MX2011001535A - Degradacion de material lignocelulosico. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para el tratamiento de material lignocelulósico método que comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con una composición que comprende dos o más actividades enzimáticas, siendo dichas actividades enzimáticas actividades de celulasa y/o hemicelulasa, donde el pH durante el pretratamiento es aproximadamente 4.5 o inferior, y el tratamiento se lleva a cabo con un contenido de materia seca de 15% o más.

Description

DEGRADACIÓN DE MATERIAL LIGNOCELULOSICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con métodos para degradar material lignocelulósico y métodos para producir un azúcar o azúcares a partir de tal material. La invención también se relaciona con métodos para producir un producto de fermentación .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carbohidratos constituyen los compuestos orgánicos ¦más abundantes sobre la tierra. Sin embargo, mucho de este carbohidrato está secuestrado en polímeros complejos que incluyen almidón (el principal carbohidrato de almacenamiento en semillas y granos) , y una colección de carbohidratos y ligninas conocidas como lignocelulosa . Los principales componentes de carbohidratos de lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas . Estos polímeros complejos se denominan frecuentemente de forma colectiva como lignocelulosas .

La bioconversión de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que se fermente subsecuentemente para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como alternativa a los combustibles líquidos a atraído una intensa atención de los investigadores desde los años 70, cuando surgió la crisis del petróleo debido al descenso en la producción de petróleo por la OPEP. El etanol sido usado ampliamente como una mezcla al 10% en gasolina en los Estados Unidos o como único combustible para los vehículos en Brasil en las últimas dos décadas. Más recientemente, el uso delE85, una mezcla con 85% de etanol ha sido implementado especialmente para aplicaciones de ciudades limpias. La importancia del combustible bioetanol se incrementará en paralelo con el incremento en los precios para el petróleo y en el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente , los azúcares fermentables que están siendo utilizados para producir plásticos, polímero y otros productos con base biológica y se espera que esta industria crezca sustancialmente incrementando por lo tanto la demanda de azúcares fermentables de bajo costo abundantes que puedan utilizarse como materias primas en lugar de materias primas basadas en el petróleo.

El secuestro de tales grandes cantidades de carbohidratos en biomasas vegetales proporciona una fuente abundante de energía potencial en la forma de azúcares, tanto de azúcares de cinco carbonos como de seis carbonos que podrían ser utilizados para numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, el enorme potencial energético de estos carbohidratos esta actualmente subutilizado puesto que los azúcares están asegurados en polímeros complejos y por tanto no son fácilmente accesibles a la fermentación. Los métodos que generan azúcares a partir de biomasa vegetal proveerían materias primas abundantes, económicamente competitivas para la fermentación en productos químicos, plásticos y combustibles.

Independientemente del tipo de materia prima celulósica, el costo y la eficiencia hidrolítica de las enzimas son los mayores factores principales que restringen la comercialización de los procesos de bioconversión de biomasas . Los costos de producción de enzimas producidas microbiológicamente están estrechamente conectadas con una productividad de la cepa productora de la enzima y la actividad final producida en el caldo de fermentación.

A pesar de la investigación continua de las últimas décadas para entender la degradación de la biomasa lignocelulósica enzimática y la producción de celulasa, es aún deseable descubrir o diseñar nuevas celulasas y hemicelulasas altamente activas. También sería altamente deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficientes capaces de llevar a cabo una biodegradacion rápida y eficiente de los materiales lignocelulósicos .

Además, las enzimas disponibles actualmente que tienen actividad celulasa, derivadas típicamente de Trichoderma, funcionan a temperaturas mesofílicas, tales como desde 45°C a 50°C y a un pH 5.0. Esto, sin embargo, puede llevar a infección bacteriana que reduce el rendimiento del producto, de manera que es deseable llevar a cabo la sacarificación a una temperatura de 65 °C o mayor. Además, el uso de temperaturas mesofílicas incrementa la viscosidad de la biomasa que está siendo usada de tal forma que se limita el contenido de materia seca. También, cuando la biomasa pretratada con ácido se utiliza como un sustrato, el pH debe ser elevado de tal forma que la enzima pueda sacarificar los azúcares en la biomasa. En el contexto de una industria etanólica de combustible viable, esto implica un requerimiento de, por ejemplo, hidróxido de sodio o sulfato de calcio y la producción de enormes cantidades de las sales correspondientes, por ejemplo yeso en el caso del hidróxido de sodio. De acuerdo con lo anterior, es deseable llevar a cabo la sacarificación utilizando una enzima que pueda operar a un pH de pH 4.0 o inferior.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Hemos demostrado que una preparación enzimática derivada de Talaromyces emersonii puede hidrolizar de forma extremadamente efectiva el material lignocelulósico, por ejemplo, residuos de maíz o heno de trigo, en azúcares monoméricos que puedan ser convertidos en un producto útil, tal como etanol . La preparación enzimática comprende actividades de celulasa y hemicelulasa .

Sorprendentemente, esta invención muestra ahora que dicha preparación enzimática puede ser utilizada para llevar a cabo una hidrólisis altamente efectiva de un sustrato lignocelulósico (alcanzando en exceso el 90% de conversión de la celulosa) . La preparación tiene una actividad específica más alta que otros productos disponibles en el mercado. Esto es altamente significativo en el contexto de la producción de etanol combustible comercialmente viable a partir de biomasa lignocelulósica puesto que se requerirán cantidades más bajas de enzimas (en comparación con los productos actualmente disponibles) .

Adicionalmente, esta hidrólisis puede llevarse a cabo a una alta temperatura que (i) reduce el riesgo de infección bacteriana y (ii) da como resultado una pulpa de biomasa menos viscosa. El efecto de esto último es significativo puesto que permite una mezcla mejor de las enzimas, dando como resultado una materia seca operacional más alta en el vegetal y permite alcanzar una concentración de etanol más alta consecuente. Así, se necesita utilizar menos energía mejorando la sostenibilidad y un proceso de fermentación más pequeño se requerirá con una menor inversión.

También, esta hidrólisis puede llevarse a cabo a un pH bajo. Esto es deseable puesto que la biomasa es pre-tratada frecuentemente con ácido. La biomasa tratada de esta manera no tiene que ser ajustada en su pH si las enzimas utilizadas subsecuentemente para la sacarificación son capaces de actuar a un pH bajo. Esto implica un requerimiento más bajo de, por ejemplo, hidróxido de sodio o sulfato de calcio y un proceso donde no hay sales residuales. Esto es significativo en un proceso en el cual, por ejemplo, el etanol combustible va a ser producido puesto que se consumen cantidades enormes de material en tales procesos. Esto permite que un proceso sea llevado a cabo en el cual no se requiera ajuste de pH, esto es, no hay un requerimiento para la adición de ácidos o bases. El proceso puede llevarse a cabo así como un proceso de cero residuos y/o como un proceso en el cual no se requiere la incorporación de productos químicos inorgánicos.

Además, se ha demostrado que la composición enzimática puede hidrolizar efectivamente la biomasa cuando se utilizan contenidos altos de materia seca. Es altamente deseable que las enzimas utilizadas en la producción de, por ejemplo, etanol combustible, sean capaces de operar en sustratos que tengan alta viscosidad (esto es, una composición con alto peso seco) puesto que esto permite que se obtengan más altas cantidades del producto final, por ejemplo, etanol combustible .

De acuerdo con la invención, se proporciona aquí un método para el tratamiento de material lignocelulósico, dicho método comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con una composición que comprende dos o más actividades enzimáticas, siendo dichas actividades enzimáticas actividades de celulasa y/o hemicelulasa, donde el pH durante el tratamiento es aproximadamente 4.5 o inferior, y el tratamiento se lleva a cabo con un contenido de materia seca de 15% o más.

