CN102712893A

CN102712893A - Talaromyces菌株和酶组合物

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Publication number: CN102712893A
Application number: CN2010800298858A
Authority: CN
Inventors: 约翰·B·伯金斯; 曼杰·库马尔; 马格雷塔·佛雷德瑞奇·金·兹尔·范; 阿德里安努斯·维尔赫穆斯·赫曼努斯·沃勒布里吉特; 帕那吉帝斯·萨拉帝诺普罗斯
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-10-03
Also published as: EP2449087A1; EP2896686A1; EA021855B1; AU2010267983A1; WO2011000949A1; EA201200091A1; US20120114797A1; CA2765691A1; MX2011013700A; BR112012000078A2

Abstract

本发明涉及Talaromyces菌株。本发明还涉及可通过Talaromyces菌株生产的酶组合物。另外，本发明涉及使用酶组合物从木质纤维素材料生产有用产品的方法。

Description

Talaromyces菌株和酶组合物

发明领域

本发明涉及具有经改进的纤维素酶生产的Talaromyces菌株和突变体。本发明还涉及可由Talaromyces菌株生产的酶组合物。另外，本发明涉及使用酶组合物由(木质)纤维素材料生产有用的产品的方法。

发明背景

碳水化合物组成地球上最丰量的有机化合物。然而，该碳水化合物中许多隐蔽(sequestered)在复杂聚合物中，包括淀粉(种子和谷物中的主要储存碳水化合物)和已知为木质纤维素的碳水化合物与木质素的集合。木质纤维素的主要碳水化合物组分是纤维素、半纤维素和果胶。这些复杂的聚合物通常被统称为木质纤维素。

从由于OPEC减少石油输出而导致石油危机爆发的70年代开始，可再生的木质纤维素生物质成为可发酵的糖的生物转化吸引了研究人员强烈的注意力，所述可发酵的糖随后被发酵产生醇(例如乙醇)，作为液体燃料的替代品。在过去二十年间，乙醇已被广泛使用，在美国作为与汽油的10％的掺合物，或在巴西作为车辆的纯燃料。更最近实现了E85(85％乙醇掺合物)的使用，特别是用于清洁城市应用。燃料生物乙醇的重要性将会随着油价的提高及其来源的逐渐耗尽而提高。另外，可发酵的糖被用于生产塑料、聚合物和其他基于生物的产品，并且预期这一工业将大幅增长，从而提高了对丰量的低成本可发酵糖的需求，所述可发酵糖可以被用作原料来代替基于石油的原料。

这类大量碳水化合物在植物生物质中的隐蔽(sequestration)提供了糖(五碳糖以及六碳糖)形式的大量潜在的能量来源，所述糖能够被用于大量工业和农业过程。然而，这些碳水化合物的大量能源潜力目前利用不足，因为糖锁闭于复杂聚合物中并因此不容易进行发酵。由植物生物质生产糖的方法会提供大量的、经济上有竞争性的原料，用于发酵成化学品、塑料和燃料。

不论纤维素原料的种类，酶的成本和水解效率是限制生物质生物转化方法商业化的主要因素。微生物生产的酶的生产成本与产酶菌株的生产力和发酵液中最终的活性产率密切相关。

纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或βD-糖苷键)，导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等等的酶。

纤维素酶传统上被分为三个大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(″EG″)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(″CBH″)和β-葡糖苷酶([β]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(″BG″)。见例如Knowles et al.，TIBTECH5，255-261，1987；Shulein，Methods Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，而纤维二糖水解酶也能够降解微晶纤维素(Nevalainen and Penttila，Mycota，303-319，1995)。因此，纤维素酶体系中纤维二糖水解酶的存在是微晶纤维素的高效溶解所必需的(Suurnakki，et al.Cellulose 7：189-209，2000)。β-葡糖苷酶作用于从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡糖苷中释放D-葡萄糖(Freer，J.Biol.Chem.vol.268，no.13，pp.9337-9342，1993)。

纤维素酶已知由大量细菌、酵母和真菌生产。某些真菌生产能够降解晶体形式纤维素的完全纤维素酶体系，从而容易地通过发酵大量生产纤维素酶。丝状真菌发挥特殊的作用，因为许多酵母(例如Saccharomycescerevisiae)缺乏水解纤维素的能力。见例如Aubert et al.，1988；Wood et al.，Methods in Enzymology，vol.160，no.9，pp.87-116，1988和Coughlan，et al.，″Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic EnzymeSystems″Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp.11-301988。

真菌纤维素酶分类CBH、EG和BG可以进一步扩展至包括每种分类内的多种组件。例如，已从多种真菌来源中分离出多种CBH、EG和BG，所述真菌来源包括Trichoderma reesei，其含有两种CBH(即CBH I和CBH II)、至少8种EG(即EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII)和至少5种BG(即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5)的已知基因。

尽管过去几十年为了理解酶促木质纤维素生物质降解和纤维素酶生产而进行了持续的研究，但是仍然期望发现或者改造新的有高度活性的纤维素酶和半纤维素酶。还高度期望构建能够进行迅速和高效的木质纤维素材料生物降解的高效的酶组合物。

另外，目前可获得的具有纤维素酶活性的酶(典型地源自Trichoderma)在嗜温温度(mesophilic temperatures)如45℃到50℃下和pH 5.0下发挥功能。然而，这可导致降低产率的细菌感染，因此期望在65℃或更高的温度下进行糖化。另外，嗜温温度的使用提高了使用的生物质的粘度，从而限制了使用的干物质含量。另外，使用经酸预处理的生物质时，必须提高pH，使得酶能够糖化生物质中的糖。在商业可行的燃料乙醇工业的情形中，这意味着需要例如氢氧化钠或硫酸钙和生产大量相应的盐，例如在氢氧化钠情况下生产石膏(gypsum)。因此，期望使用能够在pH 4.0或更低的pH下工作的酶进行糖化。

发明内容

本发明提供了具有至少6FPU_2％/ml的经改进的纤维素水解活性的Talaromyces突变体菌株。根据本发明的突变体菌株显示良好的生长和良好的孢子形成(sporulation)。

本发明还涉及包含纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)的酶组合物，其中所述组合物包含40％或更多的CBH和20％或更多的EG。优选地，酶组合物具有至多60APU/ml的蛋白酶活性。

酶组合物可极度高效地将水解木质纤维素水解材料(例如玉米芯或小麦秸)水解成单体糖，所述单体糖可随后被转化成有用的产品，例如乙醇。

酶组合物可被用于进行木质纤维素底物的高效水解。这在从木质纤维素生物质生产有商业价值的燃料乙醇的情况下是高度显著的，因为会需要更少量的酶(与目前可用的产品相比)。

另外，所述水解可以在高温下进行，这(i)降低了细菌感染的风险，并且(ii)导致更不粘稠的生物质浆体。后者的效果是显著的，因为其使得能够更好地掺合酶，导致植物中更高的可加工的干物质，并允许因此实现更高的乙醇浓度。因此，需要使用更少的能量来提高可持续性(sustainability)，并且需要更少的发酵过程，从而需要更低的投资。

另外，所述水解可以在低pH下进行。这是期望的，因为通常用酸预处理生物质。如果随后用于糖化的酶能够在低pH下作用，则用这种方式预处理的生物质不需要进行pH调节。这意味着对例如氢氧化钠或硫酸钙的更低需要，和其中没有废弃盐的方法。这在例如要生产乙醇的方法中是意义重大的，因为在此类方法中要消耗巨大量的材料。这允许进行其中不需要pH调节的方法，即不需要添加酸或碱。因此，所述方法可以作为零废弃物方法进行和/或作为其中不需要无机化学品输入的方法来进行。

另外，还表明了使用高干物质含量时，酶组合物能够有效水解生物质。高度期望在例如燃料乙醇生产中使用的酶能够作用于具有高粘度的底物(即高干重组合物)，因为这允许实现更高量的终产物，例如燃料乙醇。

本发明还涉及使用酶组合物从木质纤维素材料生产有用的产品的方法。

附图概述

图1展示了Talaromyces emersonii菌株TEC-1A的不同菌落表型。A)TEC-1A；B)TEC-101，离生的(distinct)白色气生菌丝体(种群的80％)；C，TEC-102，减少的气生菌丝体(种群的20％)；TEC-104，无离生的气生菌丝体，棕色(种群的1％)。

图2展示了在具有TEC-1A菌株的不同菌落形态学变体的摇瓶中进行的进程试验(course experiment)的结果，所述变体使用Talaromyces培养基2培养。

图3展示了在第二摇瓶测试(Talaromyces培养基2)中TEC-101突变体的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)-诱导的纤维素酶生产突变体的表现。在pH4.5下于65℃使用未经稀释的上清液进行20小时小麦秸试验。提供了感兴趣的菌株的菌株ID。纤维素酶水平以每毫升的小麦秸单位(WSU/ml)为单位表示。红线指示出了来自亲本对照菌株TEC-101的纤维素酶生产水平。

图4展示了对摇瓶中的第三次筛选结果的概述。使用来自琼脂斜面的孢子，在46℃下、Talaromyces培养基2中进行96小时的发酵。TEC-101^*是比正常纤维素酶水平生产更高的自发突变体。在pH 4.5、65℃下进行20小时的小麦秸试验。蓝色的柱是未经稀释的样品；粉色的柱是四倍稀释的样品。橙色的柱是来自TEC-101亲本对照的纤维素酶生产水平，其是两个或三个摇瓶试验的均值。

图5展示了小麦秸转化的剂量应答。在摇瓶中测试的菌株：TEC-142(●)和TEC-101(◆)。纤维素酶活性以每毫升的小麦秸单位(WSU/ml)为单位表示。

图6展示了于46℃下、Talaromyces培养基2中生长4天的突变体摇瓶培养物的经稀释的上清液的剂量应答曲线，其在小麦秸试验中测定纤维素酶水平，并以每毫升的小麦秸单位(WSU/ml)为单位表示。

图7展示了使用经预处理的、洗涤的小麦秸的剂量应答同时糖化发酵(SSF)试验中，Filtrase

NL(◆)和TEC-142(●)的上清液的乙醇产率比较。TEC-142在10升分批发酵中生长96小时。乙醇生产被表示为由经预处理的小麦秸的48.5％葡聚糖纤维含量(NREL)生产的乙醇的最大理论产率的百分比，其在y轴上被标记为“最大理论乙醇产率(％)”。

图8展示了葡萄糖去阻抑的酶突变体TEC-165相对于其葡萄糖去阻抑的亲本TEC-147的生长比较。将孢子溶液(10⁷/ml)点涂在TEC培养基上，并于40℃下生长3-4天。菌落的大小指示出了生长的程度。

图9展示了分别使用荧光底物4-甲基伞花基-β-D-纤维二糖糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside，MUC)或4-甲基伞花基-β-D-葡萄糖(MUG)的，TEC-165与TEC-101相比的CBH I+II和β-葡糖苷酶活性的比较。将每种菌株的孢子溶液(10⁷/ml)在含有0.1mM MUC或MUG、含或不含2％葡萄糖的一式两份的TEC培养基上划线培养单个菌落。将平板在40℃下孵育1-2天。在UV光(366nm)下对平板拍照。琼脂平板的亮区域是真菌生长生产的纤维素酶将底物水解引起的荧光(蓝)信号；荧光信号的大小和强度指示出酶活性的程度。

图10展示了使用彩色底物AZCL进行的葡萄糖去阻抑突变体TEC-165、TEC-199、TEC-201和TEC-207与非葡萄糖去阻抑亲本TEC-147和TEC-193的木聚糖酶活性的比较。将每种菌株的孢子溶液(10⁷/ml)在含有0.1％AZCL和2％葡萄糖的TEC培养基琼脂平板上划线培养单个菌落。将平板在40℃下孵育3-4天。真菌生长周围的暗区域(蓝色晕轮)的大小和强度指示出酶活性的程度。

发明详述

在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(″comprises″，″comprising″)、“包括”(″includes″and″including″)应被解释为开放式的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素或成分。

冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个要素”可表示一个要素或多于一个要素。

根据本发明的Talaromyces菌株具有至少6FPU_2％/ml的纤维素水解活性。优选地，它们具有至少7FPU_2％/ml，至少8或至少9，更优选地至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20FPU_2％/ml的纤维素水解活性。纤维素水解活性的优选范围是6-300FPU_2％/ml，6-150FPU_2％/ml或10-75FPU_2％/ml。对EG活性而言是5000-200000WBCU/ml，5000-100000WBCU/ml和8000-50000WBCU/ml。纤维素水解活性在本文中基于如实施例中所述经修改的Adney和Baker的方法测量，并以缩写为FPU_2％/ml的单位表示。高纤维素水解活性是期望的，因为这会降低可用菌株生产的酶组合物的最终成本。

优选地，Talaromyces菌株具有至少5000WBCU/ml，更优选地至少6000WBCU/ml，更优选地至少7000WBCU/ml，更优选地至少8000WBCU/ml，更优选地至少9000WBCU/ml，进一步更优选地至少10000WBCU/ml，最优选地10200WBCU/ml或更多的内切葡聚糖酶活性。内切葡聚糖酶活性的优选范围是5000-200000WBCU/ml，5000-100000WBCU/ml或8000-50000WBCU/ml。菌株的内切葡聚糖酶活性在本文中基于实施例中所述的方法测量，并以缩写为WBCU/ml的White Biotech纤维素酶单位/ml为单位表示。高内切葡聚糖酶活性是想要的，因为内切葡聚糖酶活性会为酶组合物中存在的外切葡聚糖酶(CBH I和II)产生更多的酶促位点，从而可以更快地降解底物。

优选地，Talaromyces菌株具有低蛋白酶活性，尤其是至多60APU/ml，至多50APU/ml，至多40APU/ml，最优选地至多35APU/ml，至多30APU/ml，至多20APU/ml，至多10APU/ml的低酸性蛋白酶活性。酸性蛋白酶活性在本文中基于实施例中所述的方法测量，并以缩写为APU/ml的酸性蛋白酶单位/ml为单位表示。低蛋白酶活性是想要的，因为其帮助产生更多(长期)稳定的酶组合物。

优选地，Talaromyces菌株具有孢子形成作用，并生产至少10⁶/ml的孢子效价。良好的孢子形成有助于通过经典方法或遗传工程方法进一步改进菌株。

本发明还涉及通过野生型Talaromyces菌株的突变生产的突变体Talaromyces菌株，其中一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株中的蛋白质水平被提高到至少1.5倍，优选地至少2倍，所述蛋白质是CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、EG/GH61和/或分子量约22993道尔顿的碳水化合物降解蛋白。

在本发明的一个实施方案中，CBH I具有约48690道尔顿的分子量，和/或CBH II具有约46674道尔顿的分子量，和/或EG/CEA具有约36825道尔顿的分子量，和/或EG/CEB具有约51462道尔顿的分子量，和/或乙酰基木聚糖酯酶具有约48690道尔顿的分子量，和/或膨胀因子样酶具有约67911道尔顿的分子量，和/或EG/GH61具有约27007道尔顿的分子量。

分子量在本文中基于AA酸序列计算，并以道尔顿为单位表示。

蛋白质水平在本文中如实施例14中所述通过APEX测定，但如果指出使用了另一方法(例如SDS-PAGE或蛋白酶试验)的情况则例外。在此类情况下，所述方法应如实施例中所述进行。

在一个实施方案中，根据本发明的Talaromyces菌株中下述蛋白质的蛋白质水平被提高到至少1.5倍，优选地提高到至少2倍，所述蛋白质是CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、EG/GH61和分子量约22993道尔顿的碳水化合物降解蛋白。

在一个实施方案中，根据本发明的突变体Talaromyces菌株中一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株被提高，优选地所述水平被提高到至少2倍，所述蛋白质是EG/GH61蛋白、膨胀因子样蛋白、和/或碳水化合物降解蛋白(Temer1170)。

在一个实施方案中，根据本发明的突变体Talaromyces菌株与野生型Talaromyces菌株相比时，一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株中的生产被降低，优选地所述生产被降低至少2倍，所述蛋白质是内切葡聚糖酶EG、木糖苷酶、壳多糖酶(chitanase)和/或蛋白酶。在一个实施方案中，根据本发明的突变体Talaromyces菌株中内切葡聚糖酶EG具有约24136道尔顿的分子量，和/或木糖苷酶具有约95022道尔顿的分子量，和/或壳多糖酶具有约45111道尔顿的分子量，和/或蛋白酶具有约28800道尔顿的分子量。

在一个实施方案中，根据本发明的突变体Talaromyces菌株的EG/GH61蛋白质水平与a)EG、b)EG/CEA和c)EG/CEB一起的蛋白质水平总和的比例至少为0.8，优选地至少为1.0。

在一个实施方案中，根据本发明的突变体Talaromyces菌株具有不受葡萄糖阻抑的下述蛋白质生产，所述蛋白质是CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、和碳水化合物降解蛋白Temer01170。

