MX2015005631A - Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares. - Google Patents

Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.

Info

Publication number
MX2015005631A
MX2015005631A MX2015005631A MX2015005631A MX2015005631A MX 2015005631 A MX2015005631 A MX 2015005631A MX 2015005631 A MX2015005631 A MX 2015005631A MX 2015005631 A MX2015005631 A MX 2015005631A MX 2015005631 A MX2015005631 A MX 2015005631A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
oxygen
hydrolysis
time
added
enzymatic hydrolysis
Prior art date
Application number
MX2015005631A
Other languages
English (en)
Other versions
MX360283B (es
Inventor
Michael Petrus Jozef Berkhout
Bertus Noordam
Aida Hiseni
Original Assignee
Dsm Ip Assets Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49554250&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2015005631(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dsm Ip Assets Bv filed Critical Dsm Ip Assets Bv
Publication of MX2015005631A publication Critical patent/MX2015005631A/es
Publication of MX360283B publication Critical patent/MX360283B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C12P7/20—Glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratamiento del material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavado del material lignocelulósico opcionalmente pretratado; c) hidrólisis enzimática del material lignocelulósico opcionalmente lavado y/u opcionalmente pretratado usando una composición de enzima que comprende al menos dos celulasas y con lo que la composición de enzima comprende al menos GH61; y d) opcionalmente, recuperación de un producto de azúcar; en que durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, se añade oxígeno al material lignocelulósico y durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática se añade menos oxígeno al material lignocelulósico en comparación con la otra parte de tiempo de la hidrólisis enzimática, preferentemente no se añade oxígeno al material lignocelulósico.

Description

PROCESO PARA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO Y FERMENTACIÓN DE AZÚCARES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El material vegetal lignocelulósico, denominado en este documento también materia prima, es una fuente de energía renovable en forma de azúcares que puede convertirse en productos valiosos, por ejemplo azúcares o biocombustible, tal como bioetanol. Durante este proceso, la (ligno o hemi)- celulosa presente en la materia prima, tal como paja de trigo, rastrojo de maíz, cascarillas de arroz, etc., se convierte en azúcares reductores mediante enzimas (hemi)- celulóticas, que después se convierten opcionalmente en productos valiosos tales como etanol por microorganismos tales como levaduras, bacterias y hongos.
Puesto que la (hemi)-celulosa es cristalina y queda atrapada en una red de lignina la conversión en azúcares reductores es en general lenta e incompleta. Típicamente, la hidrólisis enzimática de la materia prima no tratada produce azúcares en una cantidad < 20 % de la teórica. Aplicando un pretratamiento químico y termo-físico, la (hemi)-celulosa es más accesible para las enzimas (hemi)-celulóticas y, de esta manera, las conversiones son más rápidas y con mayores rendimientos.
Un rendimiento de etanol típico a partir de glucosa, derivada de rastrojo de maíz pretratado es de 151,4 litros (40 galones) de etanol por 1000 kg de rastrojo de maíz seco (Badger, P, Ethanol from cellulose: a general review, Trends in new crops and new uses, 2002, J. Janick and A. Whipkey (eds.) ASHS Press, Alexandria, VA) o 0,3 g de etanol por g de materia prima. El rendimiento máximo de etanol en una base de celulosa es aproximadamente el 90 %.
Las enzimas celulóticas -producidas en su mayor parte por especies como Trichoderma , Humicola y Aspergíllus- se usan comercialmente para convertir la materia prima pretratada en un macerado que contiene(hemi)celulosa insoluble, azúcares reductores obtenidos a partir de la misma y lignina. Las enzimas celulóticas termoestables derivados de Rasamsonia se han usado para degradar la materia prima lignocelulósica y estas enzimas se conocen por su termo-estabilidad, véase el documento 02007091231. El macerado producido se usa en una fermentación durante la cual los azúcares reductores se convierten en biomasa de levadura (células), dióxido de carbono y etanol. El etanol producido de esta manera se llama bio-etanol.
La producción habitual de azúcares a partir de materia prima lignocelulósica pretratada, la hidrólisis denominada también licuefacción, la pre-sacarificación o sacarificación, típicamente tienen lugar durante un proceso que dura de 6 a 168 horas (Kumar, S., Chem. Eng. Technol.32 (2009) 517-526) a temperaturas elevadas de 45 a 50 °C y en condiciones no estériles. Durante esta hidrólisis, la celulosa presente se convierte parcialmente (típicamente del 30 al 95 ¾, dependiendo de la actividad enzimática y de las condiciones de hidrólisis) en azúcares reductores. En el caso de inhibición de las enzimas por los compuestos presentes en la materia prima pretratada y por los azúcares liberados; y para minimizar la inactivación térmica, este periodo de temperatura elevada se minimiza tanto como sea posible.
La fermentación que sigue a la hidrólisis tiene lugar en una etapa de proceso diferente, preferentemente anaerobia, ya sea en el mismo recipiente o en un recipiente diferente, en el que la temperatura se ajusta a de 30 a 33 °C (proceso mesófilo) para adaptarse al crecimiento y producción de etanol por la biomasa microbiana, comúnmente levaduras. Durante este proceso de fermentación, el material (hemi)celulósico restante se convierte en azúcares reductores por las enzimas ya presentes de la etapa de hidrólisis, a la vez que se producen la biomasa microbiana y el etanol. La fermentación se termina una vez que el material (hemi)celulósico se convierte en azúcares fermentables y todos los azúcares fermentables se convierten en etanol, dióxido de carbono y células microbianas. Esto puede tardar hasta 6 dias. En general, el tiempo de proceso global de la hidrólisis y fermentación puede suponer hasta 13 dias.
El macerado fermentado obtenido de esta manera consiste en azúcares no fermentables, material (hemi)celulósico no hidrolizable, lignina, células microbianas (las células de levadura más comunes), agua, etanol, dióxido de carbono disuelto. Durante las etapas sucesivas, el etanol se destila a partir del macerado y se purifica adicionalmente. La suspensión sólida restante se seca y se usa, por ejemplo, como combustible de combustión, fertilizante o pienso para ganado.
El documento W02010080407 sugiere tratar el material celulósico con una composición de celulasa en condiciones anaerobias. La retirada o exclusión de las especies de oxigeno reactivas puede mejorar el rendimiento de los sistemas enzimáticos de hidrolización de celulosa. La hidrólisis de material celulósico, por ejemplo lignocelulosa, por una composición de enzima puede ser reducida- por daño oxidativo a los componentes de la composición de enzima y/u oxidación del material celulósico, por ejemplo por oxigeno molecular.
El documento W02009046538 desvela un método para tratar materiales vegetales como materia prima lignocelulósica para liberar azúcares fermentables usando un proceso de hidrólisis enzimática para tratar los materiales realizado a vacio y produciendo una corriente de proceso rica en azúcar que comprende cantidades reducidas de azúcar volátil/compuestos inhibidores de la fermentación, tales como furfural y ácido acético. Aparte de retirar los compuestos inhibidores volátiles, otros compuestos y/o moléculas que también se retiran incluyen nitrógeno, oxigeno, argón y dióxido de carbono.
Con cada lote de materia prima, se añaden enzimas para maximizar el rendimiento y la tasa de azúcares fermentables liberados a partir de la materia prima lignocelulósica pretratada durante el tiempo de proceso dado. En general, los costes para la producción de enzimas, rendimientos de materia prima a etanol e inversiones son los factores de coste principales en los costes de producción globales (Kumar, S. Chem. Eng. Technol.32 (2009) 517-526). Hasta ahora, el coste por reducción del uso de enzimas se consigue aplicando productos enzimáticos a partir de una única o de múltiples fuentes microbianas (documento WO 2008/008793) con actividad hidrolítica más amplia y/o mayor (especifica) cuyo uso pretende reducir la necesidad de enzima, velocidades de conversión más rápida y/o mayores rendimientos de conversión y, de esta manera, a unos costes de producción de bio-etanol menores globales. Esto requiere grandes inversiones en investigación y desarrollo de estos productos enzimáticos. En el caso de un producto enzimático compuesto de enzimas a partir de múltiples fuentes microbianas, son necesarias grandes inversiones de capital para la producción de cada compuesto enzimático individual.
Por lo tanto, es deseable mejorar el proceso anterior que implica hidrólisis y fermentación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar un proceso en el que la etapa de hidrólisis se realice en condiciones mejoradas. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso que implique hidrólisis que tiene un tiempo de proceso reducido. Un objeto adicional de la invención es proporcionar un proceso, en que la dosificación de enzima puede reducirse y, al mismo tiempo, la producción de un producto de hidrólisis útil se mantiene al mismo nivel o incluso aumenta. Otro objeto es proporcionar un proceso que implica hidrólisis, en que las condiciones de proceso de la hidrólisis están optimizadas. Un objeto adicional más de la invención es proporcionar un proceso que implica hidrólisis, en que la producción de un producto de hidrólisis útil aumenta usando la misma dosificación de enzima. Uno o más de estos objetos se consiguen de acuerdo con la invención.
La presente invención proporciona un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratar el material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavar el material lignocelulósico pretratado opcionalmente; c) hidrólisis enzimática del material lignocelulósico opcionalmente lavado y/u opcionalmente pretratado usando una composición de enzima que comprende al menos dos celulasas y con lo cual la composición de enzima comprende al menos GH61; y d) opcionalmente, recuperar un producto de azúcar; en que durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, se añade oxigeno al material lignocelulósico y durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática se añade menos oxigeno al material lignocelulósico en comparación con la otra parte de tiempo de la hidrólisis enzimática, preferentemente no se añade oxigeno al material lignocelulósico.
Adicionalmente la presente invención proporciona un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratar el material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavar el material lignocelulósico opcionalmente pretratado; c) hidrólisis enzimática del material lignocelulósico opcionalmente lavado y/u opcionalmente pretratado usando una composición de enzima que comprende al menos dos celulasas y con lo que la composición de enzima comprende al menos GH61; d) fermentación del material lignocelulósico hidrolizado para producir un producto de fermentación; y e) opcionalmente, recuperar un producto de fermentación; en que durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, se añade oxígeno al material lignocelulósico y durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática se añade menos oxígeno al material lignocelulósico en comparación con otra parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, preferentemente no se añade oxígeno al material lignocelulósico .
De acuerdo con una realización preferida de la invención, la parte del tiempo en que se añade menos o preferentemente nada de oxígeno es del 10 al 80 %, preferentemente del 20 al 80 %, más preferentemente del 30 al 80 % y, lo más preferentemente, del 40 al 80 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total.
De acuerdo con otra realización preferida de la invención, la parte del tiempo en que se añade más oxigeno es del 2 al 80 %, preferentemente del 4 al 60 %, más preferentemente del 8 al 50 % y, lo más preferentemente, del 10 al 50 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total, más preferentemente la parte del tiempo en que se añade más oxigeno es a) del 12 al 50 %, y preferentemente del 20 al 40 % cuando el oxigeno se añade en la segunda mitad de tiempo de la hidrólisis enzimática; b) del 2 al 30 %, preferentemente del 4 al 25 % y más preferentemente del 5 al 20 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total cuando el oxígeno se añade en la primera mitad de tiempo de la hidrólisis enzimática; o c) o una combinación de a y b.
Ventajosamente, la concentración de oxígeno en la fase liquida de la hidrólisis durante la parte del tiempo en que se añade oxígeno es al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, más preferentemente al menos 10 veces la concentración de oxígeno en la fase líquida durante la parte de tiempo en que se añade menos o nada de oxígeno.
De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, en la parte de tiempo cuando se añade el oxigeno, la concentración de oxigeno en la fase liquida, en que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, es de al menos 0,001 mol/m3, preferentemente al menos 0,002 mol/m3 y lo más preferentemente al menos 0,003 mol/m3 y aún más preferentemente más de 0,01 mol/m3, por ejemplo más de 0,02 mol/m3 o 0,03 mol/m3. En reactores de menos de 1 m3 se obtendrán valores de DO por debajo de 0,01 mol/m3 o 0,02 mol/m3 con agitación lenta. La mezcla o agitación vigorosa a tal escala introduce parte de la fase gaseosa del espacio de cabeza en el liquido de reacción. Por ejemplo, la mezcla o agitación puede crear un remolino que dirige el oxigeno hacia el liquido. En general, lavando el espacio de cabeza con oxigeno (por ejemplo en forma de aire) en combinación con mezcla o agitación (vigorosa) introducirá suficiente oxigeno en el material celulósico en el reactor de hidrólisis para reactores con un tamaño de 100 litros hasta 1 m3. A mayor escala, por ejemplo en un reactor de 50 m3 o mayor, por ejemplo 100 m3, se necesita tanta energía para la agitación vigorosa que desde el punto de vista económico esto no se aplicará en un proceso que funcione comercialmente. En general en reactores más grandes, la agitación o mezcla sin introducción de aire u oxígeno dará como resultado valores de DO de menos de 0,01 mol/m3.
De acuerdo con otra realización preferida más de la invención, durante la adición de oxigeno (en la parte del tiempo cuando se añade el oxigeno), la concentración de oxigeno en la fase liquida, en que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, preferentemente es como máximo el 80 % de la concentración de saturación de oxigeno en las condiciones de la reacción de hidrólisis, más preferentemente como máximo 0,12 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,09 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,06 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,045 mol/m3 y, lo más preferentemente, como máximo 0,03 mol/m3. La temperatura y presión influirán en la DO. Los valores preferidos y ejemplares en mol/m3 dados anteriormente se refieren a presión atmosférica normal y una temperatura de aproximadamente 62 °C. El experto en la materia apreciará valores de DO favorables en base a las presentes enseñanzas.
De acuerdo con otra realización preferida de la invención el reactor para la hidrólisis enzimática tiene un volumen de 1 m3 o mayor. El tiempo de hidrólisis enzimática del presente proceso preferentemente es de 5 a 150 horas. De acuerdo con un aspecto preferido adicional de la invención la composición de enzima se deriva de un hongo, preferentemente un microorganismo del género Rasamsonia o la composición de enzima comprende una enzima fúngica, preferentemente una enzima Rasamsonia . De acuerdo con un aspecto preferido adicional de la invención el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es el 10 % en peso o mayor, preferentemente es del 14 % en peso o mayor y aún más preferentemente es del 14 al 33 % en peso. La hidrólisis enzimática preferentemente tiene lugar en un reactor de cultivo discontinuo, de alimentación por lotes y/o continuo. Preferentemente, el oxigeno que se introduce en el presente proceso es un gas que contiene oxigeno, tal como aire. Cuanto menos oxigeno se añade a o está presente en el material lignocelulósico durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, significa que se introduce al menos un 50 % menos, preferentemente al menos un 70 % menos, más preferentemente al menos un 90 % menos del oxigeno (expresado en mol de oxigeno/m3), por ejemplo en forma de burbujas o está presente, que el que se añade o está presente durante la otra parte del tiempo de la hidrólisis enzimática en que se añade menos oxigeno.
En una realización preferida el oxigeno se añade en forma de burbujas (gaseoso).
Sorprendentemente, de acuerdo con la invención, por adición de oxigeno es posible conseguir muchas ventajas de proceso, incluyendo condiciones de temperatura óptimas, un tiempo de proceso reducido, dosificación de enzima reducida re-utilización de enzimas, mayores rendimientos y otras optimizaciones de proceso, que dan como resultando un coste reducido.
En una realización, la composición de enzima estable usada retiene actividad durante 30 o más horas. De acuerdo con una realización adicional la hidrólisis se realiza preferentemente a una temperatura de 40 °C o mayor, más preferentemente a una temperatura de 50 °C o mayor y, lo más preferentemente, a una temperatura de 55 °C o mayor. El proceso de la invención se ilustrará con más detalle a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1: El efecto de burbujear nitrógeno o aire a través de una materia prima de aCS al 10 % antes de la hidrólisis, sobre la cantidad total de glucosa (g/1) liberada por la mezcla TEC-210 (1), la mezcla 4E-GH61 (2) y la mezcla 4E-EG (3).
Fig. 2: La glucosa producida en el Ejemplo 2, 1 = Experimento 1: sin aireación, 2 = Experimento 2: aireación continua, 3 = Experimento 3: aireación que empieza a las 72 horas hasta el final.
