CN111225982A - 用于木质纤维素材料的酶促水解和糖发酵的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由木质纤维素材料制备糖和/或发酵产物的方法。

Description

用于木质纤维素材料的酶促水解和糖发酵的方法
技术领域
本申请涉及通过酶促水解由木质纤维素材料制备糖产物的方法和通过糖发酵制备发酵产物的方法。
背景技术
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，并且为产生化石燃料的替代能源提供了有吸引力的平台。该材料可大量获得，并可被转化为有价值的产品，例如糖或生物燃料，诸如生物乙醇。
从木质纤维素材料生产发酵产物是本领域已知的，其通常包括预处理、水解、发酵和任选的回收发酵产物的步骤。
在水解(其可包括液化、预糖化和/或糖化步骤)期间，木质纤维素材料中存在的纤维素通过纤维素分解酶被部分(通常30-95％，依赖于酶活性和水解条件)转化为糖。水解通常在45-50℃的升高的温度和非无菌条件下在持续6-168小时的过程中进行(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。
通常，随后通过微生物(例如，酵母)将糖转化为有价值的发酵产物(例如，乙醇)。发酵在同一容器或不同容器中在单独的(优选厌氧的)方法步骤中进行。将发酵期间的温度调节至30-33℃以适应微生物(通常为酵母)的生长和乙醇生产。在该发酵过程期间，通过自水解步骤已存在的酶，剩余的纤维素材料被转化为糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦纤维素材料被转化为可发酵糖并且所有可发酵糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物生物质，发酵完成。这可耗费长达6天。水解和发酵的总过程时间通常可达到13天。
通常，酶生产成本是来自木质纤维素材料的发酵产物的总生产过程中的主要成本因素(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。迄今为止，通过应用来自单一微生物来源或来自多种微生物来源(参见WO 2008/008793)的具有更宽和/或更高(比)水解活性的酶产物来实现酶生产成本的降低。这导致更低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率，和因此更低的总生产成本。
除了优化酶之外，优化工艺设计也是降低糖产物和发酵产物生产总成本的重要手段。例如，借助于糖降解产物，糖损失随着产率的降低而增加。由于糖降解产物能够抑制发酵，因此应优化工艺设计以减少这些糖降解产物的量。
出于经济原因，因此期望包括新颖、创新的工艺配置，所述工艺配置旨在降低涉及木质纤维素材料的预处理、水解和发酵的方法中的总生产成本。
发明内容
本申请的目的是提供一种由木质纤维素材料制备糖产物和/或发酵产物的改进方法。该方法通过使用特定的预处理、水解和发酵条件而得到了改进。
详细说明
贯穿本说明书和所附权利要求书，词语“包括”和“包含”及其变型均被解释为包括性的。即，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可包括未具体指出的其他要素或整体。在本文中不使用数量词修饰时，指代一个/种或多于一个/种的(即，一个/种或至少一个/种的)对象。举例来说，“要素”可表示一个/种要素或多于一个/种的要素。
本申请涉及由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将木质纤维素材料在160℃至200℃的温度下在1.0至2.5的pH下预处理1至15分钟；(b)使用丝状真菌的完整发酵培养液在50℃至65℃的温度和4至6的pH下酶促水解干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的经预处理的木质素纤维素材料40小时至150小时，所述培养液至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和裂解性单糖加氧酶；(c)任选地回收糖产物。术语“糖产物”、“一种或多种糖”或“糖”在本文中可互换使用。或者，可以使用术语“水解的木质纤维素材料”代替这些术语。
本申请还涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)发酵糖产物以获得发酵产物；以及(c)任选地回收发酵产物。在一个实施方式中，本申请涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将木质纤维素材料在160℃至200℃的温度下在1.0至2.5的pH下预处理1至15分钟；(b)使用丝状真菌的完整发酵培养液在50℃至65℃的温度和4至6的pH下酶促水解干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的经预处理的木质素纤维素材料40小时至150小时以获得水解的木质纤维素材料，所述培养液至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和裂解性单糖加氧酶；(c)将水解的木质纤维素材料发酵以产生发酵产物；以及(d)任选地回收发酵产物。
在一个实施方式中，酶促水解在反应器中进行。在一个实施方式中，酶促水解也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以意指多个反应器。
在如本文所述的方法中，将经预处理的木质纤维素材料添加到发生酶促水解的反应器中。这可以分批、补料分批或连续地进行。在一个实施方式中，将酶组合物添加到发生酶促水解的反应器中。这可以分批、补料分批或连续地进行。酶组合物可以是水性组合物。在一个实施方式中，将水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料循环回到发生酶促水解的反应器中。在一个实施方式中，将水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料在添加到发生酶促水解的反应器中之前进行冷却。在一个实施方式中，使水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料经受固/液分离，然后添加至发生酶促水解的反应器中。在一个实施方式中，在冷却步骤之前进行固/液分离。在一个实施方式中，仅将固/液分离后获得的液体级分冷却。在一个实施方式中，将液体级分和固体级分都添加到发生酶促水解的反应器中。
在一个实施方式中，总酶促水解时间为10小时或更长时间、12小时或更长时间、14小时或更长时间、16小时或更长时间、18小时或更长时间、20小时或更长时间、30小时或更长时间、40小时或更长时间、50小时或更长时间、60小时或更长时间、70小时或更长时间、80小时或更长时间、90小时或更长时间、100小时或更长时间、110小时或更长时间、120小时或更长时间、130小时或更长时间、140小时或更长时间、150小时或更长时间、160小时或更长时间、170小时或更长时间、180小时或更长时间、190小时或更长时间、200小时或更长时间。在一个实施方式中，酶促水解时间为40至150小时。
在一个实施方式中，在酶促水解期间将氧添加到经预处理的木质纤维素材料中。在一个实施方式中，在酶促水解的至少部分期间添加氧。在酶促水解过程中，可以连续或不连续地添加氧。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法期间，添加氧一次或多次。在一个实施方式中，可在预处理期间、在向反应器中添加(经预处理的)木质纤维素材料期间、在向反应器中添加酶期间、在向反应器中添加水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料期间、在水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料的冷却期间、在水解的木质纤维素材料和/或部分水解的木质纤维素材料的固/液分离期间，或在它们的任何组合中添加氧。将氧添加到用于酶促水解的反应器中。
氧可以几种形式添加。例如，氧可以作为氧气、富氧气体(例如富氧空气)或空气添加。也可以借助于原位氧生成来添加氧。
如何添加氧的示例包括但不限于借助于以下方式来添加氧：鼓泡、喷吹、电解、氧的化学添加、从顶部填充用于酶促水解的反应器(将水解物投入反应器中，并因此将氧引入水解物中)，以及将氧添加到反应器的顶部空间中。当将氧添加到反应器的顶部空间时，可以供应水解反应所需的足够的氧。通常，可以控制和/或改变添加到反应器中的氧的量。通过在反应器的水解时间的部分期间仅添加氧，可以限制所供应的氧。另一种选择是添加低浓度的氧，例如通过使用空气和循环空气(离开反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。通过在较长的水解时间段期间添加氧、添加较高浓度的氧或添加更多空气，可以实现氧添加量的增加。控制氧浓度的另一种方法是添加氧消耗物和/或氧生成物。可以将氧引入反应器中存在的(经预处理的)木质纤维素材料中。也可以将氧引入反应器的顶部空间中。可以将氧吹入反应器中存在的(经预处理的)木质纤维素材料中。也可以将氧吹入反应器的顶部空间中。
