CN104769117A

CN104769117A - 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法

Info

Publication number: CN104769117A
Application number: CN201380058360.0A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·彼得勒斯·乔瑟夫·贝克浩特; 爱达·海赛尼; 伯图斯·诺丹姆
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: Versalis SpA
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2015-07-08
Also published as: KR20150082276A; EA201500516A1; HRP20200092T1; KR102104151B1; MY169456A; JP6690085B2; MX2018012714A; US20180208949A1; UA117357C2; US20200224223A1; US11434507B2; HRP20191960T1; US10724057B2; HUE048887T2; JP6396307B2; HUE047092T2; IN2015DN03027A; EA028880B1; MX2015005628A; LT3613860T

Abstract

本发明涉及从木质纤维素材料制备糖产物的方法，其包括下述步骤：任选地预处理所述木质纤维素材料；任选地清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料；使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地清洗和/或任选地预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含GH61；和任选地回收糖产物；其中在所述酶促水解的部分时间期间向所述木质纤维素材料中加入氧；以及在所述酶促水解的部分时间期间向所述木质纤维素材料中加入比所述酶促水解的另一部分时间更少的氧，优选地不向所述木质纤维素材料中加入氧。

Description

酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法

发明领域

本发明涉及酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法。

发明背景

木质纤维素植物材料在本文中也称为原料(feedstock)，其是糖形式的可再生能源，其可被转化为有价值的产物，例如糖或生物燃料，例如生物乙醇。该过程期间，通过(半)纤维素分解酶，原料(例如麦秸、玉米秆、稻壳等)中存在的(木质或半)纤维素被转化为还原糖，接着任选地通过微生物(比如酵母、细菌和真菌)，所述还原糖被转化为有价值的产物例如乙醇。

鉴于(半)纤维素是结晶的并包埋在木质素网中，向还原糖的转化通常是慢的且不完全的。典型地，酶促水解未处理原料产生少于理论量的20％的糖。通过应用化学和热物理预处理，(半)纤维素对(半)纤维素分解酶而言更可及，因而转化更快且产率更高。

来自源于预处理的玉米秆的葡萄糖的典型乙醇产率是40加仑乙醇/1000kg干玉米秆(Badger,P,Ethanol from cellulose:a general review,Trends in new crops and new uses,2002,J.Janick和A.Whipkey(编)ASHSPress,Alexandria,VA)或0.3g乙醇/g原料。基于纤维素的乙醇的最大产率是约90％。

纤维素分解酶(它们中的大多由下述物种产生：比如Trichoderma、Humicola和Aspergillus)在商业上被用来将预处理的原料转化为含有不可溶的(半)纤维素、其制得的还原糖以及木质素的糊状物(mash)。来源于Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶已被用于降解木质纤维素原料，这些酶因为它们的热稳定性而众所周知，参见WO2007091231。产生的糊状物被用在发酵中，发酵期间还原糖被转化为酵母生物质(细胞)、二氧化碳和乙醇。以这种方式产生的乙醇被称为生物乙醇。

从预处理的木质纤维素原料生产糖的一般生产中，水解(还被称为液化、预糖化或糖化)典型地在45-50℃的升高的温度和非灭菌条件下的持续6-168小时的方法中进行(Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)。在该水解期间，存在的纤维素被部分(典型地30-95％，可取决于酶活性和水解条件)转化为还原糖。在酶被预处理原料中存在的化合物和被释放的糖抑制的情况下，以及为了使热失活最小化，该升高的温度的时间尽可能地降到最短。

水解后的发酵在相同或不同容器中在单独的优选厌氧的方法步骤中发生，其中温度被调至30-33℃(嗜温方法)以适应生长和通过微生物生物质(通常为酵母)生产乙醇。在该发酵方法期间，通过来自水解步骤的仍存在的酶，剩余的(半)纤维素材料被转化为还原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦(半)纤维素材料被转化为可发酵糖并且所有可发酵糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物细胞，发酵完成。这可耗费长达6天。水解和发酵的总过程时间通常可达到13天。

这样获得的发酵糊状物由非可发酵糖、非可水解(半)纤维素材料、木质素、微生物细胞(大多通常为酵母细胞)、水、乙醇、溶解的二氧化碳组成。在连续步骤中，从糊状物中蒸馏并进一步纯化乙醇。剩余的固体悬浮物被干燥并被用作例如燃烧燃料、肥料和牛饲料。

WO2010080407建议：在厌氧条件下用纤维素酶组合物处理纤维素材料。除去或排除活性氧物质可改善纤维素水解酶体系的性能。酶组合物对纤维素材料(例如，木质纤维素)的水解可被酶组合物组分的氧化损伤和/或纤维素材料的氧化(例如，通过分子氧)降低。

WO2009046538公开了处理木质纤维素原料植物材料以释放可发酵糖的方法，其中在真空下使用酶促水解方法处理材料，并产生包含降低量的挥发性糖/发酵抑制化合物例如糠醛和乙酸的富糖处理流。除了除去挥发性抑制化合物之外，还除去的其它化合物和/或分子包括氮、氧、氩和二氧化碳。

就每批原料而言，添加酶以使给定的处理时间期间从预处理的木质素纤维素原料释放的可发酵糖的产率和速率最大化。通常，生产酶的成本、原料到乙醇的产率和投资是总生产成本中的主要成本因素(Kumar,S.Chem.Eng.Technol.32(2009)517-526)。迄今为止，通过应用来自单一微生物来源或来自多种微生物来源(WO 2008/008793)的具有更宽和/或更高(特异性)水解活性的酶产物来实现酶使用成本降低，使用所述酶目的在于更低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率和因而更低的总生物乙醇生产成本。这需要在研究和开发这些酶产物中的大笔投资。在由来自多种微生物来源的酶构成的酶产物情况下，生产各单个酶化合物需要大的资本投资。

因此期望改进涉及水解和发酵的上述方法。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供这样的方法，其中水解步骤在改进条件下进行。本发明的另一个目的是提供一种方法，其涉及具有减少的处理时间的水解。本发明的再一个目的是提供这样的方法，其中酶剂量可被减少并且同时有用水解产物的输出被保持在相同水平或甚至被提高。另一个目的是提供涉及水解的方法，其中水解的处理条件被优化。本发明的又一个目的是提供涉及水解的方法，其中使用相同的酶剂量时有用水解产物的输出增加。根据本发明达到这些目的中的一个或多个。

本发明提供用于从木质纤维素材料制备糖产物的方法，其包括下述步骤：

a)任选地预处理所述木质纤维素材料；

b)任选地清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料；

c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地清洗的和/或任选地预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含GH61；和

d)任选地回收糖产物；

其中在所述酶促水解的部分时间期间，向所述木质纤维素材料中加入氧；并在所述酶促水解的部分时间期间，向所述木质纤维素材料中加入比所述酶促水解的另一部分时间更少的氧，优选地不向所述木质纤维素材料中加入氧。

此外，本发明提供用于从木质纤维素材料制备发酵产物的方法，其包括下述步骤：

a)任选地预处理所述木质纤维素材料；

b)任选地清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料；

c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地清洗的和/或任选地预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含GH61；

d)发酵所述水解的木质纤维素材料以产生发酵产物；和

e)任选地回收发酵产物；

根据本发明的一个优选实施方式，其中较少氧或优选地没有氧被加入的部分时间是总酶促水解时间的10-80％，优选地20-80％，更优选地30-80％，最优选地40-80％。

根据本发明的另一优选实施方式，其中较多氧被加入的部分时间是总酶促水解时间的2-80％，优选地4-60％，更优选地8-50％，最优选地10-50％；更优选地，其中较多氧被加入的部分时间是

a)当氧在酶促水解的后段时间被加入时，12-50％，优选地20-40％；

b)当氧在酶促水解的前段时间被加入时，总酶促水解时间的2-30％，优选地4-25％，更优选地5-20％；或者

c)a与b的组合。

有利地，其中氧被加入的部分时间中在水解液相中的氧浓度是其中较少氧或没有氧被加入的部分时间中液相中氧浓度的至少2倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。