Fig. 3: El efecto del tiempo de aireación sobre la glucosa producida durante la hidrólisis enzimática, sin aireación, ··· = aireación entre el tiempo de hidrólisis es 0 y 100 horas, - - - aireación entre el tiempo es hidrólisis de 0 y 7 horas y - - - = aireación entre el tiempo de hidrólisis es 72 y 100 horas.
Fig. 4: El efecto del tiempo de aireación sobre la glucosa producida durante la hidrólisis enzimática en el experimento 1 (¦ = aireación entre el tiempo de hidrólisis es 0 y 100 horas) y 2 (? = aireación entre el tiempo de hidrólisis es 72 y 100 horas).
Fig. 5: El efecto del tiempo de aireación sobre la glucosa producida durante la hidrólisis enzimática, aireación entre el tiempo de hidrólisis es 72 y 100 horas y -·- aireación entre el tiempo de hidrólisis es 0 y 7 horas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, los términos "que comprende" y "que incluye" y variaciones tales como "comprende", "comprendiendo", "incluye" e "incluyendo" deben interpretarse de manera inclusiva. Es decir, estos términos están destinados a transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, donde el contexto lo permita. Los artículos "un" y "una" se usan en este documento para hacer referencia a uno o a más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del articulo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
En el contexto de la presente invención "mejorado", "aumentado", "reducido" se usan para indicar que la presente invención muestra una ventaja en comparación con la misma situación, proceso o condiciones de proceso excepto que no se añade oxigeno extra. Dentro del contexto de la presente invención "medido en las mismas condiciones" o "analizado en las mismas condiciones", etc. significa que el proceso de la invención y el mismo proceso sin (o con menos) adición de oxigeno se realizan en las mismas condiciones (excepto por la adición de oxigeno) y que los resultados del presente proceso, si se compara con el proceso sin (o con menos) adición de oxigeno, se miden usando las mismas condiciones, preferentemente usando el mismo ensayo y/o metodología, más preferentemente dentro del mismo experimento o de uno paralelo. Las condiciones de la hidrólisis son un ejemplo de tales condiciones.
En la téenica anterior se sugiere mejorar la hidrólisis del material celulolítico usando condiciones anaerobias (documento W02010/080407) o al vacío (documento W02009/046538) durante la hidrólisis enzimática. En los procesos de ambos documentos el nivel de oxígeno disminuyó.
Se ha encontrado sorprendentemente que la hidrólisis de la presente invención muestra como resultado un producto de reacción mejorado que da mayores cantidades de productos de azúcar (reducidos) y/o productos de fermentación deseados en la fermentación después de la hidrólisis en comparación con un proceso en que no se añade oxigeno. En general, se observa un aumento de la conversión de glucosa del 5 a 15 % p/p o incluso hasta el 25 % p/p.
Puede añadirse oxigeno de varias maneras. Por ejemplo, puede añadirse oxigeno como gas de oxigeno, gas enriquecido con oxigeno tal como aire enriquecido con oxigeno o aire (un ejemplo de un gas que contiene oxigeno). El oxigeno puede añadirse de forma continua o discontinua. Por la expresión "se añade oxigeno" se entiende que el oxigeno se añade a la fase liquida (que comprende el material lignocelulósico) en el reactor de hidrólisis y no que el oxigeno está presente en el espacio de cabeza en el reactor por encima de la fase liquida (en combinación con una agitación lenta o inexistente) con lo que el oxigeno tendría que difundirse desde el espacio de cabeza hasta la fase líquida. Por lo tanto, el oxígeno se añade preferentemente en forma de burbujas, más preferentemente como pequeñas burbujas.
En el caso de que la enzima pueda dañarse por la presencia o adición de oxígeno, puede usarse un suministro de oxigeno más moderado. En ese caso, puede encontrarse un equilibrio entre la producción mejorada de glucosa y el rendimiento enzimático. La adición del oxigeno al material celulolitico puede realizarse durante la hidrólisis enzimática. En el caso de que se añada oxigeno en forma gaseosa, puede introducirse un gas que contiene oxigeno, por ejemplo soplarse, en los contenidos líquidos del reactor de hidrólisis del material celulolitico. En otra realización de la invención, el gas que contiene oxígeno se introduce en la corriente líquida de material celulolitico que entrará en el reactor de hidrólisis. En otra realización más de la invención, el gas que contiene oxígeno se introduce junto con el material celulolitico que entra en el reactor de hidrólisis o con parte de los contenidos líquidos del reactor que pasan por un bucle externo del reactor. En la mayoría de los casos la adición de oxígeno antes de entrar en el reactor de hidrólisis no es suficiente y la adición de oxígeno puede realizarse también durante la hidrólisis. En otra realización de la invención la fase gaseosa presente en la parte superior del reactor (espacio de cabeza) se refresca continua o discontinuamente con el gas que contiene oxígeno. En el último caso es necesaria una mezcla o agitación (vigorosa) para conseguir que el oxígeno en forma de burbujas y/o por difusión alcance los contenidos líquidos del reactor, preferentemente en combinación con sobre-presión en el reactor. En general, el lavado del espacio de cabeza con aire en combinación con mezcla o agitación (vigorosa) puede introducir oxigeno suficiente en el material celulósico en el reactor de hidrólisis para reactores de un tamaño desde 100 litros hasta a 1 m3. A una mayor escala, por ejemplo en un reactor de 50 m3 o mayor, por ejemplo de 100 m3, se necesita tanta energía para la agitación vigorosa que desde el punto de vista económico no se aplicará en un proceso que funcione a nivel de mercado.
De acuerdo con la presente invención el oxígeno puede añadirse durante parte de la etapa de hidrólisis. La adición de oxígeno durante solo parte de la hidrólisis puede realizarse, por ejemplo, en el caso de que ocurra daño por oxidación de la enzima o enzimas. En el caso de que el oxígeno presente en los contenidos del reactor de hidrólisis o el producto de azúcar o el hidrolizado formado en la etapa de hidrólisis pueda influir o alterar la etapa de fermentación posterior, la adición de oxígeno puede realizarse excepto durante la última parte de la hidrólisis y, de esta manera, (la mayor parte de) el oxígeno se consume antes de que la biomasa hidrolizada entre en el reactor de fermentación. Ventajosamente, el oxigeno, preferentemente en forma de burbujas (gaseoso) se añade en la última parte de la etapa de hidrólisis.
Los inventores plantearon la hipótesis de que en la primera parte de la (etapa) de hidrólisis (enzimática) los polisacáridos amorfos se hidrolizan a azúcares tales como glucosa y que en la segunda parte de la etapa de hidrólisis los polisacáridos cristalinos restantes se convierten en azúcares. Los polisacáridos amorfos se convierten por ejemplo en oligosacáridos por endoglucanasas, tras lo cual los oligosacáridos pueden convertirse por celobiohidrolasa y beta-glucosidasa (BG) en azúcares. De acuerdo con la presente hipótesis los polisacáridos amorfos están localizados en el exterior de los polisacáridos o complejos de polisacárido mientras que los polisacáridos cristalinos están localizados relativamente más en el interior de los polisacáridos o complejos de polisacárido presentes en el material lignocelulósico. Por lo tanto, la conversión de los polisacáridos cristalinos puede continuar incluso cuando la mayor parte de los polipéptidos se ha hidrolizado. La adición de oxigeno es especialmente beneficiosa durante la hidrólisis de los polisacáridos cristalinos, por ejemplo en la degradación de los polisacáridos en oligosacáridos. De acuerdo con esta hipótesis, la adición de oxigeno es especialmente útil en la segunda parte de la etapa de hidrólisis. En general, es necesario un tiempo más corto de adición de oxigeno (o una segunda parte de hidrólisis más corta) en el caso de cantidades relativamente bajas de polisacáridos cristalinos en el material lignocelulósico en comparación con la hidrólisis de un material lignocelulósico en el que están presentes cantidades relativamente mayores de polisacáridos cristalinos. Los inventores han planteado también que la adición de oxigeno es beneficiosa para la hidrólisis de polisacáridos cristalinos. Por lo tanto, la adición de oxigeno es muy útil, especialmente en la fase en que los polisacáridos cristalinos son atacados por las enzimas. Fuera de esta fase la no adición de oxigeno podría ser más eficaz. Por lo tanto, el suministro de oxígeno puede comenzar solo en la segunda parte o segunda mitad de la hidrólisis. Al final de la hidrólisis, cuando la mayor parte de los polisacáridos cristalinos se han degradado, la adición de oxígeno se detiene preferentemente. En la última parte de la segunda parte o segunda mitad de la hidrólisis, la mayor parte de los polisacáridos se convierte en oligosacáridos que, durante una degradación adicional, se convierten en azúcares más pequeños no necesitan oxígeno nunca más. Por lo tanto, se añade preferentemente menos oxígeno, en comparación con la adición de oxígeno durante la parte aireada del tiempo, al material lignocelulósico al final del proceso de hidrólisis o, más preferentemente, no se añade oxígeno al material lignocelulósico al final del proceso de hidrólisis. Esta hipótesis solo se da como posible explicación del efecto observado por los inventores y la presente invención no confirma ni desmiente la exactitud de esta teoría.
Los inventores también han observado que la aireación durante un proceso de hidrólisis enzimática al comienzo del proceso de hidrólisis da como resultado una mayor producción de glucosa durante la hidrólisis.
En la Figura 3 se muestra el efecto de la aireación. En comparación con la hidrólisis no aireada (mostrada como curva "no aireada"), una aireación al comienzo del proceso de hidrólisis (mostrada como curva de "aireación 0-7 horas") dará como resultado un aumento inmediato en la producción de glucosa y, por ejemplo, después de 24 horas de hidrólisis se encontrará una producción de glucosa que corresponde a una producción de glucosa sin aireación de 60 horas de hidrólisis en condiciones idénticas (excepto por la aireación). En comparación con la hidrólisis no aireada, una aireación de la última parte del proceso de hidrólisis (mostrada como curva de "aireación 72-100 horas") dará como resultado un aumento inmediato en la producción de glucosa después de la aireación y, por ejemplo, casi después de 24 horas después de la inicio de la aireación (a las 72 horas) en el proceso de hidrólisis, se encontrará un aumento de la producción de glucosa del 30 % en comparación con la producción de glucosa sin aireación en condiciones idénticas (excepto por la aireación). Los inventores creen que usando una aireación al principio asi como en la última parte del proceso de hidrólisis (entre intervalos de aireación un periodo sin aireación) podría aumentar la producción de glucosa, con lo que esto da como resultado un aumento de la producción de glucosa que es mayor que cada uno de los dos aumentos por separado. La presente explicación se da para guiar e instruir al experto en la materia a seleccionar las condiciones apropiadas para el presente proceso de hidrólisis.
En los Ejemplos se dan varios ejemplos de aireación (parcial) durante el proceso de hidrólisis enzimática para mostrar el efecto beneficioso de la presente invención. Este efecto beneficioso se encuentra para varios sustratos o materias primas y, por lo tanto, se cree que está presente para la hidrólisis de toda clase de sustratos o materias primas.
En los Ejemplos se dan varios ejemplos de composiciones de enzima para el proceso de hidrólisis enzimática para mostrar el efecto beneficioso de la presente invención. Este efecto beneficioso se encuentra para varias composiciones de enzima y, por lo tanto, se cree que está presente para toda clase de composiciones de enzima de hidrólisis.
De acuerdo con una realización preferida de la invención la parte del tiempo en que se añade menos o preferentemente nada de oxigeno es del 10 al 80 %, preferentemente del 20 al 80 %, más preferentemente del 30 al 80 % y, lo más preferentemente, del 40 al 80 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total. De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención la parte del tiempo en que se añade más oxigeno es del 2 al 80 %, preferentemente del 4 al 60 %, más preferentemente del 8 al 50 % y, lo más preferentemente, del 10 al 50 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total. En general, la concentración de oxigeno en la fase liquida durante la parte de tiempo en que se añade oxigeno es al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, más preferentemente al menos 10 veces la concentración de oxigeno en la fase líquida durante la parte del tiempo en que se añade menos o nada de oxígeno.
En una realización preferida adicional de la invención durante la parte del tiempo en que tiene lugar la adición de oxígeno en la fase líquida (por aireación o adición de oxígeno), la concentración de oxígeno (DO) en la fase líquida en que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, es al menos 0,001 mol/m3, preferentemente al menos 0,002 mol/m3, más preferentemente al menos 0,003 mol/m3 y aún más preferentemente más de 0,01 mol/m3, por ejemplo más de 0,02 mol/m3 o 0,03 mol/m3. En los reactores de menos de 1 m3 se obtendrán valores de DO por debajo de 0,01 mol/m3 o 0,02 mol/m3 por agitación lenta. La mezcla o agitación vigorosa a tal escala introduce parte de la fase gaseosa del espacio de cabeza en el liquido de reacción. Por ejemplo, la mezcla o agitación puede crear un remolino que dirige el oxigeno hacia el liquido. En general, lavar el espacio de cabeza con aire en combinación con mezcla o agitación (vigorosa) introducirá suficiente oxigeno en el material celulósico en el reactor de hidrólisis para reactores de hasta un tamaño de 100 litros a 1 m3. A una mayor escala, por ejemplo en un reactor de 50 m3 o mayor, por ejemplo 100 m3, se necesita tanta energía para la agitación vigorosa que desde un punto de vista económico esto no se aplicará en un proceso que funcione a nivel de mercado. En general, en reactores más grandes, la agitación o mezcla sin introducción de aire u oxígeno dará como resultado valores de DO de menos de 0,01 mol/m3.
En otra realización preferida adicional de la invención, durante la generación o producción de oxígeno, la concentración de oxígeno en la fase líquida (aireación o adición de oxígeno), la concentración de oxígeno en la fase líquida en que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática es durante la parte del tiempo en que el oxígeno se añade preferentemente como máximo al 80 % de la concentración de saturación del oxígeno en las condiciones de la reacción de hidrólisis, más preferentemente como máximo 0,12 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,09 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,06 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,045 mol/m3 y lo más preferentemente como máximo 0,03 mol/m3. La temperatura y presión influirán en la DO. Los valores en mol/m3 preferidos y ejemplares dados anteriormente se refieren a presión atmosférica normal y una temperatura de aproximadamente 62 °C. El experto en la materia apreciará valores de DO favorables en base a las presentes enseñanzas.
En una realización preferida adicional de la invención la concentración de oxígeno en la fase líquida, en que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, es durante la parte de tiempo en que se añade menos o nada de oxígeno es menos de 0,02 mol/m3, preferentemente menos de 0,01 mol/m3, más preferentemente menos de 0,005 mol/m3 y lo más preferentemente menos de 0,001 mol/m3.
La adición de oxígeno en forma de aire u otro gas que contiene oxígeno de acuerdo con la invención puede usarse también para agitar o mezclar al menos parcialmente los contenidos del reactor de hidrólisis. El presente proceso de la invención muestra ventajas, especialmente a escala de planta piloto y escala industrial. Preferentemente, el reactor de hidrólisis tiene un volumen de 1 m3 o mayor, preferentemente de más de 10 m3 y más preferentemente de 50 m3 o mayor. En general, el reactor de hidrólisis será más pequeño de 3000 m3 o 5000 m3. Los inventores plantean la teoría de que, especialmente a una mayor escala, está disponible oxígeno insuficiente para la hidrólisis, lo cual podría deberse a limitaciones en la transferencia de oxígeno en el reactor, por ejemplo en la biomasa celulolítica. En experimentos a escala de laboratorio esta insuficiencia de oxígeno puede desempeñar un papel menos importante. La relación del área superficial (o área de contacto con oxígeno del contenido del reactor) al volumen del reactor es más favorable para experimentos a pequeña escala que en experimentos a gran escala. Además, la mezcla en experimentos a pequeña escala es relativamente más fácil que a gran escala. Durante estos experimentos a pequeña escala también el transporte de oxígeno desde el espacio de cabeza del reactor de hidrólisis es más rápido que en comparación con la situación en los experimentos a mayor escala. Esta teoría solo da una posible explicación del efecto observado por los inventores, y la presente invención no confirma ni desmiente la exactitud de esta teoría. De acuerdo con una realización adicional de la invención la adición de oxigeno puede usarse para controlar al menos parcialmente el proceso de hidrólisis.