在一个实施方案中，Talaromyces emersonii菌株是在2009年7月1日以保藏号CBS 124902保藏在荷兰CENTRAAL BUREAU VOORSCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，NL-3508 ADUtrecht的TEC-142(也称作FBG 142)，或其功能等同突变体或其后代(descendent)。

在另一个实施方案中，菌株是以保藏号CBS 127389保藏在荷兰CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，NL-3508 AD Utrecht的TEC-192(也称作FBG 192)，或其功能等同突变体或其后代。

本发明还涉及包含纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)的酶组合物，其中所述组合物包含(以SDS-page图像为基础相对于总蛋白质)40％或更多的EG。优选地，酶组合物的蛋白酶活性为至多60APU/ml，至多50APU/ml，至多40APU/ml，或至多35APU/ml。

本发明还涉及用于将木质纤维素材料转化成有用的产品的方法，所述方法包括以下步骤：a)预处理一种或多种木质纤维素材料，以生产经预处理的木质纤维素材料；b)对经预处理的木质纤维素材料进行酶处理，以生产一种或多种糖；c)将糖转化成一种或多种有用的产品，和d)分离一种或多种有用的产品，其中在步骤a)、b)或c)中使用或添加酶组合物。

优选地，在所述方法中，木质纤维素材料是果园底料(orchardprimings)，树丛(chaparral)，磨坊废弃物(mill waste)，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，软木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，甘蔗渣，玉米，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。如上文所述，步骤a)是预处理一种或多种木质纤维素材料，以生产经预处理的木质纤维素材料。在预处理步骤中，可以以本领域已知的任何方式，用热、机械和/或化学修饰或此类方法的任何组合对原料进行预处理，从而增强底物对酶促水解的可用性，和/或水解半纤维素和/或溶解半纤维素和/或纤维素和/或木质素。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于(热)水、蒸汽(蒸汽爆炸)、酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械粉碎、碾磨、研磨或快速释压，或其中任两种或更多的组合。化学预处理通常与热预处理组合，例如在150-220℃之间1到30分钟。

优选地，在根据本发明的方法中，有用的产品是以下之一种或多种：乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。本发明提供了下述组合物，所述组合物包含纤维素水解和/或半纤维素水解酶活性，并且具有改性(例如降解)非淀粉的碳水化合物材料的能力。非淀粉的碳水化合物材料是包含一种或多种非淀粉的碳水化合物的材料、由一种或多种非淀粉的碳水化合物组成的材料或基本由一种或多种非淀粉的碳水化合物组成的材料。碳水化合物在本文上下文中包括所有糖，例如多糖、寡糖、二糖或单糖。

本文所述的组合物典型地通过此类材料的化学改性来改性非淀粉的碳水化合物材料。碳水化合物材料的化学改性可例如通过水解、氧化或其他化学改性(例如通过裂合酶(lyase)的作用)导致此类材料的降解。

适用于被本文所述的组合物改性的非淀粉的碳水化合物是木质纤维素。可以被认为是潜在的可再生原料的、包含不同木质纤维素残基的主要的多糖是纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

纤维素是由通过β-1，4键连接的葡萄糖残基组成的线性多糖。纤维素纤维的线性本质以及化学计量的β-连接的葡萄糖(相对于α)产生比淀粉的高度枝化的α-连接的结构更倾向于链间(interstrand)氢键合的结构。因此，纤维素聚合物与淀粉中存在的纤维相比通常溶解度更小，并且形成更紧密结合的纤维。

内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成为纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。

半纤维素是复合聚合物，并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1，4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子处被枝化，并且可以被与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的键取代，或者被对乙酸的酯化(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化)取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(如先前提到的β-(1，3)(1，4)葡聚糖和杂葡聚糖)和额外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。

木聚糖酶与其他附属酶(accessory enzymes)例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶一起，催化半纤维素的水解。

果胶物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们沿着一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1，4)-连接的D-半乳糖醛酸单元核心链周围构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。

结构单元的主要类型是：聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1，4)-连接的半乳聚糖和(1，5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密结合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。

酶组合物应包含下述酶活性，所述酶活性典型地源自Penicillium纲和Talaromyces属，例如Talaromyces emersonii的腐生生物真菌微生物。Talaromyces emersonii也可以被称作Geosmithia emersonii或Penicilliumemersonii。Talaromyces emersonii也曾被称作Talaromyces duponti和Penicillium duponti。

酶组合物包含至少两种活性，但是典型地组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多。典型地，本发明的酶组合物可包含至少一种纤维素酶和至少一种半纤维素酶。然而，本发明的酶组合物可包含纤维素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本发明的酶组合物可包含辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外的活性。此类辅助活性的例子在本文中有提到。

因此，酶组合物可含有内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。酶组合物可包含一个或多个这些种类中的多于一种的酶活性。例如，酶组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1，3(1，4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1，4-葡聚糖酶活性。此类组合物也可包含一种或多种木聚糖酶活性。此类组合物可包含辅助酶活性。

酶组合物可源自Talaromyces emersonii。在本发明中可以预期有下述情况，核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可源自Talaromycesemersonii。Talaromyces emersonii能够提供本文中证明对木质纤维素生物质的水解而言高度有效的活性组。随后可对所述活性补充来自其他来源的额外的酶活性。此类额外的活性可源自经典来源和/或由经遗传修饰的生物生产。

酶组合物中的活性可以是热稳定的。本文中这表示该活性具有40℃或更高，例如约50℃或更高，例如约60℃或更高，例如约70℃或更高，例如约75℃或更高，例如约80℃或更高，例如85℃或更高的温度最适度。酶组合物中的活性一般不具有相同的温度最适度，但是优选地应是热稳定的。

另外，酶组合物中的酶活性可以能够在低pH下工作。就本发明的目的而言，低pH表示约5.5或更低，约5或更低，约4.5或更低，约4.0或更低，或约3.8或更低，或约3.5或更低的pH。

酶组合物中的活性可以通过任何上述温度最适度和pH值的组合来限定。

除了源自Talaromyces的活性以外，本发明方法中使用的组合物还可包含纤维素酶(例如源自除Talaromyces之外其他来源的纤维素酶)和/或半纤维素酶(例如源自除Talaromyces之外其他来源的半纤维素酶)和/或果胶酶。

酶组合物可包含一类、两类或三类纤维素酶，例如内切葡聚糖酶(EG)、外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种或所有。酶组合物可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。

酶组合物可包含下述活性，所述活性与酶组合物所提供的活性具有不同种类的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。例如，酶组合物可包含一类由本文所述的组合物提供的纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。

在本文中，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，例如部分地降解成纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。与纤维素酶接触时，根据本发明的纤维素酶可得到纤维素糊精与葡萄糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。与半纤维素酶接触时，根据本发明的半纤维素酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

本文中，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。与果胶酶接触时，根据本发明的果胶酶可得到寡糖与糖单体的混合种群。此类降解将典型地通过水解反应而发生。

因此，本发明的酶组合物可包含任何纤维素酶，例如纤维二糖水解酶，内切-β-1，4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶。

本文中，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1，4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。所述酶也可以被称作纤维素酶1，4-β-纤维二糖苷酶(1，4-β-cellobiosidase)，1，4-β-纤维二糖水解酶，1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1，4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。纤维二糖水解酶可以被分为纤维二糖水解酶I(CBH I)和纤维二糖水解酶II(CBH II)。CBH I被定义为主要从还原性末端水解纤维素、切下纤维二糖的纤维二糖水解酶。CBH II被定义为主要从非还原性末端水解纤维素、切下纤维二糖的纤维二糖水解酶。

本文中，内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中11，4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解还含有1，3-键的β-D-葡聚糖中的1，4-键。所述酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1，4-内切葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1，4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。CEA在本文中是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4，所述酶以其3D结构为基础被归类为糖基水解酶家族5(GH5)。GH5的已知活性包括脱乙酰几丁质酶(chitosanase)(EC 3.2.1.132)；β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)；纤维素酶(EC3.2.1.4)；葡聚糖1，3-β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.58；地衣淀粉酶(licheninase)(EC 3.2.1.73)；葡聚糖内切-1，6-β-葡糖苷酶(EC3.2.1.75)；甘露聚糖内切-β-1，4-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)；内切-β-1，4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；纤维素β-1，4-纤维二糖糖苷酶(EC 3.2.1.91)；内切-β-1，6-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.-)；β-1，3-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.-)；木葡聚糖特异性内切-β-1，4-葡聚糖酶(xyloglucan-specific endo-β-1，4-glucanase)(EC 3.2.1.151)；甘露聚糖转糖酶(EC 2.4.1.-)。CEB在本文中是内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4，所述酶以其3D结构为基础被归类为糖基水解酶家族7(GH7)。GH7的已知活性包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；[作用于还原性末端的]纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.-)；脱乙酰几丁质酶(EC 3.2.1.132)；内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)。

本文中，缩写为BG的β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。

本文中，β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1，3-和1，4-键的β-D-葡聚糖中1，4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1，3-或1，4-键的β-D-葡聚糖。所述酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1，3-1，4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这类酶的替代方案是被描述为内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当下述葡萄糖残基在C-3处被自身取代时，这类酶水解β-D-葡聚糖酶中的1，3-键或1，4-键，所述葡萄糖残基的还原基团涉及要水解的键。替代性的名称包括内切-1，3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1，3-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。

本发明的酶组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。

本文中，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。所述酶也可以被称作内切-1，4-β-木聚糖酶或1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。一种替代方案是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1，4木糖苷键的酶。

本文中，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1，4-β-D-木聚糖的水解、从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这类酶也可以水解木二糖。所述酶也可以被称作木聚糖1，4-β-木糖苷酶、1，4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4-β-木糖苷酶或木二糖酶。

本文中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于阿拉伯呋喃糖苷、含(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酯。所述酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。备选的是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1，2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1，2-(4-O-甲基)葡糖醛酰基连接的水解。

本文中，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。此类多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。此类多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。

本文中，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸-糖+H(2)O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素附属酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。

本文中，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。所述酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。

本文中，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。

本文中，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这样的多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。所述酶也可以被称作外切-(1-＞4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。

本文中，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1，4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖内切-1，4-β-甘露糖苷酶或内切-1，4-甘露聚糖酶。

本文中，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。

本发明的酶组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂合酶，果胶酸裂合酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。

本文中，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中1，4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。所述酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。

在本文中，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+n H₂O＝n甲醇+果胶酸。所述酶也已知为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果酰基水解酶(pectinpectylhydrolase)。

在本文中，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。所述酶也已知为阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷键，内切-1，4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。

本文中，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处乙酰基的脱乙酰基作用的乙酰基酯酶活性。

本文中，内切-果胶裂合酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖。酶也可已知为果胶裂合酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂合酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶酶(pectolyase)，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。

本文中，果胶酸裂合酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基的任何酶。酶也可以已知为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂合酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果胶酸裂合酶，果胶裂合酶，α-1，4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂合酶，PGA裂合酶，PPase-N，内切-α-1，4-多聚半乳糖醛酸裂合酶，多聚半乳糖醛酸裂合酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂合酶。

本文中，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。所述酶也可以已知为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸、释放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n+H₂O＝(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)_n-1+D-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知为半乳糖醛1，4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1，4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。

本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂合酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱脂化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知为果胶酸二糖裂合酶，果胶酸外切裂合酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂合酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂合酶。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖结构由二糖[(1，2-α-L-鼠李糖基-(1，4)-α-半乳糖醛酸]组成。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂合酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替出现的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式、从严格交替出现的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。

本文中，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。

本文中，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被称作α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1，5-阿拉伯聚糖中1，5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。所述酶也已知为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1，5-α-L-阿拉伯聚糖1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。

本发明的酶组合物可包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶和/或至少一种果胶酶(其中之一是根据本发明的多肽)。本发明的酶组合物可包含纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。此类组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。

另外，本发明的酶组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶葡糖醛酸糖苷酶或扩展蛋白或纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。

“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分如糖之间键的酶(糖肽酶)。许多肽酶根据EC 3.4表征，适合在本发明中使用并且通过引用并入本文。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。

“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。

“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和已知解聚或以其他方式分解木质素聚合物的其他酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)。

“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可以能够催化(1，3)(1，4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。

“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)。

酶组合物可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.，Eur.J.Biohem.269，4202-4211，2002)或膨胀因子样蛋白质。

扩展蛋白(expansin)涉及植物细胞生长期间细胞壁的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质——膨胀因子，含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。就本发明的目的而言，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含此类结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。

酶组合物可包含纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因的多肽产物(见Foreman et al.，J.Biol.Chem.278(34)，31988-31997，2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将分解纤维素的亚基组合进多酶复合物中。这通过两类互补的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesion domain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。就本发明的目的而言，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一种或两种。

酶组合物可由大量上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的这些蛋白质)的任何组合组成。

酶组合物可以由来自以下的酶组成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)复合培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明的酶组合物中不同的酶可得自不同的来源。

酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并可将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆或小麦秸)等等加入例如原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵施用原料(例如玉米秆或小麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。

在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以共同(即本身作为单一组合物)或单独或先后提供。

本发明因此涉及其中使用上述组合物的方法，和所述组合物在工业方法中的用途。

原则上，本发明的酶组合物可以在任何下述方法中使用，所述方法需要处理包含非淀粉的多糖的材料。因此，本发明的多肽或酶组合物可以在非淀粉的多糖材料的处理中使用。本文中，非淀粉的多糖材料是下述材料，所述材料包含一种或更典型地包含多于一种非淀粉的多糖或者基本由所述非淀粉的多糖组成。

典型地，植物和真菌和源自它们的材料包含大量非淀粉的多糖材料。因此，本发明的多肽可以用于植物或真菌材料或源自它们的材料的处理。

植物非淀粉多糖材料的一个重要的组分是木质纤维素(在本文中也称作木质纤维素生物质)。木质纤维素是由纤维素和半纤维素和木质素组成的植物材料。碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)与木质素通过氢键和共价键紧密结合。因此，本发明的多肽可以用于木质纤维素材料的处理。本文中，木质纤维素材料是包含木质纤维素或基本由木质纤维素组成的材料。因此，在用于处理非淀粉的多糖的本发明方法中，非淀粉的多糖可以是木质纤维素材料/生物质。

因此，本发明提供了用于处理非淀粉的多糖的方法，其中所述处理包括纤维素和/或半纤维素的降解和/或改性。

降解在本文上下文中表示导致产生纤维素和/或半纤维素和/或果胶物质的水解产物(即与类似的未经处理的非淀粉多糖中存在的相比，由于处理而存在更短链的糖)的处理。因此，降解在本文上下文中可以导致寡糖和/或糖单体的释放。

所有植物和真菌都含有非淀粉的多糖，同样，基本上所有来自植物和真菌的多糖材料也含有非淀粉的多糖。因此，在本发明的用于处理非淀粉的多糖的方法中，所述非淀粉的多糖可以以植物或源自植物的材料或包含植物或源自植物的材料的形式提供，例如以植物浆、植物提取物、食品或其成分、织物、纺织品或衣物。

本发明提供了由木质纤维素材料生产糖的方法，所述方法包括将本文所述的组合物与木质纤维素材料接触。

此类方法允许由木质纤维素生物质生产游离的糖(单体)和/或寡糖。这些方法涉及用本发明的多肽或酶组合物将木质纤维素生物质转化成游离糖和小的寡糖。

将复合碳水化合物如木质纤维素转化为糖的方法优选地允许转化成可发酵的糖。此类方法可以被称作“糖化”。因此，本发明的方法可导致一种或多种己糖和/或戊糖(如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、蔗糖和果糖中的一种或多种)的释放。

适合在本发明的方法中使用的木质纤维素包括原生生物质(virginbiomass)和/或非原生生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corncobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作麸或纤维的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是，但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheat midlings)，燕麦壳，和硬木材或软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，特定地包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。

除了已经在食物和饲料或造纸和制浆工业中加工的原生生物质或原料以外，生物质/原料可额外地用热、机械和/或化学改性或此类方法的任何组合预处理，从而增强酶降解。

可发酵的糖可以被转化成有用的价值附加性(value-added)发酵产物，其非限制性例子包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品(specialty chemicals)、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇。

可以通过本发明的方法生产的特定的价值附加性产物包括但不限于生物燃料(包括乙醇和甲醇和沼气(biogas))；乳酸；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸、反丁烯二酸、衣康酸和顺丁烯二酸；3-羟基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯，丙三醇；溶剂；动物饲料补充剂；药物，如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，如赖氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，苏氨酸和天冬氨酸；工业酶，如蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化还原酶，转移酶或木聚糖酶；和化学原料。