根据本发明的另一优选实施方式，在其中氧被加入的部分时间中，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度为至少0.001mol/m³，优选地至少0.002mol/m³，最优选地至少0.003mol/m³，甚至更优选地高于0.01mol/m³，例如高于0.02mol/m³或0.03mol/m³。在小于1m³的反应器中，将通过缓慢搅拌获得低于0.01mol/m³或0.02mol/m³的DO值。在这种规模下剧烈混合或搅拌将顶部空间的部分气相引入反应液中。例如，混合或搅拌可创造将氧卷入液体中的涡流。对于尺寸高达100L至1m³的反应器，用氧(例如以空气的形式)在顶部空间吹送并连同(剧烈)混合或搅拌通常将向水解反应器中的纤维素材料中引入充足的氧。在较大规模时，例如在50m³或更大(例如100m³)的反应器中，剧烈搅拌需要如此多的能量以至于从经济学角度来看这将不能被应用于商业操作方法中。通常，在大反应器中，搅拌或混合但不引入空气或氧将导致低于0.01mol/m³的DO值。

对于本发明的另一优选实施方式，在氧加入期间(其中氧被加入的部分时间中)，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度优选地为水解反应条件下饱和氧浓度的至多80％，更优选地至多0.12mol/m³，仍然更优选地至多0.09mol/m³，甚至更优选地至多0.06mol/m³，甚至仍然更优选地至多0.045mol/m³，最优选地至多0.03mol/m³。温度和压力将影响DO。上文给出的优选和示例性mol/m³值涉及正常气压和约62℃的温度。本领域技术人员将基于本教导领会有利的DO值。

根据本发明的另一优选实施方式，用于酶促水解的反应器的体积为1m³或更大。本发明所述方法的酶促水解时间优选地为5-150小时。根据本发明的另一优选方面，酶组合物来源于真菌，优选地Rasamsonia属的微生物，或酶组合物包含真菌酶，优选Rasamsonia酶。根据本发明的另一优选方面，水解步骤c)中的干物质含量为10重量％或更多，优选地为14重量％或更多，仍然更优选地为14-33重量％。酶促水解优选地发生在分批、补料分批和/或连续培养反应器中。优选地，在本发明的方法中被引入的氧是含氧气体例如空气。在酶促水解的部分时间中较少氧被加入到或存在于木质纤维素材料中表示：与其中较少氧被加入的酶促水解的另一部分时间中被加入或存在的氧相比，引入的(例如以气泡形式)或存在的氧(以mol氧//m³表示)少至少50％，优选地少至少70％，最优选地少至少90％。

在一个优选的实施方式中，氧以(气)泡形式被加入。

出乎意料地，根据本发明，通过加入氧，可以达到许多处理优势，包括最佳温度条件、减少处理时间、降低酶剂量、酶的再利用、更高产率和其它处理优化，从而导致成本降低。

在一个实施方式中，使用的稳定酶组合物保持活性30小时或更久。根据另一实施方式，水解优选地在40℃或更高的温度下，更优选地在50℃或更高的温度下，最优选地在55℃或更高的温度下进行。以下将更详细地阐释本发明的方法。

附图简述

图1：在水解之前吹送氮或空气通过10％aCS原料对TEC-210混合物(1)、4E-GH61混合物(2)和4E-EG混合物(3)释放的葡萄糖总量(g/l)的影响。

图2：实施例2中产生的葡萄糖，1＝实验1：不通气，2＝实验2：连续通气，3＝实验3：在72小时时开始通气直至结束。

图3：通气时间对酶促水解期间产生的葡萄糖的影响，——＝不通气，●●●＝在水解时间0小时和100小时之间通气，---在水解时间0小时和7小时之间通气，———＝在水解时间72小时和100小时之间通气。

图4：在实验1(■＝在水解时间0小时和100小时之间通气)和实验2(□＝在水解时间72小时和100小时之间通气)中，通气时间对酶促水解期间产生的葡萄糖的影响。

图5：通气时间对酶促水解期间产生的葡萄糖的影响，—■—在水解时间72小时和100小时之间通气，—●—在水解时间0小时和7小时之间通气。

发明详述

在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”及其变体应被解释为包含性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其它要素或成分。本文中不使用数量词修饰表示一个或多于一个(即一个或至少一个)。例如，“要素”可表示一个要素或多于一个要素。

在本发明的语境中，“改进”、“增加”、“减少”被用来表示：与除了不加入额外的氧之外相同的情况、方法或方法条件相比，本发明显示出优势。在本发明的语境中，“在相同条件下测量”或“在相同条件下分析”等表示：本发明所述方法与没有(或较少)加入氧的相同方法在除了加入氧之外相同的条件下进行，并且如果与没有(或较少)加入氧的方法相比，使用相同条件、优选地通过使用相同试验和/或方法学，更优选地在相同或平行实验中测量本发明所述方法的结果。水解条件是这种条件的一个实例。

现有技术建议通过在酶促水解期间使用厌氧(WO2010/080407)或真空条件(WO2009/046538)来改进纤维素分解材料的水解。在两个文件的方法中，氧水平被降低。已出乎意料地发现：与不加入氧的方法相比，本发明的水解显示出导致改进的反应产物，其在水解之后的发酵中产生更高量的(还原)糖产物和/或期望的发酵产物。通常观察到的葡萄糖转化的增加为5-15重量/重量％，或甚至达到25重量/重量％。

氧可以以多种方式被加入。例如，氧可以作为氧气、富氧气体例如富氧空气或空气(含氧气体的实例)被加入。氧可被连续地或不连续地加入。氧被“加入”表示：氧被加入到水解反应器中的液相(包含木质纤维素材料)中，而非氧出现在液相上方的反应器顶部空间中(联合缓慢搅拌或不搅拌)，其中氧必须从顶部空间扩散到液相。因此，优选地氧作为气泡、最优选地作为小气泡被加入。

在酶可被氧的存在或加入损伤的情况下，可使用较温和的氧供应。在这种情况下，可在改进的葡萄糖生产和酶性能之间找到平衡。可在酶促水解期间向纤维素分解材料中加入氧。在以气态形式加入氧的情况下，含氧气体可被引入、例如吹入纤维素分解材料的液体水解反应器内容物中。在本发明的另一个实施方式中，含氧气体被引入将进入水解反应器的液体纤维素分解材料流中。在本发明的另一个实施方式中，含氧气体与进入水解反应器的纤维素分解材料或经过反应器外环(external loop)的部分液体反应器内容物一起被引入。在大多数情况下，进入水解反应器之前加入氧并不足够，还可以在水解期间加入氧。在本发明的另一个实施方式中，用含氧气体连续地或不连续地更新存在于反应器上部(顶部空间)的气相。在后一种情况下，需要(剧烈)混合或搅拌以使氧以气泡形式并/或通过扩散进入液体反应器内容物，优选地联合反应器中的超压。对于尺寸达到100L至1m³的反应器，用空气吹送顶部空间联合(剧烈)混合或搅拌通常可将充足氧引入水解反应器中的纤维素材料中。在较大规模时，例如在50m³或更大(例如100m³)的反应器中，剧烈搅拌需要如此多的能量以至于从经济学角度来看这将不能被应用于商业操作方法中。

根据本发明，可以在部分水解步骤期间加入氧。可以在例如出现酶的氧化损伤的情况下仅在部分水解期间加入氧。如果存在于水解反应器内容物或者在水解步骤中形成的糖产物或水解物中的氧可在随后的发酵步骤中造成影响或产生干扰，那么可在除了水解的最后部分之外加入氧，从而(大部分)氧在经水解生物质进入发酵反应器之前被消耗。有利地，氧(优选地以(气)泡形式)在水解步骤的最后部分被加入。