在一个实施方式中，在将经预处理的木质纤维素材料添加到反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧添加到用于酶促水解的反应器中。可以将氧与进入反应器的经预处理的木质纤维素材料一起引入。可以将氧引入将进入反应器的材料流中，或与经过反应器外部回路的反应器内容物的部分一起引入。优选地，当反应器中存在(经预处理的)木质纤维素材料时添加氧。
在一个实施方式中，在体积为10-5000m3，优选50-5000m3的反应器中进行酶促水解。在如本文所述的方法的酶促水解中使用多个反应器的情况下，所述多个反应器可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一个实施方式中，进行酶促水解的反应器的高度与直径之比为2:1至8:1。
在一个实施方式中，在体积为30-200m3，优选100-150m3的反应器中进行预处理。在如本文所述的方法的预处理中使用多个反应器的情况下，所述多个反应器可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一个实施方式中，在如本文所述的方法中使用的预处理反应器的高度与直径之比为3:1至12:1。
在一个实施方式中，用于如本文所述方法的液化步骤和/或糖化步骤中的酶组合物来自真菌，优选地丝状真菌。在一个实施方式中，酶组合物中的酶来源于真菌，优选地丝状真菌，或者所述酶包括真菌酶，优选为丝状真菌酶。在本文所述的方法的酶促水解中使用的酶来源于真菌，或者在如本文所述的方法的酶促水解中使用的酶包括真菌酶。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中所定义的)。丝状真菌包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomium paecilomyces、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸孢壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢霉属(Pyricularia)、Rasamsonia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、Trametes pleurotus、木霉属(Trichoderma)和毛癣菌属(Trichophyton)。在一个优选实施方式中，所述真菌是Rasamsonia，其中踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)是最优选的。因此，如本文所述的方法有利地与来源于Rasamsonia属微生物的酶组合应用，或者用于如本文所述的方法中的酶包括Rasamsonia酶。
丝状真菌的若干菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。
优选地，用热稳定的酶进行如本文所述的方法。如本文所用的“热稳定的”酶是指该酶具有50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高，或甚至85℃或更高的最适温度。它们可以例如从嗜热微生物中分离，或者可以由技术人员设计并人工合成。在一个实施方式中，编码热稳定的酶的多核苷酸可以从嗜热或耐热的丝状真菌分离或获得，或从非嗜热或非耐热的真菌分离，但被发现是热稳定的。“嗜热真菌”是指在50℃或更高温度下生长的真菌。“耐热的”真菌是指在45℃或更高，最大接近50℃的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是腐质霉属、根毛霉属、毁丝霉属、Rasamsonia、篮状菌属、嗜热丝孢菌属、热子囊菌属或梭孢壳属细胞，优选地是踝节菌属细胞。优选的嗜热或耐热真菌是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、嗜热团丝核菌(Papulaspora thermophilia)、丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)、嗜热赭褐白乔史密斯霉(Rasamsoniaargillacea)、嗜热象牙白篮状菌(Rasamsonia eburnean)、Rasamsonia brevistipitata、嗜热柱孢白乔史密斯霉(Rasamsonia cylindrospora)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromycesbacillisporus)、Talaromyces leycettanus、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)和太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)。
Rasamsonia是包括耐热和嗜热的篮状菌属和白乔史密斯霉属的新属。基于表型、生理学和分子数据，将物种埃默森篮状菌、丝衣霉状篮状菌(Talaromycesbyssochlamydoides)、象牙白篮状菌(Talaromyces eburneus)、赭褐白乔史密斯霉(Geosmithia argillacea)和柱孢白乔史密斯霉(Geosmithia cylindrospora)转移到Rasamsonia新属。埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、Penicillium geosmithiaemersonii和踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)在本文中可互换使用。
在如本文所述的方法中，使用酶组合物。在一个实施方式中，该组合物是稳定的。如本文所用的“稳定的酶组合物”是指酶组合物在30小时的水解反应时间后保留活性，优选在30小时的水解反应时间后保留其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一个实施方式中，酶组合物在40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、150小时、200小时、250小时、300小时、350小时、400小时、450小时、500小时的水解反应时间后保留活性。
酶可以通过用合适的微生物(例如踝节菌属埃默森蓝状菌或黑曲霉(Aspergillusniger))发酵合适的底物来制备，其中所述酶是由所述微生物产生的。可以改变微生物以改进或制造酶。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可被原样使用以产生酶或可被改变以增加产量或产生改变的酶(其可包含异源酶例如纤维素酶，即这种微生物原本不产生的酶)。优选地，真菌更优选地丝状真菌被用来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，使用诱导由产生酶的微生物进行酶表达的底物。
酶被用来液化木质纤维素材料和/或从包含多糖的木质纤维素材料中释放糖。主要的多糖为纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的木质纤维素材料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。糖产物包含可溶性糖(包含单体和多聚体二者)。在一个实施方式中，糖产物和/或水解的木质纤维素材料包括葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。其它糖的实例为纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖产物可被原样使用或者可被进一步加工例如被回收和/或纯化。
另外，果胶和其它果胶类物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。此外，木质纤维素材料可包含木质素。
下文将更详细地描述可在如本文所述的方法中使用的酶。
溶解性多糖单加氧酶，内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成产物例如纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。
木聚糖酶与其它辅助酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶一起催化半纤维素的水解。
用于本文所述方法中的酶组合物可包含至少两种活性，但典型的组合物包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。典型地，用于本文所述方法中的酶组合物包含至少两种纤维素酶。所述至少两种纤维素酶可以含有相同或不同的活性。用于本文所述方法中的酶组合物还可以包含至少一种不同于纤维素酶的酶。优选地，所述至少一种其它酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外活性。这种辅助活性的实例在本文中被提及，包括但不限于半纤维素酶。
用于如本文所述的方法中的酶组合物至少包含溶解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)、木聚糖酶、β-木糖苷酶(BX)和β-葡糖苷酶(BG)。酶组合物可包含每种活性类别中的多于一种的酶活性。例如，组合物可以包含两种内切葡聚糖酶，例如具有内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶和具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶。