与单子叶植物(monocots，即具有单个子叶或种子叶的植物，如玉米、小麦、水稻、草、大麦)相比，双子叶植物(dicot，即其种子具有两片子叶或种子叶的植物，如利马豆(lima beans)、花生、杏仁、豌豆、四季豆)中半纤维素的组成、取代性质和枝化程度差异很大。在双子叶植物中，半纤维素主要由下述木葡聚糖组成，所述木葡聚糖是具有1，6-β-连接的木糖基侧链的1，4-β-连接的葡萄糖链。在单子叶植物(包括大部分谷类作物)中，半纤维素的主要组分是异木聚糖。这些主要由下述1，4-β-连接的木糖主链聚合物组成，所述木糖主链聚合物与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸或4-O-甲基-葡糖醛酸以及由与酯连接的乙酸改性的木糖具有1，3-α连接。还存在由1，3-和1，4-β-连接的葡糖基链组成的β葡聚糖。在单子叶植物中，纤维素、杂木聚糖和β-葡聚糖可以大致等量地存在，各自包含约15-25％的细胞壁干物质。另外，不同的植物可包含不同量和不同组成的果胶物质。例如，甜菜含有以干重为基础约19％的果胶和约21％的阿拉伯聚糖。

因此，本发明的酶组合物可根据要使用的具体原料来定制。也就是说，本发明的酶组合物中的活性谱可根据考虑的原料来变化。

酶组合或物理处理可以同时施用或先后施用。酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入木质纤维素原料中。或者，酶可以被生产但不分离，并且将粗制细胞群发酵液或植物材料(如玉米秆)等等加入原料中。或者，可以处理粗制细胞群或酶生产培养基或植物材料，以预防进一步的微生物生长(例如通过加热或添加抗微生物剂)，然后添加至原料。这些粗制酶混合物可包含生产酶的生物。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵施用原料(例如玉米秆)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物可以发挥木质纤维素原料的作用，并且被添加进木质纤维素原料中。

在本发明的方法中，酶或酶的组合作用于发挥原料作用的木质纤维素底物或植物生物质上，从而将所述复合底物转化成简单的糖和寡糖，用于生产乙醇或其它有用的发酵产物。

因此，本发明的另一方面包括下述方法，所述方法与其它酶或物理处理(例如温度和pH)一起利用上述组合物，将木质纤维素植物生物质转化成糖和寡糖。

尽管组合物已作为单一混合物被讨论，但是认为酶可以先后添加，其中温度、pH和其他条件可以被改变，以提高每种个体酶的活性。或者，可以针对酶混合物测定最适pH和温度。

组合物在任何适当的条件下与底物反应。例如，酶可以在约25℃，约30℃，约35℃，约37℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃，约70℃，约75℃，约80℃，约85℃，约90℃或更高下孵育。也就是说，它们可以在从约20℃到约95℃下，例如在低到中等离子强度的缓冲液中和/或从低到中性pH下孵育。“中等离子强度”表示对任何单个离子组分而言，缓冲液具有约200毫摩尔(mM)或更少的离子浓度。pH可在从约pH 2.5，约pH 3.0，约pH 3.5，约pH 4.0，约pH 4.5，约pH 5，约pH 5.5，约pH 6，约pH 6.5，约pH 7，约pH 7.5，约pH 8.0，到约pH 8.5的范围内。通常，pH范围会从约pH 3.0到约pH 9。

典型地，反应可以在上文定义的低pH条件下进行。因此，可以进行本发明的方法从而不需要调节pH(即至更中性的pH)。也就是说，可以使用经酸预处理的原料，因为在添加本发明的酶组合物之前不需要添加例如过氧化钠。

可以在液化/水解之前洗涤原料。所述洗涤可以例如用水进行。

在这些条件下孵育组合物导致大量糖从木质纤维素材料释放或解离。大量表示至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多的可利用的糖。

可以使用涉及用酶或酶混合物孵育的液化/水解或预糖化步骤。所述步骤可以在许多不同的温度下进行，但是优选预糖化在最适合要测试的酶混合物的温度下，或针对要测试的酶预测的酶最适度下进行。预糖化温度可以在从约10℃到约80℃，约20℃到约80℃，约30℃到约70℃，约40℃到约60℃，约37℃到约50℃，优选地约37℃到约80℃，更优选地约50℃的范围内。缺失温度最适度数据时，优选首先在37℃下，然后在更高温度如50℃下进行预糖化反应。预糖化混合物的pH可以在从约2.0到约10.0，但是优选地约3.0到约5.0。另外，在糖化之前可能不必须调节pH，因为酶组合物典型地适合在本文定义的低pH下使用。

液化/水解或预糖化步骤反应可以进行数分钟到数小时，例如从约1小时到约120小时，优选地从约2小时到约48小时，更优选地从约2小时到约24小时，最优选地从约2小时到约6小时。纤维素酶处理可进行数分钟到数小时，例如从约6小时到约168小时，优选地约12小时到约96小时，更优选地约24小时到约72小时，进一步更优选地从约24小时到约48小时。

从生物质释放的糖可以被转化成有用的发酵产物，例如包括但不限于以下之一：氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料和乙醇(包括燃料乙醇)。

显著地，本发明的方法可以在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质。因此，本发明可以用约5％或更高，约8％或更高，约10％或更高，约15％或更高，约20％或更高，约25％或更高，约30％或更高，约35％或更高或约40％或更高的干物质含量进行。

因此，本发明提供了制备发酵产物的方法，所述方法包括：

a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和

b.发酵所得到的材料，

从而制备发酵产物。

可以进行此类方法而不需要在所述方法期间调节pH。也就是说，所述方法是可以不添加任何酸或碱而进行的方法。然而，这排除了其中可以添加酸的预处理步骤。关键是本发明的酶组合物能够在低pH下发挥作用，因此不需要调节经酸预处理的原料的pH，从而可以发生糖化。因此，本发明的方法可以是仅使用有机产物而不需要输入无机化学品的零废弃物方法。

可以根据本发明生产的发酵产物包括氨基酸、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料或其他有机聚合物、乳酸和乙醇，包括燃料乙醇(术语“乙醇”被理解为包括乙醇或乙醇和水的混合物)。

可以通过本发明的方法生产的特定的价值附加性产物包括但不限于生物燃料(包括乙醇和丁醇)；乳酸；3-羟基-丙酸，丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯；丙三醇；塑料；特种化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸和顺丁烯二酸；溶剂；动物饲料补充剂；药物，如β-内酰胺抗生素或头孢菌素；维生素；氨基酸，如赖氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，苏氨酸和天冬氨酸；酶，如蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶，葡聚糖酶，乳糖酶，脂肪酶，裂合酶，氧化还原酶，转移酶或木聚糖酶；化学原料；或动物饲料补充剂。

用于制备发酵产物的方法可任选地包含发酵产物的回收。

此类方法可在需氧或厌氧条件下进行。优选地，所述方法在微需氧或氧受限的条件和/或C受限的条件下进行。

厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗约5或更少、约2.5或更少或约1mmol/L/h或更少，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体的发酵方法。

氧受限的发酵方法是其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物料转移性质决定。优选地，在氧受限条件下进行的方法中，氧消耗速率至少约为5.5，更优选地至少约为6，进一步更优选地至少约为7mmol/L/h。

本发明还涉及能够过量生产木质纤维素降解酶的Talaromycesemersonii突变体，所述木质纤维素降解酶能够降解植物生物质。微生物被修饰，使得与微生物的未经修饰的形式相比，木质纤维素酶的合成被提高。

本发明包括对微生物基因的任何突变，所述突变导致提高的木质纤维素降解酶生产。经典的诱变和随后的筛选程序是公知的根据经验的、非重组的菌株改进途径(Vinci and Byng，1999)。

“诱变”表示想微生物的遗传材料中引入可遗传的改变-突变，所述遗传材料通常是染色体DNA(Crueger，1993)。这些突变由微生物基因型的改变引起(突变体)。突变在体内自发发生或在诱变剂(例如辐射或化学试剂)的诱导后发生。也可以通过使用位点特异性遗传工程技术体外诱导突变。

通过物理或化学试剂在微生物中诱导的诱变随机发生。最常用的物理诱变剂是热、冷冻和融化、在存在8-甲氧基补骨脂素(methoxypsoralen)时近紫外辐射、远紫外辐射、和电离辐射。优选的物理诱变剂是UV辐射。

最常用的化学诱变剂是：(i)影响非复制性DNA的诱变剂(例如亚硝酸、羟胺和烷化剂)；和(ii)影响复制性DNA的诱变剂(例如碱类似物，如5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤和N⁴-羟基胞苷；和移码诱变剂例如吖啶橙、原黄素、9-氨吖啶、吖啶黄、ICR化合物ICR170和ICR191、胡溴铵和光敏性补骨脂素)。除紫外辐射以外，烷化剂——一组化学诱变剂——是实践应用中最有效的诱变系统(Brookes，1990，Crueger 1993)。大部分烷化剂作为单功能试剂发挥作用，例如环氧化物(例如二氧桥丁烷[DEB])、乙撑亚胺(例如乙烯亚胺[EI])、烷基硫酸酯(例如硫酸二乙酯[DES]、硫酸二甲酯[DMS])、链烷磺酸烷基酯(例如甲磺酸甲酯[MMS]、甲磺酸乙酯[EMS])、亚硝酰胺(例如甲基亚硝基脲[MNU]、乙基亚硝基脲[ENU]、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍[NTG或MNNG]、乙基-N’-硝基-N-亚硝基胍[ENNG]、丙基-N’-硝基-N-亚硝基胍[PNNG]4-硝基喹啉[NQO])和间接作用的二甲基亚硝胺[DMN]和二乙基亚硝胺[DEN]。双功能和多功能烷化剂是氮芥(例如二-(2-氯乙基)硫化物[芥子气]、二-(2-氯乙基)胺[氮芥]、ICR化合物、丝裂霉素C)。优选的化学诱变剂是NTG和NQO或二者的组合。

对辐射或化学试剂而言，突变性改变通常是复制或修复机制中错误的结果，所述错误通过在多核苷酸链中并入错误的碱基或核苷酸造成，或通过与碱基或核苷酸的直接化学相互作用造成。修复机制是例如光复活、长程错配修复(long-patch repair)和碱基切除修复、复制后修复、SOS修复、烷基化的修复、适应性反应和DNA双链断裂的修复。

使用化学或物理诱变剂时，本领域中使用的典型存活百分比的范围在0.01％和60％之间。优选地，存活百分比的范围在0.05％和50％之间。更优选地，存活百分比是0.1％和30％。本领域技术人员公知，分生孢子是诱变真菌微生物(包括Talaromyces物种)的优选的材料。然而，突变体也可以得自菌丝体细胞。本文所述的选择方法可用于选择从分生孢子或菌丝体细胞获得的突变体。

除了这些技术以外，增变基因(mutator genes)中的突变也可以通过提高其他基因中的自发突变率而增强微生物中的诱变。例如，E.coli有至少九个基因座已知引起增变基因表型：例如，mutT基因座将突变频率提高至约1000倍，主要作为AT→CG颠换；mutD5是最有效的增变基因，其具有来自DNA聚合酶III的外切核酸酶缺陷，和复制后DNA错配修复缺陷(Horiuchi et al.，1989；Schaaper and Radman，1989；Crueger，1993)。多种增变基因也在B.subtilis中被遗传表征。尽管在B.subtilis的mutT突变体中自发突变未受影响，但是可使用B.subtilis的mutS、mutL、mutM和mutY突变体大幅增强自发突变的频率(Ginetti et al.，1996；Sasaki et al.，2000；Sasaki and Kurusu，2004)。

“突变”可以是基因序列中的缺失、取代或添加。突变可以是打断(disruption)、移码突变或无义突变。突变可以是影响基因整个序列或其部分的打断。突变可以影响基因的编码序列或非编码序列(例如启动子)。突变可导致基因转录的完全缺失，或者导致翻译的过早终止。类似地，突变可位于基因前(或“上游”)，这会通过称作极性(polarity)的过程打断相邻(或“下游”)基因的转录。或者，突变可具有下述效应：与野生型蛋白质相比，所翻译的蛋白质带有使得蛋白质无功能的突变。

此类突变可以通过多种方式提高纤维素生产。例如，纤维素编码基因的启动子和调节(顺式)位点中的突变可直接影响所述基因的表达，从而提高纤维素酶的水平或活性。或者，突变可影响下述基因的表达，所述基因编码涉及细胞外蛋白质分泌机制的蛋白质。提高这些蛋白质的水平可导致进入细胞培养基中的更高水平的分泌。突变还可以影响蛋白酶或RNA核酸酶，以防止纤维素酶基因的mRNA转录本的降解或纤维素酶的降解，从而相对于未经突变的细胞提高纤维素酶蛋白质的水平。

因此，可以通过下述方法制备根据本发明的Talaromyces菌株，所述方法包括以下步骤：

a)从Talaromyces菌株的大量菌落形态中选择并分离一种菌落变体；

b)对菌落变体进行诱变，并针对高纤维素酶活性筛选得到的突变体；

c)从所述突变体中选择并分离一种或多种高纤维素酶突变体菌株；和任选地：

d)从高纤维素酶突变体菌株的大量菌落形态中选择并分离高纤维素酶突变体菌株的一种菌落变体；

e)对来自步骤d)的菌落变体的菌株进行诱变，并针对葡萄糖类似物(例如2-脱氧-D-葡萄糖[DOG])抗性筛选得到的突变体；

f)从来自步骤e)的突变体中选择并分离一种或多种高纤维素酶葡萄糖去阻抑的突变体菌株；

g)对来自步骤c)的经改进的纤维素酶活性突变体再次进行诱变，并针对更高的纤维素酶活性筛选得到的突变体；和任选地

h)对来自步骤g)的菌株进行诱变，并针对葡萄糖类似物(例如2-脱氧-D-葡萄糖[DOG])抗性筛选得到的突变体；

i)从来自步骤h)的一种或多种高纤维素酶葡萄糖去阻抑的突变体菌株中再分离高纤维素酶葡萄糖去阻抑的突变体菌株。

在一个实施方案中，步骤b)中诱变剂是NTG。NTG给予针对FOA(5-氟-乳清酸)抗性的高突变因数(mutation factor)。

在一个实施方案中，步骤e)和h)中诱变剂是NQO和NTG的组合。该诱变剂组合给予针对DOG(2-脱氧-D-葡萄糖)抗性的高突变因数。

诱变效率在本文中通过测定诱变处理后的存活和5-氟乳清酸(FOA)抗性突变体的频率来估计，所述频率是一种容易评分的表型。这些频率的比例在本文中被称作突变因数(MF)。

在一个实施方案中，步骤c)和f)的选择在两个步骤中进行，其中第一种筛选是高通量筛选，第二种筛选是在摇瓶培养物中生产纤维素酶。

“启动子”是基因转录起点上游的DNA序列，并且涉及RNA聚合酶和/或其他蛋白质的识别和结合，从而起始基因的转录。通常，启动子决定了基因在何种条件下表达。

术语“去调节的”或“去调节”包括改变微生物中至少一种基因的修饰，使得微生物中基因产物的水平或活性被改变或修饰。优选地，至少一种基因被改变或修饰，使得基因产物被增强或提高。

“去调节的”启动子是这样的启动子：其允许基因在其通常被阻抑的生长条件或环境条件下表达。“强去调节的启动子”是这样的启动子：其导致在其被去阻抑的生长条件或环境条件下，与天然启动子相比mRNA以更高的频率被起始。

突变可降低或完全阻止一个或多于一个下述基因的表达，所述基因阻抑纤维素酶编码基因的表达。这会导致具有提高的纤维素酶生产的细胞。此类调节基因(通常称作转录因子)的例子是，但不限于，Trichodermareesei AceI和Saccharomyces cerevisiae mig1及其存在于真菌(包括Talaromyces emersonii和相关物种)中的直系同源物。

突变也可以提高一个或多于一个下述基因的表达或过表达，所述基因活化纤维素编码基因的表达。这会导致具有提高的纤维素酶生产的细胞。此类调节基因(通常也称作转录因子)的例子是，但不限于Aspergillusniger XlnR和Trichoderma reesei AceII及其存在于真菌(包括Talaromycesemersonii和相关物种)中的直系同源物。

突变也可以提高其表达受葡萄糖阻抑的纤维素酶基因的表达，这是通常被称作葡萄糖去阻抑或葡萄糖去阻抑突变的细胞状态。针对纤维素酶生产而言是葡萄糖去阻抑的细胞是下述细胞，所述细胞在葡萄糖仍然存在于生长培养基中或以可感知的量存在于通常不生产纤维素酶或以更低的水平生产纤维素酶的细胞中时，允许一种或多种纤维素酶的更高生产。葡萄糖去阻抑可通过细胞中的多种突变产生，包括但不限于，编码纤维素酶的基因启动子区中的突变，其阻止葡萄糖阻抑调节蛋白的结合。阻止此类调节蛋白的结合允许在存在葡萄糖时表达纤维素酶编码的基因。影响真菌中酶/纤维素酶生产的葡萄糖阻抑的调节蛋白的一个例子是，但不限于Aspergillus nidulan CreA及其存在于真菌(包括Talaromyces emersonii和相关物种)中的直系同源物。或者，调节CreA和类似直系同源物表达的基因中的突变也会导致存在葡萄糖时纤维素酶编码的基因的提高的表达。