本发明人提出下述假说：在(酶促)水解(步骤)的第一部分，无定型多糖被水解成糖例如葡萄糖；在水解步骤的第二部分，剩余的晶体多糖被转化为糖。无定型多糖例如通过内切葡聚糖酶被转化为寡糖，之后寡糖可通过纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶(BG)被转化为糖。根据本假说，无定型多糖位于多糖或多糖复合物的外部，而晶体多糖位于木质纤维素材料中存在的多糖或多糖复合物的相对更里面。因此，甚至当大部分无定型多糖被水解时，晶体多糖的转化可继续。在水解晶体多糖期间(例如降解多糖成为寡糖)加入氧时特别有益。根据这种假说，水解步骤的第二部分中的加入氧尤其有用。通常，与其中存在相对较高的量的晶体多糖的木质纤维素材料的水解相比，木质纤维素材料中存在相对低的量的晶体多糖的情况下，需要较短时间的氧加入(或较短的水解的第二部分)。发明人还提出：加入氧有益于晶体多糖的水解。因此，加入氧极其有用，尤其是在晶体多糖被酶攻击的阶段。在这个阶段之外，不加入氧可能更有效。因此，可仅在水解的第二部分或后半时开始供应氧。在当大部分晶体多糖被降解的水解的最后部分，优选地停止加入氧。在水解的第二部分的最后部分或后半时，大部分多糖被转化为寡糖，在寡糖被进一步分解为更小的糖期间不再需要氧。因此，优选地，与通气时间部分期间的氧加入相比，在水解方法的最后部分向木质纤维素材料中加入较少氧，或者更优选地，在水解方法的最后部分不向木质纤维素材料中加入氧。这种假说仅仅作为对发明人注意到的效果的可能解释被给出，本发明并不因这种理论的正确性而成立或不成立。

本发明人还已注意到：在水解方法开始的酶促水解过程期间通气导致水解期间增加的葡萄糖产量。

图3中显示了通气的效果。与不通气的水解(被显示为“不通气”曲线)相比，在水解方法的开始通气(被显示为“0-7小时通气”曲线)将导致葡萄糖产量立即增加，且例如早在水解24小时之后，将发现葡萄糖产量与在相同条件下(除了通气之外)不通气的60小时水解时的葡萄糖产量相当。与不通气的水解相比，在水解方法的最后部分通气(被显示为“72-100小时通气”曲线)将导致通气后葡萄糖产量立即增加，且例如在水解方法中开始通气(在72小时时)后已24小时之后，将发现葡萄糖产量比在相同条件下(除了通气之外)不通气时的葡萄糖产量增加30％。本发明人认为：通过在水解方法的开始以及最后部分利用通气(在通气间隔之间具有不通气阶段)可增加葡萄糖产量，其导致比两次单独增加之一更高的葡萄糖产量增加。给出本解释以引导和指示本领域技术人员选择本水解方法的合适条件。

实施例部分给出了在酶促水解方法期间部分通气的一些实例以展示本发明的有益效果。对于若干底物或原料，这种有益效果已被发现，因此这种有益效果被认为在所有种类的底物或原料的水解中都存在。

实施例部分给出了用于酶促水解方法的酶组合物的一些实例以展示本发明的有益效果。对于若干酶组合物，这种有益效果已被发现，因此这种有益效果被认为对于所有种类的水解酶组合物都存在。

根据本发明的一个优选实施方式，其中较少或优选地没有氧加入的时间部分是总酶促水解时间的10-80％，优选地20-80％，更优选地30-80％和最优选地40-80％。根据本发明的另一优选实施方式，其中较多氧被加入的时间部分是总酶促水解时间的2-80％，优选地4-60％，更优选地8-50％，最优选地10-50％。通常，其中氧被加入的时间部分的液相中的氧浓度是其中较少氧或没有氧被加入的时间部分的液相中的氧浓度的至少2倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。

对于本发明的一个进一步优选的实施方式，其中氧加入发生在液相中(通过通气或加入氧)的时间部分期间，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度(DO)为至少0.001mol/m³，优选地至少0.002mol/m³，更优选地至少0.003mol/m³，甚至更优选地高于0.01mol/m³，例如高于0.02mol/m³或0.03mol/m³。在小于1m³的反应器中，通过缓慢搅拌将获得低于0.01mol/m³或0.02mol/m³的DO值。在这种规模下剧烈混合或搅拌将顶部空间的部分气相引入反应液中。例如，混合或搅拌可创造将氧卷入液体中的涡流。对于尺寸达到100L至1m³的反应器，利用空气在顶部空间吹送并联合(剧烈)混合或搅拌通常将向水解反应器中的纤维素材料中引入充足氧。在较大规模时，例如在50m³或更大(例如100m³)的反应器中，剧烈搅拌需要如此多的能量以至于从经济学角度来看这将不能被应用于商业操作方法中。通常，在大反应器中，搅拌或混合但不引入空气或氧气将导致低于0.01mol/m³的DO值。

对于本发明的另一优选实施方式，在氧生成或产生期间，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度(通入或加入氧)在其中氧被加入的时间部分期间优选地为水解反应条件下饱和氧浓度的至多80％，更优选地至多0.12mol/m³，仍然更优选地至多0.09mol/m³，甚至更优选地至多0.06mol/m³，甚至仍然更优选地至多0.045mol/m³，最优选地至多0.03mol/m³。温度和压力将影响DO。上文给出的优选和示例性mol/m³值涉及正常气压和约62℃的温度。本领域技术人员将基于本教导领会到有利的DO值。

对于本发明的另一优选实施方式，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度在其中较少或没有氧被加入的部分时间为低于0.02mol/m³，优选地低于0.01mol/m³，更优选地低于0.005mol/m³，最优选地低于0.001mol/m³，

根据本发明以空气或其它含氧气体的形式加入氧还可被用来至少部分地搅拌或混合水解反应器内容物。本发明的方法尤其在试验工厂和工业规模显示出优势。优选地，水解反应器的体积为1m³或更大，优选地大于10m³，最优选地50m³或更大。水解反应器通常将小于3000m³或5000m³。本发明人提出了下述理论：尤其在大规模时，水解可利用的氧并不充足，这可能是由于反应器中(例如纤维素分解生物质中)的氧传递限制。在实验室规模实验中，这种氧不充足所起的作用可不太重要。相较于大规模实验，表面面积(或反应器内容物的氧接触面积)相对于反应器体积的比率对小规模实验更有利。此外，小规模实验中的混合比大规模实验中的混合相对简单。在那些小规模实验中，从水解反应器的顶部空间运输氧也比大规模实验中的情况更快。这种理论仅仅作为对本发明人注意到的效果的可能解释被给出，本发明并不因这种理论的正确性而成立或不成立。根据本发明的另一个实施方式，加入氧可被用来至少部分地控制水解过程。

本发明所述方法有利地联合热稳定酶的使用被应用。

“热稳定”酶表示：酶的最适温度为60℃或更高，例如70℃或更高，例如75℃或更高，例如80℃或更高，例如85℃或更高。例如，它们可分离自嗜热微生物，或者可由本领域技术人员设计和人工合成。在一个实施方式中，多核苷酸可分离自或获自嗜热或耐热丝状真菌或者分离自非嗜热或非耐热但被发现热稳定的真菌。

“嗜热真菌”表示在50℃或以上的温度下生长的真菌。“耐热真菌”表示在45℃或以上(最大值接近50℃)的温度下生长的真菌。

嗜热真菌菌株的实例是Rasamsonia emersonii(以前被称为Talaromycesemersoni；Talaromyces emersonii,Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii，它们在本文中可交换使用)。

合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia细胞，优选地Rasamsonia emersonii细胞。优选的嗜热或耐热真菌是Humicola grisea var.thermoidea、Humicola lanuginosa、Myceliophthorathermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia argillacea、Rasamsonia eburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、Rhizomucor pusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lenuginosus、Thermoascuscrustaceus、Thermoascus thermophilus、Thermoascus aurantiacus和Thielaviaterrestris。

嗜热真菌不限于特定分类学等级并出现在真菌进化树各处。实例是Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora和Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(Mouchacca 1997)。Talaromyces物种大部分是嗜温的，但例外是Emersorii和Thermophila部分(section)的物种。Emersonii部分包括Talaromyces emersonii、Talaromycesbyssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它们全部在40℃下生长良好。Talaromyces bacillisporus耐热，T.leycettanus耐热至嗜热，T.emersonii和T.byssochlamydoides尤其嗜热(Stolkand Samson1972)。Talaromyces部分Thermophila的唯一成员T.thermophilus在50℃下生长迅速(Evans和Stolk 1971；Evans 1971；Stolk和Samson 1972)。这些嗜热的Talaromyces物种的目前分类主要基于表型和生理特征，例如它们在高于40℃时生长的能力、囊孢子颜色、子囊果覆盖物(ascornatal covering)的结构和特定无性型类型的形成。Stolk和Samson(1972)陈述：Emersonii部分的成员具有Paecilomyces(T.byssochlamydoides和T.leycettanus)或Penicillium cylindrosporum系列(T.emersonii和T.bacillisporus)其中之一的无性型。稍后，基于多种特征例如从端孔而非在颈(collula，neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，Pitt(1979)将属于Penicillium cylindrosporum系列的物种转移至Geosmithia属。在Geosmithia属内，仅G.argillacea是耐热的，Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了与Talaromyces部分Emersonii成员的联系。Talaromyces内的嗜热Talaromyces物种与Trichocomaceae的系统发生关系未知。参见J.Houbraken,Antonie vanLeeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21。