La invención también proporciona: un método para producir un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico, dicho método comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con una composición tal como se definió más arriba; un método para producir un producto de fermentación, dicho método comprende : producir un azúcar fermentable utilizando un método como se definió más arriba; y fermentar el azúcar fermentable resultante, produciendo por lo tanto un producto de fermentación; - uso de una composición tal como se define más arriba en el tratamiento de un material lignocelulósico; y - uso de una composición como se definió más arriba en la producción de un azúcar o azúcares a partir de un material lignocelulósico .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra. la formación de glucosa a partir de residuos de maíz pretratados con ácido diluido utilizando diferentes dosificaciones enzimáticas a 50°C, pH 4.5 - 5: figura la = GC 220; figura Ib = Filtrase®NL; y figura le = Laminex BG.

Las figuras 2 y 3 muestran datos de actividad específica para la formación de azúcares a partir de residuos de maíz pre- tratados con ácido diluido: Figura 2a y 3a = actividad específica a las 21 horas; Figura 2b y 3b = actividad específica a las 93 horas; y Figura 2c y 3c = actividad específica a las 140 horas.

La figura 4 muestra una representación esquemática para la sacarificación y fermentación simultánea y para experimentos de destilación.

La figura 5 muestra la producción de etanol a partir de residuos de maíz pre-tratados con ácido diluido en experimentos de sacarificación y fermentación simultáneas y destilación utilizando Filtrase®NL.

La figura 6 muestra el rendimiento de la hidrólisis a partir de residuos de maíz pretratados con ácido diluido en experimentos de sacarificación y fermentación simultáneos y destilación utilizando Filtrase®NL.

La figura 7 muestra la formación de azúcares a partir de heno de trigo pretratado con vapor a 60°C, pH 3.8 utilizando Filtrase®NL.

La figura 8 muestra la producción de glucosa utilizando celulasas de Talaromyces .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A través de la presente especificación y de las reivindicaciones acompañantes, las palabras "comprenden" e "incluyen" y variaciones tales como "comprende" , "que comprende" , "incluye" y "que incluye" deben interpretarse de forma inclusiva. Esto es, estas palabras pretenden cubrir la posible inclusión de otros elementos o enteros no específicamente citados, donde el contexto lo permita.

Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (esto es, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La presente invención proporciona referencia a una composición que comprende actividad enzimática celulolítica y/o hemicelulolítica y que tiene la capacidad de modificar, por ejemplo de degradar, un material de carbohidrato sin almidón. Un material de carbohidrato sin almidón es un material que comprende, consiste o sustancialmente consiste de uno o más carbohidratos sin almidón. Carbohidrato en este contexto incluye todos los sacáridos, por ejemplo polisacaridos, oligosacáridos, disacáridos o monosacáridos .

Una composición tal como se describe aquí modifica típicamente un material de carbohidrato sin almidón por modificación química de tal material. La modificación química del material carbohidrato puede dar como resultado la degradación de tal material, por ejemplo mediante hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como mediante la acción de una liasa.

Un carbohidrato sin almidón adecuado para modificación mediante una composición tal como se describe aquí es la lignocelulosa . Los polisacáridos principales que comprenden diferentes residuos lignocelulósicos , que pueden ser considerados como potencial materia prima renovable, son celulosa (glucanos) , hemicelulosa (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos) . Además, pueden estar presentes algunas hemicelulosas como glucomananos , por ejemplo materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluyendo tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucorónico y otras hexosas y pentosas se presenta bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto.

Además, las pectinas y otras sustancias pépticas tales como arabinanos pueden hacer una proporción considerable de la masa seca de paredes celulares típicamente de tejidos de plantas no leñosas (aproximadamente un cuarto a la mitad de la masa secas pueden ser pectinas) .

La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de residuos de glucosa enlazados por enlaces ß-1,4. La naturaleza lineal de las fibras de celulosa, así como la estequiometría de la glucosa ß- enlazada (con respecto a a) genera estructuras más adecuadas para puentes de hidrógeno intercadena que las estructuras del almidón altamente ramificadas, con uniones a. Así, los polímeros de celulosa son en general menos solubles, y forman fibras unidas más apretadamente que las fibras encontradas en el almidón.

Las endoglucanasas (EG) y las exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de la celulosa insoluble a celooligosacáridos (celobiosa como producto principal) , con ß-glucosidasas (BG) que convierten los oligosacáridos , principalmente la celobiosa y la celotriosa en glucosa.

La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición frecuentemente varia ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de te ido a otro. En general, un componente principal de la hemicelulosa es la xilosa enlazada por ß-1,4, un azúcar de azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa se ramifica frecuentemente en el átomo 0 - 3 y/o 0 - 2 de la xilosa, y puede ser sustituido con uniones a arabinosa, galactosa, mañosa, ácido glucóronico, ácido galacturónico o por esterif icación a ácido acético (y esterif icación de ácido ferúlico a arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es el término general para azúcares de seis carbonos con enlaces ß (tales como los ß- (1,3) (1,4) glucanos y heteroglucanos mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los cuales están presentes tanto la glucosa como la mañosa en el esqueleto lineal, unidos uno a otro por enlaces ß) .

Las xilanasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas , feruloilo y acetilxilan esterases, glucoronidasas , y ß-xilosidasas) catalizan la hidrólisis de las hemicelulasas .

Las sustancias pépticas incluyen pectinas, arabinanos , galactános y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular de las plantas. Están construidas alrededor de una cadena central de unidades de ácido D-galacturónico enlazadas por a (1,4) intercaladas en algún grado con L-ramnosa. En cualquier pared celular hay un número de unidades estructurales que satisface esta descripción y se han considerado en general como una molécula péctica sencilla, siendo las cadenas centrales de las diferentes unidades estructurales continúas una con otra.

Los principales tipos de unidades estructurales son: galacturonano (homogalacturonano) , el cual puede ser sustituido con metanol sobre el grupo carboxilo y acetato en O- 2 y 0 - 3; ramnogalacturonano I (RGI) , en el cual las unidades de ácido galacturónico alternan con unidades de ramnosa que llevan a cadenas laterales de galactano enlazado (1,4) y de arabinano enlazado (1,5) . Las cadenas laterales de arabinano pueden conectarse directamente con la ramnosa o indirectamente a través de las cadenas de galactano; xilogalaturonano, con unidades xilosilo individuales sobre el 0 - 3 del ácido galacturónico (asociada cercanamente con RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII) y una unidad menor particularmente compleja que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos residuos de apiosilo, los cuales, bajo condiciones iónicas adecuadas, pueden formar reversiblemente esteres con el borato.

Una composición para uso en un método de la invención comprenderá actividades enzimáticas típicamente derivadas de un microorganismo fúngico saprofito de la clase Penicillium y del género Talaromyces, por ejemplo Talaromyces emersonii. El Talaromyces emersonii también puede denominarse como Geosmithia emersonii o Penicilliu emersonii. El Talaromyces emersonii también ha sido denominado como Talaromyces duponti y Penicillium duponti.

Una composición para uso en un método de la invención comprende al menos dos actividades, aunque típicamente una composición comprenderá más de dos actividades, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más. Típicamente, una composición de la invención puede comprender al menos una celulasa y al menos una hemicelulasa . Sin embargo, una composición de la invención puede comprender celulasas pero no xilanasas. Además, una composición de la invención puede comprender actividad enzimática auxiliar, esto es, actividad adicional la cual, bien sea de manera directa o indirecta lleva a la degradación de la lignocelulosa . Se mencionan aquí ejemplos de tales actividades .