在一个实施方案中，Talaromyces菌株是葡萄糖去阻抑的。在一个实施方案中，葡萄糖去阻抑的菌株在96小时中在存在葡萄糖时的酶生产相对于亲本菌株在相似条件下酶生产的比例至少为2。在优选的实施方案中，所述比例为至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少15，至少20，至少50，或至少100。在一个实施方案中，在存在葡萄糖时生长时，Talaromyces菌株生产木聚糖酶。

在一个实施方案中，相似地在不含葡萄糖的Talaromyces培养基2中生长96小时时，葡萄糖去阻抑的菌株的纤维素酶活性是野生型(葡萄糖阻抑的)亲本菌株活性的至少25％。

在本发明中，如下进行经典的诱变和筛选：(i)使用UV，或单独的NTG，或与NQO组合的NTG，产生突变体文库；(ii)针对提高的纤维素酶生产选择随机突变体，或对导致纤维素酶生产的葡萄糖去阻抑的葡萄糖类似物有抗性的突变体；(iii)在存在或不存在葡萄糖时显示经改进的纤维素酶生产的突变体的摇瓶试验；和最后(iv)发酵，从而测定下述突变体的纤维素酶水平，所述突变体在摇瓶试验中比亲本菌株生产显著更多的纤维素酶，或在存在葡萄糖时生产纤维素酶。

本发明的微生物能够过量生产一种或多种木质纤维素酶。在本文中使用时，术语“过量生产木质纤维素酶”是指本发明的微生物与所述微生物的野生型形式相比，具有显著提高的木质纤维素酶生产。优选地，木质纤维素酶的过量生产表示每毫升培养基至少6FPU的生产。

本发明的另一方面是生产纤维素酶混合物的方法，所述方法包括(a)在生产纤维素酶混合物的条件下培养根据本发明的微生物；和(b)任选地从细胞培养基中回收纤维素酶混合物。

本发明的方法包括在生产纤维素酶混合物的条件下培养经修饰的微生物的步骤。术语“培养”包括本发明的活微生物的维持和/或生长。使用本领域已知的方法，在适合纤维素酶混合物生产的营养培养基中培养本发明的微生物。进行根据本发明的培养方法所需的培养基对本发明而言并非至关重要的。根据所考虑的生物的需要，对所述过程添加养分，前提是养分过量供应。培养基便利地含有碳源、氮源以及微生物生长和/或有价值的纤维素酶混合物形成所需的额外的化合物。例如，额外的化合物可以是诱导有价值的化合物生产所必需的。要添加至根据本发明的培养过程中的碳源和氮源的总量可根据例如微生物的需要和/或培养过程的长度而变化。

例如，可在合适的培养基中，和在允许纤维素酶混合物被表达和/或分离的条件下培养本发明的微生物。使用本领域已知的步骤，使培养发生在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中(见例如Bennett，J.W.andLaSure，L.，eds.，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。合适的培养基可得自商业供应者，或可使用(例如在AmericanType Culture Collection的产品目录中)公开的组合物制备。本领域中已知的合适碳源或碳底物的例子可在WO98/37179中找到，包括但不限于，复合碳水化合物例如豆粗粉(bean meal)或谷物粗粉(grain meal)，谷物粉，淀粉，糖，糖醇，烃，油，脂肪，脂肪酸，有机酸和醇。谷物粉被定义为，但不限于，经研磨的水稻、小麦、裸麦、玉米、大麦、燕麦或燕麦片(oatmeal)。

本领域中已知的合适氮源的例子包括但不限于，植物蛋白，胨，源自谷物、豆类和根茎的肽和氨基酸，源自动物来源例如肉、奶的肽和氨基酸，和动物副产物例如胨、肉提取物、酪蛋白水解产物，大豆粗粉，酵母提取物，玉米浆，尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵。

微生物生长和/或产物形成所需的额外的化合物，如磷酸盐、硫酸盐、微量元素(例如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、钼和/或钴盐)、维生素或生长促进剂可以下述用量添加，所述用量可在不同种类的微生物之间(即真菌、酵母和细菌之间)变化。另外，要添加的额外化合物的用量可由形成的有价值化合物的类型决定。典型地，微生物生产必需的培养基组分的用量可根据培养中使用的碳源的用量来决定，因为形成的生物质的量主要由使用的碳源的量决定。

优选地在诱导物上培养微生物，以诱导纤维素酶。诱导物可以是导致诱导宿主细胞生产纤维素酶的一种或多种寡糖、二糖或单糖。诱导物可以通过一种或多种纤维素酶对纤维素的酶促水解来生产，从而主要生产β-连接的葡萄糖二聚体。来自商业来源的合适诱导物包括但不限于，Avicell、Arbocell、Buckeye和Viscokraft。更优选的是分离下述Talaromyces突变体，所述突变体不需要纤维素来诱导纤维素酶。可以使用常规的培养方法，例如静止培养、试管培养、摇瓶培养、掺气旋动培养(aerationspinner culture)或发酵，来连续或间歇地在液体培养基中培养微生物。优选地在发酵罐中培养微生物。根据本发明的培养方法可以作为分批、重复分批、进料分批、重复进料分批、连续培养、浆体或固体状态模式来进行。对特定的应用(即实施例)而言应用分批方法，其中在开始培养方法之前将所有的培养基组分直接作为整体过量添加至培养基中。在一个优选的实施方案中，在进料分批条件下培养葡萄糖去阻抑的菌株。根据所属实施方案可以生产非常高的酶效价，例如在进料分批操作中，可以达到例如20FPU_2％/ml或更多、25FPU_2％/ml或更多或30FPU_2％/ml或更多的纤维素活性。进料分批操作不能应用于葡萄糖阻抑的菌株，因为在进料分批操作中进料的葡萄糖会阻抑纤维素酶生产，导致低纤维素酶产率。

典型地，微生物培养方法可以被分为导向生物质形成的生长阶段，和导向有价值的化合物生产的生产阶段。本领域技术人员明白，这两个阶段在时间上可以并非严格分离，而是在一定程度上重叠。根据本发明的培养方法优选地以工业规模进行。工业规模方法被理解为包括在下述发酵罐体积规模上进行的发酵方法，所述发酵罐体积规模为≥0.01m³，优选地≥0.1m³，优选地≥0.5m³，优选地≥5m³，优选地≥10m³，更优选地≥25m³，最优选地≥50m³。

本发明的另一方面涉及培养发酵液下游加工的选项。根据本发明应用的分批方法有助于下游加工，尤其归因于有价值化合物的高产率和低的副产物量。下游加工可包括回收以及配制步骤。

培养过程结束后，可以使用针对感兴趣的有价值化合物的回收而开发的标准技术，从培养发酵液中回收有价值的产物。因此，要应用的相关下游加工技术取决于有价值的化合物的性质和细胞定位，以及感兴趣的产物的期望纯度水平。在一种典型的回收方法中，使用例如离心或过滤将生物质与培养液分离。然后从生物质中回收有价值的化合物，使得有价值的化合物在微生物细胞内累积或与微生物细胞结合。术语“回收”包括从培养基中分离、提取、收获、隔离或纯化化合物。化合物的分离可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行，包括但不限于改变pH、溶剂萃取、透析、细胞过滤和超滤、浓缩、冷冻干燥等等。

当然，也可以原样使用生物质。或者，当有价值的产物从微生物细胞中分泌时，从培养液中回收有价值的产物。生物质和/或有价值的化合物可以被配制成液体或固体产物。在另一实施方案中，不从微生物或培养物中纯化想要的产物。整个培养物或培养物上清液可被用作产物的来源。在特定的实施方案中，不经修饰地使用培养物或培养物上清液。在有一个实施方案中，直接向木质纤维素材料中添加培养物或培养物上清液，用于水解。

本文所述的本发明的多个实施方案可以交叉组合(cross-combined)。以下的非限制性实施例进一步阐述了本发明。

实施例

一般方法

菌株

本发明的Talaromyces emersonii菌株源自ATCC16479，其之前为Penicillium geosmithia emersonii。T.emersonii ATCC16479的其他命名是CBS393.64、IFO31232和IMI116815。纯化并存储了来自ATCC16479的单个菌落；该菌株为TEC-1。使用TEC-1的团块接种(mass inoculation)制备菌种用于进一步研究，该菌株被称作TEC-1A。本文所述的所有突变体都源自TEC-1A的单个菌落，所述菌落称作TEC-101。

培养基和溶液

1.一般生长，菌落纯化，和菌株转化：

马铃薯右旋糖琼脂，PDA，(Fluka，产品目录号70139)

生理盐

NaCl 9g/l

Na₂HPO₄.2H₂O 0.8g/l

KH₂PO₄ 0.14g/l

pH 7(用3.5M磷酸调节)

2.孢子形成：

Talaromyces琼脂培养基

盐级分组成

盐级分符合WO98/37179，表1的公开内容。与该表中组成的偏差在于CaCl2.2aq 1.0g/l、KCl 1.8g/L、柠檬酸1aq 0.45g/L(螯合剂)。

3.荧光平板试验：

C琼脂

10x MS缓冲液

4.降低菌落大小的培养基：

CTX琼脂

C琼脂

Triton X100(0.05％)

5.孢子的萌发和生长刺激：

CTXG琼脂

CTX琼脂

葡萄糖多达1.5％

6.葡萄糖类似物抗性突变体的选择：

YNB(酵母氮基)琼脂：

YNB+氨基酸(Difco，产品目录号239210)

7.氟乳清酸抗性突变体的选择：

FoA琼脂培养基

之后以0.1％(1g/l)的终浓度添加经过滤灭菌的氟乳清酸(Sigma，产品目录号F5013；在DMSO中制备的10％储液)。

摇瓶培养基

1.接种培养基：

Talaromyces培养基1

2.Talaromyces培养基2、3和4：

A3 50％、A2 25％和A3 20％分别被称作Talaromyces培养基2(T2)、Talaromyces培养基3(T3)和Talaromyces培养基4(T4)。配方在表1中给出。

表1：用于测试摇瓶和MTP中纤维素酶生产的生长培养基的组成。灭菌，120℃下20分钟。

类似物/中间产物

2-脱氧葡萄糖(Sigma，产品目录号D6134)：在水中以10％的浓度制备储液。

1-硫代葡萄糖(Sigma，产品目录号T6375)：在水中以10％的浓度制备储液。

摇瓶生长流程

预培养：

在Talaromyces琼脂培养基斜面上，将来自菌种的菌株于40℃下培养5-7天；菌种于-80℃下储存于10％甘油中。生长的琼脂斜面需要储存在室温下，最大储存期为两周，之后应当将该新鲜的琼脂斜面培养物制备用于菌株测试。

使用来自琼脂斜面的孢子和菌丝体接种含有Talaromyes培养基1(100ml锥形瓶中20ml培养基)的预培养物。这通过将2ml Talaromyces培养基1吸液至琼脂斜面的表面上，并重复吸液和刮擦，直至去除菌丝体；然后将悬浮的生物质分配进接种培养基中。使用数滴剩余的细胞悬浮液接种新鲜的琼脂斜面，以确保菌株的保存。然后将预培养物于44℃下摇动(280rpm)培养最多20小时。

生产培养基：

使用1ml或0.5ml预培养物接种100ml锥形瓶中的20ml生产培养物(表1)。将培养物于44℃下摇动(280rpm)孵育4天。

纤维素酶试验

1.小麦秸试验(WSU试验)。

样品制备

对摇瓶培养物而言，将10ml培养液转移至12ml一次性管中，并离心去除生物质。然后将1ml上清液转移至96深孔平板中，储存于-20℃。

对24孔MTP而言，对平板离心去除生物质。然后将1ml上清液转移至96深孔平板中，储存于-20℃。

对96孔半深孔平板而言，首先在每个孔中添加300-400μl水。之后对平板离心去除生物质。然后将最多200μl上清液转移至96深孔平板中，储存于-20℃。

经预处理、洗涤的小麦秸底物的制备。

用水洗涤经稀酸预处理的小麦秸，直至含有小麦秸的溶液的pH为6.5或更高，并在分析前使用分散机(ultra-turrax)匀化团块，冷冻干燥并磨碎。为了获得经预处理的小麦秸，可使用如Linde，M.et al，Biomass andBioenergy 32(2008)，326-332所述的稀酸预处理和如Schell，D.J.，AppliedBiochemistry and Biotechnology(2003)，vol.105-108，pp 69-85所述的设备。

1WSU表示：在65℃和pH 4.50下20小时内，200μl酶混合物从2.1w/v％经洗涤的预处理小麦秸中释放0.119mg/ml葡萄糖。

葡萄糖释放不是组合物中酶量的线性函数。也就是说，两倍数量的酶不自动导致相等时间中两倍数量的葡萄糖。因此，优选选择要针对WSU活性进行测试的组合物稀释度，使得WSU不超过40。

以WSU为单位的纤维素酶活性测量

将储存的样品融化，在去矿物质化的水中制备2倍稀释系列，直至32倍。使用经稀释的样品进行两种测量，其中分析200μl经稀释的样品。在第一种测量中，将200μl经稀释的样品转移至含700μL水的管中，所述水含有3％(w/v)经预处理洗涤的小麦秸底物干物质和100μl 250mM的柠檬酸缓冲液，最终pH被调节至pH 4.5。在第二种测量中，将空白样品、200μl经稀释的样品转移至管中，所述管含有700μl水代替经预处理洗涤的小麦秸底物，和100μl 250mM的柠檬酸缓冲液，最终pH被调节至pH 4.5。将试验样品在65℃下孵育20和/或60小时。将试验样品孵育后，添加100μl内标溶液(D₂O中20g/L顺丁烯二酸，40g/L EDTA)。释放的葡萄糖量以5.20ppm处的信号为基础，与在27℃的温度下、使用具有水抑制的脉冲程序、通过在500MHz的质子频率下操作的1D ¹H NMR测定的二甲基-硅-戊烷-磺酸盐比较。通过从用小麦秸孵育的样品中测量的葡萄糖量中减去空白样品中检测的葡萄糖量，由数据计算WSU数。小麦秸单位被表示为样品稀释因子的函数。

2.滤纸试验(FPU _2％试验)

还以每毫升的“滤纸单位”(FPU)的方式在原始(未经稀释的)酶溶液的滤纸单位试验(FPU试验)中测量了纤维素酶活性。所述方法由Adney and Baker(1996，MoA Laboratory Analytical Procedures-006 entitled：Measurement of cellulase activities by Adney and Baker(1996)www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html)的分析方法改造而来，比基于International Union of Pure and applied chemistry(IUPAC)指南的标准方法更加灵敏。对定量的结果而言，以显著和相等的转化为基础比较酶组合物。60分钟内来自50mg滤纸的1.0mg作为葡萄糖的还原糖数值(2％转化，而不是国际标准的4％)被指定为IUCA计算滤纸单位(FPU)的截断值(intercept)。在该流程中，还原糖产率不是试验混合物中酶数量的线性函数，两倍数量的酶不会预期在相等时间中产生两倍数量的还原糖。因此，试验流程涉及寻找原始酶储液的稀释度，使得0.5ml小份式样的稀释液会在60分钟内催化2％的转化，然后从所需的稀释度计算原始储液的活性(以FPU_2％/ml为单位)。

使用下式计算FPU：

滤纸活性＝0.37/([酶]释放1.0mg葡萄糖)[单位/ml]

[酶]表示直接测试的酶稀释液中存在的原始酶溶液的比例。

各纤维素酶活性试验

β-葡糖苷酶(WBDG)

在37℃和pH 4.40下，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma，产品目录号N-7006)作为底物，测定β-葡糖苷酶的酶活性。pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷的酶促水解导致对硝基苯酚(pNP)和D-葡萄糖的释放。在碱性条件下测定的定量释放的对硝基苯酚是酶活性的度量。孵育20分钟后，通过添加碳酸钠终止反应，并在405nm的波长下测定吸光度。利用对硝基苯基的摩尔消光系数计算β-葡糖苷酶活性(Sigma，产品目录号N-7660)。

使用的方法是绝对法，并且活性以每ml或每克样品释放的n(纳)摩尔的对硝基苯酚为单位表示。β-葡糖苷酶活性以每克或每毫升的WhiteBiotech β-D-葡糖苷酶(WBDG)为单位表示。一个WBDG单位被定义为在确定的试验条件(4.7mM pNPBDG，pH＝4.40且T＝37℃)下每秒从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷释放1n(纳)摩尔对硝基苯酚的酶量。绝对活性使用本领域已知的标准计算流程计算。

内切葡聚糖酶活性(WBCU)