用于在如本文所述的方法中使用的组合物可从真菌，例如丝状真菌，例如Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌获得。在一个实施方式中，酶中的至少一种可来源于踝节菌属埃默森蓝状菌。在一个实施方式中，溶解性多糖单加氧酶和/或β-木糖苷酶来源于踝节菌属埃默森蓝状菌。如果需要的话，可以用来自其他来源的附加酶补充所述酶。此类附加酶可来源于经典来源和/或由经基因修饰的生物产生。
另外，用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物中的酶可能够在低pH下工作。出于本发明的目的，低pH表示pH为5.5或更低、5或更低、4.9或更低、4.8或更低、4.7或更低、4.6或更低、4.5或更低、4.4或更低、4.3或更低、4.2或更低、4.1或更低、4.0或更低、3.9或更低、3.8或更低、3.7或更低、3.6或更低、3.5或更低。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含来自Rasamsonia的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们还可以包含来自不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或多种Rasamsonia酶一起使用，或者它们可以在不存在附加Rasamsonia酶的情况下使用。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物包含溶解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I(CBHI)、纤维二糖水解酶II(CBHII)、β-葡糖苷酶、内切木聚糖酶(EX)和β-木糖苷酶。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含由如本文所述的组合物提供的一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，以及由附加的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
如本文所用，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。如本文所述的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
如本文所用，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。如本文所述的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
如本文所用，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。如本文所述的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
因此，用于如本文所述的方法的酶组合物可包含以下酶中的一种或多种：溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)、纤维二糖水解酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶，以及β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯生物呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶、香豆酰基酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和/或β-甘露糖苷酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种果胶酶，例如内切-多聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果胶-乙酰基酯酶、内切果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α-鼠李糖苷酶、外切半乳糖醛酸酶，外切聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖酸酸水解酶，和/或木半乳糖醛酸酶。另外，用于在如本文所述的方法中使用的组合物中可以存在以下酶中的一种或多种：淀粉酶、蛋白酶、脂酶、木质素酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶、扩展蛋白(expansin)、纤维素诱导的蛋白或纤维素整合蛋白，或类似蛋白(这些在上文中称为辅助活性)。
如本文所用，溶解性多糖单加氧酶是最近被CAZy分类在AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)中的酶。因此，存在AA9溶解性多糖单加氧酶和AA10溶解性多糖单加氧酶。溶解性多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构，并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。溶解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是溶解性多糖单加氧酶。GH61最初基于一个家族成员中非常弱的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性测量值而被归类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy分类在AA9家族中。CBM33(家族33碳水化合物结合模块)也是一种溶解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，Journal of BiologicalChemistry，第289卷，第5期，第2632-4642页)。CAZy最近将CBM33重新分类在AA10家族中。
在一个实施方式中，溶解性多糖单加氧酶包括AA9溶解性多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的溶解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9溶解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有溶解性多糖单加氧酶均为AA9溶解性多糖单加氧酶。
在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自热子囊菌属(例如橙色嗜热子囊菌)的溶解性多糖单加氧酶，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2和在WO2014/130812及WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的溶解性多糖单加氧酶；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的溶解性多糖单加氧酶，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812及WO 2008/148131描述为SEQ ID NO:4以及WO 2011/035027中所述的溶解性多糖单加氧酶；或来自曲霉属(例如烟曲霉菌)的溶解性多糖单加氧酶，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的溶解性多糖单加氧酶；或来自青霉菌属(例如埃默森青霉(Penicillium emersonii))的溶解性多糖单加氧酶，例如在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的溶解性多糖单加氧酶。其他合适的溶解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/005867)、热子囊菌属(参见WO 2011/039319)和甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(参见WO 2011/041504)。可包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263，以及US 5,686,593(仅举几例)中。在一个优选的实施方式中，所述溶解性多糖单加氧酶来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌(参见WO 2012/000892)。