Así, una composición para uso en la invención puede comprender actividad de endoglucanasa y/o actividad de celobiohidrolasa y/o actividad de ß-glucosidasa . Una composición para uso en la invención puede comprender más de una actividad enzimática en una o más de estas clases. Por ejemplo, una composición para uso en la invención puede comprender dos actividades de endoglucanasa, por ejemplo actividad de endo-1,3 (1,4) -ß glucanasa y actividad de endo-ß-1 , -glucanasa . Tal composición puede también comprender una o más actividades de xilanasa. Tal composición puede comprender una actividad enzimática auxiliar.

Una composición para uso en la invención puede derivarse del Talaromyces emersonii. En la invención, se anticipa que un grupo central de actividades enzimáticas (degradantes de la lignocelulosa) puede derivarse del Talaromyces emersonii. El Talaromyces emersonii puede proveer un conjunto de actividades altamente efectivas como se demuestra aquí para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica . Esa actividad puede entonces ser complementada con actividades enzimáticas de otras fuentes. Tales actividades adicionales pueden derivarse de fuentes clásica y/o producirse mediante un organismo genéticamente modificado.

Las actividades en una composición para uso en la invención pueden ser termoestables . Aquí, esto significa que la actividad tiene un óptimo de temperatura de 40 °C o superior, por ejemplo aproximadamente 50 °C o superior, tal como aproximadamente 60 °C o superior, por ejemplo aproximadamente 70 °C o superior, tal como aproximadamente 75 °C o superior, por ejemplo aproximadamente 80 °C o superior tal como 85 °C o superior. Las actividades en una composición para uso en la invención no tendrán típicamente los mismos óptimos de temperatura, pero preferiblemente serán, sin embargo, termoestables .

Además las actividades enzimáticas en una composición para uso en la invención pueden ser capaces de trabajar a pH bajo. Para los propósitos de esta invención, pH bajo indica un pH de aproximadamente 5.5 o inferior, aproximadamente 5 o inferior, aproximadamente 4.9 o inferior, aproximadamente 4.8 o inferior, aproximadamente 4.7 o inferior, aproximadamente 4.6 o inferior, aproximadamente 4.5 o inferior, aproximadamente 4.4 o inferior, aproximadamente 4.3 o inferior, aproximadamente 4.2 o inferior, aproximadamente 4.1 o inferior, aproximadamente 4.0 o inferior, aproximadamente 3,9 o inferior, o aproximadamente 3.8 o inferior, aproximadamente 3.7 o inferior, aproximadamente 3.6 o inferior, o aproximadamente 3.5 o inferior.

Las actividades en una composición para uso en la invención pueden definirse mediante una combinación de cualquiera de los óptimos de temperatura y valores de pH anteriores .

La composición usada en un método de la invención puede comprender, además de las actividades derivadas del Talaromyces, una celulasa (por ejemplo una derivada de una fuente diferente a Talaromyces) y/o una hemicelulasa (por ejemplo una derivada de una fuente diferente a Talaromyces) y/o una pectinasa.

Una composición para uso en la invención puede comprender una, dos o tres clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas de endoglucanasa (EG) , una exocelobiohidrolasa (CBH) y una ß-glucosidasa (BG) . Una composición para uso en la invención puede comprender dos o más de cualquiera de estas clases de celulasas.

La enzima ß -glucosidasa nativa del Talaromyces se conoce por ser muy activa, el valor de Vmax para la ß-glucosidasa Cel3a de Talaromyces es 512IU/mg el cual es considerablemente más alto que los valores reportados para las ß-glucosidasas de otras fuentes fúngicas (P. Murray et al-. / Protein Expression and Purification 38 (2004) 248-257) . A pesar de la alta actividad de la ß -glucosidasa en las composiciones de acuerdo con la invención, y los altos niveles de glucosa alcanzados, no se presenta inhibición de glucosa. Esto es ventajoso puesto que los niveles y actividades altos de glucosa pueden combinarse utilizando las composiciones de acuerdo con la invención.

Una composición de la invención puede comprender una actividad que tenga un tipo diferente de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa que la provista por la composición para uso en un método de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa provista por una composición tal como se describe aquí y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa y/o actividad de pectinasa provista mediante una celulasa/hemicelulasa/pectinasa adicional .

Aquí, una celulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la celulosa en unidades más pequeñas, bien sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas , o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis .

Aquí, una hemicelulasa es un polipéptido que es capaz de degradar o modificar la hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano , glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, bien sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos , o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar de hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis.

Aquí, una pectinasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la pectina en unidades más pequeñas, bien sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal degradación tendrá lugar típicamente mediante una reacción de hidrólisis-.

De acuerdo con lo anterior, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo- ß- 1 , 4 -glucanasa , una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) ( 1 , 4 ) -glucanasa .

Aquí, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en la celulosa o celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima también puede denominarse como celulasa 1,4-ß-celobiosidasa, 1 , 4 - ß-celobiohidrolasa, l,4-p-D-glucan celobiohidrolasa, avicelasa, exo- 1 , 4 - -D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa.

Aquí, una endo- ß-1 , 4 -glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o ß-D-glucanos de cereales. Tal polipéptido puede también ser capaz de hidrolizar enlaces 1,4 en ß-D-glucanos que contienen también enlaces 1,3. Esta enzima también puede ser denominadada como una celulasa, avicelasa, ß-1, 4 -endoglucano hidrolasa, ß-1 , -glucanasa, carboximetil celulasa, celudextrinasa, endo-1, 4^-D-glucanasa, endo- 1 , 4 - ß-D-glucanohidrolasa, endo-1, 4 - ß-glucanasa o endoglucanasa.

Aquí, una ß-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos ß-D-glucosa terminales no reductores con liberación de ß-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una amplia especificidad por ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactósido, un a-L arabinósido, un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido . Esta enzima también puede denominarse como amigdalasa, ß-D-glucósido glucohidrolasa, celobiasa o gentobiasa.

Aquí, una ß- (1, 3) (1, 4) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1 , 4 - ß-D-glucosídicos en ß-D-glucanos que contienen enlaces 1,3- y 1,4-. Tal polipéptido puede actuar sobre la liquenina y ß-D-glucanos de cereales, pero no sobre ß-D-glucanos que contienen solamente enlaces 1,3- o 1,4- . Esta enzima puede también denominarse como liqueninasa, 1,3-1,4-ß-D-glucan 4 -glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo- ß - 1 , 3 - 1 , 4 glucanasa, liquenasa o ß-glucanasa enlazada mixta. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo- 1 , 3 (4 ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3- o 1,4- en beta-D-glucanos, cuando el resido de glucosa cuyo grupo reductor está involucrado en el enlace que va a ser hidrolizado es sustituido en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1, 3 -beta-glucanasa, laminarinasa, 1,3- (1,3; 1 , 4 ) -beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa. Los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereal .

Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxilanasa , una ß-xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa , una OÍ-D-glucoronidasa, una acetil xilan esterasa, un feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa , una ß- galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa.

Aquí, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , - -D-xilosídicos en xilanos. Esta enzima puede también denominarse como una endo-1, 4~ -xilanasa o 1,4-ß-?-xilan xilano idrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilan endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos .

Aquí, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de 1,4-ß-D-xilanos, para eliminar residuos sucesivos de D-xilosa de los terminales no reductores. Tales enzimas también pueden hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima también puede denominarse como xilan 1 , 4 - ß-xilosidasa, 1 , 4 - ß-D-xilan xilohidrolasa, exo-1 , 4 - ß-xilosidasa o xilobiasa.