内切葡聚糖酶催化羧甲基纤维素的水解。酶反应期间形成的还原糖的量用二硝基水杨酸试剂测定。样品在存在羧甲基纤维素(Novacel，ref.394)溶液18g/L时，在乙酸缓冲液pH 4.60中于37℃下孵育。60分钟后通过添加氢氧化钠溶液终止孵育。在存在二硝基水杨酸(Acros15644500)试剂时将样品煮沸5分钟。用水稀释后，在540nm处测量色彩强度。使用所述方法作为比较法(relative method)。结果与具有官方指定活性的纤维素酶组合物比较。活性以WBCU单位为单位表示。WBCU单位被定义为在试验条件下，在1小时内水解一定量糖苷键、等于生产0.5mg葡萄糖的纤维素酶的量。如下计算活性：使用本领域已知的标准计算流程，通过针对具有已知活性的样品活性绘制δOD₅₄₀，之后使用从校准线产生的方程计算未知样品的活性。

蛋白质测量试验

1.总蛋白质

TCA双缩脲

该方法是使用三氯乙酸(TCA)去除干扰物质并允许测定蛋白质浓度的蛋白质沉淀法与色度法双缩脲反应的组合。在双缩脲反应中，铜(II)离子被还原成铜(I)，所述铜(I)与碱性溶液中肽键的氮和碳形成络合物。紫色指示蛋白质的存在。根据Beer-Lambert定律，色彩强度及因而在546nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比。使用BSA(牛血清白蛋白)进行标准化，蛋白质含量以作为BSA当量的g蛋白质/L或作为BSA当量的mg蛋白质/ml为单位表示。如下计算蛋白质含量：使用本领域已知的标准计算流程，通过针对具有已知浓度的样品浓度绘制OD₅₄₆，之后使用由校准线产生的方程计算未知样品的浓度。

2.使用PAGE、光密度计和LC/MS/MS测量各蛋白质

样品预处理SDS-PAGE

基于估计的样品蛋白质浓度，进行以下的样品制备。向10μl样品中添加40μl MilliQ水和50μl TCA(20％)，从而将样品稀释五倍(～1mg/ml)，并使蛋白质沉淀。在冰上放置1小时后，对样品离心(10分钟，14000rpm)。用500μl丙酮洗涤沉淀物并离心(10分钟，14000rpm)。如下文所述处理沉淀物。

SDS-PAGE

将沉淀物溶于65μl MilliQ水、25μl NuPAGE^TM LDS样品缓冲液(4x)Invitrogen和10μl NuPAGE^TM样品还原剂(10x)Invitrogen中。在变性(deanuarion)步骤之前，使用65∶25∶10比例的MilliQ；NuPAGE^TM LDS样品缓冲液和10μl NuPAGE^TM样品还原剂的混合物，将样品稀释5倍。混合后将样品在热混合仪中于70℃下混合10分钟。将样品溶液上样于4-12％Bis-Tris凝胶(NuPAGE^TM BisTris，Invitrogen)上。标记物M12(Invitrogen)的样品(10μl)也被上样在凝胶上。使用XCELL Surelock将凝胶在200V下电泳50分钟，外缓冲腔中是600ml 20x稀释的SDS缓冲液，内缓冲腔中是含有0.5ml抗氧化剂(NuPAGE^TM Invitrogen)的200ml 20x稀释的SDS缓冲液。电泳后，用去矿物质化水将凝胶冲洗两次，用50％甲醇/7％乙酸溶液将凝胶固定1小时，并用Sypro Ruby(每块凝胶50ml)染色过夜。用MilliQ水洗涤凝胶后使用Typhoon 9200(610 BP 30，Green(532nm)，PMT 600V，100微米)制造图像。

蛋白质的定量分析

使用Typhoon扫描仪，使用本领域已知的标准方法测定泳道内蛋白质条带之间的比例。将样品一式三份上样，使用程序Image quant测定灰度值(gray value)。数值被表示为相对于总蛋白质的相对蛋白质％，使用所选择的蛋白质条件的灰度值相对于所有蛋白质条件的总灰度值计算。

用来自BioRad的Exquest Spotcutter(FE003)切下所选择的条带，并在96孔微孔滴定板中用milliQ冲洗。弃去milliQ水，将所有条带第二次切割，以收集更多样品材料。

为了使用LC/MS/MS进行肽序列分析的蛋白质胶内消化

用50mM NH₄HCO₃ pH＝7.8洗涤微孔滴定板中收集的凝胶块。将该步骤进行若干次，每次在使用乙腈的洗涤步骤之间缩小凝胶块，以去除任何杂质并确保胶内消化的理想环境。添加的50mM NH₄HCO₃和乙腈的量随着凝胶块的大小而变化；凝胶块应当充分浸没在溶液中。添加新鲜制备的胰蛋白酶溶液，并将MTP平板在冰上或4℃下于冰箱中孵育至少半小时，之后在37℃下在MTP上放置热盖孵育过夜。过夜孵育后，对凝胶块进行1-5分钟的超声处理，并将流体级分转移进新鲜的LoBind MTP中。为了从凝胶块中取出尽可能多的肽，向凝胶块中添加尽可能少的乙腈和甲酸，之后超声处理1-5分钟。将流体级分转移至LoBind MTP平板，并添加小体积的甲酸。

使用本领域已知的标准LC/MS/MS分析测定胰蛋白酶肽的氨基酸序列。

为了分析肽混合物，使用所谓的测量扫描(survey scan)。其中每次扫描由两段组成的该方法被如下定义：

1.全MS扫描分析，用于基于确定的标准选择用于MS/MS的前体离子

2.对选择的离子进行MS/MS，以获得氨基酸序列信息。

使用该流程，在某些阈值内针对MS/MS一次选择一种前体离子，这得到肽的MS/MS数据组，均代表了蛋白质一部分的氨基酸序列。所有MS/MS谱被用于通过在适当的数据库中使用Mascot搜索引擎进行数据库搜索的蛋白质鉴定。

3.使用APEX蛋白组学分析的各蛋白质

材料

LC-MS/MS系统由来自Thermo Fisher(San Jose，CA，美国)的LTQ-Velos和Accela组成。柱购自Agilent：Zorbax 2.1mm x 5mm C₁₈柱1.8□m颗粒。使用来自Heraeus centrifuge的Biofuse fresco进行微量离心管的离心，使用Beckman Coulter Allegra X-15R进行Greiner管的离心。使用来自Eppendorf(Hamburg，德国)的thermomixer comfort进行孵育，使用Eppendorf Lo-bind管进行所有试验。使用运行反式蛋白组学流水线(Trans-Proteomics Pipeline，TPP)的Sorcerer 2(SageN，San Diego，CA，美国)搜索引擎进行数据库搜索。

使用获得蛋白质数量的免费软件Absolute Protein Expression软件(APEX)http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics/apex.html加工鉴定结果。

分别在水中含0.1％甲酸(FA)和在乙腈中含0.1％FA的LC-MS级缓冲液A和B购自Biosolve(Valkenswaard，荷兰)。牛血清白蛋白(BSA)、尿素、碘乙酰胺(IAA)和三氯乙酸(TCA)、6.1N溶液购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO，美国)。TCA溶液被4.5倍稀释，得到20％的TCA溶液。二硫苏糖醇(DTT)购自Roche Applied Science(Indianapolis IN，美国)。甲酸(FA)购自JT Baker(Phillipsburg，NJ，美国)。测序级别的胰蛋白酶购自Roche applied science(Penzberg，德国)。

TCA沉淀和消化

将样品小心地解冻，并且在样品制备期间尽可能多地储存在冰上。将样品稀释至5mg/ml的蛋白质浓度。用20％TCA对100μl样品和50μl 0.1mg/ml BSA进行1∶1的稀释。将样品在4℃下孵育30分钟，并通过在4℃下13000rpm离心10分钟使蛋白质沉淀。去除上清液，用-20℃的200μl丙酮洗涤沉淀物。再次在4℃下13000rpm离心10分钟使蛋白质沉淀，并去除上清液。

将经洗涤的沉淀物溶于75μl 8M尿素中。用392.5μl 100mMNH₄HCO₃稀释所述溶液。添加5μl 500mM DTT，并将样品在Thermomixer中在最大搅动下于室温下孵育30分钟。通过添加13.5μl 550mM IAA，在暗中在Thermomixer中在最大搅动下于室温下孵育30分钟，使半胱氨酸烷基化。通过添加20μl 250μg/ml胰蛋白酶pH 3，在Thermomixer中在最大搅动下于37℃孵育过夜，来进行消化。再添加5μl250μg/ml胰蛋白酶pH 3，并在37℃下降消化继续3小时以确保完全。

在Accela LTQ-Velos系统(Thermo Electron)上分析样品。

●柱：Agilent 2.1mm x 5mm C₁₈柱1.8□m颗粒

●梯度80分钟5-40％AcN 0.1％甲酸

●2分钟40-60％AcN 0.1％甲酸

●流速400□L/分钟

●注射体积：20□l

●总运行时间包括注射、柱洗涤和再平衡85分钟

●MS方法：前10个峰使用10阶联用增强型(10th order double playenhanced)MS m/z 300-2000和MS/MS

●带电状态注射仅允许2+和3+离子

●动态排除：重复1，排除持续时间10秒

使用Sorcerer和Spotfire进行数据分析

针对Talaromyces emersonii数据库(TEMER)搜索数据，所述数据库被手动编辑，以含有BSA内标的序列。在Sorcerer 2上使用TPP进行数据库搜索。使用标准统计学工具进行数据的统计学分析。

蛋白酶试验

所应用的方法被用于测定酸性条件(pH 3.5)下的蛋白酶活性。在60℃下，在存在血红蛋白(Sigma，产品目录号H2625)时孵育样品。60分钟后通过添加三氯乙酸终止反应。使用Whatman 42滤纸，通过过滤去除形成的沉淀。在280nm下测量的滤液的光密度与在相同系列中测定的校准线溶液的光密度比较。活性以每ml或每克的APU(酸性蛋白酶单位)为单位表示。1个APU是在测试条件下每分钟水解一定量底物、给予下述溶液的酶量，所述溶液在280nm下的光密度与每毫升含1.911μg酪氨酸的溶液的光密度相等。

如下使用本领域已知的标准计算流程计算活性：针对具有已知活性的样品的活性绘制δOD₂₈₀，之后使用由校准线产生的等式计算未知样品的活性。

纤维素酶平板试验

荧光纤维素酶平板试验

分别使用荧光化合物4-甲基伞形酮-β-D-纤维二糖糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside，Sigma，产品目录号M6018)和4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖(Sigma，产品目录号M3633)使在C琼脂平板上生长的菌落的CBH和β-葡糖苷酶活性表达显影。底物4-甲基伞形酮β-D-纤维二糖(MUC)和4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖(MUG)作为DMSO中的10mM储存溶液储存，并且在临使用前用50mM乙酸钠缓冲液pH 4.5进行10x稀释。将获得的溶液过滤灭菌(0.2u)，添加至熔融的琼脂培养基(CTXG)至0.1mM的终浓度，并倒入培养皿中。使用不同浓度的葡萄糖：无、0.1％、0.5％和1％。使用具有0.5％麦芽糖的琼脂平板作为对照。

用来自选定的突变体文库的10⁴个经诱变的孢子接种含有CTXG+荧光底物的Q盘。用参照菌株TEC-147、TEC-123和TEC-101类似地接种琼脂平板作为对照。在40℃下孵育期间，通过在UV光(366nm)下每天检查Q盘，在存在或不存在葡萄糖的情况下针对荧光筛选菌落。总计在荧光琼脂培养基上筛选了10⁶个经突变的孢子。保存在存在或不存在葡萄糖时给予最强荧光的突变体用于进一步研究。

AZCL木聚糖(木聚糖酶平板试验)

使用来自燕麦的彩色化合物AZCL(Megazyme，产品目录号I-AZXOT)使琼脂平板上生长的菌落的木聚糖酶活性表达显影。

使用含有1％纤维素的YNB琼脂，并向琼脂中添加AZCL木聚糖至0.1％的终浓度。还根据需要对琼脂添加2％葡萄糖。使用来自甘油菌种或充分形成孢子的琼脂斜面的孢子悬浮液，在这些琼脂平板上接种(即针对单个菌落划线)要测试的菌株。将琼脂平板在40℃下孵育2-3天。使用菌落周围蓝色晕轮的大小和生长品质来评估不同菌株之间木聚糖酶的生产水平。

诱变条件

孢子的制备

从具有Talaromyces 2培养基琼脂的琼脂平板上收获孢子，所述琼脂平板用来自菌株TEC-101的孢子菌种的10倍稀释的孢子悬浮液接种。在40℃下孵育7天后，通过使用10％甘油溶液从琼脂平板上刮下形成孢子的菌丝体，来完成收获。将孢子悬浮于10％甘油中并储存于-80℃。

NTG

在20ml Talaromyes培养基1中接种T.emersonii孢子批量(≥10⁸个孢子)，并将该培养物在45℃下摇动(280rpm)孵育4小时，以起始孢子的萌发。将孢子悬浮液离心，并通过将沉淀物重悬于10ml含0.01％TritonX100的0.01M TRIS顺丁烯二酸缓冲液pH 8中来浓缩。使用本领域已知的标准方法(CerdáOlmedo，1987，Mutagenesis.In Phycomyces，(E.Cerdá-Olmedo and E.D.Lipson，eds.)，pp.341-344.CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)，通过NTG诱变处理萌发的孢子。

使用的NTG浓度为0、0.05、0.1和0.2mg/ml。使用10％Na₂S₂O₃溶液的添加使NTG反应终止/失活。

诱变后，在生理盐缓冲液中将经处理的细胞洗涤一次，并将稀释液(10^-1-10^-5/ml)涂布在Talaromyces琼脂培养基平板上，以测定细胞存活率。将平板在45℃下孵育3-7天，以测定CFU效价。

使用每个突变体批量(0.5ml)接种含有TEC琼脂的一个Q盘(24cm x 24cm；VWR)。将经突变的细胞悬浮液的剩余部分在含有10％甘油的冷冻管中储存于-80℃下。

然后测定不同突变体批次中FoA^r突变体的频率，以评价突变体批次的质量。将每个突变体批次约～10⁷个孢子涂布在FOA琼脂培养基上。将平板在40℃下孵育3-7天，以测定CFU效价。

具有5-25％细胞存活率并且FoA^r菌落提高至少10倍的突变体批次通常被用于突变体筛选。

UV

使用(Bos，C.J.and Stadler，D，1996.Mutation.In Fungal Genetics，Principles and Practice(C.J.Bos，ed.)，pp 28-31，Marcel Dekker，New York；Bos et al.，1992，Curr.Genet.21：117-120)中已知的标准方法，用UV辐射处理萌发的孢子。

NQO

使用本领域已知的标准方法(Jerzy Bal et al.，1977，Mutation Research56：153-156)，用NQO处理萌发的孢子。简言之，使用的流程可与用于NTG诱变Talaromyces萌发孢子的流程比较。使用的NQO浓度时每份孢子悬浮液0.5、1和2.5μg/ml。存在NQO时的孵育时间是1小时。10％Na₂S₂O₃溶液的添加被用于使NQO反应终止/失活。

用于组合突变的原生质体融合

原生质体形成

用于原生质体形成的条件源自本领域已知的流程(Peberdy，1975，ArchMicro 105：201-205；Peberdy，1985，J.Gen.Microbiol.131：2813-2823)。接种来自Talaromyces培养基1中甘油菌种的、具有不同选择标记物例如FOA(5-氟-乳清酸)抗性和DOG(2-脱氧-D-葡萄糖)抗性的Talaromyces菌株，并在摇瓶中于45℃、280rpm下培养48小时。使用2ml这些接种培养物接种含有50ml YGG培养基(每升：8g KCl、16g葡萄糖.H2O、20ml 10％酵母提取物、10ml 100x pen/strep、6.66g YNB+氨基酸、1.5g柠檬酸和6g K2HPO4)的500ml摇瓶。在250-280rpm下的旋转摇床中，于45℃下将孵育继续16小时。然后通过在50ml Greiner管中于4000rpm离心10分钟或使用Miracloth滤纸(Calbiochem)收获来自这些培养物的菌丝体。将沉淀物洗涤并重悬于0.6M KCl/20mM柠檬酸缓冲液，pH 5.8中。

原生质体分离

对原生质体形成而言，每2g菌丝体添加10ml STC缓冲液(每升：218g山梨糖醇(1,2M)、7.35g CaCl2.2H2O、10mM Tris/HCl pH7.5)和2ml glucanex溶液(H₂O中250mg/ml Glucanex 200G(Novozymes))。将混合物于34℃下在100rpm的旋转摇床中孵育90-150分钟。使用miraclot滤器将原生质体从菌丝体中分离，并添加STC至45ml的终体积。于4℃下在390g下将原生质体悬浮液离心10分钟，随后将原生质体重悬于45mlSTC中。于4℃下将原生质体在390g下离心10分钟，并以10⁷-10⁸个原生质体/ml的浓度重悬于STC缓冲液中。在显微镜下验证原生质体的质量和数量。