如本文中所用，内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖(lichenin)或谷类β-D-葡聚糖中的1,4β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，并且还可能够水解还含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。内切葡聚糖酶也可以称为纤维素酶、结晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4β-葡聚糖酶。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切葡聚糖酶中的至少一种是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多的内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶，或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自以下的内切葡聚糖酶：木霉属，例如里氏木霉；腐质霉属，例如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；曲霉属，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或白曲霉(Aspergillus kawachi)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；镰刀菌属，例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；梭孢壳属，例如太瑞斯梭孢壳；腐质霉属，例如灰腐质霉高温变种或特异腐质霉；白丝菌属(Melanocarpus)，例如热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉；枝鼻菌属(Cladorrhinum)，例如多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或金孢子菌属，例如鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的菌株(参见WO 01/70998)。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可水解木二糖。β-木糖苷酶也可以称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在一个实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的β-木糖苷酶中的至少一种是GH3β-木糖苷酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶均为GH3β-木糖苷酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自粗糙脉孢菌、烟曲霉菌或里氏木霉的β-木糖苷酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。
如本文所用，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可以被称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一个实施方式中，内切木聚糖酶包括GH10木聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶均为GH10木聚糖酶。
在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉菌(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(参见WO 2011/041405)、青霉菌属(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、Talaromyces leycettanus、嗜热裂孢菌，或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的内切木聚糖酶(参见WO 02/24926)。
如本文所用，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。此类多肽可对β-D-葡糖苷具有宽特异性，并且还可以水解以下中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷，或β-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为苦杏仁酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属的β-葡糖苷酶，例如来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶，例如在WO 02/095014中公开的β-葡糖苷酶，或在WO2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自烟曲霉菌的β-葡糖苷酶，例如在WO 2005/047499中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如在WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如具有以下取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)，或来自棘孢曲霉、黑曲霉或白曲霉的β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于青霉属，例如在WO 2007/019442公开为SEQ IDNO:2的巴西青霉(Penicillium brasilianum)；或来源于木霉属，例如里氏木霉，例如在US6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中描述的里氏木霉。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于太瑞斯梭孢壳(WO 2011/035029)或囊状长毛盘菌(WO2007/019442)。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的β-葡糖苷酶(参见WO 2012/000886)。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键水解，从而从链端部释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可以称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、结晶纤维素酶、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，酶组合物包含来自曲霉属(例如烟曲霉菌)的纤维二糖水解酶I，例如在WO 2011/057140中以SEQ ID NO:6公开或在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:6公开的Cel7A CBH I；来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶I；来自毛壳菌属(例如嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶I；来自篮状菌属(例如Talaromyces leycettanus)的纤维二糖水解酶I；或来自青霉菌属(例如埃默森青霉)的纤维二糖水解酶I。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。
在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自曲霉(例如烟曲霉)的纤维二糖水解酶II，例如在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:7所示的纤维二糖水解酶II；或来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶II；或来自篮状菌属(例如Talaromyces leycettanus)的纤维二糖水解酶II；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的纤维二糖水解酶II，例如来自太瑞斯梭孢壳的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。