El proceso de la invención se aplica ventajosamente en combinación con el uso de enzimas termoestables.
Una enzima "termoestable" significa que la enzima tiene una temperatura óptima de 60 °C o mayor, por ejemplo 70 °C o mayor, tal como 75 °C o mayor, por ejemplo 80 °C o mayor, tal como 85 °C o mayor. Por ejemplo, pueden aislarse a partir de microorganismos termófilos o pueden diseñarse por el experto en la materia y sintetizarse artificialmente. En una realización los polinucleótidos pueden aislarse u obtenerse a partir de hongos filamentosos termófilos o termotolerantes o aislarse a partir de hongos no termófilos o no termotolerantes pero que se sabe que son termoestables.
Por "hongo termófilo" se entiende un hongo que crece a una temperatura de 50 °C o mayor. Por "hongo termotolerante" se entiende un hongo que crece a una temperatura de 45 °C o mayor que tiene un máximo cercano a los 50 °C.
Los ejemplos de cepas de hongos termófilos son Rasamsonia emersonii (anteriormente conocido como Talaromyces emersoni ; Talaromyces emersonii , Penicillium geosmithia emersonii y Rasamsonia emersonii se usan de forma intercambiable en este documento).
Las células de hongos termófilos o termotolerantes pueden ser una célula Humicola , Rhizomucor, Myceliophthora , Rasamsonia , Talaromyces , Thermomyces Thermoascus o Thielavia, preferentemente una célula Rasamsonia emersonii . Los hongos termófilos o termotolerantes preferidos son Humicola grísea var. thermoidea , Humicola lanuginosa , Myceliophthora thermophila , Papulaspora thermophilia , Rasamsonia byssochlamydoides , Rasamsonia emersonii , Rasamsonia argillacea , Rasamsonia eburnean , Rasamsonia brevistipi ta ta , Rasamsonia cylindrospora , Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei , Talaromyces bacillisporus , Talaromyces leycettanus , Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus , Thermoascus crustaceus , Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus y Thielavia terrestris .
Los hongos termófilos no están restringidos a un orden taxonómico especifico y se dan en todo el árbol fúngico de la vida. Son ejemplos Rhizomucor en Mucorales, Myceliophthora en Sordariales y Talaromyces , Thermomyces y Thermoascus en Eurotiales (Mouchacca 1997). La mayoría de las especies Talaromyces son mesófilas pero son excepciones las especies en las secciones Emersorii y Thermophila. La sección Emersonii incluye Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides , Talaromyces bacillisporus y Talaromyces leycettanus, todas las cuales crecen bien a 40 °C.
Talaromyces bacillisporus es termotolerante, T. leycettanus es de termotolerante a termófilo y T. emersonii y T. byssochlamydoides son realmente termófilos (Stolk y Samson 1972). El único miembro de la sección Talaromyces Thermophila , T. thermophilus, crece rápidamente a 50 °C (Evans y Stolk 1971; Evans 1971; Stolk y Samson 1972). La actual clasificación de estas especies de Talaromyces termófilas principalmente está basada en caracteres fenotipicos y fisiológicos tales como su capacidad para crecer por encima de 40 °C, color ascóporo, la estructura de la cubierta arcornatal y la formación de un cierto tipo de anamorfia. Stolk y Samson (1972) establecieron que los miembros de la sección Emersonii tienen anamorfos de cualquiera de Paecilomyces (T . byssochlamydoides y T. leycettanus) o la serie Penicillium cylindrosporum { T. emersonii y T. bacillisporus) . Posteriormente, Pitt (1979) transfirió las especies que pertenecían a la serie Penicillium cylindrosporum al género Geosmithia , basándose en diversos caracteres tales como la formación de conidios a partir de poros terminales en lugar de en los collula (cuellos), un carácter de Penicillium y Paecilomyces. Dentro del género Geosmithia, solo G. argillacea es termotolerante, y Stolk et al. (1969) y Evans (1971) propusieron una conexión con los miembros de la sección Talaromyces Emersonii. La relación filogenética de la especie Talaromyces termófila dentro de Talaromyces y Trichocomaceae es desconocida. Véase J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek 2012 Feb; 101 (2): 403- 21.
Rasamsonia es un nuevo género que comprende las especies Talaromyces y Geosmithia termotolerantes y termófilas (J. et al. Houbraken vida supra) . Basándose en datos fenotípicos, fisiológicos y moleculares, Houbraken et al. propusieron transferir las especies T. emersonii , T. byssochlamydoides , T. eburneus , G. argillacea y G. cylindrospora a Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii , Penicillium geosmithia emersonii y Rasamsonia emersonii se usan de forma intercambiable en este documento.
Los hongos termófilos preferidos son Rasamsonia byssochlamydoides , Rasamsonia emersonii , Thermomyces lenugínosus , Talaromyces thermophilus , Thermoascus crustaceus , Thermoascus thermophilus y Thermoascus aurantiacus .
"Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al . en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungí, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU). Los hongos filamentosos se caracterizan por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación de las hitas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. Las cepas fúngicas filamentosas incluyen, aunque sin limitación, las cepas Acremonium , Agaricus , Aspergillus , Aureobasidium, Chrysosporium , Coprinus , Cryptococcus , Filibasidium, Fusarium, Geosmithia , Humicola , Magnaporthe, Mucor , Myceliophthora , Neocallimastix, Neurospora , Paecilomyces , Penicillium, Piromyces , Panerochaete , Pleurotus , Rasamsonia , Schizophyllum , Talaromyces , Thermoascus , Thermomyces , Thielavia , Tolypocladium, y Trichoderma .
Varias cepas de hongos filamentosos son fácilmente accesibles al público en un número de colecciones de cultivos tales como la colección de cultivos tipo americana (ATCC), Deutsche Sammlung von ikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y la colección de cultivo de patentes para el servicio de investigación agrícola, Centro de Investigación Regional del Norte (NRRL). Los ejemplos de tales cepas incluyen Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersoníí CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 o ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 o ATCC 56765 o ATCC 26921, Aspergíllus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 y derivados de los mismos.
Una ventaja de la expresión y producción de las enzimas (por ejemplo al menos dos, tres o cuatro celulasas diferentes) en un microorganismo adecuado puede ser un alto rendimiento de composición de enzima que puede usarse en el proceso de la presente invención.
De acuerdo con la invención, mediante la adición de oxigeno es posible conseguir muchas ventajas de proceso, incluyendo condiciones de temperatura óptimas, tiempo de proceso reducido, dosificación de enzima reducida, reutilización de enzimas y otras optimizaciones de proceso, dando como resultado costes reducidos. Ventajosamente la invención proporciona un proceso en el que la etapa de hidrólisis se realiza en condiciones mejoradas. La invención proporciona también un proceso que implica la hidrólisis que tiene un tiempo de proceso reducido. Adicionalmente, la invención proporciona un proceso en que la dosificación de enzima puede reducirse y al mismo tiempo la producción de un producto de hidrólisis útil se mantiene al mismo nivel. Otra ventaja de la invención es que el presente proceso que implica hidrólisis puede dar como resultado condiciones de proceso que están optimizadas. Una ventaja adicional de la invención es que la producción de un producto de hidrólisis útil del proceso que implica la hidrólisis aumenta usando la misma dosificación de enzima.
Composición de enzima estable La composición de enzima estable en este documento significa que la composición de enzima retiene su actividad después de 30 horas de tiempo de reacción de hidrólisis, preferentemente al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de su actividad inicial después de 30 horas de tiempo de reacción de hidrólisis. Preferentemente, la composición de enzima retiene su actividad después de 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tiempo de reacción de hidrólisis.
La composición de enzima puede prepararse por fermentación de un sustrato adecuado con un microorganismo adecuado, por ejemplo Rasamsonia emersoníi o Aspergíllus niger en que el microorganismo produce la composición de enzima. El microorganismo puede alterarse para mejorar o crear la composición de celulasa. Por ejemplo, el microorganismo puede mutar por procedimientos de mejora de cepa clásicos o por téenicas de ADN recombinantes. Por lo tanto, los microorganismos mencionados en este documento pueden usarse como tales para producir la composición de celulasa o pueden alterarse para aumentar la producción o producir una composición de celulasa alterada que podría incluir celulasas heterólogas, y por tanto enzimas que no se producen originalmente por ese microorganismo. Preferentemente se usa un hongo, más preferentemente un hongo filamentoso para producir la composición de celulasa. Ventajosamente se usa un microorganismo termófilo o termotolerante. Opcionalmente se usa un sustrato que induce la expresión de las enzimas en la composición de enzima durante la producción de la composición de enzima.
La composición de enzima se usa para liberar azúcares a partir de lignocelulosa, que comprende polisacáridos. Los polisacáridos principales son celulosa (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ). Además, algo de hemicelulosa puede estar presente en forma de glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de la madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan de forma concertada. Por producto de azúcar se entiende el producto de hidrólisis enzimática de la materia prima o material lignocelulósico. El producto de azúcar comprenderá azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multimeros, preferentemente comprenderá glucosa. Los ejemplos de otros azúcares son celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas. El producto de azúcar puede usarse como tal o puede procesarse adicionalmente, por ejemplo purificarse.
Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos pueden crear una proporción considerable de la materia seca de las paredes celulares típicas a partir de tejidos vegetales distintos de madera (aproximadamente de un cuarto a la mitad de materia seca pueden ser pectinas).
La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de residuos de glucosa unidos mediante enlaces b-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa unida mediante b (respecto a a) genera estructuras más susceptibles a entremezclarse con enlaces de hidrógeno que las estructuras unidas mediante a altamente ramificadas del almidón. De esta manera, los polímeros de celulosa son generalmente menos solubles y forman fibras unidas más fuertemente que las fibras unidas en el almidón.
Las enzimas que pueden incluirse en la composición de enzima estable usada en la invención se describen ahora con más detalle: GH61, endoglucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa insoluble a productos tales como celooligosacáridos (celobiosa como producto principal), mientras que las b-glucosidasas (BG) convierten los oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa en glucosa.
La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición a menudo varía ampliamente de un organismo a otro y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es la xilosa con uniones b-1,4, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa a menudo está ramificada en 0 a 3 y/o 0 a 2 átomos de xilosa, y puede estar sustituida con uniones a arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico o por esterificación a ácido acético (y esterificación de ácido ferúlico a arabinosa). La hemicelulosa puede contener también glucano, que es un término general para los azúcares de seis carbonos con unión b (tal como los glucanos b—(1,3) (1,4) y heteroglucanos mencionados anteriormente) y adicionalmente glucomananos (en los que están presentes tanto glucosa como mañosa en la estructura básica lineal, unidas entre si mediante uniones P) .
Las xilanasas junto con otras enzimas añadidas, por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas, feruloil y acetilxilan esterasas, glucuronidasas y b-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de hemicelulosas.
Las sustancias pécticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos. Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular de la planta. Se acumulan alrededor de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico unido a(1,4) entremezcladas en algún grado con L-ramnosa. En cualquier pared celular hay un número de unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y generalmente se ha considerado que, en una única molécula péctica, las cadenas centrales de diferentes unidades estructurales son continuas entre si.
Los principales tipos de unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano), que puede estar sustituido con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2 y 0-3; ramnogalacturonano I (RGI), en el que las unidades de ácido galacturónico se alternan con unidades ramnosa que llevan galactano unido (1,4) y cadenas secundarias de arabinano con unión (1,5). Las cadenas secundarias de arabinano pueden fijarse directa o indirectamente a ramnosa a través de las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con las unidades xilosilo individuales en 0-3 del ácido galacturónico (muy relacionado con RGI); y ramnogalacturonano II (RGII), una unidad minoritaria particularmente compleja que contiene azúcares poco habituales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos residuos apiosilo que, en las condiciones iónicas adecuadas, pueden formar reversiblemente ásteres con borato.
Una composición para su uso en un método de la invención comprende preferentemente al menos dos actividades, aunque típicamente una composición comprenderá más de dos actividades, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más. Típicamente, una composición de la invención puede comprender al menos dos celulasas diferentes o una celulasa y al menos una hemicelulasa. Una composición de la invención puede comprender celulasas pero no xilanasas. Además, una composición de la invención puede comprender actividad enzimática auxiliar, es decir actividad adicional que, ya sea directamente o indirectamente, conduce a la degradación de la lignocelulosa . Los ejemplos tales actividades auxiliares se mencionan en este documento.
De esta manera, una composición para su uso en la invención puede comprender GH61, actividad endoglucanasa y/o actividad celobiohidrolasa y/o actividad b-glucosidasa. Una composición para su uso en la invención puede comprender más de una actividad enzimática en una o más de estas clases. Por ejemplo, una composición para su uso en la invención puede comprender dos actividades endoglucanasa, por ejemplo actividad endo-1,3(1,4)-b glucanasa y actividad endo^ -1,4-glucanasa. Tal composición puede comprender también una o más actividades xilanasa. Tal composición puede comprender una actividad enzimática auxiliar.
Una composición para su uso en la invención puede derivarse de Rasamsonia emersonií . En la invención, se anticipa que un conjunto central de actividades enzimáticas (degradantes de lignocelulosa) pueden derivarse de Rasamsonia emersonií . Rasamsonia emersonii puede proporcionar un conjunto muy eficaz de actividades como se demuestra en este documento para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. Esta actividad puede complementarse entonces con actividades enzimáticas adicionales de otras fuentes. Tales actividades adicionales pueden derivarse de fuentes clásicas y/o producirse por un organismo modificado genéticamente.
Las actividades en una composición para su uso en la invención pueden ser termoestables. En este documento, esto significa que la actividad tiene una temperatura óptima de aproximadamente 60 °C o mayor, por ejemplo aproximadamente 70 °C o mayor, tal como aproximadamente 75 °C o mayor, por ejemplo aproximadamente 80 °C o mayor tal como 85 °C o mayor. Las actividades en una composición para su uso en la invención típicamente no tendrán la misma temperatura óptima sino que preferentemente no obstante serán termoestables.
Además, las actividades enzimáticas en una composición para su uso en la invención pueden ser capaces de trabajar a pH bajo. Para los fines de esta invención, pH bajo indica un pH de aproximadamente 5,5 o menor, aproximadamente 5 o menor, aproximadamente 4,9 o menor, aproximadamente 4,8 o menor, aproximadamente 4,7 o menor, aproximadamente 4,6 o menor, aproximadamente 4,5 o menor, aproximadamente 4,4 o menor, aproximadamente 4,3 o menor, aproximadamente 4,2 o menor, aproximadamente 4,1 o menor, aproximadamente 4,0 o menor a 3,9 o menor, o aproximadamente 3,8 o menor, aproximadamente 3,7 o menor, aproximadamente 3,6 o menor, o aproximadamente 3,5 o menor.
Las actividades en una composición para su uso en la invención pueden definirse por una combinación de cualquiera de los valores anteriores de temperatura y pH óptimos.
La composición usada en un método de la invención puede comprender, además de las actividades derivadas de Rasamsonia, una celulasa (por ejemplo, una derivada de una fuente distinta de Rasamsonia) y/o una hemicelulasa (por ejemplo, una derivada de una fuente distinta de Rasamsonia) y/o una pectinasa.
Una composición para su uso en la invención puede comprender una, dos, tres, cuatro clases o más de celulasa, por ejemplo una, dos, tres o cuatro o todas de una GH61, una endoglucanasa (EG), una o dos exo-celobiohidrolasa (CBH) y una b-glucosidasa (BG). Una composición para su uso en la invención puede comprender dos o más de cualquiera de estas clases de celulasa.
Una composición de la invención puede comprender una actividad que tiene un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa que el proporcionado por la composición para su uso en un método de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionado por una composición como se describe en este documento y un segundo tipo de actividad celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionado por una celulasa/hemicelulasa/pectinasa adicional.
En este documento, una celulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o modificar la celulosa. Un polipéptido que sea capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradar la celulosa en unidades más pequeñas ya sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Tal degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.