原生质体融合：

通过将1ml原生质体悬浮液与6ml含有50mM CaCl₂的60％PEG4000(Merck)混合，之后再室温下孵育15分钟来诱导原生质体融合。孵育后通过添加30ml KCl/柠檬酸缓冲液来稀释PEG，并在2000rpm下离心5分钟。

将沉淀物重悬于2ml新鲜的KCl/柠檬酸缓冲液中，并将该原生质体悬浮液涂布在再生琼脂平板上。为了再生，如所述使用Talaromyces琼脂培养基平板，但是添加山梨糖醇作为渗透稳定剂，终浓度为0.8M。在40℃下孵育7天后，从再生琼脂平板上收获孢子，将这些孢子涂布在选择性琼脂培养基上，以选择具有两种可选择标记物的融合子。

分批发酵

接种步骤：

将一个管的内容物添加至预培养基：带挡板的2L-摇瓶[20g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖、pH 6.8(用KOH调节)、300mL培养基、在121℃下蒸汽灭菌20分钟]中。在48℃和200rpm下将预培养物培养24-48小时。可以使时间适应摇瓶的构型和试管生存力。

主要发酵步骤：

培养基由谷物粉(3％)、纤维素(6％)、氮源(2.5％；本领域已知的氮源的例子包括大豆粗粉、酵母提取物、玉米浆、铵、铵盐、硝酸盐)以及盐级分的混合物组成。盐级分与WO98/37179第12页的表1一致。与该表的不同在于：CaCl2.2aq 1.0g/L、KCl 1.8g/L柠檬酸.1aq 0.45g/L(螯合剂)。将培养基按一个级分蒸汽灭菌。以～10％的接种物比例接种生物反应器，工作体积为10L。(使用磷酸和氨水)将过程的pH控制在5.0-3.0，同时将温度控制在42-52℃。气流被维持在0.5和1.5vvm(每分钟每体积发酵液的空气体积)之间，通过搅动使DOT高于接种前氧饱和度的30％。以周期性的方式使用Clerol作为消泡剂：最初24小时每30分钟2秒，然后每小时2秒。

在预培养阶段结束时，采样进行污染检验、葡萄糖测定和pH测量。在主发酵期间，每24小时采样并进行以下分析：污染控制、pH测量、SDS-PAGE凝胶、总蛋白质浓度测定(TCA双缩脲方法)、滤纸单位活性(FPU_2％/ml)、β-葡糖苷酶(WBDG)活性、内切葡聚糖酶活性(WBCU)和小麦秸试验，如上文所述。

实施例1

该实施例描述了T.emersonii的菌落形态变体的分离和表征。

Talaromyces emersonii是嗜热的丝状真菌。在标准PDA琼脂培养基上的孢子形成非常差(＜10⁶/ml)，在Talaromyces培养基2上的生长给出经改进的孢子形成(～10⁷/ml)。将TEC-1A的系列稀释液涂布在Talaromyces琼脂培养基平板上后，可以鉴别出具有三种不同表型的菌落(图1)：TEC-101，离散的白色气生菌丝体(80％的种群)；TEC-102和TEC-103，减少的气生菌丝体(20％的种群；回收了两个隔离群)；TEC-104，无离散的气生菌丝体，棕色(1％的种群)。在琼脂平板上或液体生长培养基上生长若干代后，TEC-104的表型保持稳定。然而对TEC-101而言，与TEC-104相似的菌落变体继续以低频率生产(＜1％)。

孢子形成测试指示出，TEC-104生产了最高的孢子效价(＞10⁷/ml)。然而在时程摇瓶试验中，仅TEC-101以与亲本TEC-1A相比相似或更高的水平生产纤维素酶(图2)。另外，在10升发酵罐分批发酵中，发酵96小时后TEC-101与TEC-1A均生产5FPU_2％/ml，而TEC-104生产更少的纤维素酶(2.3FPU_2％/ml)。因此，TEC-101给出最好的总体特征，并被选择用于菌株改进。

TEC-101(也被命名为FBG 101)于2010年6月30日以保藏号CBS127450被保藏于CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，NL-3508 AD Utrecht，荷兰。在本文中涉及“野生型Talaromyces菌株”或“野生型菌株”或“野生型”时，均表示和/或使用TEC-101。

实施例2

该实施例描述了通过随机突变体的高通量筛选来分离T.emersonii的经改进的纤维素酶生产突变体。

将经NTG处理的TEC-101孢子从冷冻的菌株涂布在Talaromyces琼脂培养基上，并于40℃下培养4天。将约6000个突变体转移进含有Talaromyces琼脂培养基(200μl/孔)的96孔微量滴定板(MTP)中。将称作“母板(masterplates)”的这些MTP于40℃下孵育5天。保留若干孔为空白，使其之后含有TEC-101未经诱变的亲本和Filtrase

NL酶。

使用自动化接种装置将母板进行平板复制到含有Talaromcyes培养基4(3ml/孔)的24孔MTP中。为此，向母板孔中添加生理盐(150μl/孔)，并将孢子悬浮液转移至24孔MTP。另外，在该流程中接种新的96孔母板(200μl/孔Talaromyces琼脂培养基)。将24孔平板于46℃和80％湿度下于摇床中孵育96小时。将培养物离心以去除生物质，将1ml上清液样品转移至多个管中，使用小麦秸试验测试纤维素酶活性。

生长培养基中纤维素酶活性比来自TEC-101的对照上清液高出20-30％的突变体被选择用于进行更多的筛选轮次。这些筛选轮次比第一次更加严格，使其允许除去假阳性。

从来自第一轮筛选的每个被选择的突变体中，制备每个菌株的两个琼脂斜面，用于在摇瓶培养物种进行第二轮筛选。使用来自培养物的孢子接种一式两份的含有Talaromyces培养基2的摇瓶培养物。在一些系列中，使用第二琼脂斜面首先接种Talaromyes培养基1(在摇瓶中)；培养24小时后，将来自该培养物的1ml接种进摇瓶生产培养基中。

图3中展示了摇瓶中测试的所有突变体的纤维素酶活性(pH 4.5，65℃下20小时的小麦秸试验，未经稀释的样品)。TEC-101对照亲本菌株的纤维素酶活性的均值为62.6±4.9WSU。一个具体的突变体(DoE600)具有63％的显著改进。

在第三轮筛选中，在摇瓶中再次测试来自第二轮测试的最好的突变体菌株中的30个。程序与第二轮筛选中使用的方法相似。通过将来自琼脂斜面的孢子直接接种进生产培养基中，一个一个地测试菌株。图4中展示了所有再测试的菌株生产的概述。

使用用于小麦秸试验的未经稀释的上清液再测试第一摇瓶组(DoE523、529、531、541、552、553、558、618和比正常生产更高纤维素酶水平的TEC-101^*自发突变体；所有其他使用经稀释的样品测试，以防止纤维素酶的葡萄糖产物抑制。通常，大部分菌株具有与亲本菌株相比提高的纤维素酶活性。令人感兴趣的是，菌株DoE 600显示大于100％的最高的改进。

制备来自第三轮筛选的所有30个选择的TEC-101突变体的原始细胞库。菌株ID编号为TEC-107-122、TEC-127-130和TEC-135-144。

剂量应答的小麦秸试验证实与对照亲本菌株TEC-101相比，TEC-142(DoE600)生产几乎两倍的纤维素酶活性(图5)。

实施例3

该实施例描述了纤维素酶经改进的T.emersonii突变体的发酵。

在10升生产发酵罐中作为分批发酵测试了来自随机HTS筛选的纤维素酶生产突变体中的三个TEC-121、TEC-137和TEC-142，和TEC-101的自发突变体TEC-111(先前称作TEC-101^*)。作为对照，类似地评价了其他菌株：原始起始菌株TEC-1A，和TEC-1A的常见菌落变体TEC-101(其为突变体的直接亲本)。

在发酵结束时(96小时)，TCA双缩脲分析揭示了在所有情况下总蛋白质浓度在9-10g/kg的范围内。仅对突变体TEC-142而言，蛋白质水平显著更高，测量约为16.4g/kg(表2)。

表2.T.emersonii纤维素酶生产突变体和亲本菌株的10升发酵罐分批发酵的概述。nd，未测定。

FPU分析结果显示，四种突变体TEC-111、TEC-121、TEC-137和TEC-142比TEC-101亲本菌株生产显著更多的纤维素酶活性(高于10％)(在96小时发酵后作为FPU_2％/ml测量，考虑FPU试验的10％偏差)。另外，TEC-142生产最高的水平15.8FPU_2％/ml，该水平代表与其亲本TEC-101(5.1FPU_2％/ml)相比3倍的改进(表2)。对TEC-142突变体而言，酶试验显示与母体菌株TEC-101(EG水平4580WBCU/ml，小麦秸单位33.1WSU/ml，BG水平151WBDG/ml)相比EG水平(10200WBCU/ml)和小麦秸单位(70.2WSU/16-倍稀释液)的至少两倍的提高，但是BG水平(～155WBDG/ml)无提高。这与突变体TEC-137相反，所述突变体TEC-137的FPU水平的提高(5.9FPU_2％/ml；20％)与BG活性的提高(172WBDG/ml；14％)而不是EG水平(2990WBCU/ml；35％降低)相关(表2)。发现第二最佳的突变体是TEC-121，其显示7.2FPU_2％/ml(40％改进)和48WSU/ml(45％改进)，但相反的是BG和EG活性低于母本菌株。还注意到酸性蛋白酶活性的两倍降低。

剂量应答小麦秸测定试验证实，与对照菌株TEC-1A或亲本菌株TEC-101相比，TEC-142生产几乎两倍的纤维素酶活性(图6)。令人感兴趣的是，使用由该突变体生产的酶检测到低但是显著水平的释放的纤维二糖。

最后，发酵的SDS-PAGE分析显示，在发酵的较晚阶段(72-96小时)生产纤维素酶活性，而在开始时主要形成生物质。另外，明确了在48小时后TEC-137突变体生产最高水平的分泌型蛋白质。该早期分泌归因于在实验室规模发酵罐中或预培养物中这些突变体快速生长的表型。

实施例4

该实施例描述了纤维素酶经改进的T.emersonii突变体TEC-142的表征。

将TEC-142和亲本菌株TEC-101的系列稀释涂布在Talaromyces琼脂培养基平板上，并在46℃下培养96小时。TEC-142的菌落显示比TEC-101更小，并且菌落的颜色也变成绿色。还在含有3％经预处理、洗涤的小麦秸的琼脂平板上测试生长。在46℃下96小时后，不再观察到TEC-142和TEC-101的菌落大小的差异。当TEC-142和TEC-101二者均被涂布在添加或不添加麦芽糖(1％)的C-琼脂上时，二者之间也未观察到生长差异。在含有经预处理、洗涤的小麦秸(3％)的晕轮C-琼脂平板上，在这两种菌株之间也未观察到晕轮大小的差异。最后，与TEC-101相比，TEC-142未显示对葡萄糖类似物(MIC水平上的1-硫代葡萄糖或2-脱氧葡萄糖)的更高抗性。

与光密度计定量和LC/MS/MS鉴定偶联的TEC-142 10升发酵罐分批发酵上清液的SDS PAGE分析验证了纤维素酶的蛋白质水平提高。在亲本菌株TEC-1A中鉴定了至少四种特异性的纤维素酶：纤维二糖水解酶I(CBH I)加纤维二糖水解酶II(CBH II)、内切葡聚糖酶(EG)、β-葡糖苷酶(BG)。还鉴定了一种半纤维素酶，木聚糖酶(表3)。

表3.TEC-1A和TEC-142的相对细胞外蛋白质水平的比较。对来自TEC-1A和TEC-142的96小时10升发酵罐分批发酵的上清液进行SDS-PAGE，并使用公知的数据库通过LC/MS/MS鉴定细胞外蛋白质，通过光密度测量法定量它们的水平。数值贝表示为针对总蛋白质的相对蛋白质％，使用所选择的蛋白质条带的灰度值相对于所有蛋白质条带的总灰度值计算。

^*数值被表示为针对总蛋白质的相对蛋白质％，使用所选择的蛋白质条带的灰度值相对于所有蛋白质条带的总灰度值计算。

该模式与TEC-142的细胞外蛋白质模式的比较显示显著的差异。最重要的EG蛋白被提高至两倍，这对应于EG酶活性的提高。令人感兴趣的是，没有观察到BG或CBH I+II蛋白水平的显著改变。

最后，使用原始的Talaromyces TEC-1A菌株时，在不同琼脂培养基上涂布时观察到TEC-142的至少两种不同的菌落形态：最占优势(总体的90％)的是TEC-101-样(具有离散的气生菌丝体)，最不占优势(总体的10％)的是TEC-104-样(无离散的气生菌丝体，棕色)。纯化这两种变体并分别命名为TEC-146和TEC-147。孢子形成测试表明，TEC-147生产了最高的孢子效价(＞10⁷/ml)。然而，与先前TEC-101和TEC-104的时程摇瓶试验不同，在46℃下培养96小时后Talaromyes培养基2中，TEC-147比TEC-148或TEC-142任一生产多出10％的纤维素酶活性(在小麦秸试验中使用上清液的8倍稀释液)。这随后在10升Eschweiler分批发酵中被证实。在96小时的培养后，TEC-146生产14.9FPU_2％/ml和14.0mg/ml蛋白质(TCA-双缩脲试验)，而TEC-147生产17.3FPU_2％/ml和17.4mg/ml蛋白质。当TEC-147的发酵延长至120小时时，在上清液中检测到20.5FPU_2％/ml和19.4mg/ml蛋白质。

因此，突变体TEC-147组合了经改进的纤维素酶生产和良好的孢子形成特性，这有助于通过经典或基因工程方法进一步改进菌株。

实施例5

该实施例描述了纤维素酶经改进的T.emersonii突变体TEC-142在同时糖化发酵(SSF)应用中的分析。

进行分批SSF试验，以比较突变体TEC-142生产的纤维素酶与Filtrase

NL酶的表现。在这些试验中使用实施例3中制备的经过滤的发酵液。SSF条件是本领域已知的，并且描述于专利申请WO2010018105中。经预处理、洗涤的小麦秸的糖化在起始pH 5下，在56℃下进行20小时。以不同的剂量对发酵批次中直接添加酶组合物，所述剂量被测定为每g葡聚糖+木聚糖含量的mg TCA-双缩脲蛋白。以0.5g/l的浓度添加S.cerevisiae(面包酵母)，并在33℃下进行发酵；对发酵培养基补充0.025％ KH₂PO₄和0.05％(NH₄)₂SO₄。发酵结束时(168小时)使用NMR测量乙醇生产。为此，从每个烧瓶中取出约2ml醪液，将样品在4000rpm下离心7分钟，并将上清液转移至多个管中。将样品储存于-18℃冰箱中直至分析。

如图7中所示，使用相同剂量的Filtrase

NL和来自TEC-142的纤维素酶混合物时，由经预处理、洗涤的小麦秸生产的乙醇的剂量应当曲线几乎是相同的。然而，因为突变体生产的蛋白质是野生型菌株的两倍，所以以发酵结束时的滤液为基础需要50％的体积，导致显著的成本节约。

TEC-142在2009年7月1日被保藏在CENTRAAL BUREAU VOORSCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan 8，P.O.Box 85167，NL-3508 ADUtrecht，荷兰，其保藏号为CBS 124902。

实施例6

该实施例描述了使用葡萄糖类似物，通过合理的选择，分离对纤维素酶生产而言是葡萄糖去调节的T.emersonii TEC-147的突变体。

将TEC-142的10⁷/ml孢子悬浮液的0.1ml稀释液接种在含有递增浓度类似物的YNB+琼脂平板上后，通过检查生长测定多种葡萄糖类似物(2-脱氧葡萄糖、1-硫代葡萄糖、5-硫代葡萄糖)的MIC值。

结果表明这两种菌株的MIC水平为：2-脱氧葡萄糖-0.5g/升；1-硫代葡萄糖-4g/升。

然后将使用UV制备，使用NTG制备，和使用NTG与NQO的组合制备的TEC-147的突变体批次涂布在含有葡萄糖类似物的琼脂平板上(每个平板10⁶个孢子)。使用YNB+琼脂平板+0.1％脱氧葡萄糖或0.4％1-硫代葡萄糖选择想要的葡萄糖类似物抗性突变体。

对每种选择而言，从琼脂平板上挑取100个抗性突变体，并转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。使用斜面接种两组一式两份的含有Talaromyces培养基2的摇瓶，并将培养物在46℃下摇动(280rpm)培养。一组在培养48小时后收获，此时葡萄糖刚刚被耗尽，另一组在培养96小时后收获，此时纤维素酶水平通常是最高的。使用48小时和96小时的纤维素酶生产比例的比较来鉴定关于纤维素酶生产而言是葡萄糖去阻抑的突变体。如下验证葡萄糖阻抑：在摇瓶培养中，将突变体在含有5％葡萄糖的Talaromyces培养基2中培养96小时，并在小麦秸试验中检测酶生产，其至少为在不含葡萄糖的Talaromyces培养基2中类似生长时未经突变的亲本菌株活性的25％。