Rasamsonia是包括耐热的和嗜热的Talaromyces和Geosmithia物种的新属(J.Houbraken等人，如上所述)。基于表型、生理和分子数据，Houbraken等人提出将T.emersonii、T.byssochlamydoides、T.eburneus、G.argillacea和G.cylindrospora物种转移至Rasamsonia新属。Talaromycesemersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交换使用。

优选的嗜热真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsoniaemersonii、Thermomyces lenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus和Thermoascusaurantiacus。

“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢绝对好氧。丝状真菌菌株包括但不限于，Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Geosmithia、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Rasamsonia、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thermomyces、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。

丝状真菌的若干菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,NorthernRegional Research Center(NRRL))。这些菌株的实例包括Aspergillus nigerCBS 513.88、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicillium citrinum ATCC 38065、Penicilliumchrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS 393.64、Acremoniumchrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporium lucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500-D、ATCC44006和其衍生株。

在合适的微生物中表达和生产酶(例如至少2、3或4种不同纤维素酶)的一个优势可以为高的酶组合物产率，其可被用于本发明所述方法中。

根据本发明，通过加入氧，可以达到许多方法优势，包括最佳温度条件、减少处理时间、降低酶剂量、酶的再利用和其它过程优化，从而导致成本降低。有利地，本发明提供这样的方法，其中水解步骤在改进的条件下进行。本发明还提供涉及具有减少的处理时间的水解的方法。此外，本发明提供这样的方法，其中酶的剂量可被减少并且同时有用水解产物的输出被保持在相同水平。本发明的另一个优势是：涉及水解的本发明方法可导致被优化的处理条件。本发明的另一个优势是：使用相同的酶剂量，涉及水解的方法的有用水解产物的输出增加。

稳定的酶组合物

本文中的稳定酶组合物表示：酶组合物在30小时水解反应时间后保持活性，优选地，在30小时水解反应时间后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时的水解反应时间后保持活性。

可通过用合适的微生物(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillusniger)发酵合适的底物制备酶组合物，其中酶组合物通过微生物生产。可改变微生物以改进或制造纤维素酶组合物。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可被原样使用以产生纤维素酶组合物或可被改变以增加产量或产生改变的纤维素酶组合物(其可包含异源纤维素酶，即这种微生物原本不产生的酶)。优选地，真菌更优选地丝状真菌被用来产生纤维素酶组合物。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，在酶组合物生产期间，使用诱导酶组合物中的酶表达的底物。

酶组合物被用来从包含多糖的木质纤维素中释放糖。主要的多糖为纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的原料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。糖产物表示原料或木质纤维素材料的酶促水解产物。糖产物将包含可溶性糖(包含单体和多聚体二者)，优选地将包含葡萄糖。其它糖的实例为纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖产物可被原样使用或者可被进一步加工例如被纯化。

另外，果胶和其它果胶类物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

纤维素是由通过β-1,4键连接的葡萄糖残基构成的线性多糖。纤维素纤维的线性特性以及β-连接的葡萄糖(相对于α)的化学计量产生比淀粉的高度枝化α-连接结构更倾向于链间氢键结合的结构。因此，纤维素聚合物与淀粉中存在的纤维相比通常溶解度更小，并且形成更紧密结合的纤维。

现更详细描述可被包括在用于本发明的稳定酶组合物中的酶：

GH61，内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成产物例如纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。

半纤维素是复杂聚合物，并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1,4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子枝化，并且可以被与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的键或者通过乙酸酯化(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化)被取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(例如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和杂葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。

木聚糖酶与其它辅助酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶一起催化半纤维素的水解。

果胶类物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们围绕一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1,4)-连接的D-半乳糖醛酸单元的核心链构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。

结构单元的主要类型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1,4)-连接的半乳聚糖和(1,5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖交替。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密关联)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹菜糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。

在本发明方法中使用的组合物优选地包含至少两种活性，但典型的组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多。典型地，本发明的组合物可包含至少两种不同的纤维素酶或者一种纤维素酶和至少一种半纤维素酶。本发明的组合物可包含纤维素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本发明的组合物可包含辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外活性。这种辅助活性的实例在本文中被提及。

因此，在本发明中使用的组合物可包含GH61，内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本发明中使用的组合物可包含一个或多个这些种类中的多于一种的酶活性。例如，在本发明中使用的组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。这种组合物也可包含一种或多种木聚糖酶活性。这种组合物可包含辅助酶活性。

在本发明中使用的组合物可来源于Rasamsonia emersonii。在本发明中，预期核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可来源于Rasamsoniaemersonii。Rasamsonia emersonii能够提供本文中证明对木质纤维素生物质的水解而言高度有效的活性组。所述活性可再被来自其它来源的额外的酶活性补充。这种额外的活性可来源于经典来源和/或由经遗传改造的生物生产。

本发明中使用的组合物中的活性可以是热稳定的。本文中这表示：该活性的最适温度为约60℃或更高，例如约70℃或更高，例如约75℃或更高，例如约80℃或更高，例如85℃或更高。本发明中使用的组合物中的活性一般不具有相同的最适温度，但是优选地将是热稳定的。

另外，本发明中使用的组合物中的酶活性可以能够在低pH下起作用。为了本发明目的，低pH表示约5.5或更低，约5或更低，约4.9或更低，约4.8或更低，约4.7或更低，约4.6或更低，约4.5或更低，约4.4或更低，约4.3或更低，约4.2或更低，约4.1或更低，约4.0或更低，约3.9或更低，或约3.8或更低，约3.7或更低，约3.6或更低，或约3.5或更低的pH。

本发明中使用的组合物中的活性可以通过任何上述最适温度和pH值的组合来限定。

除了来源于Rasamsonia的活性以外，本发明方法中使用的组合物还可包含纤维素酶(例如来源于不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶)和/或半纤维素酶(例如来源于不同于Rasamsonia的来源的半纤维素酶)和/或果胶酶。

本发明中使用的组合物可包含一种、两种、三种、四种或更多种纤维素酶，例如GH61、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。本发明中使用的组合物可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。

本发明的组合物可包含下述活性，所述活性与本发明方法中使用的组合物所提供的活性具有不同种类的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，本发明的组合物可包含一种由本文所述的组合物提供的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。

在本文中，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。

根据最新文献，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s)。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性测量值，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。本文所使用的术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有将被归类到得到确认的CAZY GH分类系统(http://www.cazy.org/GH61.html)的家族61中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成员。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。

本文中，半纤维素是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。

因此，本发明的组合物可包含任何纤维素酶，例如GH61，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。

本文中，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。

本文中，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。

本文中，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。

本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。

本发明的组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。

本文中，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC 3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键。

本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。

本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。

本文中，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。

本文中，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H(2)O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。

本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。

本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。

本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。

本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。

本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。

本发明的组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。

本文中，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。

在本文中，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+n H₂O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectinpectylhydrolase)。

在本文中，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。

本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。

本文中，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n+H₂O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。

本文中，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。

本文中，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。

本文中，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。

本发明的组合物将一般包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶和/或至少一种果胶酶(其中之一是根据本发明的多肽)。本发明的组合物可包含GH61，纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这种组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。

另外，本发明的组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶或扩展蛋白(expansin)或纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。

“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明中使用并且通过引用并入本文。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。

“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。

“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。

“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。

“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)。

本发明中使用的组合物可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.,Eur.J.Biohem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样蛋白质。

扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。为了本发明的目的，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。

本发明中使用的组合物可以是纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesiondomain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。为了本发明的目的，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。