Las proteínas GH61 (familia glucósido hidrolasa 61 o en ocasiones denominada EGIV) son polisacárido monooxigenasas (PMO) dependientes de oxígeno de acuerdo con la bibliografía más reciente. Se menciona a menudo en la bibliografía que estas proteínas potencian la acción de las celulasas sobre los sustratos de lignocelulosa. GH61 originalmente se clasificó como una endoglucanasa basándose en la medición de una actividad endo-1,4-p-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. El término "GH61" como se usa en este documento, debe entenderse como una familia de enzimas que comparten porciones de secuencia conservada y pliegues comunes para poder clasificarlas en la familia 61 del sistema de clasificación bien establecido CAZY GH (http://www.cazy.org/GH61.html). La familia glucósido hidrolasa 61 es un miembro de la familia de las glucósido hidrolasas EC 3.2.1. GH61 se usa en este documento como parte de las celulasas.
En este documento, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o modificar hemicelulosa. Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de degradación de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente, en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.
En este documento, una pectinasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar o modificar pectina. Un polipéptido que sea capaz de degradar pectina es uno que sea capaz de catalizar el proceso de degradar pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradación típicamente tendrá lugar mediante una reacción de hidrólisis.
Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo una GH61, una celobiohidrolasa, una endo-b-I,4-glucanasa, una b-glucosidasa o una b-(1,3) (1,4)-glucanasa.
En este documento, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de las uniones 1,4-^-D-glucosídicas en celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima puede denominarse también celulasa 1,4-b-celobiosidasa, 1,4^ -celobiohidrolasa, 1 ,4^-D-glucan celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1,4^ -D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa.
En este documento, una endo-b-I,4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de las uniones 1,4^ -D-glucosídicas en la celulosa, b-D-glucanos de liquenina o cereal. Tal polipéptido puede ser capaz de hidrolizar las uniones 1,4 en b-D-glucanos que también contienen uniones 1,3. Esta enzima puede denominarse celulasa, avicelasa, b-l,4-endoglucan hidrolasa, b-1,4-gluconasa, carboximetilcelulosa, celudextrinasa, endo- 1,4-p-D-glucanasa, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasa, endo-1,4~p-glucanasa o endoglucanasa.
En este documento, una p-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-glucosa no reductores terminales con liberación de p-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una amplia especificidad para p-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un p-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un p-D-xilósido o un p-D-fucósido. Esta enzima puede denominarse también amigdalasa, P-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.
En este documento, una p-(1,3)(1,4)-glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de las uniones 1,4-p-D-glucosídicas en los p-D-glucanos que contienen enlaces 1,3- y 1,4. Tal polipéptido puede actuar sobre los p-D-glucanos de liquenina y cereal, pero no sobre los p-D-glucanos que contienen solo enlaces 1,3- o 1,4. Esta enzima puede denominarse también liqueninasa, 1,3-1,4-p-D-glucan 4-glucanohidrolasa, p-glucanasa, endo-p-1,3-1,4-glucanasa, liquenasa o una unión mixta P-glucanasa. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1,3 (4)-beta- glucanasa. Este tipo de enzima hidrolasas con uniones 1,3- o 1.4- en beta-D-glucanasa cuando el residuo glucosa cuyo grupo reductor está implicado en la unión a hidrolizar está sustituido él mismo en C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1,3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1,3-(1,3; 1,4)-b-?-glucan 3 (4) glucanohidrolasa; los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de liquenina y cereal.
Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo una endoxilanasa, una b-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una OÍ-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a galactosidasa, una b-galactosidasa, una b-mananasa o una b-manosidasa.
En este documento, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de las uniones 1,4^-D-xilosídicas en xilanos. Esta enzima puede denominarse también endo-1,4^ -xilanasa o 1.4-b—D—xilan xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilan endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar las uniones 1,4 xilosidicas en los glucuronoarabinoxilanos.
En este documento, una b-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-p-D-xilanos, para retirar los residuos D-xilosa sucesivos de los extremos no reductores. Tales enzimas pueden también hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima puede denominarse xilan 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilan xilohidrolasa, exo-1,4-p-xilosidasa o xilobiasa.
En este documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranosidos, a-L-arabinanos que contienen uniones (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima puede denominarse también o¡-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.
En este documento, una a-D-glucuronidasa (CE 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido+H(2)O = un alcohol + D-glucuronato. Esta enzima puede denominarse también alf a-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas pueden también hidrolizar el ácido glucurónico 4-O-metilado que también puede estar presente como un sustituyente en xilanos. La alternativa es EC 3.2.1.131: xilan alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de las uniones alfa-1,2-(4-0-metil) glucuronosilo.
En este documento, una acetil xilan esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos. Tal polipéptido puede catalizar la hidrólisis de los grupos acetilo a partir de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato o p-nitrofenil acetato pero, típicamente, no a partir de triacetilglicerol. Tal polipéptido típicamente no actúa sobre el manano acetilado o la pectina.
En este documento, una feruloil esterasa (CE 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Típicamente puede catalizar la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoílo (feruloílo) a partir de un azúcar esterificado, que normalmente es arabinosa en sustratos "naturales". El acetato de p-nitrofenol y ferulato de metilo típicamente son sustratos más pobres. Esta enzima también puede denominarse cinamoil éster hidrolasa, esterasa de ácido ferúlico o esterasa de hidroxicinamoílo. Puede denominarse también enzima auxiliar de hemicelulasa, puesto que ayuda a las xilanasas y pectinasas a degradar la pared celular vegetal de hemicelulosa y pectina.
En este documento, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacárido + H(2)0 = curaarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima puede denominarse también trans-4-cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o esterasa de ácido p-cumárico. Esta enzima también se incluye dentro de EC 3.1.1.73 por lo que puede denominarse feruloil esterasa.
En este documento, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos a-D-galactosa no reductores, terminales, en a-D-galactósidos, incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos. Tal polipéptido puede ser capaz también de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima puede denominarse también melibiasa.
En este documento, una b-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de los restos b-D-galactosa no reductores terminales en b-D-galactósidos. Tal polipéptido puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos . Esta enzima puede denominarse también exo-(l->4)-b-D-galactanasa o lactasa.
En este documento, una b-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de las uniones 1,^ -D-manosídicas en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima puede denominarse también manan endo-1,4-p-manosidasa o endo-1,4-mananasa.
En este documento, una-p-manosidasa (CE 3.2.1.25) es cualguier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-manosa no reductores terminales en p-D-manósidos. Esta enzima puede denominarse también mananasa o manasa.
Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectin metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una peptin acetil esterasa, una endo-pectin liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una epoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonan liasa, una ramnogalacturonan acetil esterasa, una ramnogalacturonan galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa.
En este documento, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de uniones 1,4-a-D-galactosidurónico en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima puede denominarse también poligalacturonasa, pectin despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectin hidrolasa, pectin poligalacturonasa, poli-a-I,4-galacturónido glucanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli (1,4-a-D-galacturónido) glucanohidrolasa.
En este documento, una pectin metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que sea capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima puede conocerse también como pectinesterasa, pectin demetoxilasa, pectin metoxilasa, pectin metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectin pectilhidrolasa.
En este documento, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de las uniones 1,4-p-D-galactosídicas en arabinogalactanos. La enzima puede conocerse también como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa, endo-1,4-P~galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactan 4-b-?-galactanohidrolasa.
En este documento, una pectina acetil esterasa se define en este documento como cualquier enzima que tenga una actividad acetil esterasa que catalice la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos de GalUA de la pectina En este documento, una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de (1—»4)-a-D-galacturonan metil éster para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-O-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede conocerse también como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturonico transeliminasa, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (l-»4)-6-0-metil-a-D-galacturonan liasa.
En este documento, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de (1—>4)- -D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima puede conocerse también como poligalacturónico transeliminasa, transeliminasa de ácido péctico, poligalacturonato liasa, endopectin metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, liasa de ácido péctico, liasa péctica, liasa de ácido cx-1,4-D-endopoligalacturonico, PGA liasa, PPasa-N, liasa del ácido endo-a-1,4-poligalacturónico, liasa del ácido poligalacturónico, pectina trans-eliminasa, trans-eliminasa del ácido poligalacturónico o (1—>4)-a-D-galacturonan liasa.
En este documento, una alfa-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de residuos a-L-ramnosa no reductores terminales en a-L-ramnósidos o, como alternativa, en ramnogalacturonanos. Esta enzima puede conocerse también como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa.
En este documento, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrolizar ácido péctico a partir del extremo no reductor liberador de digalacturonato. La enzima puede conocerse también como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.
En este documento, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturónido) + ¾0 = (1,4-a-D-galacturónido)n-i + D-galacturonato. La enzima puede conocerse también como galacturan 1,4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli (1,4-a-D-galacturónido) galacturonohidrolasa.
En este documento, la exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato del extremo reductor de pectato, es decir, pectina desesterificada. Esta enzima puede conocerse como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, transeliminasa de ácido exopéctico, exopectato liasa, transeliminasa del ácido exopoligalacturónico, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido-liasa del extremo reductor de (1—»4)-a-D-galacturonano.
En este documento, la ramnogalacturonano hidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar la unión entre ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo de una manera endo en estructuras ramnogalacturonano estrictamente alternas, que consiste en disacárido [(ácido 1,2-alfa-L-ramnoil- (1,4)-alfa-galactosilurónico].
En este documento, ramnogalacturonan liasa es cualquier polipéptido que sea cualquier polipéptido que sea capaz de escindir las uniones a-L-Rhap-(1—>4)-a-D-GalpA de una manera endo en ramnogalacturonano por beta-eliminación.
En este documento, la ramnogalacturonan acetil esterasa es cualquier polipéptido que catalice la desacetilación de la estructura básica de residuos alternos ramnosa de ácido galacturónico en ramnogalacturonano.
En este documento, la ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas de una manera exo.
En este documento, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúe sobre xilogalacturonano por escisión de la estructura básica del ácido galacturónico sustituido con b-xilosa de una manera endo. Esta enzima también puede conocerse como xilogalacturonan hidrolasa.
En este documento, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, a-L-arabinanos que contienen uniones (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos. Esta enzima puede denominarse también a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.
En este documento, la endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la endohidrólisis de las uniones 1,5-a-arabinofuranosidicas en 1,5-arabinanos. La enzima puede conocerse también como endo-arabinasa, arabinan endo-1,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-cx-L-arabinanasa, endo-a-I,5-arabanasa; endo-arabanasa o 1,5-a-L-arabinan 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.
Una composición de la invención típicamente comprenderá al menos una celulasa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención). Una composición de la invención puede comprender una GH61, una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una b-glucosidasa. Tal composición puede comprender también una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.
Además, una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa, una glucuronidasa o una expansina o una celulosa inducida por proteina o una celulosa integrante de proteina o una proteina similar puede estar presente en una composición de la invención (estas se han denominado actividades auxiliares anteriormente).
Una "proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptidicos (peptidasas), asi como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros restos tales como azúcares (glucopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan según EC 3.4, y son adecuadas para su uso en la invención y se incorporan en este documento por referencia. Algunos tipos específicos de próteasas incluyen cisteína proteasas incluyendo pepsina, papaína y serina proteasas incluyendo quimiotripsínas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.
Una "lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos, y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En plantas, los lípidos se usan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, asi como cutina y suberina.
Una "ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o degradar la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden degradar la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas y otras enzimas descritas en la téenica que se sabe que despolimerizan o rompen de otra manera los polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar los enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (en concreto arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen, aunque sin limitación, el siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.1.14), manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).
Una "hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de catalizar una reacción de transferasa, pero que pueden catalizar también una reacción de hidrólisis, por ejemplo de celulosa y/o productos de degradación de celulosa. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede usarse en la invención es una b-glucanosiltransferasa. Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3)(1,4) glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.
Una "glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo b-glucuronósido para producir un alcohol. Se han caracterizado muchas glucuronidasas y pueden ser adecuadas para su uso en la invención. Por ejemplo b-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato b- glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).
Una composición para su uso en la invención puede comprender una expansina o proteina similar a expansina tal como swollenina (véase Salheimo et al . , Eur. J. Biohem.269, 4202-4211, 2002) o una proteina similar a swollenina.
Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento celular vegetal. Las expansinas se han propuesto para alterar el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolitica. De esta manera, se enseña que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y la ampliación de la pared celular. La swollenina, una proteina similar a expansina, contiene un dominio de la familia del módulo de unión a carbohidrato N-ter inal 1 (CBD) y un dominio similar a expansina C-terminal. Para los fines de esta invención, una proteina similar a expansina o proteina similar a swollenina puede comprender uno o ambos de tales dominios y/o puede alterar la estructura de las paredes celulares (tal como alterar la estructura de la celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.
Una composición para su uso en la invención puede ser una proteina inducida por celulosa, por ejemplo el producto polipeptidico del gen cipl o cip2 o genes similares (véase Foreman et al . , J. Biol. Chem.278(34), 31988-31997, 2003), una proteina integrante de celulosa/celulosoma, por ejemplo el producto polipeptidico del gen cipA o cipC, o una escafoldina o una proteina similar a escafoldina. Las escafoldinas y las proteínas integrantes de celulosa son subunidades integrantes multifuncionales que pueden organizar las subunidades celulolíticas en complejos multi-enzimáticos. Esto se consigue por interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión en la escafoldina y un dominio de dockerina en cada unidad enzimática. La subunidad escafoldina también lleva un módulo de unión a celulosa (CBM) que media la fijación del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína integrante de celulosa para los fines de esta invención puede comprender uno o ambos de tales dominios.
Una composición para su uso en un método de la invención puede estar compuesta de un miembro de cada una de las clases de enzimas mencionadas anteriormente, varios miembros de una clase de enzima o cualquier combinación de estas clases de enzimas o proteínas auxiliares (es decir, las proteínas mencionadas en este documento que no tienen actividad enzimática per se, pero que no obstante ayudan en la degradación lignocelulósica).
Una composición para su uso en un método de la invención puede estar compuesta de enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldo complejo (tal como el resultante del crecimiento de una cepa microbiana en un medio, en que las cepas secretan proteínas y enzimas al medio; (4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3); y/o (5) enzimas que expresan material vegetal. Pueden obtenerse diferentes enzimas en una composición de la invención a partir de diferentes fuentes.
Las enzimas pueden producirse ya sea exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas después de aislarse y añadirse por ejemplo a una materia prima lignocelulósica. Como alternativa, las enzimas se producen, pero no se aíslan, y puede añadirse un caldo de fermentación de masa celular en bruto, o material vegetal (tal como rastrojo de maíz o paja de trigo) y similares, por ejemplo, a la materia prima. Como alternativa, la masa celular en bruto o medio de producción de enzima o material vegetal puede tratarse para evitar el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, por calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) después añadirlo a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzima en bruto pueden incluir el organismo productor de la enzima. Como alternativa, la enzima puede producirse en una fermentación que usa una materia prima (pretratada) (tal como el rastrojo de maiz o paja de trigo) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima o enzimas. De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir por si mismas como materia prima lignocelulósica y añadirse en la materia prima lignocelulósica.
En los usos y métodos descritos en este documento, los componentes de las composiciones descritas anteriormente pueden proporcionarse simultáneamente (es decir, como una única composición per se) o por separado o secuencialmente.
Por lo tanto, la invención se refiere a métodos en los que se usa la composición descrita anteriormente y a los usos de la composición en procesos industriales.
Material lignocelulósico El material lignocelulósico en este documento incluye material lignocelulósico y/o hemicelulósico. El material lignocelulósico adecuado para su uso como materia prima en la invención incluye biomasa, por ejemplo, biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, materia orgánica comercial, residuos de construcción y demolición, residuos sólidos urbanos, papel residual y residuos de jardín. Las formas habituales de biomasa incluyen árboles, arbustos y céspedes, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, miscanto, maíz, rastrojo de maíz, cascarillas de maíz, mazorcas de maíz, tallos de cañóla, tallos de semilla de soja, sorgo dulce, granos de maíz incluyendo fibras de los granos, productos y subproductos de molienda de granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) a menudo denominado "salvado o fibra", así como residuos sólidos urbanos, papel residual y residuos de jardín. La biomasa puede ser también, aunque sin limitación, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, papel residual y pasta y papel de residuos de molinos. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cascarillas de maíz, cultivos energéticos, forestales, frutas, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos madereros de rotación corta, arbustos, pasto varilla, árboles, hortalizas, mondaduras de frutas, vides, pasta de remolacha azucarera, afrechillo de trigo, cascarillas de avena, y maderas duras y blandas (sin incluir maderas con materiales perjudiciales). Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de procesos agrícolas incluyendo actividades agrícolas y forestales, incluyendo específicamente residuos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de los mencionados anteriormente de forma individual o cualquier combinación o mezcla de los mismos.