从该筛选中至少分离出一种突变体，所述突变体相对于亲本对照在48和96小时给出显著更高的酶生产比例，并且对96小时而言，其生产的纤维素酶活性是在不含葡萄糖的Talaromyces培养基2中类似培养时未经突变的亲本菌株活性的25％。本发明因此提供了对纤维素酶生产而言是葡萄糖去阻抑的Talaromyces菌株。

实施例7

该实施例描述了使用随机突变体的高通量筛选，分离在较早的生长时间生产葡萄糖纤维素酶的T.emersonii TEC-147的突变体。

将用UV处理、用NTG处理、或用NTG和NQO的组合处理的TEC-147孢子从冷冻菌株中涂布在含有青霉素(6.7mg/升)和链霉素(10mg/升)抗生素的Talaromyces琼脂培养基上，并在40℃下培养4天。将总计11,000个突变体在含有Talaromyces琼脂培养基(200μl/孔)的96孔平板(MTP)中培养，所述培养基含有抗生素。将称作“母板”的这些MTP在40℃下孵育5天。

将母板平板复制进含有Talaromyces培养基3(300μl/孔)的96孔半深平板中。接种后用透气封膜(breathable seal)覆盖半深孔平板，并放回盖子。将96孔平板在摇床中于44℃和80％湿度下孵育96小时。添加500μl/孔水后，对培养物离心以去除生物质，并将50μl上清液转移至多个管中，以使用小麦秸试验测试纤维素酶活性。

选择生长培养基中纤维素酶活性显著高于来自TEC-147的对照上清液的前10％的突变体(1000个突变体)，如实施例2中所述使用Talaromyces培养基4在24孔MTP格式中进行第二轮筛选。为此，使用来自母板的采样(hits)制备新的96孔母板(200μl/孔Talaromyces琼脂培养基)。使用新的母板一式两份接种24孔平板：一组在摇床中于40℃和80％湿度下孵育72小时，此时葡萄糖刚刚被耗尽，另一组在培养144小时后收获，此时纤维素水平最高。使用72小时和144小时的纤维素酶生产比例的比较来鉴定比亲本对照(TEC-147)更早生产纤维素酶活性的突变体。对培养物离心以去除生物质，并将上清液转移至多个管中，以使用小麦秸试验测试纤维素酶活性。

选择生长培养基中纤维素酶活性显著高于来自TEC-147的对照上清液的前10％的突变体(100个突变体)，在摇瓶培养中进行第三轮筛选。这一轮筛选比前两轮更加严格，使得允许处理假阳性。

从来自第一轮筛选的每个选择的突变体中，在摇瓶培养中制备每个菌株的两个琼脂斜面用于第二轮筛选。使用来自这些培养物的孢子一式两份接种含有Talaromyces培养基2生产培养基的摇瓶培养物。在一些系列中，使用第二琼脂斜面首先接种(摇瓶中的)Talaromyces培养基1；培养24小时后，将来自该培养物中的1ml接种进摇瓶生产培养基中。

在摇瓶中测试所有突变体的纤维素酶活性(pH 4.5下小麦秸试验，20小时，经稀释的样品)。使用实施例3中描述的分批流程，在10升发酵罐中评价所有10种突变体。发现与TEC-147亲本对照相比，一种突变体生产最高和最早的纤维素酶活性水平。

实施例8

该实施例描述了通过原生质体融合组合T.emerersonii纤维素酶经改进的突变体的有益突变。

将来自实施例2的TEC-142的FoA^r变体、TEC-147，或来自实施例7的其经改进的变体与来自实施例6的针对纤维素酶生产而言去阻抑的TEC-142或TEC-147的DG^r或TG^r突变体杂交。将来自每种菌株的大于10⁷个原生质体混合在一起，并添加PEG4000+50mM CaCl₂至40％PEG4000的终浓度。混合并在室温下孵育15分钟后，如所述用KCl/柠檬酸盐缓冲液洗涤原生质体混合物。洗涤后，将原生质体混合物的系列稀释液涂布在如所述添加山梨糖醇的Talaromyces琼脂培养基上。在40℃下孵育7天后，从再生琼脂平板上收获孢子，制备系列稀释液，并将0.1ml散布在Talaromyces琼脂培养基平板上，以获得单个菌落。在一些情况下，对平板添加5-氟乳清酸和脱氧葡萄糖，或添加5-氟乳清酸和硫代葡萄糖，以选择重组融合体。

在24孔平板筛选试验中，针对纤维素酶生产测试约100个单菌落隔离群。使用含有或不含有5％葡萄糖的TEC培养基2，使用TEC142或TEC-147作为参照菌株，在摇瓶中再测试最好的50个纤维素酶生产隔离群。选择具有显著改进的纤维素酶生产，但是对纤维素酶生产而言仍然是葡萄糖去阻抑的五个菌株。

针对10L规模的纤维素酶生产测试选择了两个菌株TEC-PF1和TEC-PF2，它们显示与TEC-142或TEC-147相比＞20％的纤维素酶生产改进，并且仍然是葡萄糖去阻抑的。

实施例9

该实施例描述了使用2-脱氧葡萄糖，通过合理的选择，分离对纤维素酶生产而言是葡萄糖去调节的T.emersonii TEC-142和TEC-147的突变体。

将TEC-142的10⁷/ml孢子悬浮液的0.1ml稀释液接种在含有递增浓度类似物的YNB+琼脂平板上后，通过检查生长测定2-脱氧葡萄糖(DOG)的MIC值。结果表明该菌株的MIC水平为0.5g/升。

使用NTG和NQO的组合制备TEC-142的突变体批次，然后涂布在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上(每个平板10⁶个孢子)。从琼脂平板上挑取约300个DG^r突变体，并转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。孢子形成后，在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上纯化突变体。在40℃下孵育3-4天后，将单个菌落转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。使用来自这些斜面的孢子接种含有Talaromyces培养基2的一式两份的两组摇瓶，并将培养物在46℃下摇动培养。一组在培养48小时后收获，此时葡萄糖刚刚被耗尽，另一组在培养96小时后收获，此时纤维素酶水平通常是最高的。使用48小时和96小时的纤维素酶生产比例的比较来鉴定关于纤维素酶生产而言是葡萄糖去阻抑的突变体。至少有三种突变体倍鉴定为在两个时间点之间具有高的TEC生产比例(＞0.5的比例)：DOG32、DOG33和DOG264。如下验证葡萄糖阻抑：在摇瓶培养中，将突变体在含有5％葡萄糖的Talaromyces培养基2中培养96小时，并检测24、48、72和96小时的酶生产。与在相同时间段中不生产可检出水平TEC的对照菌株TEC-101、TEC-142和TEC-147相比，在存在葡萄糖时两种突变体(DOG33和DOG264)生产显著量的TEC(表4)。

表4.在存在5％葡萄糖和3％纤维素时培养的突变体TEC生产的时程生产。

从该筛选中选择DOG33(再命名为TEC-152)进行进一步的研究。在含有或不含5％葡萄糖的含Talaromyces培养基2的SF培养物中，TEC生产的比较显示葡萄糖去阻抑为74％(即在SF培养物中孵育96小时后，与不存在葡萄糖时生产的水平相比，突变体生产减少25％的TEC)。SDS-PAGE证实在存在葡萄糖时培养TEC-152时，纤维素特异性蛋白质条带的生产。

将TEC-152菌落划线在含有5％葡萄糖和荧光指示剂MUG和MUC之任一的C-培养基上时，在46°下培养72小时后检测到强烈的荧光，但是使用TEC-142时没有或几乎没有荧光。这表明在存在葡萄糖时培养细胞时，CBH和β-葡糖苷酶活性显著提高，这是如所预期的葡萄糖去阻抑。

类似地，将TEC-152涂布在含有5％葡萄糖和AZCL木聚糖的C培养基上时，在46℃下培养72小时后检测到强烈的蓝色，而使用TEC-142则没有或几乎没有颜色。这表明在存在葡萄糖时培养细胞时，木聚糖酶活性显著提高，这是如所预期的葡萄糖去阻抑。

使用类似的途径获得TEC-147的葡萄糖去阻抑突变体。将使用NTG和NQO的组合制备的TEC-142的突变体批次涂布在含有1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上(每个平板10⁶个孢子)。从琼脂平板上挑取约400个DG^r突变体，并转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。孢子形成后，在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上纯化突变体。在40℃下孵育3-4天后，将单个菌落转移至Talaromyces琼脂培养基斜面。使用来自这些斜面的孢子接种具有含5％葡萄糖的Talaromyces培养基2的摇瓶，并将培养物在46℃下摇动培养。获得在72小时时生产显著水平TEC的若干突变体(＞10wsu/样品的8x稀释液)，而TEC-147亲本对照不生产显著可检出水平的TEC(＜1wsu/样品的8-倍稀释液)。基于在使用含5％葡萄糖的TEC培养基的SF研究中120小时生长中优秀的TEC生产，保留三种突变体用于进一步的研究：TEC-162(DOG-540)、TEC-164(DOG-563)和TEC-165(DOG-568)。在这三者中，TEC-165是最好的突变体，其在TEC培养基中针对SF培养物培养时比TEC-147生产多出～15％的TEC。

将TEC-165菌落划线在含5％葡萄糖和荧光指示剂MUG和MUC之任一的C-培养基上时，在46°下培养24小时后检测到强烈的荧光，但是使用TEC-142或TEC-14任一时没有或几乎没有荧光。这表明在存在葡萄糖时培养细胞时，CBH和β-葡糖苷酶活性显著提高，这是如所预期的葡萄糖去阻抑。

类似地，将TEC-165涂布在含有5％葡萄糖和AZCL木聚糖的C培养基上时，在40℃下培养72小时后检测到强烈的蓝色，而使用TEC-142和TEC-147时则没有或几乎没有检测到颜色。这表明在存在葡萄糖时培养细胞时，木聚糖酶活性显著提高，这是如所预期的葡萄糖去阻抑。

TEC-165和TEC-152的比较表明TEC-165是更好的葡萄糖去阻抑的突变体，在含有5％葡萄糖的TEC培养基中培养96小时时，其比TEC-152生产多出＞50％的TEC，尽管TEC-165仅是50％葡萄糖去阻抑的(即在SF培养物中孵育96小时后，与不存在葡萄糖时生产的水平相比，存在葡萄糖时突变体生产少50％的TEC)。

SDS-PAGE证实在存在葡萄糖时培养TEC-165时，纤维素特异性蛋白质条带的生产。然而，与来自TEC-152的条带相比，纤维素特异性蛋白质条带更浓。

实施例10

该实施例描述了使用随机突变体的高通量筛选来分离T.emersoniiTEC-147的下述突变体，所述突变体在更早或更晚的生长时间生产更高的葡萄糖纤维素酶水平。

将用UV处理、用NTG处理、或用NTG和NQO的组合处理的TEC-147孢子从冷冻菌株中涂布在含有青霉素(6.7mg/升)和链霉素(10mg/升)抗生素的Talaromyces琼脂培养基上，并在40℃下培养4天。将总计11,000个突变体在含有Talaromyces琼脂培养基(200μl/孔)的96孔微量滴定板(MTP)中培养，所述培养基含有抗生素。将称作“母板”的这些MTP在40℃下孵育5天。

选择生长培养基中纤维素酶活性显著高于来自TEC-147的对照上清液的前10％的突变体(＞1100个突变体)，如实施例2中所述使用Talaromyces培养基4在24孔MTP格式中进行第二轮筛选。为此，使用来自母板的采样(hits)制备新的96孔母板(200μl/孔Talaromyces琼脂培养基)。使用新的母板一式两份接种24孔平板(具有透气封膜和盖子)：一组在摇床中于40℃和80％湿度下孵育72小时，此时葡萄糖刚刚被耗尽，另一组在培养144小时后收获，此时纤维素水平最高。使用72小时和144小时的纤维素酶生产比例的比较来鉴定比亲本对照(TEC-147)更早或更晚生产纤维素酶活性的突变体。对培养物离心以去除生物质，并将上清液转移至多个管中，以使用小麦秸试验测试纤维素酶活性。在所有中保留24个突变体(A组)，其中TEC活性比TEC-147显著更高。回收另外72个突变体(B组)，其中144小时时的TEC生产显著高于来自TEC-147的对照上清液。在这96个突变体中，11个是相同的(C组)。然后在摇瓶培养中针对提高的TEC生产测试两组突变体。

为此，制备每种菌株的琼脂斜面，用于第一轮筛选。使用来自这些培养物的孢子接种含有Talaromyces培养基2培养基的摇瓶培养物。将突变体培养96小时，并在24、48、72和96小时时监测酶生产。纤维素酶活性(pH 4.5，20小时，8x稀释的样品的小麦秸试验)表明，一种突变体EVE750比亲本对照TEC-147生产多出25-50％的TEC，如表5中所示。该突变体来自B组。

表5.在含有TEC培养基的SF培养物中培养的突变体TEC生产的时程生产。

将该突变体保留用于进一步研究，并再命名为TEC-180。通过在TEC琼脂培养基中再划线，制备TEC-180的各菌落，并针对TEC生产再测试10个菌落。菌落中只有两个(再命名为TEC-192和TEC-193)生产比TEC-147亲本对照菌株多出＞25％的TEC。制备TEC-180、TEC-192和TEC-193的WCB。剂量应答小麦秸试验证实，TEC-192和TEC-193比对照亲本菌株TEC-147生产多出＞25％的纤维素酶活性。

实施例11

该实施例描述了葡萄糖去阻抑的突变体TEC-165和其他纤维素酶经改进的T.emersonii突变体TEC-192和TEC-193的发酵。在10升生产发酵罐中作为分批发酵测试前述突变体。

突变体TEC-165显示了约24-30小时的长滞后期(lag-phase)，这最可能归因于预培养物中相对较差的生长。因为这一原因，所述突变体的生长多延长了一天，并且发酵终点为117小时后。相反，对突变体TEC-192和-193而言，几乎没有观察到任何滞后期，并且发酵在91小时后结束。

在发酵结束时，TCA-双缩脲分析揭示TEC-192和-193的总蛋白质浓度为～17g/kg，而对TEC-165而言略高(18.8g/kg)。这些数值与亲本菌株TEC-147(17.5g/kg)处于相同的范围内(表6)。

表6.T.emersonii纤维素酶生产突变体TEC-165，-192，-193及其亲本菌株TEC-147的10升发酵罐分批发酵的概述。nd，未检测。

^*不同的小麦秸批次。

FPU分析结果显示，所有三种突变体都比TEC-147亲本菌株生产更多的纤维素酶活性(在发酵结束时作为FPU_2％/ml测量)。在91小时后TEC-192和-193生产相同的纤维素酶活性，所述活性比TEC-147显著更高(15％)。考虑与亲本菌株相比更高的纤维素酶活性和更短的总发酵时间，对生产力的影响甚至更大(提高21％)。基于小麦秸试验，突变体TEC-192和-193与亲本菌株之间的差异低得多，因为在前一情况下使用新的小麦秸批次，所述小麦秸批次通常比旧的批次产生低5-10％的活性值。对TEC-165而言，纤维素活性的提高(在发酵结束时作为FPU_2％/ml测量)为7％，这落入FPU试验所具有的10％的误差范围内(表6)。因为突变体TEC-165所显示的更长的滞后期，生产力与亲本菌株相比更低。WSU活性也更低，但是不能得出具体的结论，因为分析使用不同的小麦秸批次。最后，所有发酵的SDS-PAGE分析显示，纤维素酶活性在发酵的较晚阶段(72-117小时)生产，而在开始时主要形成生物质。

实施例12

该实施例描述了使用2-脱氧葡萄糖，通过合理的选择分离T.emersoniiTEC-180的突变体及其隔离群TEC-192和TEC-193，所述突变体和隔离群对纤维素酶生产而言是葡萄糖去调节的。

将TEC-180的10⁷/ml孢子悬浮液的0.1ml稀释液接种在含有递增浓度类似物的YNB+琼脂平板上后，通过检查生长测定2-脱氧葡萄糖的MIC值。结果表明该菌株的MIC水平为0.5g/升。