在一个实施方式中，酶组合物还包含以下提及的酶中的一种或多种。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣多糖酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣聚糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可以称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于来自黑曲霉、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和大型亚灰树花菌(M.giganteus)(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。该酶也可以称为α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶(glucuronosidase)，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。可包含在酶组合物中的α-葡糖醛酸糖苷酶的示例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillusclavatus)、烟曲霉菌、黑曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(参见WO 2009/068565)和里氏木霉的α-葡糖醛酸糖苷酶。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。可包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于来自棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、细丽毛壳(Chaetomium gracile)、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(见WO2010/014880)、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳NRRL8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的乙酰木聚糖酯酶(参见WO 2010/000888)。
如本文所用，阿魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰糖+H2O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。阿魏酸酯酶通常可以催化来自酯化糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)的水解，所述酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯是典型地更弱的底物。该酶也可以称为肉桂酰基酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。它也可以称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁的半纤维素和果胶。可包含在酶组合物中的阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)的示例包括但不限于：来自特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/076122)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、黄灰青霉(参见WO 2009/127729)和太瑞斯梭孢壳(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酰酯酶。
如本文所用，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
如本文所用，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所用，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
如本文所用，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合用于如本文所述的方法中。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“木质素酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并且可适于使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质——膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesion domain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”是指催化两个过氧化氢转化为氧和两个水的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。可以基于以下反应，通过在240nm处监测过氧化氢的降解来测定过氧化氢酶活性：2H2O2→2H2O+O2。在25℃下，在pH为7.0的50mM磷酸盐中，利用10.3mM底物(H2O2)和约100单位酶/ml进行该反应。在16-24秒内采用分光光度法监测吸光度，这应该对应于0.45-0.4的吸光度降低。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H2O2。
如本文所用的术语“淀粉酶”是指水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉中)的α-1,4-葡糖苷键的酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)；以及水解α-1,6-糖苷键(为支链淀粉中支链点)的酶，例如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限糊精酶(EC 3.2.1.142)。
用于在如本文所述的方法中使用的组合物可以由来自以下来源的酶构成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中不同的酶可获自不同的来源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素材料中。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以作为木质纤维素材料，并且被添加进木质纤维素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时(即本身作为单一组合物)或分别或顺次提供。
在一个实施方式中，酶组合物是真菌的完整发酵培养液(whole fermentationbroth)，优选是丝状真菌的完整发酵培养液，更优选是Rasamsonia的完整发酵培养液。完整发酵培养液可以由非重组丝状真菌和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一种实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因。在一种实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因，其中所述一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。完整发酵培养液可包含上述多肽中的任一者，或它们的任何组合。
优选地，酶组合物为完整发酵培养液，其中细胞被杀死。完整发酵培养液可包含有机酸(用于杀死细胞)、被杀死的细胞和/或细胞碎片和培养基。
通常，在适于生产能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基、温度范围以及适于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的其它条件是本领域已知的。可以通过使丝状真菌生长到静止期并将丝状真菌在限碳条件下维持足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备完整发酵培养液。一旦丝状真菌将酶(例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)分泌到发酵培养基中，便可以使用完整发酵培养液。本发明的完整发酵培养液可以包含丝状真菌。在一些实施方式中，完整发酵培养液包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级内容物。通常，完整发酵培养液包含丝状真菌生长至饱和、在限碳条件下培养以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)之后存在的已用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方式中，完整发酵培养液包含已用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法裂解、透化或杀死完整发酵培养液中存在的丝状真菌以产生细胞被杀死的完整发酵培养液。在一种实施方式中，完整发酵培养液是细胞被杀死的完整发酵培养液，其中含有丝状真菌细胞的完整发酵培养液被裂解或杀死。在一些实施方案中，通过凭借化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，以产生细胞被杀死的丝状真菌的完整发酵培养液。在一些实施方式中，通过凭借化学和/或pH处理裂解丝状真菌并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH来杀死细胞。在一种实施方式中，完整发酵培养液包含第一有机酸成分，其包括至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，以及第二有机酸成分，其包括至少6个或更多碳的有机酸和/或其盐。在一种实施方式中，第一有机酸成分为醋酸、甲酸、丙酸、其盐或其任意组合，第二有机酸成分为苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任意组合。