Aquí, una a-L-arabinofuranosida (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre -L-arabinofuranósidos , a-L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5)- arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede denominarse como a-?-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también puede denominarse como alfa-glucurónidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucurónico 4 -O-metilado, el cual también puede estar presente como sustituyente en xilanos. La alternativa es EC 3.2.1.131: xilan alfa-1,2-glucuronosidasa que cataliza la hidrólisis de enlaces alpha-1, 2- (4-0-metil) glucuronosilo .

Aquí, una acetil xilan esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos . Tal polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alpha-naptilo o acetato de p-nitrofenilo pero, típicamente, no de triacetil glicerol. Tal polipéptido típicamente no actúa sobre mañano acetilado o pectina.

Aquí, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido + H(2)0 = ferulato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Puede catalizar típicamente la hidrólisis del grupo 4 -hidroxi -3 -metoxicinamoil (feruloilo) a partir de un azúcar esterificado , el cual es usualmente arabinosa en sustrato "naturales" . El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son típicamente sustratos más pobres. Esta enzima también puede ser denominada como cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. También puede denominarse como una enzima accesoria de la hemicelulasa, puesto que puede ayudar a que las xilanasas y las pectinasas rompan la hemicelulosa y la pectina de la pared celular de las plantas.

Aquí, una cumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil -sacárido + H(2)0 = cumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido . Esta enzima también puede denominarse como una trans-4 -cumaroil esterasa, trans-p- cumaroil esterasa, p-cumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también cae dentro de EC 3.1.1.73 de manera que puede ser nominada también como feruloil esterasa.

Aquí, una -galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de a-D-galactosa no reductores terminales en a-D-galactósidos , incluyendo oligosacáridos de galactosa, galanomananos , galactanos y arabinogalactanos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también puede denominarse como melibiasa .

Aquí, una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-galactosa no reductores terminales en ß-D-galactósidos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos . Esta enzima también puede denominarse como exo- ( 1?4 ) - ß-D-galactanasa o lactasa.

Aquí, una ß -mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , 4 -ß-D-manosídicos en mananos, galactomananos y glucomananos . Esta enzima también puede denominarse como una manan endo- 1 , 4 - ß -manosidasa o endo-1 , 4 -mananasa .

Aquí, una ß-manosidasa (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de ß-D-manosa no reductores terminales en ß-D-manósidos. Esta enzima también puede denominarse como mananasa o manasa .

Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectin metil esterasa, una endo-galactanasa, una beta galactosidasa, una pectin cetil esterasa, una endo pectin liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exogalaturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa, una xilogalacturonasa .

Aquí, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 , -a-D-galactosidurónicos en pectatos y otros galacturonanos . Esta enzima también puede denominarse como poligalacturonasa pectin despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectin hidrolasa, pectin poligalacturonasa, poli-a-l , 4-galacturonido glicanohidrolasa , endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli (1,4-a-D-galacturonido) glicanohidrolasa.

Aquí, una pectin metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima también puede ser conocida como pectinesterasa, pectin desmetoxilasa, pectin metoxilasa, pectin metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectin pectilhidrolas .

Aquí, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-ß-D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima también puede ser conocida como arabinogalactan endo-l,4- -galactosidasa, endo-1, 4^-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactan 4-ß-?-galactanohidrolasa .

Aquí, una pectin acetil esterasa se define como una enzima que tiene una actividad acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos GalUA de la pectina.

Aquí, una endo-pectin liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la ruptura con eliminación de ( l?4 ) -oí-D-galacturonan metil éster para dar oligosacáridos de grupos 4-desoxi-6-0-metil-oí-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como una pectin liasa, pectin trans-eliminasa; endo pectin liasa, polimetilgalacturónico transelimanasa, pectin metil transeliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1? ) -6-0-metil- -D-galacturonan liasa.

Aquí, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la ruptura con eliminación de (l?4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4 -enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser denominada como poligalacturónico transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido pectico liasa, péctico liasa, ácido a-l,4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-OÍ- 1,4 -poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectin trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa, o ( 1? ) -a-D-galacturonan liasa.

Aquí, una alfa ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos a-L- ramnosa no reductores terminales en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano . Esta enzima también puede ser conocida como oí-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósido ramnohidrolasa .

Aquí, exogalacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de la hidrólisis del ácido péctico del extremo no reductor, liberando digalacturonato. La enzima puede también ser conocida como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

Aquí, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: ( 1 , 4 -a-D-galacturonido) n + H20 = (1, 4 -a-D-galacturonido) n-1 + D-galacturonato . La enzima también puede ser conocida como galacturan 1,4-OÍ-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli (galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli ( 1 , 4 -a-D-galacturonido) galacturonohidrolasa .

Aquí, exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la ruptura con eliminación de 4- (4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato del extremo reductor del pectato, esto es pectina desesterificada . Esta enzima puede ser conocida como pectato disacárido liasa, pectato exoliasa, ácido exopéctico trans eliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico trans eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o (l?4)-a-D-galacturonan disacárido liasa del extremo reductor.

Aquí, la ramnogalacturonan hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y el ácido ramnopiranosilo en una forma endo en estructuras ramnogalacturonano estrictamente alternantes, consistentes del disacárido [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil- (1,4) -alfa-galactosilurónico) ] .

Aquí, la ramnogalacturonan liasa es cualquier polipéptido que es capaz de romper enlaces a-L-Rhap- (l->4 ) - -D-GalpA en una forma endo en ramnogalacturonano por eliminación beta.

Aquí, la ramnogalacturonan acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación del esqueleto de residuos alternantes de ramnosa y ácido galacturónico en ramnogalacturonano .

Aq í, la ramnogalacturonan galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes en una forma exo .

Aquí, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre el xilogalacturonano rompiendo el esqueleto de ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa en una forma endo. Esta enzima también puede ser conocida como xilogalacturonan hidrolasa.

Aquí, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos , -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5)-, arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también puede ser denominada como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .

Aquí, endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endo hidrólisisde enlaces 1 , 5 -a-arabinof ranosídicos en 1 , 5 -arabinanos . La enzima también puede ser conocida como endo-arabinasa, arabinan endo-1 , 5-a-L-arabinosidasa, endo- 1 , 5 -a-L-arabinanasa, endo-a- 1 , 5 -arabanasa ; endo arabanasa o 1,5- -L-arabinan 1, 5 -a-L-arabinanohidrolasa .

Una composición de la invención comprenderá típicamente al menos una celulosa y/o al menos una hemicelulasa y/o al menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa. Tal composición puede también comprender una o más hemicelulasa y/o una o más pectinasas Además, una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa, una glucoronosidasa o una expansión de una proteína inducida por la celulosa o una proteína integrante de la celulosa o una proteína similar pueden estar presente en una composición de la invención (estas se denominan como actividades auxiliares más arriba) .

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos (peptidasas) , así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otras unidades estructurales, tales como azúcares (glicopeptidasas ) . Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4, y son adecuadas para uso en la invención incorporadas aquí como referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen proteasas de pepsina, papaína y serina incluyendo quimiotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas .

"Lipasas" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos , incluyendo fosfoglicéridos , lipoproteínas , diacilgliceroles y similares. En las plantas, los lípidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden romper la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas y otras enzimas descritas en la técnica, conocidas por despolimerizar o de alguna forma romper los polímeros de la lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (principalmente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan al siguiente grupo de enzimas: lignin peroxidasas (EC 1.11.1.14) , manganeso peroxidasas (EC 1.11.1.13) , lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73) .