本发明方法中使用的组合物可由上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的那些蛋白质)的任何组合构成。

在本发明的方法中使用的组合物可以由来自以下来源的酶构成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)复合培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中不同的酶可获自不同的来源。

酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并可将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆或麦秸)等等加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至例如原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)原料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以作为木质纤维素原料，并且被添加进木质纤维素原料中。

在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时(即本身作为单一组合物)或分别或顺次提供。

因此，本发明涉及其中使用上述组合物的方法，和所述组合物在工业方法中的用途。

木质纤维素材料

本文中的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用作本发明原料的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virgin biomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corncobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheat midlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。

预处理

任选地，原料可通过本领域中已知的任何方式用热、机械和/或化学改性或这些方法的任何组合预处理，以便增强底物对酶促水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，通过用蒸汽喷发、热水处理或用稀酸或稀碱处理木质纤维素进行预处理。

清洗步骤

任选地，根据本发明的方法包括清洗步骤。任选的清洗步骤可被用来去除可能作为发酵步骤的抑制剂的水溶性化合物。清洗步骤可以已知的方式进行。

酶促水解

本发明所述方法中使用的酶组合物可极其有效水解木质纤维素材料，例如玉米秆或麦秸，然后其可被进一步转化为有用产物，例如乙醇、生物气、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，来自水解之后过程的中间产物(例如作为生物气生产中的中间体的乳酸)可被用作其它材料的结构单元。本发明利用乙醇生产进行示例，但这仅作为例证而非限制，其它被提及的有用产物可被同样地良好生产。

根据本发明的方法包括酶促水解步骤。酶促水解包括但不限于液化原料的目的的水解和从原料释放糖的目的的水解或两者。在该步骤中，使任选地预处理的和任选地清洗的木质纤维素材料与根据本发明的酶组合物接触。根据木质纤维素材料和预处理，技术人员可调节不同的反应条件例如温度、酶剂量、水解反应时间和干物质浓度，以实现木质纤维素向糖的期望转化。一些指标在下文给出。

在本发明的一个方面中，水解在45℃或更高，50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的温度下进行。水解期间的高温具有许多优势，所述优势包括在酶组合物的最适温度下起作用、(细菌)污染风险降低、降低的粘性、需要更少量的冷却水、使用具有更高温度的冷却水、酶的再利用和更多的优势。

在本发明的另一个方面中，添加的酶组合物的量(本文中也称为酶剂量或酶负载量)低。在一种实施方式中，酶的量是6mg蛋白/g干物质重量或更低，5mg蛋白/g干物质或更低，4mg蛋白/g干物质或更低，3mg蛋白/g干物质或更低，2mg蛋白/g干物质或更低或1mg蛋白/g干物质或更低(表示为mg蛋白/g干物质形式的蛋白)。在一种实施方式中，酶的量是0.5mg酶/g干物质重量或更低，0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低，0.3mg酶/g干物质重量或更低，0.25mg酶/g干物质重量或更低，0.20mg酶/g干物质重量或更低，0.18mg酶/g干物质重量或更低，0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为mg酶/g干物质形式的总纤维素酶)。低酶剂量是可行的，由于酶的活性和稳定性，可以增加水解反应时间。

在本发明的另一个方面中，水解反应时间是5小时或更长，10小时或更长，20小时或更长，40小时或更长，50小时或更长，60小时或更长，70小时或更长，80小时或更长，90小时或更长，100小时或更长，120小时或更长，130小时或更长。在另一方面中，水解反应时间是5-150小时，40-130小时，50-120小时，60-120小时，60-110小时，60-100小时，70-100小时，70-90小时或70-80小时。由于酶组合物的稳定性，更长水解反应时间是可以的，这对应更高的糖产率。

水解期间的pH可由技术人员选择。在本发明的另一个方面中，水解期间的pH可以是3.0-6.4。本发明的稳定酶可具有高至2个pH单位，高至3个pH单位，高至5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0至8.0，3.0-8.0，3.5-7.0，3.5-6.0，3.5-5.0，3.5-4.5，4.0-4.5的界限内或约4.2。

在本发明的另一个方面中，进行水解步骤直到木质纤维素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被释放出。

显著地，本发明的方法可在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质进行。因而，本发明可用约5重量％或更高，约8重量％或更高，约10重量％或更高，约11重量％或更高，约12重量％或更高，约13重量％或更高，约14重量％或更高，约15重量％或更高，约20重量％或更高，约25重量％或更高，约30重量％或更高，约35重量％或更高或约40重量％或更高的干物质含量进行。在另一实施方式中，水解步骤中的干物质含量是14重量％，15重量％，16重量％，17重量％，18重量％，19重量％，20重量％，21重量％，22重量％，23重量％，24重量％，25重量％，26重量％，27重量％，28重量％，29重量％，30重量％，31重量％，32重量％，33重量％或更多或14-33重量％。

发酵

根据本发明的方法包含发酵步骤。在另一个方面中，本发明因而包括分步骤发酵方法，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或其可通过经修饰的宿主细胞对其进行生产。在后者的情况下，经修饰宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一个优选的方法中，经修饰宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxicgrowth)。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰宿主细胞生长所需的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域众所周知。

在相同条件下的发酵时间可比在常规发酵中更短，其中部分酶促水解在发酵期间仍必须参与。在一个实施方式中，就50g/l葡萄糖和来自木质纤维素原料的相应其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖组合而言，发酵时间是100小时或更短，90小时或更短，80小或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，可相应减少发酵时间。

发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此再产生NAD⁺。因而，在一个优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产出。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。

在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被氧从气体至液体的转化所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5，更优选地至少6和甚至更优选地至少7mmol/L/h。

发酵方法优选地在对经修饰细胞而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃，优选地低于38℃下的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35、33、30或28℃的温度下并在高于20、22或25℃的温度下进行。

在本发明的一个实施方式中，在步骤中，用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行发酵。在一个实施方式中，所述方法是用于乙醇生产的方法，其中，所述方法包括下述步骤，所述步骤包括用能发酵至少一种C5糖的微生物发酵含糖培养基，其中宿主细胞能将葡萄糖、L-阿拉伯糖和木糖发酵为乙醇。在一个其实施方式中，能发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选地是Saccharomycescerevisiae种，其中已进行遗传修饰。这种微生物及其制备的一个例子被更详细地描述在WO 2008/041840和于2010年4月21日提交的欧洲专利申请EP10160622.6中。在一个实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下，更优选地所述方法是需氧的并在限氧条件下。限氧条件已在本文上文定义过。

在这种方法中，乙醇体积生产率优选地为至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。方法中基于L-阿拉伯糖和任选的木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任选的木糖，理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。

在一个方面中，与已知乙醇发酵方法相比，导致乙醇生产的发酵方法具有若干优势：

-厌氧方法是可行的；

-限氧条件也是可行的；

-可获得较高的乙醇产率和乙醇生产速率；

-使用的菌株可以能够使用L-阿拉伯糖和任选地木糖。

替代上述发酵方法，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。

可进行发酵方法而完全无需在发酵期间调节pH。也就是说，所述方法是不用添加任何酸或碱即可进行的方法。然而，这排除了可添加酸的预处理步骤。要点是本发明的组合物能在低pH下起作用，因而不需要为了糖化或水解可发生而调整酸预处理原料的酸的pH。因此，本发明的方法可以是仅使用有机产物不需要无机化学输入的零废物方法。

总反应时间

根据本发明，可减少总反应时间(或水解步骤和发酵步骤合起来的反应时间)。在一个实施方式中，90％葡萄糖产率下的总反应时间为300小时或更少，200小时或更少，150小时或更少，140小时或更少，130小时或更少，120小时或更少，110小时或更少，100小时或更少，90小时或更少，80小时或更少，75小时或更少，或约72小时。相应地，在较低的葡萄糖产率下可达到较少总时间。

发酵产物

可根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其它有机聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(术语“乙醇”被理解为包括乙基醇(ethylalcohol)或乙基醇和水的混合物)。

可通过本发明的方法生产的具体的价值增加产物包括但不限于，生物燃料(包括生物气、乙醇和丁醇)；乳酸；3-羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸和马来酸；溶剂；动物饲料补充物；药物例如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶；化学原料；或动物饲料补充物。