Pretratamiento La materia prima puede pretratarse opcionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métodos para potenciar la accesibilidad del sustrato a la hidrólisis enzimática y/o para hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o la celulosa y/o lignina, de cualquier manera conocida en la téenica. En una realización, el pretratamiento se realiza tratando la lignocelulosa con explosión de vapor, tratamiento con agua caliente o tratamiento con ácido diluido o base diluida .
Etapa de lavado Opcionalmente, el proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de lavado. La etapa de lavado opcional puede usarse para retirar los compuestos solubles en agua que pueden actuar como inhibidores para la etapa de fermentación.
La etapa de lavado puede realizarse de cualquier manera conocida.
Hidrólisis enzimática La composición de enzima usada en el proceso de la invención puede hidrolizar de forma extremadamente eficaz el material lignocelulolitico, por ejemplo rastrojo de maíz o paja de trigo, que después puede convertirse adicionalmente en un producto útil, tal como etanol, biogás, butanol, ácido láctico, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un complemento para pienso animal, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química. Adicionalmente, los productos intermedios a partir de un proceso después de la hidrólisis, por ejemplo, ácido láctico como intermedio en la producción de biogás pueden usarse como bloque constructor para otros materiales. La presente invención se ejemplifica con la producción de etanol pero esto se hace como ejemplificación y no como limitación de los otros productos útiles mencionados que pueden producirse igualmente bien.
El proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de hidrólisis enzimática. La hidrólisis enzimática incluye, aunque sin limitación, hidrólisis para el fin de licuefación de la materia prima e hidrólisis con el fin de liberar el azúcar de la materia prima o ambos. En esta etapa, el material lignocelulósico opcionalmente pretratado y opcionalmente lavado se pone en contacto con la composición de enzima de acuerdo con la invención. Dependiendo del material lignocelulósico y del pretratamiento, las diferentes condiciones de reacción, por ejemplo, temperatura, dosificación de enzima, tiempo de reacción de hidrólisis y concentración de materia seca, pueden adaptarse por los expertos para conseguir la conversión deseada de lignocelulosa a azúcar. Se dan algunas indicaciones más adelante.
En un aspecto de la invención la hidrólisis se realiza a una temperatura de 45 °C o mayor, 50 °C o mayor, 55 °C o mayor, 60 °C o mayor, 65 °C o mayor o 70 °C o mayor. La alta temperatura durante la hidrólisis tiene muchas ventajas, que incluyen trabajar a la temperatura óptima de la composición de enzima, la reducción del riesgo de contaminación (bacteriana), viscosidad reducida, pequeña cantidad de agua de enfriamiento requerida, uso de agua de enfriamiento con una mayor temperatura, reutilización de las enzimas y más.
En un aspecto adicional de la invención, la cantidad de composición de enzima añadida (denominada también en este documento dosificación de enzima o carga de enzima) es baja. En una realización, la cantidad de enzima es 6 mg de proteina/g de materia seca en peso o menor, 5 mg de proteína/g de materia seca o menor, 4 mg de proteína/g de materia seca o menor, 3 mg de proteina/g de materia seca o menor, 2 mg de proteina/g de materia seca o menor o 1 mg de proteína/g de materia seca o menor (expresado como proteína en mg de proteína/g de materia seca). En una realización, la cantidad de enzima es 0,5 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,4 mg de composición de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,3 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,25 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,20 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,18 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor, 0,15 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor o 0,10 mg de enzima/g de materia seca en peso o menor (expresado como el total de enzimas celulasa en mg de enzima/g de materia seca). Es posible una dosificación de enzima baja, puesto que debido a la actividad y estabilidad de las enzimas, es posible aumentar el tiempo de reacción de hidrólisis.
En un aspecto adicional de la invención, el tiempo de reacción de hidrólisis es 5 horas o mayor, 10 horas o mayor, 20 horas o mayor, 40 horas o mayor, 50 horas o mayor, 60 horas o mayor, 70 horas o mayor, 80 horas o mayor, 90 horas o mayor, 100 horas o mayor, 120 horas o mayor, 130 horas o mayor. En otro aspecto, el tiempo de reacción de hidrólisis es de 5 a 150 horas, de 40 a 130 horas, de 50 a 120 horas, de 60 a 120 horas, de 60 a 110 horas, de 60 a 100 horas, de 70 a 100 horas, de 70 a 90 horas o de 70 a 80 horas. Debido a la estabilidad de la composición de enzima son posibles tiempos de reacción de hidrólisis más largos con los correspondientes mayores rendimientos de azúcar.
El pH durante la hidrólisis puede elegirlo un experto. En un aspecto adicional de la invención, el pH durante la hidrólisis puede ser de 3,0 a 6,4. Las enzimas estables de la invención pueden tener un intervalo de pH amplio de hasta 2 unidades de pH, hasta 3 unidades de pH, hasta 5 unidades de pH. El pH óptimo puede estar dentro de los limites de pH 2,0 a 8,0, de 3,0 a 8,0, de 3,5 a 7,0, de 3,5 a 6,0, de 3,5 a 5,0, de 3,5 a 4,5, de 4,0 a 4,5 o es de aproximadamente 4,2.
En un aspecto adicional de la invención la etapa de hidrólisis se realiza hasta que se libera el 70 % o más, el 80 % o más, el 85 % o más, el 90 % o más, el 92 % o más, el 95 % o más del azúcar disponible en el material lignocelulosico.
Significativamente, un proceso de la invención puede realizarse usando altos niveles de materia seca (del material lignocelulósico) en la reacción de hidrólisis. De esta manera, la invención puede realizarse con un contenido de materia seca de aproximadamente el 5 % en peso o mayor, aproximadamente el 8 % en peso o mayor, aproximadamente el 10 % en peso o mayor, aproximadamente 11 % en peso o mayor, aproximadamente el 12 % en peso o mayor, aproximadamente el 13 % en peso o mayor, aproximadamente 14 % en peso o mayor, aproximadamente el 15 % en peso o mayor, aproximadamente el 20 % en peso o mayor, aproximadamente el 25 % en peso o mayor, aproximadamente el 30 % en peso o mayor, aproximadamente el 35 % en peso o mayor, o aproximadamente el 40 % en peso o mayor. En una realización adicional, el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis es de 14 % en peso, 15 % en peso, 16 % en peso, 17 % en peso, 18 % en peso, 19 % en peso, 20 % en peso, 21 % en peso, 22 % en peso, 23 % en peso, 24 % en peso, 25 % en peso, 26 % en peso, 27 % en peso, 28 % en peso, 29 % en peso, 30 % en peso, 31 % en peso, 32 % en peso, 33 % en peso o mayor, o de 14 a 33 % en peso.
Fermentación El proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de fermentación. En un aspecto adicional, la invención incluye por tanto, en la etapa de fermentación, procesos en los que se usa un microorganismo para la fermentación de una fuente de carbono que comprende un azúcar o azúcares, por ejemplo glucosa, L-arabinosa y/o xilosa. La fuente de carbono puede incluir cualquier carbohidrato oligo- o polimérico que comprenda unidades L-arabinosa, xilosa o glucosa tal como por ejemplo lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, arabinano y similares. Para la liberación de las unidades de xilosa o glucosa de tales carbohidratos pueden añadirse carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) al medio de fermentación o pueden producirse por la célula hospedadora modificada. En el último caso, la célula hospedadora modificada puede modificarse genéticamente para producir y secretar tales carbohidrasas. Una ventaja adicional usar fuentes oligo- o poliméricas de glucosa es que posibilita mantener una baja o menor concentración de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo usando cantidades limitantes de velocidad de carbohidrasas. Esto, a su vez, evitará la represión de los sistemas requeridos para el metabolismo y transporte de azúcares distintos de glucosa tales como xilosa. En un procedimiento preferido, la célula hospedadora modificada fermenta tanto L-arabinosa (opcionalmente xilosa) como glucosa, preferentemente simultáneamente, en cuyo caso se usa preferentemente una célula hospedadora modificada que es insensible a la represión de glucosa para evitar el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de L-arabinosa, opcionalmente xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá adicionalmente el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula hospedadora modificada. Las composiciones de los medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos tales como levaduras u hongos filamentosos se conocen bien en la téenica.
El tiempo de fermentación puede ser más corto gue en la fermentación convencional en las mismas condiciones, en gue parte de la hidrólisis enzimática aún tiene que tener lugar durante la fermentación. En una realización, el tiempo de fermentación es de 100 horas o menor, 90 horas o menor, 80 horas o menor, 70 horas o menor o 60 horas o menor, para una composición de azúcar de 50 g/1 de glucosa y otros azúcares correspondientes de la materia prima lignocelulósica (por ejemplo 50 g/1 de xilosa, 35 g/1 de L-arabinosa y 10 g/1 de galactosa. Para composiciones de azúcar más diluidas el tiempo de fermentación puede reducirse correspondientemente.
El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio. Un proceso de fermentación anaerobia se define en este documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxigeno o en el que no se consume sustancialmente oxigeno, preferentemente se consume menos de 5, 2,5 o 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (es decir, el consumo de oxigeno no es detectable), y en que las moléculas orgánicas sirven tanto como dadores de electrones y como aceptores de electrones. En ausencia de oxigeno, el NADH producido en la glucólisis y formación de biomasa, no puede oxidarse por fosforilación oxidativa. Para resolver este problema muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como un aceptor de electrones e hidrógeno, regenerando de esta manera el NAD+. De esta manera, en un proceso de fermentación anaerobia preferido se usa piruvato como un aceptor de electrones (y de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tales como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, ácido acético, ácido succinico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, antibióticos de b-lactama y una cefalosporina. En una realización preferida, el proceso de fermentación es anaerobio. Un proceso anaerobio es ventajoso puesto que es más barato que los procesos aerobios: se necesita un equipo menos especial. Adicionalmente, se espera que los procesos anaerobios den un mayor rendimiento de producto de los procesos aerobios. En condiciones aerobias, normalmente el rendimiento de biomasa es mayor que en condiciones anaerobias. En consecuencia, normalmente en condiciones aerobias, el rendimiento de producto esperado es menor que en condiciones anaerobias.
En otra realización, el proceso de fermentación es en condiciones limitadas de oxigeno. Más preferentemente, el proceso de fermentación es aerobio y en condiciones limitadas de oxígeno. Un proceso de fermentación limitado en oxígeno es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno está determinado por la cantidad y composición del flujo de gas entrante así como por las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo de fermentación usado. Preferentemente, en un proceso en condiciones limitadas de oxígeno, la velocidad de consumo de oxígeno es al menos 5,5, más preferentemente al menos 6 y aún más preferentemente al menos 7 mmol/l/h.
El proceso de fermentación preferentemente se realiza a una temperatura que es óptima para la célula modificada. De esta manera, para la mayoría de levaduras o células fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es menor de 42 °C, preferentemente menor de 38 °C. Para levaduras o células hospedadoras fúngicas filamentosas, el proceso de fermentación preferentemente se realiza a una temperatura que es menor de 35, 33, 30 o 28 °C y a una temperatura que es mayor de 20, 22, o 25 °C.
En una realización de la invención, la etapa la fermentación se realiza con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5. En una realización el proceso es un proceso para la producción de etanol, con lo que el proceso comprende la etapa de fermentar un medio que contiene un azúcar o azúcares con un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5, con lo que la célula hospedadora es capaz de fermentar glucosa, L-arabinosa y xilosa a etanol. En una realización de la misma, el microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5 es una levadura. En una realización, la levadura pertenece al género Saccharomyces, preferentemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, en la que se han realizado modificaciones genéticas. Un ejemplo de tal microorganismo y su preparación se describe con más detalle en el documento WO 2008/041840 y en la Solicitud de Patente Europea EP10160622.6, presentada el 21 de abril de 2010. En una realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol es anaerobio. El término anaerobio ya se ha definido anteriormente en este documento. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol es aerobio. En otra realización preferida, el proceso de fermentación para la producción de etanol es en condiciones limitadas de oxigeno, más preferentemente condiciones aerobias y limitadas de oxigeno. Las condiciones limitadas de oxigeno ya se han definido anteriormente en este documento .
En un proceso de este tipo, la productividad volumétrica de etanol preferentemente es al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 o 10,0 g de etanol por litro por hora. El rendimiento de etanol sobre L-arabinosa y opcionalmente xilosa y/o glucosa en el proceso preferentemente es al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98 %. El rendimiento de etanol se define en este documento como un porcentaje del rendimiento máximo teórico, que para glucosa y L-arabinosa y opcionalmente xilosa es 0,51 g de etanol por g de glucosa o xilosa.
En un aspecto, el proceso de fermentación que conduce a la producción de etanol tiene varias ventajas por comparación con los procesos de fermentación de etanol conocidos: - son posibles procesos anaerobios; - también son posibles condiciones limitadas de oxígeno; pueden obtenerse mayores rendimientos de etanol y velocidades de producción de etanol; - la cepa usada puede ser capaz de usar L-arabinosa y opcionalmente xilosa.
Como alternativa a los procesos de fermentación descritos anteriormente, pueden usarse al menos dos células distintas, esto significa que este proceso es un proceso de co-fermentación. Todas las realizaciones preferidas de los procesos de fermentación como se ha descrito anteriormente también son realizaciones preferidas de este proceso de co-fermentación: identidad del producto de fermentación identidad de la fuente de L-arabinosa y la fuente de xilosa, condiciones de fermentación (condiciones aerobias o anaerobias, condiciones limitadas de oxigeno, temperatura a la que se está realizando el proceso, productividad de etanol, rendimiento de etanol).
El proceso de fermentación puede realizarse sin ningún requisito para ajustar el pH durante el proceso. Es decir, el proceso es uno que puede realizarse sin adición de ningún ácido o base. Sin embargo, esto excluye una etapa de pretratamiento donde puede añadirse ácido. El caso es que la composición de la invención sea capaz de actuar a un pH bajo y, por lo tanto, no haya necesidad de ajustar el pH de ácido de una materia prima pretratada con ácido para que la sacarificación o hidrólisis pueda tener lugar. Por consiguiente, un método de la invención puede ser un método con residuo cero usando solo productos orgánicos que no requieran un aporte químico inorgánico.
Tiempo de reacción global De acuerdo con la invención, el tiempo de reacción global (o tiempo de reacción de la etapa de hidrólisis y la etapa de fermentación juntas) puede reducirse. En una realización, el tiempo de reacción global es 300 horas o menos, 200 horas o menos, 150 horas o menos, 140 horas o menos, 130 o menos, 120 horas o menos, 110 horas o menos, 100 horas o menos, 90 horas o menos, 80 horas o menos, 75 horas o menos o aproximadamente 72 horas con un rendimiento de glucosa del 90 %. Pueden alcanzarse tiempos globales menores correspondientes a un rendimiento de glucosa más bajo.
Productos de fermentación Los productos de fermentación que puedan producirse de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, complementos para piensos de animales, productos químicos especializados, materias primas químicas, plásticos, disolventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol como combustible (entendiéndose que el término "etanol" incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua).
Algunos productos de valor añadido específicos que puedan producirse por los métodos de la invención incluyen, aunque sin limitación, biocombustibles (incluyendo biogás, etanol y butanol); ácido láctico; ácido 3-hidroxi-propiónico; ácido acrílico; ácido acético; 1,3-propano-diol; etileno; glicerol; un plástico; un producto químico especializado; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico y ácido maleico; un disolvente; un complemento para piensos de animales; un producto farmacéutico tal como un antibiótico de b-lactama o una cefalosporina; una vitamina; un aminoácido tal como U sina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; una materia prima química; o un complemento alimentario para animales.
Separación del producto de fermentación El proceso de acuerdo con la invención opcionalmente comprende la recuperación del producto de fermentación. Un producto de fermentación puede separarse del caldo de fermentación de cualquier manera conocida. Para cada producto de fermentación el experto será capaz por tanto de seleccionar una téenica de separación apropiada. Por ejemplo, el etanol puede separarse de un caldo de fermentación de levadura por destilación, por ejemplo destilación con vapor/destilación al vacío de una manera convencional.