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de catalizar una reacción de transferasa, pero que también pueden catalizar una reacción de hidrólisis, por ejemplo de celulosa y/o productos de degradación de la celulosa. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que puede ser usada en la invención es una ß-glucanosiltransferasa. Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3) (1,4) glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de la celulosa.

"Glucoronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo ß-glucoronósido para producción en alcohol. Se han caracterizado muchas glucoronidasas y pueden ser adecuadas para uso en la invención, por ejemplo ß-glucoronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucoronidasa (EC 3.2.1.36), glucoronosil-disulfoglucosamina glucoronidasa (3.2.1.56), glicirricinato ß-glucoronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucoronidasa (EC 3.2.1.139) .

Una composición para uso en la invención puede comprender una expansina o una proteína similar a la expansina, tal como swolenina (véase Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 4202 - 4211, 2002) o una proteína similar a la swolenina.

Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula vegetal . Las expansinas se han propuesto para romper los puentes de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta manera., se cree que permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el alargamiento de la pared celular. La swolenina, una proteína similar a la expansina contiene un dominio de familia 1 N terminal de Módulo de Enlazamiento de Carbohidrato (CBD) y un dominio similar a la expansina C- terminal. Para los propósitos de esta invención, una proteína similar a la expansina o una proteína similar a la swolenina pueden comprender uno o ambos de tales dominios y/o pueden romper la estructura de las paredes celulares (tal como la ruptura de una estructura de celulosa) , opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores .

Una composición para uso en la invención puede ser una proteína inducida por la celulosa, por ejemplo el producto polipeptídico del gen cipl o cip2 o genes similares (véase Foreman et al., J. Biol . Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), una proteína integrante de celulosa/celusoma, por ejemplo el producto polipeptídico del gen cipa o cipC, o una escafoldina o una proteína similar a la escafoldina. Las escafoldinas y las proteínas integrantes de celulosa son subunidades integrantes multifuncionales que pueden organizar las subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático . Esto se logra mediante la interacción de dos clases complementarias de dominio, esto es, un dominio de cohesión sobre la escafoldina y un dominio de acumulación sobre cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también porta un modulo enlazador de la celulosa (CBM) que media la unión del celulosoma a su sustrato. Una proteína escafoldina o integrante de celulosa para los propósitos de esta invención puede comprender uno o ambos de tales dominios .

Una composición para uso en un método de la invención puede estar compuesta de un miembro de cada una de la clases de enzimas mencionadas anteriormente, varios miembros de una clase de enzimas, o cualquier combinación de estas clases de enzimas son proteínas auxiliares (esto es, aquellas proteínas mencionadas aquí que no tienen actividad enzimática per se, pero ayudan no obstante en la degradación lignocelulósica) .

Una composición para uso en un método de la invención puede estar compuesta de enzimas (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldos complejos (tales como el resultante del crecimiento de cepas microbianas en un medio, donde las cepas secretan proteínas y enzimas hacia el medio; (4) lisados de células de cepas cultivadas como en (3); y/o (5) material vegetal que expresa enzimas. Pueden obtenerse diferentes enzimas en una composición de la invención a partir de diferentes fuentes.

Las enzimas pueden ser producidas bien sea de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aisladas y añadidas, por ejemplo, a materias primas lignocelulósicas . En forma alternativa, las enzimas se producen pero no se aislan, y pueden añadirse caldo de fermentación de masa celular crudo, o material vegetal (tales como residuos de maíz o heno de trigo), y similares, por ejemplo, a la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción de enzimas o el material vegetal pueden tratarse para prevenir crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, por calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , luego añadirse, a una materia prima. Estas mezclas de enzimas crudas pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utilice la materia prima (tal como residuos de maíz o heno de trigo) para proveer la nutrición a un organismo que produzca una (s) enzima (s) . De esta manera las plantas que producen las enzimas pueden por si mismas servir como materia prima lignocelulósica y añadirse a la materia- prima lignocelulósica .

En los usos y métodos descritos aquí, los componentes de las composiciones descritas más arriba pueden proveerse de forma concomitante (esto es como una composición sencilla per se) o de forma separada o secuencialmente .

La invención así se relaciona con métodos en los cuales se usa la composición descrita más arriba y con los usos de la composición en procesos industriales.

En principio, una composición de la invención puede usarse en cualquier proceso que requiera el tratamiento de un material que comprende un polisacárido sin almidón. Así, un polipéptido o composición de la invención puede utilizarse en el tratamiento de material polisacárido sin almidón. Aquí, un material polisacárido sin almidón es un material que comprende o consiste esencialmente de uno o, más típicamente, más de un polisacárido sin almidón.

Típicamente, las plantas y hongos y el material derivado de los mismos comprenden cantidades significativas de material polisacárido sin almidón. De acuerdo con lo anterior, un polipéptido de la invención puede utilizarse en el tratamiento de un material vegetal o fúngico o un material derivado de los mismos.

Un componente importante del material polisacárido sin almidón vegetal es la lignocelulosa (también denominada aquí como biomasa lignocelulolítica . La lignocelulosa es un material vegetal que está compuesto de celulosa y hemicelulosa y lignina. Los polímeros carbohidratos (celulosa y hemicelulosa) están enlazados apretadamente a la lignina mediante enlaces de hidrógeno y covalentes . De acuerdo con lo anterior, puede utilizarse un polipéptido en la invención en el tratamiento del material lignocelulolítico . Aquí, el material lignocelulolítico es un material que comprende o consiste esencialmente de lignocelulosa. Así, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido sin almidón, el polisácarido sin almidón puede ser un material/biomasa lignocelulósico . _ De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método para tratar un polisacárido sin almidón en el cual el tratamiento comprende la degradación y/ 0 modificación de la celulosa y/o la hemicelulosa .

La degradación en este contexto indica que el tratamiento da como resultado la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica, esto es, sacáridos de longitud más corta que están presentes como resultado del tratamiento en comparación con un polisacárido sin almidón similar no tratado. Así, la degradación en este contexto puede dar como resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.

Todas las plantas y hongos contienen polisacáridos sin almidón y virtualmente todos los materiales polisacáridos derivados de vegetales y hongos. De acuerdo con lo anterior, en un método de la invención para el tratamiento de un polisacárido sin almidón, dicho polisacárido sin almidón puede ser provisto en la forma de un material vegetal o derivado de un vegetal o un material que comprende un material vegetal o un material derivado de un vegetal, por ejemplo, un vegetal de una planta, un extracto de planta, un alimento o ingredientes del mismo, una tela, un textil o un artículo de vestimenta.

La invención proporciona un método para producir un azúcar a partir de material lignocelulósico método que comprende poner en contacto una composición tal como se describe aquí con el material lignocelulósico .

Tal método permite que los azúcares libres (monómeros) y/o oligosacáridos sean generados a partir de la masa lignocelulósic . Estos métodos involucran la conversión de la biomasa lignocelulósica en azúcares libres y pequeños oligosacáridos con un polipéptido o composición de la invención .

El proceso de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares permite preferiblemente la conversión en azúcares fermentables . Tal proceso puede ser denominado como "sacarificación" . De acuerdo con lo anterior, un método de la invención puede dar como resultado la liberación de uno o más azúcares de hexosa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucorónico, mañosa, ramnosa, sacarosa y fructosa.