如本文使用的术语“完整发酵培养液”指通过未进行或进行了最少回收和/或纯化的细胞发酵而产生的制备物。例如，完整发酵培养液是当微生物培养物生长至饱和时、在碳限制性条件下培养以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌至细胞培养基中而产生的。通常，完整发酵培养液是未分级的且包括已用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为非存活的细胞。
如果需要的话，完整发酵培养液可以是分级的且可使用经分级内容物中的一种或多种。例如，可从完整发酵培养液去除杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些成分的组合物。
完整发酵培养液可进一步地包含防腐剂和/或抗微生物剂。这种防腐剂和/或试剂是本领域中是已知的。
通常，如本文所述的完整发酵培养液为液体，但也可含有不溶性成分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整发酵培养液。
在一种实施方式中，可以用丝状真菌不内源性表达或以相对低的水平表达的一种或多种酶活性补充完整发酵培养液，以改善纤维素底物降解，例如成为可发酵糖，例如葡萄糖或木糖。补充酶可以作为补充物添加到完整发酵培养液中，并且所述酶可以是单独的完整发酵培养液的组分，或者可以被纯化，或最低限度地回收并/或纯化。
在一种实施方式中，完整发酵培养液包含过表达一种或多种酶的重组丝状真菌发酵的完整发酵培养液，以改善纤维素底物的降解。或者，完整发酵培养液可以包含过表达一种或多种酶的重组丝状真菌发酵和非重组丝状真菌发酵的完整发酵培养液的混合物，以改善纤维素底物的降解。在一种实施方式中，完整发酵培养液包含过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌发酵的完整发酵培养液。或者，本方法和反应性组合物中使用的完整发酵培养液可以包含过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌发酵的完整发酵培养液和非重组丝状真菌发酵的完整发酵培养液的混合物。
本文中使用的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用于如本文所述的方法的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virginbiomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗，甘蔗秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corn cobs)，玉米纤维，玉米粒，芸苔茎，大豆茎，高粱，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，干酒精糟，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woodycrops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheatmidlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工(包括农业和林业活动)产生的有机废弃物材料，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是上述任一或其任何组合或混合物。
在一个实施方式中，将木质纤维素材料在酶促水解之前进行预处理。预处理是借助于热和化学改性完成的。
将木质纤维素材料在155℃至220℃，优选160℃至200℃，更优选170℃至190℃的温度下进行预处理。
将木质纤维素材料在1.0至2.5，优选1.3至2.4，优选1.6至2.3，以及更优选1.9至2.2的pH下进行预处理。
将木质纤维素材料预处理0.5至20分钟，优选1至15分钟，优选2至10分钟，以及更优选2.5至6分钟。
将木质纤维素材料在5至25bara的压力下进行预处理。
可以洗涤木质纤维素材料。在一种实施方式中，可以在预处理后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可用于除去可充当发酵步骤和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按本领域技术人员已知的方式进行洗涤步骤。除了洗涤之外，还存在其它脱毒方法。木质纤维素材料也可以通过这些方法的任何(或任何组合)来脱毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、提取、吸附、中和、超施石灰(overliming)、添加还原剂、添加脱毒酶(例如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解物脱毒的微生物。
如本文所述的方法中使用的酶组合物可极其有效地水解木质纤维素材料，例如玉米秆、麦秸、甘蔗秸和/或蔗渣，然后其可被进一步转化为产物，例如乙醇、生物气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，来自水解之后过程的中间产物(例如作为生物气生产中的中间体的乳酸)可被用作其它材料的结构单元。
在一个实施方式中，添加的酶的量(本文中也称为酶剂量或酶负载)低。在一个实施方式中，酶的量为0.1-10mg蛋白质/g干物质。
经预处理的木质纤维素材料的酶促水解期间的pH为4至6。经预处理的木质纤维素材料的酶促水解期间的温度为50℃至65℃，优选为55℃至65℃。
在一个实施方式中，进行水解步骤，直到木质纤维素材料中的可用糖的70％-90％，优选70％-95％，更优选70％-100％被释放。
如本文所述的方法的酶促水解是使用干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的经预处理的木质纤维素材料进行的。
如上所述，本发明还涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法；(b)发酵糖产物以获得发酵产物；以及(c)任选地回收发酵产物。如上所述，糖产物也可以称为水解的木质纤维素材料。
在一个实施方式中，发酵在反应器中进行。在一个实施方式中，发酵也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以意指多个反应器。
在一个实施方式中，发酵在体积为1-5000m3的反应器中进行。在如本文所述的方法的发酵中使用多个反应器的情况下，所述多个反应器可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一个实施方式中，进行发酵的反应器的高度与直径之比为2:1至8:1。
在一个实施方式中，通过产醇微生物进行发酵以产生醇。通过产醇微生物进行发酵以产生醇可以在执行水解的同一反应器中进行。优选地，通过产醇微生物进行发酵以产生醇在不同的反应器中执行。
在一个实施方式中，通过酵母进行发酵。在一个实施方式中，产醇微生物是酵母。在一个实施方式中，产醇微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。在一个实施方式中，用能够转化至少一种C5糖的酵母进行发酵。在一个实施方式中，本申请涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将木质纤维素材料在160℃至200℃的温度下在1.0至2.5的pH下预处理1至15分钟；(b)使用丝状真菌的完整发酵培养液在50℃至65℃的温度和4至6的pH下酶促水解干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的经预处理的木质素纤维素材料40小时至150小时以获得水解的木质纤维素材料，所述培养液至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和溶解性多糖单加氧酶；(c)将水解的木质纤维素材料发酵以产生发酵产物；以及(d)任选地回收发酵产物，其中所述水解的木质纤维素材料包括葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。在一个实施方式中，水解的木质纤维素材料包含乙酸，优选0.3％(w/w)或更多的乙酸。在一个实施方式中，水解的木质纤维素材料包含甘油。在一个实施方式中，水解的木质纤维素材料包含乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖。在一个实施方式中，用于发酵的微生物将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵成发酵产物。在一个实施方式中，用于发酵的酵母将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵成发酵产物。在一个实施方式中，用于发酵的酵母将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵为乙醇。在一个实施方式中，水解的木质纤维素材料包含Mn2+。