Ciertas realizaciones de la invención se describirán más adelante con más detalle pero no limitan de ninguna manera el alcance de la presente invención.
Uso de enzimas termoestables en condiciones de temperatura óptimas En una realización la invención se refiere al uso de enzimas termoestables tales como enzimas celulolíticas de Rasamsonia para la producción de azúcares reductores a partir de una materia prima lignocelulósica pretratada, aunque sin limitación, en la producción de etanol. Las enzimas celuloliticas de Rasamsonia aplicadas a la materia prima lignocelulósica pretratada mostraron velocidades de conversión máximas a una temperatura dentro del intervalo de 50 a 70 °C. La enzima sigue activa en estas circunstancias durante 14 dias y más sin un cese completo de la actividad.
Usando las condiciones de temperatura óptimas, puede liberarse una cantidad de azúcares reductores de la materia prima (hidrólisis total) dentro del tiempo de hidrólisis más corto posible. De esta manera, se consigue un 100 % de conversión de celulosa en glucosa en menos de 5 dias.
El rendimiento máximo teórico (Yps máx en g de producto por gramos de glucosa) de un producto de fermentación puede obtenerse de un libro de texto de bioquímica. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 g) produce, de acuerdo con la ruta de fermentación de glucólisis normal en levadura, 2 moles de etanol (=2x46 = 92 g de etanol). El rendimiento máximo teórico de etanol sobre glucosa es por tanto 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glucosa.
Para el butanol (PM 74 g/mol) o iso butanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Por lo que Yps máx para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g de (iso-)butanol/g de glucosa.
Para el ácido láctico el rendimiento de fermentación para fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (PM = 90 g/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequiometria, el Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glucosa.
Para otros productos de fermentación puede realizarse un cálculo similar.
La reducción de coste conseguida con la aplicación de enzimas celuloliticas de Rasamsonia será el resultado de una reducción global en el tiempo de proceso.
Compensación de una menor dosificación de enzima con un tiempo de hidrólisis prolongado usando enzimas de Rasamsonia Debido a la alta estabilidad de las enzimas estables, las actividades no cesan en el tiempo, aunque se liberen menos azúcares reductores en el transcurso de la hidrólisis. Es posible reducir la dosificación de enzima y prolongar el uso de la enzima prolongando los tiempos de hidrólisis para obtener niveles similares de azúcares reductores liberados. Por ejemplo, 0,175 mi de enzima/g de materia seca de materia prima dieron como resultado la liberación de aproximadamente un 90 % del máximo teórico de azúcares reductores para la materia prima pretratada en 72 h. Cuando se usan 0,075 mi de enzima/g de materia prima seca, se consigue aproximadamente un 90 % de conversión del máximo teórico en 120 h. Los resultados muestran que, debido a la estabilidad de la actividad enzimática, la reducción de la dosificación enzimática puede compensarse prolongando el tiempo de hidrólisis para obtener la misma cantidad de azúcares reductores. Esto mismo se mantiene para la hidrólisis de materia prima pretratada a contenidos de materia seca mayores del 10 %, que muestra este efecto de compensación del tiempo de hidrólisis prolongado al 15 % de materia prima seca.
La reducción de coste conseguido usando enzimas celuloliticas estables tales como Rasamsonia, da como resultado que se requiere menos dosificación de enzima, dando como resultado rendimientos de conversión de hidrólisis similares.
Reducción del riesgo sobre la contaminación con enzimas estables En un proceso común para convertir el material lignocelulósico en etanol, las etapas de proceso se realizan preferentemente en condiciones sépticas para reducir los costes operativos. Por lo tanto, puede ocurrir la contaminación y crecimiento de microorganismos contaminantes y da como resultado efectos secundarios indeseables tales como producción de ácido láctico, ácido fórmico y ácido acético, pérdidas de rendimiento de etanol sobre el sustrato, producción de toxinas y polisacáridos extracelulares que puede afectar a los costes de producción significativamente. Una temperatura de proceso alta y/o un tiempo de proceso corto limitarán el riesgo sobre la contaminación durante la hidrólisis y fermentación. Las enzimas termoestables, como las de Rasamsonia, son capaces de hidrolizar una materia prima lignocelulósica a temperaturas mayores de 60 °C. A estas temperaturas, el riesgo de que un microorganismo contaminante provoque efectos secundarios indeseados será de muy pequeño a casi cero.
Durante la etapa de fermentación, en la que se produce etanol, las temperaturas típicamente son entre 30 y 37 °C y preferentemente no subirán debido a las pérdidas de producción. Aplicando tiempos de proceso de fermentación tan cortos como sea posible los riesgos y efectos de contaminación y/o crecimiento de contaminantes se reducirán tanto como sea posible. Con enzimas estables, como las de Rasamsonia, pueden aplicarse tiempos de fermentación tan cortos como sea posibles (véase la descripción anterior) y, de esta manera, los riesgos sobre la contaminación y/o el crecimiento de contaminantes se reducirán tanto como sea posible. De esta manera, la reducción de costes conseguida con la aplicación de enzimas celulolíticas termoestables de Rasamsonia dará como resultado un menor riesgo de fallos en el proceso debido a contaminación.
Las enzimas establea reducen los costes de enfriamiento y aumentan la productividad de las plantas de etanol La primera etapa después del pretratamiento térmico será enfriar la materia prima pretratada a temperaturas donde las enzimas sean óptimamente activas. A gran escala, esto se realiza típicamente añadiendo agua (enfriada), que aparte de disminuir la temperatura, reducirá el contenido de materia seca. Usando enzimas termoestables, como las de Rasamsonia, puede conseguirse una reducción de costes por el hecho de que (i) se requiere menos enfriamiento de la materia prima pretratada puesto que se permiten mayores temperaturas durante la hidrólisis y (ii) se añadirá menos agua, lo que aumentará el contenido de materia seca durante la hidrólisis y fermentación y, de esta manera, aumentará la capacidad de producción de etanol (cantidad producida por unidad de tiempo por volumen) de una planta de etanol. Asimismo, usando enzimas termoestables de acuerdo con la invención, tales como las de Rasamsonia, la reducción de costes puede conseguirse también usando agua de enfriamiento que tenga una mayor temperatura que el agua que se usa en un proceso con una enzima no termoestable.
Recielado de enzimas después de la hidrólisis con enzimas estables Al final de la hidrólisis, las actividades de las enzimas parecen ser bajas puesto que se liberan pocos azúcares reductores una vez que se ha convertido casi toda la celulosa. Sin embargo, la cantidad de actividad enzimática presente ha disminuido solo un poco, presumiblemente debido principalmente a la absorción de las enzimas en el sustrato. Aplicando separación sólido-liquido después de la hidrólisis, tal como centrifugación, filtración, sedimentación-decantación, etcétera, puede recuperarse un 60 % o más, por ejemplo un 70 % de la actividad enzimática en solución y reutilizarse para la hidrólisis de una nueva materia prima lignocelulósica pretratada durante la siguiente hidrólisis.
Además, después de la separación sólido-liquido la enzima en solución puede separarse de la solución que contiene azúcares reductores y otros productos de hidrólisis de las acciones enzimáticas. Esta separación puede realizarse mediante, aunque sin limitación (ultra y micro)filtración, centrifugación, sedimentación-decantación, sedimentación con o sin primera adsorción de la enzima a un soporte de cualquier tipo.
Por ejemplo, después de la hidrólisis de materia prima pretratada con 0,175 ml/g de carga de enzima como materia prima seca durante 20 h, se libera un 50 % de la cantidad máxima teórica de azúcares reductores y después de la misma hidrólisis durante 72 h, se libera un 90 % de la cantidad máxima teórica de azúcares reductores. Por centrifugación y ultrafiltración, se recuperó un 60-70 % de la actividad enzimática en el retenido, mientras que el filtrado contenia más del 80 % de los azúcares reductores liberados. Reutilizando el retenido, ya sea tal cual o después de purificación y/o concentración adicional, la dosificación de enzimas durante la siguiente etapa de hidrólisis puede reducirse en un 60 a 70 %. La reducción de costes conseguida usando enzimas celuloliticas estables, tales como Rasamsonia, de esta manera, da como resultado que se requiera una menor dosificación de enzimas.
Recielado de enzimas después de la hidrólisis en combinación con producción de enzimas y recielado de células de levadura con enzimas estables El proceso que incluye el reciclado de enzimas después de la hidrólisis, como se ha descrito anteriormente, puede combinarse con el reciclado del microorganismo productor de etanol después de la fermentación y con el uso del filtrado que contiene azúcares reductores como sustrato (purificado y/o concentrado o diluido) en la fermentación para producción de enzimas y como sustrato para el cultivo de microorganismos productores de etanol.
Reciclado de enzimas después de destilación al vacio con enzimas estables La termoestabilidad de las enzimas como las de Rasamsonia, provoca actividad celulolitica remanente después de la hidrólisis, fermentación y destilación al vacio en los residuos de elaboración finos. La actividad total de la enzima se reduce durante las tres etapas de proceso sucesivas. Por lo tanto, los residuos de elaboración finos obtenidos después de la destilación al vacio pueden reutilizarse como una fuente de enzima para un ciclo de proceso de hidrólisis-fermentación-destilación recién iniciado de conversión de paja de trigo pretratada en etanol. Los residuos de elaboración finos pueden usarse como una forma concentrada o no diluida y/o purificada y con o sin complementos enzimáticos adicionales.
Reciclado de enzima en combinación con complementación de enzimas después de destilación al vacio con enzimas termoestables En un proceso óptimo, se complementa una cantidad de enzima en los residuos de elaboración finos, antes de su re utilización en un nuevo ciclo de proceso, igual a la cantidad de actividad perdida durante las tres etapas de proceso sucesivas del ciclo de proceso previo. De esta manera, se evita la sobre-dosificación de enzima y se obtiene por tanto un uso más eficiente de la enzima.
Además, proporcionando una alta dosificación de enzima en el primer ciclo de proceso y complementando enzima en una cantidad igual a la de la actividad perdida durante las tres etapas de proceso sucesivas en los siguientes ciclos de proceso, pueden obtenerse posibles velocidades de hidrólisis más altas en cada ciclo de proceso, dando como resultado tiempos de hidrólisis cortos de menos de 48 h en combinación con un uso más eficaz de las enzimas.
Uso de enzimas estables en sistemas mixtos Aplicando mezcla durante la hidrólisis, las enzimas entran más a menudo en contacto con los sustratos, lo que da como resultado un uso más eficaz de la actividad catalítica. Esto dará como resultado menores dosificaciones de enzimas y, de esta manera, menores costes, a menos que la mezcla tenga un efecto negativo sobre las enzimas. Las enzimas estables, tales como las enzimas termoestables de Rasamsonia, son robustas y pueden resistir las circunstancias (localmente) de alta cizalla y temperaturas, que es el caso durante la mezcla intensiva de las suspensiones. El uso de esta en sistemas mixtos es por tanto beneficioso y conducirá a la dosificación y por tanto a la reducción de costes.
La invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deberían considerarse limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos Información experimental Cepas La cepa Rasamsonia (Talaromyces) emersonii se depositó en CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan 8, P.O. Box 85167, NL-3508 AD Utrecht, Holanda en diciembre de 1964 con el Número de Acceso CBS 393.64.
Pueden usarse igualmente otras cepas adecuadas en los presentes ejemplos para mostrar el efecto y las ventajas de la invención. Por ejemplo TEC-101, TEC-147, TEC-192, TEC-201 o TEC-210 son cepas de Rasamsonia adecuadas que se describen en el documento W02011/000949.
Preparación de un sustrato de rastrojo de maiz pretratado con ácido Se obtuvo un rastrojo de maiz pretratado con ácido diluido (aCS) como se describe en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), vol. 105-108, pp 69- 85. Se usó un reactor de pretratamiento a escala piloto que funcionaba en condiciones de estado estacionario de 190 °C, tiempo de residencia de 1 min y una concentración eficaz de ácido H2S04 del 1,45 % (p/p) en la fase liquida.
Ensayos de medición de proteínas 1 . Proteína total Biuret TCA El método era una combinación de precipitación de proteínas usando ácido tricloro acético (TCA) para retirar las sustancias molestas y permitir la determinación de la concentración de proteínas con la reacción colorimétrica de Biuret. En la reacción de Biuret, un ión de cobre (II) se reduce a cobre (I) que forma un complejo con los nitrógenos y carbonos de los enlaces peptídicos en una solución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color y, por tanto, la absorción a 546 nm es directamente proporcional a la concentración de proteína, de acuerdo con la lcy de Beer-Lambert. La normalización se realizó usando BSA (Albúmina de Suero Bovina) y el contenido de proteína se expresó en g de proteína como equivalentes de BSA/1 o mg de proteína como equivalentes de BSA/ l. El contenido de proteína se calculó usando protocolos de cálculo convencionales conocidos en la téenica, por representación de OD546 frente a la concentración de las muestras con concentración conocida, seguido del cálculo de la concentración de las muestras desconocidas usando la ecuación generada a partir de la línea de calibrado. 2 . Proteínas individuales usando PAGE Pretratamiento de muestras por SDS-PAGE Basándose en la concentración de proteína estimada de las muestras se realizó la siguiente preparación de muestras. A 10 ml de muestra se le añadieron 40 ml de agua MilliQ y 50 m? de TCA (20 %) para diluir la muestra cinco veces (~ 1 mg/ml) y precipitar las proteínas. Después de 1 hora en hielo la muestra se centrifugó (10 minutos, 14000 rpm). El sedimento se lavó con 500 ml de acetona y se centrifugó (10 minutos, 14000 rpm). El sedimento se trató como se describe más adelante.
SDS-PAGE El sedimento se disolvió en 65 ml de agua MilliQ, 25 m? de tampón de muestra NuPAGE™ LDS (4x) de Invitrogen y 10 m? de agente reductor de muestra NuPAGE™ (lOx) de Invitrogen. Antes de la etapa de desnaturalización la muestra se diluyó 5 veces usando una mezcla de MilliQ; tampón de muestra NuPAGE™ LDS y 10 m? de reductor de muestra NuPAGE™ en la proporción 65:25:10. Después de la mezcla, las muestras se incubaron en una mezcladora térmica durante 10 minutos a 70 °C. Las soluciones de muestra se aplicaron en un gel Bis-Tris al 4-12 % (NuPAGE™ BisTris, Invitrogen). Se aplicó también una muestra (10 m?) de marcador M12 (Invitrogen) sobre el gel. El gel se corrió a 200 V durante 50 minutos, usando XCELL Surelock, con 600 mi de tampón SDS diluido 20 x en la cámara de tampón externa y 200 mi de tampón SDS diluido 20 x que contenía 0,5 mi de antioxidante (NuPAGE™ Invitrogen) en la cámara de tampón interna. Después del corrido, el gel se enjuagó dos veces con agua desmineralizada y los geles se fijaron con 50 % metanol/solución al 7 % de ácido acético durante una hora y se tiñeron con Sypro Ruby (50 mi por gel) durante una noche. Se formó una imagen usando Typhoon 9200 (610 BP 30, Verde (532 nm), PMT 600V, 100 micrómetros) después de lavar el gel con el agua MilliQ.
Análisis cuantitativo de la proteina Usando el escáner Typhoon se determinó la relación entre bandas de proteina dentro de un carril usando métodos convencionales conocidos en la téenica. La muestra se aplicó por triplicado y los valores en gris se determinaron usando el programa Image quant. Los valores se expresan como % relativo de proteina a proteina total, calculados usando el valor en gris de la proteina seleccionada de la banda relativa al valor en gris total de todas las bandas de proteina.
Cálculo de conversión de glucano: % de conversión de glucano (%) = (glucosa (g/1) x 100 %) / (glucano (fracción sobre DM) x dm (g/kg) x 1,1) en que: glucosa (g/1) = concentración de glucosa en el sobrenadante después de la hidrólisis. glucano (fracción sobre d ) = contenido de glucano sobre el sustrato antes del pretratamiento. dm (g/kg) = materia seca de la hidrólisis (f.i.20 % dm = 200 g/kg). 1,1 = aumento de peso debido a la incorporación de agua durante la hidrólisis.