La biomasa lignocelulolítica adecuada para la invención incluye biomasa que puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, productos orgánicos comerciales, residuos de construcción y demolición, residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de jardinería. Formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y pastos, trigo, heno de trigo, bagazo de caña de azúcar, pastos de conmutación, miscantus, maíz, residuos de maíz, cortezas de maíz, mazorcas de maíz, tallos de cañóla, tallos de soya, sorgo dulce, otros residuos de maíz que incluyen fibras de los residuos, productos y subproductos de la molienda de granos tales como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) llamadas frecuentemente "salvado o fibra" así como residuos sólidos municipales, residuos de papel y residuos de jardinería. La biomasa también puede ser, pero no se limita, a material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual y pulpa y residuos de la molienda del papel. "La biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, maíz y cortezas de maíz, cultivos para energía, bosques, frutos, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, agujas, troncos, raíces, plantones, cultivos maderables de rotación corta, zarzas, arbustos, pastos de conmutación, árboles, vegetales, cáscaras de frutas, viñedos, pulpa de remolacha de azúcar, moliendas de trigo, cortezas de avena y maderas duras y suaves (no incluyendo maderas con materiales deletéreos) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados a partir de los procesos agrícolas incluyendo las actividades de granja y forestales, específicamente residuos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente en forma individual o en cualquier combinación o mezcla de las mismas.

Aparte de la biomasa virgen o de las materias primas ya procesadas en alimentos y alimentación para las industrias de papel y la pulpa, la biomasa/materia prima puede ser tratada adicionalmente con calor, modificación mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métodos con el fin de potenciar la degradación enzimática.

Los azúcares fermentables pueden convertirse en productos de fermentación con valor añadido, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol combustible.

Los productos de valor añadido específicos que pueden ser producidos por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol y un biogás) ; ácido láctico; un plástico; un producto químico especial; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maléico; ácido 3 -hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético; 1,3-propano diol; etileno, glicerol; un solvente; un suplemento para alimentación animal; un producto farmacéutico tal como un antibiótico de ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.

La composición, naturaleza de la sustitución y grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferente en las plantas dicotiledóneas (dicotiledóneas, esto es, plantas cuyas semillas tienen dos cotiledones o dos partes de semillas tales como semillas de lima, cacahuetes, almendras, guisantes, alubias) en comparación con plantas monocotiledóneas (monocotiledóneas ; esto es, plantas que tienen un cotiledón individual o una hoja de semilla tal como maíz, trigo, arroz, pastos, cebada) . En las dicotiledóneas, la hemicelulosa está compuesta principalmente de xiloglucanos que son cadenas de glucosa enlazadas por 1,4-ß con cadenas laterales de xilosilo enlazadas vía 1, 6 - ß. En las monocotiledóneas, incluyendo la mayoría de los cultivos de granos, los componentes principales de la hemicelulosa son heteroxilanos . Estos están compuestos primariamente de polímeros de esqueletos de xilosa con enlaces 1,4-ß con enlaces 1,3-a arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucorónico, galactosa, mantosa y ácido glucorónico o ácido 4 -O-metil-glucurónico así como xilosa modificada por ácido acético enlazado por éster. Que también comprenden cadena de glucosilo enlazadas con 1,3 y 1,4-ß- . En las monocotiledóneas , la celulosa, los etero xilanos y los ß-glucanos pueden estar presentes en cantidades más o menos iguales, comprendiendo cada uno aproximadamente 15 - 25% de la materia seca de las paredes celulares. También plantas diferentes pueden comprender cantidades diferentes de, y composiciones diferentes de, sustancias pépticas. Por ejemplo, la remolacha de azúcar contiene aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinosa sobre una base de peso seco.

De acuerdo con lo anterior, una composición de la invención puede ser diseñada con respecto a la materia prima particular que va a ser usada. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.

Las combinaciones enzimáticas o tratamientos físicos pueden ser administrados de forma concomitante o secuencialmente . Las enzimas pueden ser producidas bien de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislarse y añadirse a la materia prima lignocelulósica . De forma alternativa, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de la masa celular cruda, o material vegetal (tal como residuos de maíz) y similares se añaden a la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción enzimático o el material vegetal pueden ser tratados para prevenir crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, por calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , y luego añadirse a la materia prima. Estas mezclas de enzimas crudas pueden incluir el organismo el microorganismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima puede ser producida en una fermentación que utilice materia prima (tal como residuo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produzca la (s) enzima (s) . De esta forma, las plantas que producen las enzimas pueden servir como materia prima lignocelulósica y ser añadidas a la materia prima lignocelulósica.

En el método de la invención, una enzima o combinación de enzimas actúa sobre un sustrato lignocelulósico o biomasa vegetal, sirviendo como materia prima, de manera que se convierta este sustrato complejo en azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol o de otros productos de fermentación útiles.

Concordantemente , otro aspecto de la invención incluye métodos que utilizan la composición descrita más arriba junto con enzimas o tratamiento físicos adicionales tales como temperatura y pH para convertir la biomasa vegetal lignocelulósica en azúcares y oligosacáridos .

En tanto que la composición ha sido discutida como una mezcla sencilla se reconoce que las enzimas pueden añadirse secuencialmente cuando la temperatura, el pH y otras condiciones puedan alterarse para incrementar la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, pueden determinarse un pH y temperaturas óptimos para la mezcla enzimática.

La composición se hace reaccionar con un sustrato bajo cualquier condición apropiada. Por ejemplo, las enzimas pueden incubarse a aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C, aproximadamente 90 °C o más. Esto es, pueden ser incubadas a una temperatura que va desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 95 °C, por ejemplo en reguladores de baja a media fuerza iónica y/o de pH bajo a neutro. Por "fuerza iónica media" se entiende que el regulador tiene una concentración de iones de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente iónico individual . El pH puede variar desde aproximadamente pH 2.5, aproximadamente pH 3.0, aproximadamente pH 3.5, aproximadamente pH 4.0, aproximadamente pH 4.5, aproximadamente pH 5 , aproximadamente pH 5.5, aproximadamente pH 6 , aproximadamente pH 6.5, aproximadamente pH 7 , aproximadamente pH 7.5, aproximadamente pH 8.0, hasta aproximadamente pH 8.5. En general el rango de pH ira desde aproximadamente pH 3.0 hasta aproximadamente pH 9.

Típicamente, la reacción puede llevarse a cabo bajo condiciones de pH bajo como se definió más arriba. Así, un método de la invención puede llevarse a cabo de tal forma que no se requiere ajuste de pH (esto es se requiere a un pH más neutro) . Es decir, una materia prima pretratada con ácido puede ser utilizada puesto que no hay requerimiento de adicionar, por ejemplo, hidróxido de sodio, antes de la adición de una composición de la invención.

La materia prima puede ser lavada antes de la licuefacción/hidrólisis. Tal lavado puede ser, por ejemplo, con agua.

La incubación de una composición bajo estas condiciones da como resultado la liberación o producción de cantidades sustanciales del azúcar a partir del material lignocelulósico . Por cantidad sustancial se entiende al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o más de azúcar disponible.

Puede utilizarse una etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que involucre la incubación con una enzima o una mezcla de enzimas. Esta etapa puede llevarse a cabo a diferentes temperaturas pero se prefiere que el pre-tratamiento ocurra a la temperatura más adecuada para la mezcla de enzimas que está siendo probada, o el óptimo de enzimas predicho de las enzimas que van a ser probadas. La temperatura del pretratamiento puede variar desde aproximadamente 10 °C hasta aproximadamente 80 °C, aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 80 °C, desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 70 °C, aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60 °C, aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 50 °C, preferiblemente aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 80°C, más de preferencia aproximadamente 50°C. En la ausencia de datos del óptimo de temperatura, es preferible llevar a cabo las reacciones de pre-tratamiento a 37 °C primero, luego a una temperatura más alta tal como 50 °C. El pH de la mezcla de pre-tratamiento puede variar desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente hasta aproximadamente 10.0, pero es preferiblemente de forma aproximada 3.0 hasta aproximadamente 5.0. De nuevo, puede no ser necesario ajustar el pH antes de la sacarificación puesto que una composición para uso en la invención es adecuada típicamente para uso a pH bajo como se define aquí.