在另一方面中，本申请包括如本文所述的方法，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖、半乳糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、半乳糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或可通过经修饰的宿主细胞生产。在后者的情况下，经修饰的宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一种实施方式中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxic growth)。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰的宿主细胞生长所需的适宜成分。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此再产生NAD+。因而，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一种优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产率。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。
在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下进行。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下进行。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被从气体至液体的氧转移所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选地至少6mmol/L/h和甚至更优选地至少7mmol/L/h。在一种实施方式中，发酵是厌氧的。
发酵方法优选地在对所用微生物而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃，优选地低于38℃下的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度下并在高于20℃、22℃或25℃的温度下进行。在一种实施方式中，发酵在25℃至35℃之间执行。
在一个实施方式中，用发酵微生物进行发酵。在本发明的一个实施方式中，用C5发酵微生物进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在本发明的一个实施方式中，用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTMAFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSM Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个实施方式中，产醇微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它还能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方式中，本申请描述了一种由木质纤维素材料制备乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法；(b)发酵糖产物以产生乙醇；以及(c)任选地回收乙醇。可以用能够发酵至少一种C5糖的酵母进行发酵。
发酵中使用的微生物可以是原核或真核生物。所使用的微生物可以是经遗传工程化的微生物。合适的微生物的示例是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；汉逊酵母属(Hansenula)；伊萨酵母属(Issatchenkia)，例如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；毕赤酵母属(Pichia)，例如树干毕赤酵母(ichiastipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)；念珠菌属(Candida)，例如伪热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)或酸性嗜热假丝酵母(Candida acidothermophilum)；管囊酵母属(Pachysoien)，例如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)；或细菌，例如乳杆菌属(例如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis))、芽孢杆菌属(Geobacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))、梭菌属(Clostridium)(例如Clostridium phytofermentans)、埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于酵母属，优选地属于酿酒酵母种。在如本文所述的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)能够转化己糖(C6)和戊糖(C5)。在如本文所述的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。在一个实施方式中，除葡萄糖外，如本文所述的酵母还能够厌氧地使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。能够从L-阿拉伯糖产生乙醇的生物，例如酿酒酵母菌株，可以通过以下方式产生：修饰宿主酵母，引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖二草酸酯)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。可将这些基因引入宿主细胞中以使所述宿主细胞能够利用阿拉伯糖。WO2003/095627中描述了这种方法。来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD基因可以使用并公开在WO2008/041840中。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的araA基因以及来自大肠杆菌的araB和araD基因可以使用并公开在EP1499708中。在另一种实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于棒形杆菌属(Clavibacter)、节细菌属(Arthrobacter)和/或革兰菌属(Gramella)中的至少一种，特别是番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和/或弗塞特革兰菌(Gramella forsetii)中的一种，如WO 2009011591中所公开的那样。在一种实施方式中，酵母还可以包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可以包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例有引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许通过细胞中戊糖磷酸途径的通量增加。遗传工程酵母的实例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适商业酵母的实例有RN1016，其是来自荷兰DSM的发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母菌株。
在一种实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下进行，例如所述方法是需氧的和在限氧条件下进行。限氧条件已在本文上文定义过。
或者，对于上述发酵方法，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有实施方式也是该共发酵方法的实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。
可以通过本发明的方法生产的发酵产物可以是源自发酵的任何物质，它们包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃类(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃类(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃类(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)以及气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶(例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶)。在一个优选的实施方式中，在如本文所述的发酵方法中制备醇。在一个优选的实施方式中，在如本文所述的发酵方法中制备乙醇。