Ejemplo de cálculo: Glucosa = 60 g/1 fracción de glucano = 0,40 (es un 40 % sobre materia seca) dm = 200 g/kg ejemplo de conversión de glucano = (60*100) / (0,4 x 200 x 1,1) = 68 % de conversión Ejemplo 1 Evaluación del efecto del efecto de la ausencia de oxigeno durante la hidrólisis en la actividad celulolitica de cócteles de enzima celulasa El efecto de ausencia de oxigeno durante la hidrólisis sobre la actividad celulolitica de tres cócteles de enzima diferentes se evaluó de acuerdo con los procedimientos descritos más adelante. Las reacciones de hidrólisis se realizaron con una materia prima de rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) a una concentración final del 10 % p/p de DM. Esta solución de materia prima se preparó por dilución de una solución de materia prima concentrada con agua. Posteriormente, el pH se ajustó a un pH de 4,5 con una solución 4 M de NaOH. La eliminación de oxigeno de la materia prima se consiguió en dos etapas. En primer lugar, la solución de materia prima se desgasificó por sonicación al vacio en un baño de sonicación (Bransonic 5510E-DTH, ajuste; Degas) durante 15 minutos. En la segunda etapa, el oxígeno se retiró adicionalmente por rociado continuo de un flujo de nitrógeno a través de una solución de 500 mi de la materia prima al 10 % de DM durante un periodo de 3 horas. Antes de rociarlo a través de la solución de materia prima, el flujo de nitrógeno se roció a través de agua para saturarlo con vapor de agua y evitar la evaporación del agua de la solución de materia prima. En paralelo, 500 mi del mismo lote al 10 % p/p de DM de aCS se roció con aire como una muestra de control que contiene oxígeno en un montaje similar de acuerdo con el mismo protocolo.
La hidrólisis de las soluciones de materia prima de aCS al 10 % p/p agotadas en oxigeno (rociadas con nitrógeno) y saturadas en oxígeno (rociadas con aire) se realizaron en frascos de centrífuga de 30 mi herméticos al aire (Nalgene Oakridge) en un volumen de reacción total de 10 mi. Los frascos, que ya contenía la solución de celulasa, usados para el experimento agotado en oxígeno se rociaron con nitrógeno antes de y durante el llenado de los mismos con la materia prima. Cada hidrólisis se realizó por duplicado con 7,5 mg/g de cóctel de la enzima celulasa DM añadida en un volumen total no mayor de 375 ml. Los tres cócteles de enzima celulasa ensayados incluían: una mezcla TEC-210 (mezcla de celulasas), una mezcla 4E-GH61 (que consiste en 9 % p/p de proteína total BG, 30 % p/p de proteína total CBHI, 25 % p/p de proteína total CBHII y 36 % p/p de proteína total GH61) y una mezcla 4E-EG (que consiste en 9 % p/p de proteína total BG, 30 % p/p de proteína total CBHI, 25 % p/p de proteina total CBHII y 36 % p/p de proteína total EG). La TEC-210 se fermentó de acuerdo con los procedimientos de inoculación y fermentación descritos en el documento W02011/000949. Se usó la mezcla 4E (como se describe en el documento WO2011/098577).
Los frascos de centrífuga que contenían la materia prima y la solución de enzima se colocaron en un horno-incubadora (horno de hibridación Techne HB-ID) y se incubaron durante 72 horas a 65 °C mientras se hacían girar en el punto de ajuste 3 (12 rpm por minuto). Después de la hidrólisis, las muestras se enfriaron en hielo e inmediatamente 50 ml de cada sobrenadante se diluyó en 1450 m? de agua de calidad I. El sobrenadante diluido posteriormente se filtró (filtro de 0,45 micrómetros, Pall PN 454) y los filtrados se analizaron para el contenido de azúcar como se describe más adelante.
Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas se midieron usando un equipo de HPLC equipado con una columna Aminex HPX-87P (Biorad N° 1250098) por elución con agua a 85 °C a un caudal de 0,6 mi por minuto y se cuantificó por integración de las señales de glucosa a partir de la detección del indice de refracción (R.I.) calibrado con soluciones patrón de glucosa.
Los datos presentados en la Tabla 1/Figura 1 muestran que la glucosa liberada de las materias primas rociadas con nitrógeno es menor que la glucosa liberada de las materias primas rociadas con aire, tanto para incubaciones de la mezcla TEC-210 como de la mezcla 4E-GH61. No hay diferencia detectable en la liberación de glucosa entre las materias primas rociadas con nitrógeno y aire para las muestras hidrolizadas por la mezcla 4E-EG.
Basándose en estos resultados se concluye que la presencia de oxigeno mejora el rendimiento celulolitico de las mezclas de celulasa que contienen enzimas GH61.
Tabla 1: El efecto de rociar nitrógeno o aire a través de una materia prima de aCS al 10 % antes de la hidrólisis, sobre la cantidad total de glucosa liberada por tres mezclas de celulasa diferentes.
Ejemplo 2 El efecto del oxigeno sobre la actividad celulolitica de cócteles de enzima celulasa durante la hidrólisis de materias primas lignocelulósicas En este ejemplo se muestra el efecto del oxigeno sobre la actividad celulolitica del cóctel enzimático durante la hidrólisis de la materia prima lignocelulósica. Las reacciones de hidrólisis se realizan con una materia prima de rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) a una concentración final del 20 % p/p de DM. Esta solución de materia prima se prepara por dilución de una solución de materia prima concentrada con agua. Posteriormente el pH se ajusta a pH 4,5 con una solución de NH4OH al 10 % (p/p).
La hidrólisis se realiza en un reactor agitado de pH controlado y temperatura controlada con un volumen de trabajo de 11 . Cada hidrólisis se realiza por duplicado con 2,5 mg/g del cóctel de enzima celulasa DM TEC-210. La TEC-210 se produjo de acuerdo con los procedimientos de inoculación y fermentación descritos en el documento W02011/000949.
Se realizan los siguientes experimentos: 1.1 1 de aCS al 20 %, pH 4.5, temperatura 62 °C, velocidad del agitador 60 rpm (esto corresponde a un nivel de DO de < 0,002 mol de oxigeno por m3), 2,5 mg/g de dm del cóctel celulasa TEC-210, tiempo de incubación 120 horas (experimento de referencia). 2. Como el experimento 1 pero al comienzo de la hidrólisis, el rociado de aire en la solución empezó a un nivel de oxigeno disuelto del 20 % (esto corresponde a 0,03 mol de oxigeno por m3, medido usando un electrodo de DO (oxigeno disuelto). Este nivel de oxigeno disuelto se mantiene durante el resto del proceso de hidrólisis. 3. Como el experimento 1 pero a las 72 horas se rocía aire en la solución que empieza a un nivel de oxígeno disuelto del 20 % (esto corresponde a 0,03 mol de oxígeno por m3, medido usando un electrodo de DO (oxígeno disuelto). Este nivel de oxígeno disuelto se mantiene durante el resto del proceso de hidrólisis.
Después de la hidrólisis, las muestras se enfrían en hielo e inmediatamente 50 ml de cada sobrenadante se diluye en 1450 ml de agua de calidad I. El sobrenadante diluido posteriormente se filtra (filtro de 0,45 m , Pall PN 454) y los filtrados se analizan para el contenido de azúcar como se describe más adelante.
Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas se miden usando un equipo de HPLC equipado con una columna A inex HPX-87P (Biorad N° 1250098) por elución con agua a 85 °C a un caudal de 0,6 mi por minuto y se cuantificó por integración de las señales de glucosa a partir de la detección del indice de refracción (R.I.) calibrado con soluciones patrón de glucosa.
Los resultados, visibles en la Figura 2, muestran claramente una producción de glucosa aumentada en el caso de que se añada aire. Además, el aire añadido a la reacción de hidrólisis en la segunda parte del tiempo demuestra una producción de glucosa superior en comparación con la no adición de aire o una adición de aire durante toda la etapa de hidrólisis.
Ejemplo 3 El efecto de la aireación parcial (en el tiempo) sobre la hidrólisis enzimática de la materia prima lignocelulósica a escala piloto En este ejemplo se muestra el efecto de la concentración de oxigeno disuelto sobre la actividad celulolitica del cóctel o composición de enzima durante la hidrólisis de materia prima lignocelulósica a escala piloto. Las reacciones de hidrólisis se realizan con una materia prima de rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) a una concentración final del 17,1 % p/p de DM. La solución de materia prima se prepara mediante la dilución de una suspensión de materia prima concentrada con agua. El pH se ajusta a pH 4,5 con una solución de NH4OH al 25 % (p/p).
La hidrólisis enzimática se realiza en un reactor a escala piloto de 270 litros que tiene pH y temperatura controlados, con un volumen de trabajo de 150 litros. El oxigeno disuelto durante el proceso se controla ajustando la velocidad del impulsor a un flujo de aire y sobrepresión dados. La hidrólisis enzimática se realiza a una dosificación de 2,5 g (proteina TCA)/g de cóctel enzimático de celulasa dm TEC-210. La TEC-210 se produjo de acuerdo con los procedimientos de inoculación y fermentación descritos en el documento W02011/000949.
Se realizan los siguientes experimentos: Experimento 1 Aireación de 0 a 120 horas: 150 1 de pCS al 17,1 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, 1 bar de sobrepresión, flujo de aire 10 kg/h en el espacio de cabeza, 2,5 mg de TCA/g de cóctel de celulasa dm TEC-210, tiempo de incubación 120 horas en un reactor a escala piloto de 270 litros. La concentración de oxigeno disuelto (DO) de la mezcla de reacción se midió constantemente usando un electrodo de DO. El DO se controló a un nivel de 0,15-0,22 mol/m3 ajustando la velocidad del impulsor .
Experimento 2 Aireación entre 72 y 120 horas: 1501 de pCS al 17,1 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, una dosificación de enzima de 2,5 mg TCA/g de cóctel de celulasa dm TEC-210 y un tiempo de incubación total de 120 horas en un reactor a escala piloto de 270 litros. La concentración de oxigeno disuelto (DO) de la mezcla de reacción se midió constantemente usando un electrodo de DO. Durante las primeras 72 horas del proceso se aplicaron los siguientes ajustes: sin sobrepresión, sin flujo de aire en el espacio de cabeza y el DO se controla a un nivel de [0,02-0,05] mol/m3 ajustando la velocidad del impulsor. Durante las últimas 48 horas del proceso se aplicaron los siguientes ajustes: una sobrepresión de 1 bar, un flujo de aire de 10 kg/h en el espacio de cabeza y el DO se controló a un nivel de 0,15-0,22 mol/m3 ajustando la velocidad del impulsor.
Durante la hidrólisis enzimática se tomaron muestras diariamente para análisis de carbohidratos (glucosa, celobiosa) por RMN y medición de viscosidad y pH.
El análisis de composición del rastrojo de maíz se realizó por hidrólisis química de la muestra y determinación de los monosacáridos por RMN.
Las muestras tomadas durante la hidrólisis enzimática se analizaron para (oligo) azúcares, ácidos orgánicos e inhibidores por RMN de flujo.
Los resultados se presentan en la Figura 4 y muestran que, durante la hidrólisis enzimática, en el experimento 2 con la aireación parcial (? = aireación entre tiempo de hidrólisis es 72 y 120 horas) se produce más glucosa que durante la hidrólisis enzimática en el experimento 1 (¦ = aireación entre tiempo de hidrólisis es 0 y 120 horas).
Ejemplo 4 El efecto de la temporización del suministro de oxigeno disuelto sobre la hidrólisis enzimática de la materia prima lignocelulósica En este ejemplo se muestra el efecto de la temporización del suministro de oxigeno disuelto sobre la hidrólisis enzimática de la materia prima lignocelulósica. Las reacciones de hidrólisis se realizan con una materia prima de rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) a una concentración final de 20 % p/p de DM. La solución de materia prima se prepara por dilución de la suspensión de materia prima concentrada con agua. El pH se ajusta a pH 4,5 con una solución de NH4OH al 25 % (p/p)· La hidrólisis enzimática se realiza en un reactor de 2 litros que tiene pH y temperatura controlados, con un volumen de trabajo de 1 litro. El oxigeno disuelto durante el proceso se controla ajustando la velocidad del impulsor y el refrescado continuó del espacio de cabeza con aire fresco en el caso de una concentración de oxigeno disuelto aumentada. La hidrólisis enzimática realiza a una dosificación de 1,5 g (proteina TCA)/g de cóctel enzimático de celulasa dm TEC-210. La TEC-210 se produjo de acuerdo con los procedimientos de inoculación y fermentación descritos en el documento WO2011/000949.
Se realizan los siguientes experimentos: Experimento 1. Aireación de 0 a 7 horas: 1 1 de pCS al 20 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, 1,5 mg de TCA/g de cóctel de celulasa dm TEC-210, tiempo de incubación 120 horas. La concentración de oxigeno disuelto (DO) de la mezcla de reacción se midió constantemente usando un electrodo de DO. El DO se controló a un nivel de > 0,05 mol/m3 durante las 7 primeras horas del proceso de hidrólisis. Entre las 7 y 120 horas del tiempo de hidrólisis el DO se mantuvo a un nivel < 0,02 mol/m3.
Experimento 2. Aireación entre 72 y 120 horas: 11 de pCS al 20 %, pH 4,5, temperatura 62 °C, 1,5 mg de TCA/g de cóctel de celulasa dm TEC-210, tiempo de incubación 120 horas. La concentración de oxigeno disuelto (DO) de la mezcla de reacción se midió constantemente usando un electrodo de DO.
El DO se controló a un nivel de < 0,01 mol/m3 durante las primeras 72 horas del proceso de hidrólisis. Entre 72 y 120 horas del tiempo de hidrólisis el DO se mantuvo a un nivel > 0,05 mol/m3.
Durante la hidrólisis enzimática, se tomaron muestras diariamente para el análisis de carbohidrato (glucosa, celobiosa) por RMN y medición de viscosidad y pH.
El análisis de la composición del rastrojo de maíz pretratado se realizó por hidrólisis química de la muestra y determinación de los monosacáridos por RMN.
Los resultados se presentan en la Tabla 5 y demuestran claramente un aumento en la velocidad de formación de glucosa cuando se airea la mezcla de reacción. El experimento 1, que se aireó entre las 0 y 7 horas, claramente muestra una velocidad de formación de glucosa aumentada durante las 7 primeras horas del proceso en comparación con la situación no aireada durante esa fase del proceso del Experimento 2. Además, el Experimento 2 demuestra un aumento en la velocidad de formación de glucosa entre 72 y 120 horas en comparación con la situación no aireada durante ese periodo en el Experimento 1.

Claims (16)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1.- Proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material lignocelulósico, que comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratamiento del material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavado del material lignocelulósico opcionalmente pretratado; c) hidrólisis enzimática del material lignocelulósico opcionalmente lavado y/u opcionalmente pretratado usando una composición de enzima que comprende al menos dos celulasas y con lo que la composición de enzima comprende al menos GH61; y d) opcionalmente, recuperación de un producto de azúcar; caracterizado por que durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, se añade oxigeno al material lignocelulósico y durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática se añade menos oxigeno al material lignocelulósico en comparación con la otra parte de tiempo de la hidrólisis enzimática, preferentemente no se añade oxigeno al material lignocelulosico.
2.- Proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material lignocelulósico gue comprende las siguientes etapas: a) opcionalmente, pretratamiento del material lignocelulósico; b) opcionalmente, lavado del material lignocelulósico opcionalmente pretratado; c) hidrólisis enzimática del material lignocelulósico opcionalmente lavado y/u opcionalmente pretratado usando una composición de enzima que comprende al menos dos celulasas y con lo que la composición de enzima comprende al menos GH61; d) fermentación del material lignocelulósico hidrolizado para producir un producto de fermentación; y e) opcionalmente, recuperación de un producto de fermentación; caracterizado por que durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, se añade oxigeno al material lignocelulósico y durante parte del tiempo de la hidrólisis enzimática se añade menos oxigeno al material lignocelulósico en comparación con la otra parte del tiempo de la hidrólisis enzimática, preferentemente no se añade oxígeno al material lignocelulósico.