分离发酵产物

根据本发明的方法任选地包括回收发酵产物。可以以任何已知的方式从发酵液中分离发酵产物。对于每种发酵产物，技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。

以下将更详细地描述本发明的某些实施方式，但绝非限制本发明的范围。

在最佳温度条件下使用热稳定酶

在一个实施方式中，本发明涉及使用热稳定酶(例如Rasamsonia的纤维素分解酶)用于在(但不限于)乙醇生产中从预处理的木质纤维素原料生产还原糖。应用于预处理的木质纤维素原料的Rasamsonia的纤维素分解酶显示出在50-70℃范围内的温度下的最大转化速率。酶在这些环境下保持活性达14天及更久，而没有完全停止活性。

通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在尽可能短的水解时间内从原料(完全水解)释放出。以这种方式，在不到5天实现了葡萄糖形式的纤维素的100％转化。

发酵产物的理论最大产率(以g产物/克葡萄糖计的Yps max)可来源于生物化学教科书。对乙醇而言，根据酵母中正常的糖酵解发酵通路，1摩尔葡萄糖(180g)产生2摩尔乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。

对丁醇(MW 74g/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps max＝74/180＝0.411g(异)丁醇/g葡萄糖。

对乳酸而言，同型乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90g/摩尔)。根据该化学计量，Ypsmax＝1g乳酸/g葡萄糖。

对其它发酵产物而言，可以进行类似的计算。

应用Rasamsonia的纤维素分解酶实现的成本降低是总方法时间减少的结果。

使用Rasamsonia酶，用延长水解时间补偿较少的酶剂量

由于稳定酶的高稳定性，活性不会随时间停止，尽管较少的还原糖在水解期间被释出。通过延长水解时间来延长酶的使用和减少酶剂量，从而获得释放的还原糖的类似水平是可行的。例如，0.175mL酶/g原料干物质导致在72小时内从预处理的原料中释放还原糖的理论最大值的约90％。当使用0.075mL酶/g原料干物质时，在120小时内实现理论最大值的约90％转化。结果显示，由于酶活性的稳定性，减少的酶剂量可通过延长水解时间补偿，以获得相同量的还原糖。对在高于10％干物质含量下的预处理原料水解同样如此，显示了在15％干物质原料下延长水解时间的补偿作用。

通过使用稳定的(例如Rasamsonia的)纤维素分解酶实现成本降低，这是由于需要较少的酶剂量，从而导致相似的水解转化产率。

用稳定酶降低污染风险

在将木质纤维素材料转化为乙醇的常见方法中，处理步骤优选地在腐败性条件(septic condition)下进行以减少操作成本。污染微生物的污染和生长可因而发生并导致不期望的副作用，这种乳酸、甲酸和乙酸生产，基于底物的乙醇的产率损失，毒素和细胞外多糖的产生可显著影响生产成本。高处理温度和/或短处理时间会限制水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)能在高于60℃的温度下水解木质纤维素原料。在这些温度下，污染微生物引起不期望副作用的风险会减小至几乎为零。

在其中乙醇被生产的发酵步骤期间，温度典型地在30-37℃之间并且由于产量损失而优选地不会被升高。通过应用尽可能短的发酵处理时间，污染的风险和作用和/或污染物的生长会尽可能多地被减小。使用稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可应用尽可能短的发酵时间(见说明书上文)，因而污染风险和/或污染物生长将被尽可能大地降低。以这种方式应用Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶实现的成本降低起因于降低了由于污染导致的处理失败的风险。

稳定酶减少冷却成本并增加乙醇工厂的生产力

热预处理后的第一个步骤是将预处理的原料冷却至酶为最佳活性的温度。大规模时，这典型地通过添加(冷却)水完成，这除了降低温度外，会减少干物质含量。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可通过下述事实实现成本降低：i)更少需要对预处理原料冷却，因为在水解期间允许更高温度，和ii)添加更少的水，这会增加水解和发酵期间的干物质含量并因而增加乙醇工厂的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。而且，通过根据本发明使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，成本降低也可通过使用比用在有非热稳定酶的方法中的水具有更高温度的冷却水实现。

利用稳定酶水解后再循环酶

水解结束时，酶活性表现为低的，因为一旦几乎所有纤维素被转化，几乎没有还原糖被释放出。但是，存在的酶促活性的量仅减少少许，假设这主要是由于酶对底物的吸收。通过在水解后应用固液分离，例如离心、过滤、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多，例如70％可被回收并被再利用用于在下一水解期间水解新的预处理的木质纤维素原料。

而且，固液分离后，溶液中的酶可从含有还原糖和来自酶促作用的其它水解产物的溶液中分离出。可借助或不借助首先将酶吸附到任何类型的载体上，通过但不限于(超或微)过滤、离心、沉淀、沉降进行该分离。

例如，用0.175mL/g原料干物质的酶载量对预处理的原料水解20小时后，还原糖的理论最大量的50％被释出，相同水解72小时后，还原糖的理论最大量的90％被释出。通过离心和超滤，在渗余物中回收60-70％的酶活性，而滤液含有超过80％的释出的还原糖。通过再利用渗余物自身或被进一步纯化和/或浓缩后的渗余物，在下一水解步骤期间的酶剂量可被减少60-70％。通过这种方式通过使用稳定纤维素分解酶(例如Rasamsonia的那些)实现成本降低起因于需要更少的酶剂量。

利用稳定酶的水解后酶再循环与酶生产和酵母细胞再循环的组合

包括如上文所述的水解后再循环酶的方法可与发酵后再循环生产乙醇的微生物的方法组合，其中在酶生产发酵中使用含还原糖的滤液作为底物(纯化的和/或浓缩的或稀释的)和作为底物用于培养生产乙醇的微生物。

利用稳定酶的真空蒸馏后再循环酶

酶(比如来自Rasamsonia的那些)的热稳定性导致在糟水中的水解、发酵和真空蒸馏后剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的方法步骤期间降低。真空蒸馏后获得的糟水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理麦秸转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏处理循环。糟水可被以浓缩形式或(未)稀释形式和/或被纯化并有或没有额外的酶补充的形式被使用。

利用热稳定酶的真空蒸馏后酶再循环与酶补充的组合

在最佳方法中，酶在新处理循环中再利用之前，补充到糟水中的酶量等于在先前处理循环的三个连续处理步骤期间损失的活性量。以这种方式，避免超剂量的酶，并因此获得酶的最有效使用。

而且，通过在第一处理循环中提供高酶剂量并补充等于在随后处理循环中的三个连续处理步骤期间损失的活性量的酶，可在每个处理循环中获得尽可能高的水解速率，导致少于48小时的短的水解时间和酶的最有效使用的组合。

在混合系统中使用稳定酶

通过在水解期间应用混合，酶变得更经常地与底物接触，这导致催化活性被更有效使用。这将导致酶剂量更低并因而导致成本更低，除非混合对酶具有负面作用。稳定酶(比如来自Rasamsonia的热稳定酶)是稳健的并可抵抗(局部)高剪切和高温环境，这是浆体剧烈混合期间的情况。在混合系统中使用稳定酶因而是有益的并会导致剂量减少并因此导致成本降低。

通过下述实施例进一步描述本发明，其不应被解释为限制本发明的范围。

实施例

实验信息

菌株

Rasamsonia(Talaromyces)emersonii菌株在1964年12月被保藏在荷兰真菌培养物保藏中心(CENTRAAL BUREAU VOORSCHIMMELCULTURES,)乌普萨兰8号,邮箱85167,NL-3508 AD乌特勒支,荷兰，其具有登录号CBS 393.64。

其它合适的菌株可被同样用于本发明的实施例中以展示本发明的效果和优势。例如，WO2011/000949中所述的TEC-101,TEC-147,TEC-192,TEC-201或TEC-210是合适的Rasamsonia菌株。

制备酸预处理的玉米秆底物

如Schell,D.J.,Applied Biochemistry and Biotechnology(2003),105-108卷,69-85页中所述获得稀酸预处理的玉米秆(aCS)。使用中试规模预处理反应器，并在190℃、1分钟滞留时间和液相中1.45％(重量/重量)的有效H2SO4酸浓度的稳态条件下操作。

蛋白质测量试验

1.总蛋白

TCA双缩脲

该方法是使用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白质以除去干扰物质并允许用比色双缩脲反应测定蛋白质浓度的组合。在双缩脲反应中，铜(II)离子被还原为铜(I)，铜(I)在碱性溶液中与肽键的氮和碳形成复合物。紫色表示蛋白质的存在。根据Beer-Lambert定律，颜色强度以及因此的在546nm的吸光度与蛋白质浓度直接成正比。使用BSA(牛血清白蛋白)进行标准化，蛋白质含量被表示为根据BSA等价物的g蛋白质/L或者mg根据BSA等价物的蛋白质/ml。使用本领域已知的标准计算方案来计算蛋白质含量，其中通过标绘相对于浓度已知样品的浓度的OD₅₄₆，随后使用由校准线生成的方程计算未知样品的浓度。

2.使用PAGE的个体蛋白质

样品预处理SDS-PAGE

基于估算的样品蛋白浓度，进行下述样品制备。向10μl样品中加入40μl MilliQ水和50μl TCA(20％)以将样品稀释5倍(～1mg/ml)和沉淀蛋白。在冰上1小时后，离心样品(10分钟，14000rpm)。用500μl丙酮清洗沉淀并离心(10分钟，14000rpm)。如下所述处理沉淀。

SDS-PAGE

将沉淀溶解于65μl MilliQ水、25μl NuPAGE^TM LDS样品缓冲液(4×)Invitrogen和10μl NuPAGE^TM样品还原剂(10×)Invitrogen中。在变性步骤之前，使用比率为65:25:10的MilliQ、NuPAGE^TM LDS样品缓冲液和10μlNuPAGE^TM样品还原剂的混合物将样品稀释5倍。混合之后，在70℃下在热混合器中孵育样品10分钟。将样品溶液应用于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE^TM BisTris,Invitrogen)上。将标记M12(Invitrogen)的样品(10μl)也应用于凝胶上。使用外部缓冲室中具有600ml 20×稀释的SDS缓冲液和内部缓冲室中具有含0.5ml抗氧化剂(NuPAGE^TM Invitrogen)的200ml 20×稀释的SDS缓冲液的XCELL Surelock，使凝胶在200V下电泳50分钟。电泳后，用去离子水漂洗凝胶2次，然后用50％甲醇/7％乙酸溶液固定1小时并用Sypro Ruby(每凝胶50ml)染色过夜。用MilliQ水清洗凝胶之后，使用Typhoon 9200(610BP 30,绿色(532nm),PMT 600V,100μm)成像。

定量分析蛋白质

使用Typhoon扫描仪并使用本领域已知的标准方法测定泳道内的蛋白条带之间的比率。一式三份地应用样品并使用图像定量(Image quant)程序测定灰度值。使用所选蛋白条带的灰度值相对于所有蛋白条带的总灰度值计算值，其被表示为相对于总蛋白的相对％蛋白。

葡聚糖转化计算：

％葡聚糖转化(％)＝(葡萄糖(g/l)×100％)/(葡聚糖(基于DM级分)×dm(g/kg)×1.1)

其中：

葡萄糖(g/l) ＝水解后的上清液中的葡萄糖浓度

葡聚糖(基于DM级分) ＝预处理前的底物的葡聚糖含量

dm(g/kg) ＝水解的干物质(例如20％dm＝200g/kg).

1.1 ＝水解期间掺入水导致的重量增加

实例计算：

葡萄糖＝60g/l

葡聚糖级分＝0.40(基于干物质为40％)

dm ＝200g/kg

葡聚糖转化实例＝(60*100)/(0.4×200×1.1)＝68％转化率

实施例1

评估水解期间缺乏氧对纤维素酶混合物的纤维素分解活性的影响

根据下述程序评估水解期间缺乏氧对三种不同酶混合物的纤维素分解活性的影响。利用终浓度为10重量/重量％DM的酸预处理的玉米秆(aCS)原料进行水解反应。通过用水稀释浓缩的原料溶液来制备这种原料溶液。随后用4M NaOH溶液将pH调节至pH 4.5。从原料中消除氧在两个步骤中完成。首先，通过在真空下在超声槽(Bransonic 5510E-DTH,设置；脱气)中超声15分钟来使原料溶液脱气。在第二个步骤中，凭借连续吹送氮流通过500ml 10％DM原料溶液3小时来进一步除去氧。在吹送通过原料溶液之前，吹送氮流通过水以使它被水蒸汽饱和并避免从原料溶液蒸发水。并行地，以类似设置并根据相同流程，用空气吹送500ml相同批次的10重量/重量％DM的aCS作为含氧对照样品。

在总反应体积为10ml时，在气密的30ml离心瓶(Nalgene Oakridge)中进行氧耗尽的(吹送氮)和氧饱和的(吹送空气)10重量/重量％aCS原料溶液的水解。在用原料填充被用于氧耗尽实验的已含有纤维素酶溶液的瓶之前或期间，用氮吹送所述瓶。每种水解一式两份地进行，其中向不多于375μl的总体积中加入7.5mg/g DM纤维素酶混合物。被检验的三种纤维素酶混合物包括：TEC-210混合物(纤维素酶混合物)、4E-GH61混合物(由9重量/重量％总蛋白的BG、30重量/重量％总蛋白的CBHI、25重量/重量％总蛋白的CBHII和36重量/重量％总蛋白的GH61组成)和4E-EG混合物(由9重量/重量％总蛋白的BG、30重量/重量％总蛋白的CBHI、25重量/重量％总蛋白的CBHII和36重量/重量％总蛋白的EG组成)。根据WO2011/000949中所述的接种和发酵程序发酵TEC-210。使用4E混合物(如WO2011/098577中所述)。

将含有原料和酶溶液的离心瓶放置在孵化箱(Techne HB-1D杂交箱)中并在65℃下孵育72小时同时以设定点3(12rpm/分)旋转。水解后，在冰上冷却样品并立即在1450μl I级水中稀释50μl每种上清液。随后过滤(0.45μm滤器,Pall PN 454)稀释的上清液并如下所述分析滤液的糖含量。

使用配备Aminex HPX-87P柱(Biorad#1250098)的HPLC，通过在85℃用水以0.6ml/min的流速洗脱来测量稀释样品的糖浓度，并通过整合用葡萄糖标准溶液校准的来自示差折光检测(R.I.)的葡萄糖信号来量化。

表1/图1中所示数据显示：对于TEC-210混合物和4E-GH61混合物孵育，从被吹送氮的原料释放的葡萄糖比从被吹送空气的原料释放的葡萄糖少。对于被4E-EG混合物水解的样品，被吹送氮的原料与被吹送空气的原料之间不存在可检测的葡萄糖释放差异。

基于这些结果，我们的结论是：氧的存在改进了含GH61酶的纤维素酶混合物的纤维素分解性能。

表1：水解前吹送氮或空气通过10％aCS原料对三种不同的纤维素酶混合物释放的葡萄糖总量的影响。

实施例2

水解木质纤维素原料期间氧对纤维素酶混合物的纤维素分解活性的影响

这个实施例中显示了水解木质纤维素原料期间氧对酶混合物的纤维素分解活性的影响。利用终浓度为20重量/重量％DM的酸预处理的玉米秆(aCS)原料进行水解反应。通过用水稀释浓缩的原料溶液来制备这种原料溶液。随后用10％(重量/重量)NH₄OH溶液将pH调节至pH 4.5。

在搅拌式、pH和温度受控、工作容积为1L的反应器中进行水解。利用2.5mg/g DM TEC-210纤维素酶混合物一式两份地进行每种水解。根据WO2011/000949中所述接种和发酵程序生产TEC-210。

进行下述实验：

1.1L 20％aCS、pH 4.5、温度62℃、搅拌速度60rpm(这对应于DO水平＜0.002mol氧/m³)、2.5mg/g dm TEC-210纤维素酶混合物、孵育时间120小时(参照实验)。

2.如实验1，但在水解开始时开始向溶液中吹送入空气至溶氧水平为20％(这对应于0.03mol氧/m³，使用DO(溶氧)电极测量)。在水解方法的剩余部分始终维持这种溶氧水平。

3.如实验1，但在72小时时开始向溶液中吹送空气至溶氧水平为20％(这对应于0.03mol氧/m³，使用DO(溶氧)电极测量)。在水解方法的剩余部分始终维持这种溶氧水平。

水解后，在冰上冷却样品并立即在1450μl I级水中稀释50μl每种上清液。随后过滤(0.45μm滤器,Pall PN 454)稀释的上清液并如下所述分析滤液的糖含量。

图2中可见的结果清楚显示了加入空气时增加的葡萄糖产量。此外，与不加入空气或在整个水解步骤期间加入空气相比，在第二部分时间向水解反应中加入空气展示出更高的葡萄糖产生。

实施例3

在中试规模部分通气(时间上)对木质纤维素原料的酶促水解的影响

这个实施例中显示了在中试规模水解木质纤维素原料期间的溶氧浓度对酶混合物或组合物的纤维素分解活性的影响。利用终浓度为17.1重量/重量％DM的酸预处理的玉米秆(aCS)原料进行水解反应。通过用水稀释浓缩的原料浆来制备这种原料溶液。用25％(重量/重量)NH₄OH溶液将pH调节至pH 4.5。

在pH和温度受控、工作容积为150L的270L中试反应器中进行酶促水解。在给定的气流和超压下，通过调节叶轮速度来控制方法期间的溶氧。在TEC-210纤维素酶混合物的剂量为2.5mg(TCA蛋白质)/g dm时进行酶促反应。根据WO2011/000949中所述接种和发酵程序生产TEC-210。

进行下述实验：

实验1

从0小时至120小时通气：270L中试反应器中，150L 17.1％pCS、pH4.5、温度62℃、1bar超压、反应器顶部空间10kg/h的气流、2.5mg TCA/gdm TEC-210纤维素酶混合物、孵育时间120小时。使用DO电极不断测量反应混合物的溶氧浓度(DO)。通过调节叶轮速度将DO控制在0.15-0.22mol/m³的水平。

实验2

在72小时至120小时之间通气：270L中试反应器中，150L 17.1％pCS、pH 4.5、温度62℃、2.5mg TCA/g dm TEC-210纤维素酶混合物的酶剂量且总孵育时间120小时。使用DO电极不断测量反应混合物的溶氧浓度(DO)。对于方法的前72小时，应用下述设置：无超压、顶部空间中无气流并通过调节叶轮速度将DO控制在[0.02–0.05]mol/m³的水平。对于方法的最后48小时，应用下述设置：1bar超压、顶部空间10kg/h的气流并通过调节叶轮速度将DO控制在0.15-0.22mol/m³的水平。

在酶促水解期间，每天取样以通过NMR分析碳水化合物(葡萄糖、纤维二糖)，并测量粘度和pH。

通过化学水解样品进行预处理的玉米秆的组成分析并通过NMR测定单糖。

通过流NMR分析酶促水解期间获取的样品的(寡)糖、有机酸和抑制剂。

结果被展示于图4中，其显示：部分通气的实验2(□＝在水解时间为72小时和120小时之间通气)中的酶促水解期间比在实验1(■＝在水解时间为0小时和120小时之间通气)中的酶促水解期间产生更多葡萄糖。

实施例4

溶氧供应的时机对木质纤维素原料的酶促水解的影响

这个实施例中显示了溶氧供应的时机对木质纤维素原料的酶促水解的影响。利用终浓度为20重量/重量％DM的酸预处理的玉米秆(aCS)原料进行水解反应。通过用水稀释浓缩的原料浆来制备这种原料溶液。用25％(重量/重量)NH₄OH溶液将pH调节至pH 4.5。

在pH和温度受控、工作容积为1L的2L反应器中进行酶促水解。在增加的溶氧浓度的情况下，通过调节叶轮速度和用新鲜空气持续更新顶部空间来控制方法期间的溶氧。在TEC-210纤维素酶混合物的剂量为1.5mg(TCA蛋白质)/g dm时进行酶促水解。根据WO2011/000949中所述接种和发酵程序生产TEC-210。

进行下述实验：

实验1.从0小时至7小时通气：1L 20％pCS、pH 4.5、温度62℃、1.5mgTCA/g dm TEC-210纤维素酶混合物、孵育时间120小时。使用DO电极不断测量反应混合物的溶氧浓度(DO)。在水解方法的前7小时，DO被控制在＞0.05mol/m³的水平。在水解时间的7-120小时之间，DO被维持在＜0.02mol/m³的水平。

实验2.在72小时和120小时之间通气：1L 20％pCS、pH 4.5、温度62℃、1.5mg TCA/g dm TEC-210纤维素酶混合物、孵育时间120小时。使用DO电极不断测量反应混合物的溶氧浓度(DO)。在水解方法的前72小时，DO被控制在＜0.01mol/m³的水平。在水解时间的72小时和120小时之间，DO被维持在＞0.05mol/m³的水平。

结果被展示于图5中，其清楚显示：当反应混合物被通气时，葡萄糖形成速率增加。在0小时和7小时之间被通气的实验1清楚显示：在方法的前7小时期间的葡萄糖形成速率比实验2方法阶段期间不通气的情况下的葡萄糖形成速率增加。此外，实验2显示：在72小时和120小时之间的葡萄糖形成速率比实验1中在该阶段期间不通气的情况下的葡萄糖形成速率增加。

Claims

1.从木质纤维素材料制备糖产物的方法，其包括下述步骤：

a)任选地预处理所述木质纤维素材料；

b)任选地清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料；

c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地清洗和/或任选地预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含GH61；和

d)任选地回收糖产物；

其中在所述酶促水解的部分时间期间向所述木质纤维素材料中加入氧；以及在所述酶促水解的部分时间期间向所述木质纤维素材料中加入比所述酶促水解的另一部分时间更少的氧，优选地不向所述木质纤维素材料中加入氧。

2.从木质纤维素材料制备发酵产物的方法，其包括下述步骤：

a)任选地预处理所述木质纤维素材料；

b)任选地清洗所述任选地预处理的木质纤维素材料；

c)使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物酶促水解所述任选地清洗和/或任选地预处理的木质纤维素材料，其中所述酶组合物至少包含GH61；

d)发酵水解的所述木质纤维素材料以产生发酵产物；和

e)任选地回收发酵产物；

3.根据权利要求1或2的方法，其中，更少或优选地没有氧被加入的部分时间是总酶促水解时间的10-80％，优选地20-80％，更优选地30-80％，最优选地40-80％。

4.根据权利要求1或2的方法，其中，更多氧被加入的部分时间是总酶促水解时间的2-80％，优选地4-60％，更优选地8-50％，最优选地10-50％。

5.根据权利要求4的方法，其中，更多氧被加入的所述部分时间

a)当氧在所述酶促水解的后段时间被加入时，是总酶促水解时间的12-50％，优选地20-40％；

b)当氧在所述酶促水解的前段时间被加入时，是总酶促水解时间的2-30％，优选地4-25％，更优选地5-20％；或者

c)或a与b的组合。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中，氧被加入的部分时间期间水解的液相中的氧浓度为更少或没有氧被加入的部分时间期间液相中的氧浓度的至少2倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中，氧被加入的部分时间中，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度为至少0.001mol/m³，优选地至少0.002mol/m³，最优选地至少0.003mol/m³；或者，氧被加入的部分时间中，在酶促水解期间存在木质纤维素材料的液相中的氧浓度为至多0.12mol/m³，优选地至多0.09mol/m³，仍更优选地至多0.06mol/m³，甚至更优选地至多0.045mol/m³，最优选地至多0.03mol/m³。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中以气泡形式加入所述氧。

9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中用于所述酶促水解的反应器的体积为1m³或更大。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述酶促水解的时间为5-150小时。

11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所使用的酶组合物保持活性30小时或更久。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中在45℃或更高的温度，优选地50℃或更高的温度，更优选地55℃或更高的温度下进行所述水解。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述酶组合物来源于真菌，优选地Rasamsonia属的微生物，或者所述酶组合物包含真菌酶，优选地Rasamsonia酶。

14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中水解步骤c)中的干物质含量为10重量％或更多，优选地为14重量％或更多，仍更优选地为14-33重量％。

15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述酶促水解发生在分批、补料分批和/或连续培养反应器中。

16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中氧作为含氧气体例如空气被引入。