本文所述的方法可包括回收在该方法中制得的所有种类的产物，包括发酵产物，例如乙醇。可以以本领域技术人员已知的方式从发酵液中分离发酵产物。回收技术的示例包括但不限于色谱法、电泳程序、差别性溶解度(differential solubility)、蒸馏或提取。对于每种发酵产物，技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。
在一个实施方式中，本文所述的方法还产生能量、热、电和/或蒸汽。
实施例
实施例1
用于木质纤维素材料的预处理和酶促水解的条件
将玉米秆(其中基于干物质的组成为36.5％(w/w)葡聚糖、0.2％(w/w)甘露聚糖、1.0％(w/w)半乳聚糖、2.3％(w/w)阿拉伯聚糖、19.4％(w/w)木聚糖、2.9％(w/w)乙酰基和0.6％(w/w)甲酰基)在40℃的烘箱中于真空下干燥至水分含量为9.3％(w/w)。此后，将干燥的材料研磨成＜2mm的颗粒，并将经研磨的材料用于进一步的实验。
将搅拌棒、0.83克经研磨的干燥玉米秆(＝0.75克干重)和9.17克硫酸溶液或水添加到20ml小瓶中，导致玉米秆浓度为7.5％(w/w)。将小瓶贮存过夜，然后在以下条件下使用微波(Biotage Initiator 2.0微波合成仪)进行预处理步骤：
表1：预处理条件。
样本编号 温度(℃) 时间(分钟) pH
1 160 4.6 1.3
2 180 2.7 1.9
3 200 1.9 2.5
4 140 151 1.9
5 200 15 4.0
*样本1-5中的硫酸重量％分别为0.67、0.32、0.24、0.32和0。
预处理后，将样本进行酶促水解。打开用于预处理过程的小瓶，并将它们的内容物转移到40ml的离心管中。随后，使用2M NaOH溶液将经预处理的样本的pH设置为4.5。加入的NaOH溶液的总体积是用于校正每个管的最终干物质含量(不同地预处理的样本需要从0.05ml至0.5ml的不同体积的2M NaOH以将pH设置为4.5)。接下来，将按总蛋白(w/w)计包含2.0％的埃默森篮状菌β-葡糖苷酶的埃默森篮状菌纤维素酶混合物(即完整发酵培养液)添加至每克干物质30mg蛋白的最终剂量。根据WO 2011/000949中描述的接种和发酵程序来生产混合物。使用TCA-缩二脲方法确定混合物的蛋白质浓度。简而言之，制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml和10mg/ml)以生成校准曲线。另外，用水制备混合物的稀释液。将270μl的(BSA和混合物的)每种经稀释的样本转移到含有830μl的12％(w/v)三氯乙酸的丙酮溶液的10ml的管中，并充分混合。随后，将管在冰水上孵育一个小时，并在4℃和6000rpm下离心30分钟。弃去上清液，通过将管倒置在纸巾上并在室温下静置30分钟来干燥沉淀。接下来，将3ml BioQuant Biuret试剂混合物添加到管中的沉淀中，沉淀在混合后溶解，之后添加1ml水。将管充分混合并在室温下孵育30分钟。在546nm处测量混合物的吸收，并且将水样本用作空白测量。将在校准线范围内在546nm处具有吸收值的混合物稀释液用于经由BSA校准线计算混合物中的总蛋白浓度。
将含有经预处理的材料和酶混合物的离心管在烘箱中在62℃下孵育，同时旋转。在pH 4.5、62℃下孵育72小时后，将获得的水解物离心，并使用配备有反射指数检测器(Agilent 1260Infinity)的高效液相色谱系统(Agilent 1100)分析上清液的葡萄糖和木糖含量。糖的分离是通过使用包含Micro Guard Carbo-P(Bio Rad)前置柱的300×7.8mmAminex HPX-87P(Bio Rad)柱实现的。流动相为HPLC级水，流速为0.6ml/min，并且柱温为85℃。将前置柱保持在室温下。进样量为10μl。将样本用HPLC级水稀释至2g/l葡萄糖的估计最大值，并使用0.2μm滤器(Afridisc LC，25mm注射器滤器，PVDF膜)过滤。根据保留时间确定葡萄糖和木糖的含量，并经由用在0.2g/l；0.4g/l；1.0g/l；2.0g/l范围内的葡萄糖标准品(D-(+)-葡萄糖，Sigma)和在0.2g/l；0.4g/l；1.0g/l；2.0g/l范围内的木糖标准品(木糖，Sigma)生成的葡萄糖和木糖校准曲线进行定量。结果如表2所示。
表2：葡聚糖、木聚糖和总转化率。
Figure BDA0002436841690000371
表3：木聚糖降解为糠醛的损失。
Figure BDA0002436841690000372
*在60℃的温度和100μl的进样量下，使用Aminex HPX-87H柱(BioRad)通过HPLC测量糠醛；洗脱液：流速为0.55ml/min的5mM H2SO4；RI检测：检测器温度：50℃；运行时间：60min
表2中的数据表明，用根据本发明的预处理和水解条件进行方法(参见样本1-3)与用不同的预处理和水解条件进行方法(参见样本4-5)时相比导致了更高的转化率。当使用干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的经预处理的木质纤维素材料进行方法时，用根据本发明的预处理和水解条件进行的方法与用不同的预处理和水解条件进行的方法之间的转化率差异甚至更大(即，用根据本发明的预处理和水解条件进行的方法具有更高的转化率)。
表3中的数据表明，与经受不同的预处理和水解条件的样本(即样本4-5)相比，对于经受使用根据本发明的预处理和水解条件的方法的样本(即样本1-3)观察到了较低的木聚糖降解为糠醛的降解损失。对于样本2，即已经在170℃至190℃的温度和1.9至2.2的pH下预处理了2.5至6分钟的样本，观察到的木聚糖降解为糠醛的降解损失最低。

Claims (12)

1.一种由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述木质纤维素材料在160℃至200℃的温度下在1.0至2.5的pH下预处理1至15分钟；
b)使用丝状真菌的完整发酵培养液在50℃至65℃的温度和4至6的pH下酶促水解干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的所述经预处理的木质素纤维素材料40小时至150小时，所述培养液至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和溶解性多糖单加氧酶；以及
c)任选地回收所述糖产物。
2.一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述木质纤维素材料在160℃至200℃的温度下在1.0至2.5的pH下预处理1至15分钟；
b)使用丝状真菌的完整发酵培养液在50℃至65℃的温度和4至6的pH下酶促水解干物质重量为15％(w/w)至25％(w/w)的所述经预处理的木质素纤维素材料40小时至150小时以获得水解的木质纤维素材料，所述培养液至少包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和溶解性多糖单加氧酶；
c)将所述水解的木质纤维素材料发酵以产生发酵产物；以及
d)任选地回收所述发酵产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在酶促水解期间将氧添加到所述经预处理的木质纤维素材料中。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在体积为10-5000m3的反应器中进行所述酶促水解。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在55℃至65℃的温度下进行所述酶促水解。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在1.0至1.5的pH下预处理所述木质纤维素材料。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中将所述木质纤维素材料预处理1至5分钟。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中用能够转化至少一种C5糖的酵母来进行所述发酵。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在体积为30-200m3的反应器中进行所述预处理。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述预处理反应器的高度与直径之比为3:1至12:1。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在高度与直径之比为2:1至8:1的反应器中进行所述酶促水解。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在高度与直径之比为2:1至8:1的反应器中进行所述发酵。
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