La reacción de la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación puede ocurrir desde varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 120 horas, de preferencia desde aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 48 horas, más de preferencia desde aproximadamente 2 hasta 24 horas, lo más de preferencia desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 horas. El tratamiento con celulasa puede ocurrir desde varios minutos hasta varias horas, tal como desde aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 168 horas, de preferencia aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 96 horas, más preferiblemente desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 72 horas, aún más preferiblemente desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 48 horas. Estas condiciones son particularmente adecuadas en el caso de que la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación se lleve a cabo en el modo de Hidrólisis y Fermentación Separadas (SHF) .

Modo SSF Para el modo de Sacarificación y Fermentación Simultánea (SSF) , el tiempo de reacción para la etapa de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo necesario para alcanzar un rendimiento deseado, esto es, el rendimiento de la conversión de celulosa a glucosa. Tal rendimiento es preferiblemente tan alto como sea posible, preferiblemente 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más 96% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, aún 99.5% o más o 99% o más.

De acuerdo con la invención se realizan concentraciones muy altas de azúcar en el modo SHF y concentraciones de producto altas (por ejemplo etanol) en el modo SSF. En la operación SHF la concentración de glucosa es 25 g/L o más, 30 g/L o más, 35 g/L o más, 40 g/L o más, 45 g/L o más, 50 g/L o más, 55 g/L o más, 60 g/L o más, 65 g/L o más, 70 g/L o más, 75 g/L o más, 80 g/L o más, 85 g/L o más, 90 g/L o más, 95 g/L o más, 100 g/L o más, 110 g/L o más, 120 g/L o más o puede por ejemplo ser 25 g/L-250 g/L, 30 g/L-200 g/L, 40 g/L-200 g/L, 50 g/L-200 g/L, 60 g/L-200 g/L, 70 g/L-200 g/L, 80 g/L-200 g/L, 90 g/L, 80 g/L-200 g/L.

Concentración de producto en modo SSF En la operación SSF, la concentración de producto (g/L) depende de la cantidad de glucosa producida, pero esto no es visible puesto que los azúcares son convertidos al producto en el SSF, y las concentraciones de producto pueden ser relacionadas con la concentración subyácete de glucosa por multiplicación con el rendimiento máximo teórico (Yps max en gr de producto por gramo de glucosa) .

El rendimiento teórico máximo (Yps max en gr de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación puede derivarse a partir de la bioquímica de texto. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 g) produce de acuerdo con el camino de fermentación por glicólisis normal en levadura 2 moles de etanol (=2x46 = 92 gr de etanol) . El rendimiento máximo teórico de etanol en la glucosa es por lo tanto de 92/180 = 0.511 gr de etanol/gr de glucosa.

Para el butanol (PM 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así el Yps máximo para (iso- ) utanol = 74/180 = 0.411 g ( iso- ) butanol/g de glucosa.

Para el ácido láctico el rendimiento de la fermentación para la fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (PM = 90 g/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequeometría, el Yps max = 1 g de ácido láctico/g de glucosa .

Para otros productos de fermentación puede hacerse un cálculo similar.

Modo SSF En la operación SSF la concentración del producto es 25g * Yps g/L /L o más, 30 * Yps g/L o más, 35g * Yps /L o más, 40 * Yps g/L o más, 45 * Yps g/L o más, 50 * Yps g/L o más, 55 * Yps g/L o más, 60 * Yps g/L o más, 65 * Yps g/L o más, 70 * Yps g/L o más , 75 * Yps g/L o más, 80 * Yps g/L o más, 85 * Yps g/L o más, 90 * Yps g/L o más, 95 * Yps g/L o más, 100 * Yps g/L o más, 110 * Yps g/L o más, 120g/L * Yps o más o puede ser por ejemplo 25 * Yps g/L-250 * Yps g/L, 30 * Yps gl/L-200 * Yps g/L, 40 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 50 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 60 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 70 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L , 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L.

Los azúcares liberados a partir de la biomasa pueden convertirse en productos de fermentación útiles tales como uno de los que incluyen, pero no se limita a aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos y etanol, incluyendo etanol para combustible .

Significativamente, un método de la invención puede llevarse a cabo utilizando altos niveles de materia seca (del material lignocelulósico) en la reacción de hidrólisis. Así, la invención puede llevarse a cabo con un contenido de materia seca de aproximadamente 5% o superior, aproximadamente 8% o superior, aproximadamente 10% o superior, aproximadamente 11% o superior, aproximadamente 12% o superior, aproximadamente 13% o superior, aproximadamente 14% o superior, aproximadamente 15% o superior, aproximadamente 20% o superior, aproximadamente 25% o superior, aproximadamente 30% o superior, aproximadamente 35% o superior, o aproximadamente 40% o superior.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, método que comprende: a. degradar la lignocelulosa utilizando un método como el descrito aquí; y b. fermentar el material resultante, para preparar así un producto de fermentación.

Tal proceso puede llevarse a cabo sin ningún requerimiento para ajustar el pH durante el proceso. Es decir, el proceso es uno que puede ser llevado a cabo sin la adición de ácidos o bases. Sin embargo, esto excluye una etapa de pre-tratamiento, donde puede añadirse ácido. El punto es que la composición de la invención es capaz de actuar a pH bajo y, por lo tanto, no hay necesidad de ajustar el pH de una materia prima acida o pre-tratada con ácido con el fin de que pueda tener lugar la sacarificación. De acuerdo con lo anterior, un método de la invención puede ser un método de residuos cero residuos utilizando solamente productos orgánicos sin requerimiento de incorporación de productos químicos inorgánicos .

Los productos de fermentación que pueden ser producidos de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos para alimentación animal, productos químicos especiales, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo etanol para combustible (el término "etanol" se entiende que incluye alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua) .

Los productos de valor añadido específico que pueden ser producidos por los métodos de la invención, incluyen pero no se limitan a, biocombustibles (incluyendo etanol y butanol) ; ácido láctico; ácido 3-hidroxi-propiónico; ácido acrílico; ácido acético; 1 , 3 -propanodiol ; etileno; glicerol; un plástico; un producto químico especial; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico y ácido maléico; un solvente; un suplemento para alimentación animal; un producto farmacéutico tal como un antibiótico de ß-lactama o una cefalosporina ; una vitamina; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina y ácido aspártico; una enzima tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una óxidorreductasa, una transíerasa o una xilanasa; una materia prima química; o un suplemento para alimentación animal..

Un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente la recuperación del producto fermentación.

Tal proceso puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas . Preferiblemente, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones micro-aerofílicas o con limitación de oxígeno .

Un proceso de fermentación anaeróbica se define aquí como un proceso de fermentación adelantado en la ausencia de oxígeno o en el cual no se consume sustancialmente oxígeno, de manera preferible aproximadamente 5 o menos, aproximadamente 2.5 o menos o aproximadamente 1 mmol/L/h o menos, y donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donores de electrones y aceptores de electrones.