3.- Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la parte del tiempo en que se añade menos o preferentemente nada de oxígeno es del 10 al 80 %, preferentemente del 20 al 80 %, más preferentemente del 30 al 80 % y lo más preferentemente del 40 al 80 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total.
4.- Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la parte del tiempo en que se añade más oxígeno es del 2 al 80 %, preferentemente del 4 al 60 %, más preferentemente del 8 al 50 % y lo más preferentemente del 10 al 50 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total.
5.- Proceso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el tiempo en que se añade más oxígeno es a) del 12 al 50 %, y preferentemente del 20 al 40 % cuando el oxígeno se añade en la segunda mitad del tiempo de la hidrólisis enzimática; b) del 2 al 30 %, preferentemente del 4 al 25 % y más preferentemente del 5 al 20 % del tiempo de la hidrólisis enzimática total cuando el oxigeno se añade en la primera mitad del tiempo de la hidrólisis enzimática; o c) o una combinación de a y b.
6.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la concentración de oxigeno en la fase liquida de la hidrólisis durante la parte del tiempo en que se añade oxigeno es al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, más preferentemente al menos 10 veces la concentración de oxigeno en la fase liquida durante la parte del tiempo en que se añade menos o nada de oxigeno.
7.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que en la parte del tiempo cuando se añade el oxigeno, la concentración de oxigeno en la fase liquida, caracterizada por que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, es al menos 0,001 mol/m3, preferentemente al 0 menos 0,002 mol/m3 y lo más preferentemente al menos 0,003 mol/m3, o caracterizado por que en la parte del tiempo cuando se añade el oxigeno, la concentración de oxigeno en la fase liquida, caracterizada por que el material lignocelulósico está presente durante la hidrólisis enzimática, es como máximo 0,12, preferentemente como máximo 0,09 mol/m3, aún más preferentemente como máximo 0,06 mol/m3, todavía más preferentemente al menos 0,045 mol/m3 y lo más preferentemente como máximo 0,03 mol/m3.
8.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el oxígeno se añade en forma de burbujas.
9.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el reactor para la hidrólisis enzimática tiene un volumen de 1 m3 o mayor.
10.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que el tiempo de hidrólisis enzimática es de 5 a 150 horas.
11.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la composición de enzima usada retiene su actividad durante 30 horas o más.
12.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que la hidrólisis se realiza a una temperatura de 45 °C o mayor, preferentemente a una temperatura de 50 °C o mayor y más preferentemente a una temperatura de 55 °C o mayor.
13.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que la composición de enzima se deriva de un hongo, preferentemente un microorganismo del género Rasamsonia o la composición de enzima comprende una enzima fúngica, preferentemente una enzima de Rasamsonia .
14.- Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que el contenido de materia seca en la etapa de hidrólisis c) es del 10 % en peso o mayor, preferentemente del 14 % en peso o mayor y aún más preferentemente del 14 al 33 % en peso.
15.- Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en el que la hidrólisis enzimática tiene lugar en un reactor de cultivo discontinuo, de alimentación por lotes y/o continuo.
16.- Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que se introduce oxigeno como un gas que contiene oxigeno tal como aire.
MX2015005631A 2012-11-09 2013-11-07 Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares. MX360283B (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12191957 2012-11-09
EP13174656 2013-07-02
EP13176083 2013-07-11
EP13176500 2013-07-15
EP13184702 2013-09-17
EP13184701 2013-09-17
PCT/EP2013/073253 WO2014072393A1 (en) 2012-11-09 2013-11-07 Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2015005631A true MX2015005631A (es) 2015-08-14
MX360283B MX360283B (es) 2018-10-25

Family

ID=49554250

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2015005628A MX360067B (es) 2012-11-09 2013-11-07 Proceso para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
MX2015005631A MX360283B (es) 2012-11-09 2013-11-07 Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.
MX2018012714A MX2018012714A (es) 2012-11-09 2015-05-04 Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2015005628A MX360067B (es) 2012-11-09 2013-11-07 Proceso para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2018012714A MX2018012714A (es) 2012-11-09 2015-05-04 Proceso para hidrolisis enzimatica de material lignocelulosico y fermentacion de azucares.

Country Status (23)

Country Link
US (7) US9982280B2 (es)
EP (4) EP3613860B1 (es)
JP (3) JP6396307B2 (es)
KR (2) KR102104152B1 (es)
CN (3) CN104769117A (es)
AU (4) AU2013343597B2 (es)
BR (3) BR112015004163A2 (es)
CA (2) CA2888170C (es)
DK (3) DK2917354T3 (es)
EA (2) EA028880B9 (es)
ES (2) ES2761448T3 (es)
FI (1) FI3613860T3 (es)
HR (2) HRP20191960T1 (es)
HU (3) HUE064894T2 (es)
IN (2) IN2015DN03027A (es)
LT (1) LT3613860T (es)
MX (3) MX360067B (es)
MY (2) MY176707A (es)
PL (2) PL2917355T3 (es)
RS (1) RS65279B1 (es)
SI (1) SI3613860T1 (es)
UA (2) UA117357C2 (es)
WO (2) WO2014072395A1 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA117357C2 (uk) 2012-11-09 2018-07-25 Дсм Айпі Асетс Б.В. Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу
MX366745B (es) 2012-11-09 2019-07-23 Dsm Ip Assets Bv Proceso para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
CN105074001A (zh) 2013-02-21 2015-11-18 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
WO2015004098A1 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112016009619B1 (pt) 2013-11-01 2022-11-16 Novozymes A/S Métodos para sacarificar um material celulósico e para produzir um produto de fermentação a partir de material celulósico
BR112016021866A2 (pt) 2014-04-03 2018-07-03 Dsm Ip Assets B.V. processo e aparelho para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
AU2015254649B2 (en) 2014-04-30 2018-11-01 Versalis S.P.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2015175308A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Danisco Us Inc. Improved enzymatic hydrolysis of biomass
WO2016029107A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Novozymes A/S Process for saccharifying cellulosic material under oxygen addition
MY195095A (en) 2014-12-19 2023-01-10 Dsm Ip Assets Bv Process for Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Material And Fermentation Of Sugars
DK3250698T3 (da) 2015-01-28 2020-02-24 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til enzymatisk hydrolyse af lignocellulosemateriale og fermentering af sukker
HRP20220771T1 (hr) * 2015-01-28 2022-09-16 Dsm Ip Assets B.V. Postupak enzimske hidrolize lignoceluloznog materijala i fermentacije šećera
WO2016207147A1 (en) * 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3458596A1 (en) 2016-05-20 2019-03-27 POET Research, Inc. Methods of removing one or more compounds from a lignocellulosic hydrolysate via gas stripping, and related systems
EP3545100A1 (en) * 2016-11-24 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
FI3695001T3 (fi) * 2017-10-09 2024-02-14 Versalis Spa Menetelmä lignoselluloosamateriaalin entsymaattista hydrolyysiä ja sokerien fermentointia varten
CA3080746A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Poet Research, Inc. Methods for propagating microorganisms for fermentation & related methods & systems
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
JP7374991B2 (ja) 2018-08-15 2023-11-07 ケンブリッジ グリコサイエンス エルティーディー 新規組成物、それらの使用、およびそれらの形成方法
FR3087449A1 (fr) 2018-10-19 2020-04-24 Afyren Procede de preparation de molecules organiques par fermentation anaerobie
EP3924499A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Borregaard AS Chemically modified lignin as reducing agent for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
EP4013240A1 (en) 2019-08-16 2022-06-22 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
BR112022011603A2 (pt) 2019-12-12 2022-08-30 Cambridge Glycoscience Ltd Produtos alimentícios multifase com baixo teor de açúcar

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3105581C2 (de) 1981-02-16 1985-05-15 Otto Dr. 2300 Kiel Moebus Verfahren zur Fermentation von Kohlenhydraten unter Erzeugung von Äthanol und Biomasse
KR930701654A (ko) 1991-04-18 1993-06-12 리차드 지. 바커 고 경점도 산소 탈리그닌화를 제공하기 위해 펄프에 알칼리를 첨가하는 방법
FR2694768B1 (fr) 1992-07-30 1994-12-23 Pasteur Institut Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés.
US5865898A (en) * 1992-08-06 1999-02-02 The Texas A&M University System Methods of biomass pretreatment
CA2400336C (en) 2000-02-17 2010-04-27 Forskningscenter Riso A method for processing lignocellulosic material
MXPA02012324A (es) 2000-06-26 2004-09-10 Univ Florida Metodos y composiciones para la sacarificacion y fermentacion simultaneas.
US7034062B2 (en) 2001-05-25 2006-04-25 BP Exploration Operatiing Company Limited Fischer-tropsch process
US8580541B2 (en) 2003-03-19 2013-11-12 The Trustees Of Dartmouth College Lignin blockers and uses thereof
HUE051490T2 (hu) 2004-03-25 2021-03-01 Novozymes Inc Eljárások növényi sejtfal-poliszacharidok lebontására vagy átalakítására
AP2701A (en) 2004-11-29 2013-07-23 Elsam Engineering As Enzymatic hydrolysis of biomasses having a high dry matter (DM) content
RU2441912C2 (ru) 2005-09-30 2012-02-10 Новозаймз, Инк. Способы усиления деградации или превращения целлюлозного материала
IES20060090A2 (en) 2006-02-10 2007-06-13 Nat Univ Ireland Talaromyces emersonii enzyme systems
US8968515B2 (en) 2006-05-01 2015-03-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for pretreating biomass
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
AU2007302867B2 (en) 2006-10-02 2013-11-07 Dsm Ip Assets B.V. Metabolic engineering of arabinose-fermenting yeast cells
WO2008151079A2 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Novozymes, Inc. Compositions for degrading cellulosic material
JP5731194B2 (ja) 2007-06-27 2015-06-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 発酵製品を生産するための方法
US8980599B2 (en) 2007-08-02 2015-03-17 Iogen Energy Corporation Method for the production of alcohol from a pretreated lignocellulosic feedstock
AU2008310246A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Mascoma Canada Inc. Two-stage enzymatic hydrolysis process for treating lignocellulosic materials
US20090098617A1 (en) 2007-10-10 2009-04-16 Murray Burke Enzymatic treatment under vacuum of lignocellulosic materials
MX2010004518A (es) 2007-10-25 2010-07-29 Landmark Structures I Lp Sistema y metodo para la digestion anaerobica de biomasas.
CA2709490A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20110201084A1 (en) 2008-07-25 2011-08-18 The Regents Of The University Of California Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass through enhanced removal of oligomers
EP2313514B1 (en) 2008-08-11 2016-11-16 DSM IP Assets B.V. Degradation of lignocellulosic material
US8337663B2 (en) 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material
EP2435561B1 (en) 2009-05-29 2018-08-08 Novozymes Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
AU2010267983A1 (en) * 2009-07-03 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Talaromyces strains and enzyme compositions
MX341469B (es) 2009-10-08 2016-08-19 Dsm Ip Assets B V * Proceso para la hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
BR112012020802A2 (pt) 2010-02-11 2015-09-15 Dsm Ip Assets Bv célula hospedeira capaz de produzir enzimas úteis para degradação de material lignocelulósico
CN102191299A (zh) 2010-03-10 2011-09-21 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 多步酶解提高木质纤维素糖化得率的方法
DK2601302T3 (da) 2010-08-06 2021-01-04 Novozymes Inc Fremgangsmåder til nedbrydning eller hydrolyse af et polysaccharid
EP2635689B1 (en) 2010-11-02 2015-04-15 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
EP2689011B1 (en) 2011-03-25 2017-10-25 Novozymes A/S Method for degrading or converting cellulosic material
CA2834061A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Mian Li Use of cellulase and glucoamylase to improve ethanol yields from fermentation
WO2013028701A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
MX366745B (es) 2012-11-09 2019-07-23 Dsm Ip Assets Bv Proceso para hidrólisis enzimática de material lignocelulósico y fermentación de azúcares.
UA117357C2 (uk) 2012-11-09 2018-07-25 Дсм Айпі Асетс Б.В. Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу
WO2014072392A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN105074001A (zh) 2013-02-21 2015-11-18 诺维信公司 糖化和发酵纤维素材料的方法
BR112016021866A2 (pt) 2014-04-03 2018-07-03 Dsm Ip Assets B.V. processo e aparelho para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
AU2015254649B2 (en) 2014-04-30 2018-11-01 Versalis S.P.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
MY195095A (en) 2014-12-19 2023-01-10 Dsm Ip Assets Bv Process for Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Material And Fermentation Of Sugars

Also Published As

Publication number Publication date
EP3656866A1 (en) 2020-05-27
PL2917355T3 (pl) 2020-04-30
US20150299749A1 (en) 2015-10-22
CA2888333A1 (en) 2014-05-15
JP6690085B2 (ja) 2020-04-28
SI3613860T1 (sl) 2024-03-29
AU2013343595B2 (en) 2017-06-22
EP2917355A1 (en) 2015-09-16
JP6396307B2 (ja) 2018-09-26
CA2888333C (en) 2023-01-24
US20190032093A1 (en) 2019-01-31
EA028880B9 (ru) 2018-05-31
WO2014072395A1 (en) 2014-05-15
US11434508B2 (en) 2022-09-06
US10717995B2 (en) 2020-07-21
JP2015534829A (ja) 2015-12-07
US9982280B2 (en) 2018-05-29
EP3613860A1 (en) 2020-02-26
KR20150082276A (ko) 2015-07-15
JP2016501012A (ja) 2016-01-18
DK2917355T3 (da) 2020-01-20
UA116789C2 (uk) 2018-05-10
IN2015DN03027A (es) 2015-10-02
HUE047092T2 (hu) 2020-04-28
US20180208949A1 (en) 2018-07-26
ES2761448T3 (es) 2020-05-19
FI3613860T3 (fi) 2024-02-01
MY176707A (en) 2020-08-19
JP6429155B2 (ja) 2018-11-28
US20180237804A1 (en) 2018-08-23
CN104769116A (zh) 2015-07-08
JP2019010108A (ja) 2019-01-24
KR102104151B1 (ko) 2020-04-24
MX2015005628A (es) 2015-09-04
MX2018012714A (es) 2021-11-16
MY169456A (en) 2019-04-11
RS65279B1 (sr) 2024-03-29
AU2017206241A1 (en) 2017-08-10
HRP20191960T1 (hr) 2020-02-07
IN2015DN03084A (es) 2015-10-02
US20150307903A1 (en) 2015-10-29
KR20150082275A (ko) 2015-07-15
US20200224223A1 (en) 2020-07-16
EP2917355B1 (en) 2019-10-23
AU2013343595A1 (en) 2015-04-30
ES2773953T3 (es) 2020-07-15
AU2013343597B2 (en) 2017-06-22
AU2013343597A1 (en) 2015-04-30
HUE064894T2 (hu) 2024-04-28
CN104769117A (zh) 2015-07-08
US11434507B2 (en) 2022-09-06
PL3613860T3 (pl) 2024-04-08
MX360067B (es) 2018-10-22
EA028880B1 (ru) 2018-01-31
US20200248209A1 (en) 2020-08-06
US9957528B2 (en) 2018-05-01
EA201500510A1 (ru) 2015-09-30
EA032496B1 (ru) 2019-06-28
EP2917354B1 (en) 2020-01-15
CA2888170A1 (en) 2014-05-15
AU2017206278A1 (en) 2017-08-10
KR102104152B1 (ko) 2020-04-24
DK2917354T3 (da) 2020-04-06
WO2014072393A1 (en) 2014-05-15
EP3613860B1 (en) 2023-12-27
US10131923B2 (en) 2018-11-20
BR112015004163A2 (pt) 2015-10-06
BR122016020119B1 (pt) 2022-04-12
CA2888170C (en) 2021-04-13
CN112813119A (zh) 2021-05-18
DK3613860T3 (da) 2024-02-19
EP2917354A1 (en) 2015-09-16
US10724057B2 (en) 2020-07-28
EA201500516A1 (ru) 2015-08-31
HRP20200092T1 (hr) 2020-04-03
MX360283B (es) 2018-10-25
BR112015004344A2 (pt) 2015-09-22
HUE048887T2 (hu) 2020-08-28
LT3613860T (lt) 2024-01-25
UA117357C2 (uk) 2018-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11434508B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11427844B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2014072394A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration