteina inducida por celulosa . 22. Un método para el tratamiento de un sustrato que comprende material de carbohidrato, opcionalmente un material vegetal, cuyo método comprende poner en contacto el sustrato de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 y/o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21. 23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el sustrato es un material vegetal y el material vegetal está provisto en la forma de una planta, una pulpa de planta, un extracto de planta, un material de alimento o un ingrediente derivado de una tela, textil o articulo de vestimenta que comprende un material vegetal. 24. Un método de acuerdo con la reivindicación 22 y/o reivindicación 23, en donde el tratamiento comprende la degradación y/o modificación de la celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péptica. 25. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 y/o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 para producir azúcar a partir de un material lignocelulósico .