将使用NTG和NQO的组合制备的TEC-180的突变体批次涂布在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上(每个平板10⁶个孢子)。从琼脂平板上挑取约100个DG^r突变体，并转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。孢子形成后，在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上再次纯化突变体。在40℃下孵育3-4天后，将单个菌落转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。使用来自这些斜面的孢子接种含有Talaromyces培养基2的摇瓶，并将培养物在44℃下摇动(280rpm)培养，所述Talaromyces培养基2含有5％葡萄糖。获得在72小时时生产显著水平TEC(＞10wsu/样品的8x稀释液)的若干突变体，而TEC-180亲本对照不生产显著可检出水平的TEC(＜1wsu/样品的8-倍稀释液)。基于在使用含5％葡萄糖的TEC培养基的SF研究中72小时生长中优秀的TEC生产，保留三种突变体用于进一步的研究：TEC-199(DOG158A)、TEC-200(DOG172A)和TEC-201(DOG173A)。这些突变体与TEC-165的比较表明，在含5％葡萄糖的TEC培养基中培养72小时后，所有均生产比TEC-165更高的TEC效价(表7)。SDS-PAGE证实在存在葡萄糖时培养每种突变体时，纤维素特异性蛋白条带的生产。

表7.在存在5％葡萄糖和3％纤维素时培养时，突变体的TEC生产的时程生产。

从该筛选中选择所有三种突变体用于进一步的研究。含有Talaromyces培养基2(含或不含5％葡萄糖)的SF培养物中TEC生产的比较显示，对所有而言葡萄糖去阻抑为50％(即在SF培养物中孵育96小时后，与不存在葡萄糖时生产的水平相比，存在葡萄糖时突变体生产少50％的TEC)。另外，三种突变体均在TEC培养基(无葡萄糖)中保留了它们的高TEC生产水平，比TEC-147亲本生产多出25-50％的TEC。另外，含有荧光指示剂MUG或MUC或色彩指示剂AZCL木聚糖的平板试验表明，CBH和β-葡糖苷酶活性和木聚糖酶活性是葡萄糖去阻抑的。

使用类似的途径获得TEC-192和TEC-193的葡萄糖去阻抑突变体。将使用NTG和NQO的组合制备的TEC-192和TEC-193的突变体批次涂布在含有1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上(每个平板10⁶个孢子)。从琼脂平板上挑取约75个DG^r突变体，并转移至Talaromyces琼脂培养基斜面上。孢子形成后，在含有0.1％脱氧葡萄糖的YNB+琼脂平板上再次纯化突变体。在40℃下孵育3-4天后，将单个菌落转移至Talaromyces琼脂培养基斜面。使用来自这些斜面的孢子接种具有含5％葡萄糖的Talaromyces培养基2的摇瓶，并将培养物在46℃下摇动培养。获得在72小时时生产显著水平TEC的若干突变体(＞10wsu/样品的8x稀释液)，而TEC-192和TEC-193亲本对照不生产显著可检出水平的TEC(＜1wsu/样品的8-被稀释液)。基于在使用含5％葡萄糖的TEC培养基的SF研究中72小时生长中优秀的TEC生产，保留四种突变体用于进一步的研究：TEC-205(DOG235A)、TEC-207(DOG340A)、TEC-209(DOG343A)和TEC-210(DOG344A)(表8)。含有Talaromyces培养基2(含或不含5％葡萄糖)的SF培养物中TEC生产的比较显示，对所有而言葡萄糖去阻抑为50％(即在SF培养物中孵育96小时后，与不存在葡萄糖时生产的水平相比，存在葡萄糖时突变体生产少50％的TEC)。然而，基于该测量，突变体TEC-209(DOG343A)是＞60％葡萄糖去阻抑的，但是在不含葡萄糖的A350％中培养时TEC水平低于其他突变体。最后，所有三种突变体均在TEC培养基(无葡萄糖)中保留了它们的高TEC生产水平，比TEC-147亲本生产多出25-50％的TEC。选择所有四种突变体用于进一步的研究。另外，含有荧光指示剂MUG或MUC或色彩指示剂AZCL木聚糖的平板试验表明，在这些突变体中CBH和β-葡糖苷酶活性和木聚糖酶活性是葡萄糖去阻抑的。

表8.在存在5％葡萄糖和3％纤维素时培养时，突变体的TEC生产的时程生产。

实施例13

该实施例描述了葡萄糖去阻抑的T.emersonii突变体的表征。

在生长和酶生产方面，TEC-165相对于其亲本TEC-147显示了若干不同的特性。首先，涂布在琼脂培养基上时，TEC-165的菌落显示显然小于亲本菌株TEC-147，表明显著更慢的生长(图8)。在摇瓶培养中也观察到这种缓慢的生长特性。使用其他葡萄糖去阻抑的菌株TEC-152、TEC-199、TEC-200、TEC201、TEC-205、TEC-209和TEC-210也观察到类似的缓慢生长的特性。

酶平板试验也表明在存在葡萄糖时，葡萄糖去阻抑的突变体与其亲本菌株在酶生产方面的显著差异。在含有2-5％葡萄糖和分别用于使CBHI+II和β-葡糖苷酶活性的表达显影的荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-纤维二糖糖苷和4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖的TEC培养基上培养时，TEC-165菌落比TEC-101或TEC-147生产更强烈的荧光(图9)，表明TEC-165中具有比TEC-147重更多的CBH和β-葡糖苷酶活性。使用所有其他葡萄糖去阻抑的突变体观察到类似的结果。

最后，除了显示木质纤维素降解酶的提高以外，酶平板试验还表明TEC-165中木聚糖酶、半纤维素降解酶的显著提高。在含有2-5％葡萄糖和色彩底物AZCL木聚糖的TEC培养基上培养时，葡萄糖去阻抑的突变体TEC-165、TEC-199、TEC-201和TEC-207菌落在菌株周围生产与TEC-147或TEC-193相比更强烈的蓝色晕轮(图10)，表明在葡萄糖去阻抑的突变体中具有比非葡萄糖去阻抑的亲本菌株更多的木聚糖酶活性。使用所有其他葡萄糖去阻抑的突变体观察到类似的结果。

因此，葡萄糖去阻抑的突变体组合了经改进的纤维素酶和半纤维素酶生产。

诱变试验的结论

使用UV、NTG、NQO、和NTG+NQO组合来诱变来自142菌株组(TEC-142和TEC-147)和180菌株组(TEC-180、TEC-192和TEC-193)的菌株。使用容易评分的表型(例如对5-FOA的抗性)，通过测定突变体频率的提高来评估诱变效率。大部分有效的UV和NTG处理给出～100的可比较的突变因数。NTG和NQO的组合给出更高的杀伤，并导致＞100的高得多的突变因数。针对2-脱氧葡萄糖(DOG)的突变体的预选择被证实是获得葡萄糖去阻抑的纤维素酶突变体的一种有效方法。来自142菌株组的最佳去阻抑突变体是TEC-165，其得自NTG+NQO处理。TEC-165在添加5％葡萄糖的标准摇瓶培养基中生产的TEC活性约为在不添加葡萄糖的相同摇瓶培养基中能够获得的TEC活性的50-60％；TEC-142在存在葡萄糖时生产少于1％。10L规模的发酵证实菌株TEC-165的葡萄糖去阻抑的表型。迄今为止，180菌株组的最佳葡萄糖去阻抑突变体(在分批发酵中比TEC-14的TEC生产好15％)是TEC-200和TEC-205。使用葡萄糖培养基的摇瓶中任一菌株的TEC生产比TEC-165高出10-20％。10L规模的发酵证实了菌株TEC-201、TEC-205、TEC-209和TEC-210的葡萄糖去阻抑的表型。

实施例14

该实施例针对通过蛋白组学测定的提高的特定纤维素酶水平，描述了纤维素酶经改进的T.emersonii突变体TEC-147、TEC-165、TEC-180和TEC-192的表征

TEC-147、TEC-165、TEC-180和TEC-192的10升Eschweiler分批发酵上清液的SDS PAGE分析，与通过使用EST和全基因组序列数据库(APEX)的LC/MS/MS鉴定进行的鉴定和定量偶联，验证了TEC纤维素酶的蛋白质水平得到提高。与亲本菌株FBG-101相比，至少鉴定了六种特定的纤维素酶：纤维二糖水解酶I(CBH I：分子量48690道尔顿)，纤维二糖水解酶II(CBH II：分子量46674道尔顿)，三种内切葡聚糖酶(EG：分子量24136道尔顿；EG/CEA，分子量36825道尔顿；和EG/CEB：分子量51462道尔顿)和一种β-葡糖苷酶(BG：分子量94888道尔顿)。另外鉴定了至少两种半纤维素酶，木聚糖酶(分子量43818道尔顿)和乙酰基木聚糖酯酶(AXE：分子量32538道尔顿)，和三种推定的能够帮助木质纤维素降解的蛋白质，EG/GH61蛋白质(分子量27007道尔顿)、膨胀因子样蛋白(分子量67911道尔顿)和碳水化合物降解蛋白(分子量22993道尔顿)(表9)。

TEC-101细胞外蛋白质模式与突变体的这些模式的比较显示了重要的差异。所有突变体都比对照生产更多的CBH I和CBH II；提高通常在2-3倍的范围内。只有TEC-147和TEC192具有显著更高的EG/CEA蛋白质水平。对EG/CEB而言未检测到差异，但是观察到第三种EG(EG分子量24136道尔顿)的降低。与TEC-101对照相比观察到可变的BG水平：TEC-147中降低，TEC-165中提高，TEC-165和TEC-192中无改变。

对半纤维素酶而言，与TEC-101相比在4种突变体中的3种中观察到显著的木聚糖酶提高，但是在TEC-192中则无。还检测到乙酰基葡聚糖酯酶的提高，但是仅对TEC-180而言是显著的。最后对于被认为有助于木质纤维素降解的辅助蛋白而言，三种蛋白质显示在突变体中比TEC-101显著更高的水平：EG/GH61蛋白和膨胀因子样蛋白。所述提高为3-4倍和＞10倍。最后，在测试的所有突变体中，还显示碳水化合物降解蛋白(分子量22993道尔顿)显著提高(1.8倍或更高)。

表9.Talaromyces菌株TEC101、TEC-147、TEC-165、TEC-180和TEC-192^a的相对纤维素酶和其他蛋白质水平(APEX)的比较。

^a对来自96小时10升Eschweiler分批发酵的上清液进行SDS-PAGE，通过使用EST和全基因组序列数据库的LC/MS/MS鉴定对其细胞外蛋白质进行鉴定和定量。所有数据以所检测的蛋白质的百分比表示。粗体的数值表明后代菌株中的水平与TEC-101菌株有统计学显著性的差异(在学生T检验中p-值≤0.05，两侧，不等方差)。带有星号的数值表明TEC-147和后代菌株之间有统计学显著性改变的水平(在学生T检验中p-值≤0.05，两侧，不等方差)。底部展示了以FPU_2％/ml为单位的来自分批发酵的TEC水平；n.d.未检测。

^b列出的纤维素酶和辅助蛋白的总和。

^c列出的纤维素酶、半纤维素酶和辅助蛋白的总和。实际上蛋白质水平的所有这些改变发生在得到菌株TEC-147的第一次HTS诱变和筛选中。然而，在TEC-165中观察到木聚糖酶丰度的进一步改进(10％)，在TEC-192中观察到CBH I的进一步改进(20％)。在TEC-147中BG也相对于TEC-101显著降低，在TEC165、TEC-180和TEC-192中相对于TEC-101中的水平显著提高。

总体而言，这六种纤维素酶、两种半纤维素酶和三种辅助蛋白的蛋白质含量的提高从TEC-101中的27％显著提高至突变体中的超过50％。然而，仅考虑六种纤维素酶和三种辅助蛋白时，发现与TEC-147相比TEC-192的显著提高，再次显示第二次CSI活动导致纤维素酶生产的进一步改进。

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(该表并非并且不被计入为国际申请的一页)

Claims

1.Talaromyces菌株，其具有至少6FPU_2％/ml，至少7FPU_2％/ml，至少8FPU_2％/ml，至少10FPU_2％/ml，至少12FPU_2％/ml，至少15FPU_2％/ml，至少18FPU_2％/ml，或至少20FPU_2％/ml的纤维素水解活性。

2.根据权利要求1所述的Talaromyces菌株，其具有至少5000WBCU/ml，至少6000WBCU/ml，至少7000WBCU/ml，至少8000WBCU/ml，至少9000WBCU/ml，或至少10000WBCU/ml的内切葡聚糖酶活性。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的Talaromyces菌株，其具有至多60APU/ml，至多50APU/ml，至多40APU/ml，或至多35APU/ml的酸性蛋白酶活性。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的Talaromyces菌株，其具有孢子形成作用，并且生产至少10⁶/ml的孢子效价。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的Talaromyces菌株，其是Talaromyces emersonii菌株。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的Talaromyces菌株，其是葡萄糖去阻抑的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的Talaromyces菌株，其在葡萄糖的存在下生长时生产木聚糖酶。

8.根据权利要求1-8中任一项所述的Talaromyces菌株，其包含CreA的缺失或改变。

9.根据权利要求1-9中任一项所述的Talaromyces菌株，其是具有保藏号CBS 124902的菌株，或具有保藏号CBS127389的菌株，或其功能等同的突变体。

10.通过野生型Talaromyces菌株的突变生产的突变体Talaromyces菌株，其中一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株中的蛋白质水平被提高到至少1.5倍，或至少2倍，所述蛋白质是CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、EG/GH61和/或分子量约22993道尔顿的碳水化合物降解蛋白。

11.根据权利要求10所述的突变体，其中所述CBH I具有约48690道尔顿的分子量，和/或所述CBH II具有约46674道尔顿的分子量，和/或所述EG/CEA具有约36825道尔顿的分子量，和/或所述EG/CEB具有约51462道尔顿的分子量，和/或所述乙酰基木聚糖具有约48690道尔顿的分子量，和/或所述膨胀因子样酶具有约67911道尔顿的分子量，和/或所述EG/GH61具有约27007道尔顿的分子量。

12.根据权利要求10或11所述的突变体Talaromyces菌株，其中下述蛋白质的蛋白质水平被提高到至少1.5倍，优选地提高到至少2倍，所述蛋白质是CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白、EG/GH61和分子量约22993道尔顿的碳水化合物降解蛋白。

13.根据权利要求10到12中任一项所述的突变体Talaromyces菌株，其中一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株被提高，优选地所述水平被提高到至少2倍，所述蛋白质是EG/GH61蛋白、膨胀因子样蛋白、和/或未知功能的蛋白质(Temer1170)。

14.根据权利要求10到13中任一项所述的突变体Talaromyces菌株，其中与野生型Talaromyces菌株相比，一种或多种下述蛋白质的蛋白质水平相对于野生型Talaromyces菌株中的蛋白质水平被降低，优选地蛋白质水平被降低至少2倍，所述蛋白质是内切葡聚糖酶EG、木糖苷酶、壳多糖酶和/或蛋白酶。

15.根据权利要求14所述的突变体Talaromyces菌株，其中所述内切葡聚糖酶EG具有约24136道尔顿的分子量，和/或所述木糖苷酶具有约95022道尔顿的分子量，和/或所述壳多糖酶具有约45111道尔顿的分子量，和/或所述蛋白酶具有约28800道尔顿的分子量。

16.根据权利要求10-15中任一项所述的突变体Talaromyces菌株，其中EG/GH61蛋白质水平与a)EG、b)EG/CEA和c)EG/CEB一起的蛋白质水平总和的比例至少为0.8，优选地至少为1.0。

17.根据权利要求10-16中任一项所述的突变体Talaromyces菌株，其中所述蛋白质CBH I、CBH II、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙酰基木聚糖酯酶、膨胀因子样蛋白的蛋白质水平和碳水化合物降解蛋白Temer01170的蛋白质水平不被葡萄糖阻抑。

18.包含纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)的酶组合物，其中所述组合物包含40％(通过SDS-page检测的针对总蛋白质的相对蛋白质％)或更多的CBH，和20％(通过SDS-page检测的针对总蛋白质的相对蛋白质％)或更多的EG。

19.根据权利要求18所述的酶组合物，其中所述酶组合物的蛋白酶活性为至多60APU/ml，至多50APU/ml，至多40APU/ml，或至多35APU/ml。

20.用于将木质纤维素材料转化成有用的产品的方法，所述方法包括以下步骤：a)预处理一种或多种木质纤维素材料，以生产经预处理的木质纤维素材料；b)对所述经预处理的木质纤维素材料进行酶处理，以生产一种或多种糖；c)将所述糖转化成一种或多种有用的产品，和d)分离所述一种或多种有用的产品，其中在步骤a)、b)或c)中使用或添加根据权利要求18或19的酶组合物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述木质纤维素材料是果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海藻，软木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，甘蔗渣，玉米，玉米棒，玉米粒，来自玉米粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多的组合。

22.根据权利要求20或21的方法，其中所述有用的产品是以下之一种或多种：乙醇、丁醇、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。

23.用于制备Talaromyces突变体菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

b)对所述菌落变体进行诱变，并针对高纤维素酶活性筛选得到的突变体；

h)对来自步骤g)的菌株进行诱变，并针对对葡萄糖类似物(例如2-脱氧-D-葡萄糖[DOG])的抗性筛选得到的突变体；