Un proceso de fermentación con oxígeno limitado es un proceso en el cual el consumo de oxígeno es limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas hasta el líquido. El grado de eliminación de oxígeno se determina por la cantidad de composición del flujo de gas entrante así como de las propiedades de transferencia de mezcla/masa reales del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un proceso bajo condiciones de oxígeno limitado, la rata de consumo de oxígeno es al menos aproximadamente 5.5, más preferiblemente al menos aproximadamente 6 y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 7 m/mol/L/h.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención: Ejemplo 1 Sacarificación de un hidrolizado de residuos de maíz utilizando diversas celulasas Materiales y métodos Se evalúo la capacidad de tres diferentes preparaciones de celulasas para sacarificar un hidrolizado de residuos de maíz. Se comparo un producto enzimático de Talaromyces emersonii llamado Filtrase®NL (DSM Food Specialties, Países Bajos) con Laminex®BG y GC 220 (Genecor-Danisco, Rochester, USA) . El Laminex®BG y GC220 se consideran como las enzimas de referencia disponibles actualmente en el mercado.

Se utilizaron residuos de maíz pre-tratados con ácido diluido preparados por NREL como sustrato para la sacarificación llevada a cabo con las preparaciones de celulasa. Los residuos de maíz pre-tratados fueron almacenados a 4°C. La pasta tenia aproximadamente 34% de sólidos totales con aproximadamente 17% de sólidos insolubles. La composición de los residuos de maíz utilizados para el tratamiento se define en la tabla 1.

Tabla 1 La composición de los residuos de materia prima es como sigue : Componente % (p/p, base seca) Celulosa 33.9 ± 0.7 Xilano 24.1 + 1.1 Lignina 11.4 + 0.8 Extractos 9.7 ± 0.3 Sacarosa 6.2 ± 1.0 Ácido urónicob 4.0 ±0.2 Acetato 3.9 ± 0.8 Arabinano 3.1 ± 0.2 Productos inorgán no estructural! 2.0 ± 0.4 Proteína 1.6 ± 0.5 Galactano 1.5 ± 0.1 Cenizas 1.4 + 0.5 a Promedio ± desviación estándar de 4 muestras. b Valor calculado.

La concentración de materia seca se verifico y resulto ser 32.8% de pulpa como materia seca (105 °C, 48 horas de secado) .

Se mezclaron 60 g de la fibra con 120 g de agua y el pH (1.9) se ajusto a 5.0 utilizando NaOH 4N y después de eso se completo hasta 200 g con agua para obtener una materia pastosa seca al 9.45%. Se dividieron porciones de 10 g de la pasta en un erlenmeyer marca Schott de 50 mL y se añadió cada preparación enzimática en tres dosificaciones diferentes (20, 61 y 204 µ?_ respectivamente) .

Subsecuentemente, los erlenmeyer fueron cerrados e incubados a 50°C a 280 rpm durante 140 horas y se tomaron muestras (3 mi) a 0, 21, 93 y 140 horas, se centrifugaron utilizando una centrífuga eppendorf y el sobrenadante fue decantado en un vial y analizado en cuanto a glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa utilizando NMR.

Resultadosy discusión Al comienzo de la incubación fue claro que el pretratamiento con ácido diluido había hecho el trabajo sobre la fracción de la hemicelulosa puesto que había presentes 24 g/L de xilosa ya de un teórico de 30 g/L. la composición en azúcar al comienzo de la sacarificación se define en la Tabla 2; la concentración de glucosa libre en el tiempo cero fue aproximadamente 4 g/L.

Tabla 2. Composición de azúcares en el inicio de la sacarificación El pH fue fijado a 5.0 a t=0 y se midió a las 93 horas y 140 horas y fue pH 4.5 en ambos casos, aunque las concentraciones de los ácidos orgánicos no se incrementaron significativamente. La caída en el pH puede haber impactado el rendimiento de la enzima aunque el pH 4.5 es más ideal para la aplicación que el pH 5.0 (debido al riesgo de contaminación bacteriana más bajo a 50°C.

Tabla 3-: Dosificación de enzimas del ejemplo 1 en mg de proteína enzimática (Bradford) por gramo de materia seca de residuos de maíz (mg EP/g CS dm) , para dosificación baja, media y alta de enzima.

Enzima Dosificación de enzima mg EP/g CS dm Baja Media Alta GC220 1.0 3.1 10.4 Filtrase®NL 0.15 0.47 1.5 Laminex®BG 1.1 3.5 11.5 Las figuras la a c presentan los resultados de sacarificación para las tres preparaciones enzimáticas utilizadas en estos experimentos. A partir de los datos presentados en las figuras la a le es claro que el Laminex® BG se asemeja mucho al GC 220. Sin embargo, la preparación Filtrase®NL de Talaromyces parece ser muy activa puesto que libera más azúcares por cantidad de proteína enzimática que el GC 220 o el Laminex® BG. El contenido de proteína de las mezclas enzimáticas se determino mediante la prueba de proteína de Bradford y se determino que la cantidad de proteína utilizada en los experimentos fue menor para la preparación de Filtrase®NL de Talaromyces que para la GC 220 o Laminex® BG. Véase tabla 3. Esto demuestra que la actividad específica de la preparación de Filtrase®NL de Talaromyces es más alta que la de las otras preparaciones de celulasa usadas en la comparación.

Actividad específica La actividad específica de la proteína fue calculada de acuerdo con la siguiente ecuación: Productividad = { [Glucosa+arabinosa+galactosa+xilosa] (gramos de azúcares monoméricos) en tiempo X [Glucosa+arabinosa+galactosa+xilosa] (gramos de azúcares monoméricos) en tiempo 0] } / [tiempo global de incubación (horas)] / [cantidad de proteína de incubación (gramos de proteína) ] En gramos de azúcares fermentable / gramos de proteína enzimática / hora.

Los datos de actividad específica fueron calculados únicamente para los experimentos que produjeron más de 34 g/L de azúcares totales en comparación con los 30 g/L disponibles inicialmente de azúcares en tiempo 0 puesto que los errores pequeños en la medición tienen un alto impacto en las actividades específicas a niveles de producción netos bajos. La actividad específica fue revisada para las 3 preparaciones enzimáticas en 3 puntos del tiempo diferentes y los resultados obtenidos se presentan en las figuras 2A a C y en las figuras 3A a 3C.

A partir de los resultados obtenidos en estos experimentos, se demuestra que la preparación enzimática Filtrase®NL supera a las otras preparaciones de enzimas comerciales de referencia en cuanto a la producción de azúcar o glucosa por cantidad de proteína. El GC 220 fue comparable con el Laminex® BG.

Ejemplo 2 Experimentos SSF con Filtrase®NL y Saccharomyces cerevisiae 237NG utilizando residuos de maíz pretratados Como seguimiento al experimento de sacarificación descrito en el ejemplo 1, se llevaron a cabo experimentos de Sacarificación y Fermentación Simultánea y Destilación para etanol de celulosa en escala de 100 mi con residuos de maíz pre-tratados con ácido diluido utilizando Filtrase®NL y levadura (Saccharomyces cerevisiae 237 NG) . Utilizando esta tecnología, la glucosa inhibidora se elimina y luego se asumen que se obtienen rendimientos de hidrólisis más altos en comparación con la hidrólisis como tal. Un esquema para estos experimentos se presenta en la figura 4.

Materiales y métodos El rendimiento de etanol por ingreso de peso seco de biomasa y rendimientos de la hidrólisis se calcularon como sigue: 1. Entrada de materia seca: determinación de peso seco 48 horas, 105°C 2. Producción de etanol: mi de etanol a 100% medidos sobre DMA 3. Contenido de glucano: muestra NREL, usamos datos proporcionados por NREL 4. Los azúcares en el lavado líquido fueron determinados por NMR (suma de glucosa, galactosa, xilosa y arabinosa) y los azúcares totales presentes en el hidrolizado fueron calculados a partir del balance de masa y el procedimiento de lavado (concentración de azúcares multiplicada por el peso medido del lavado líquido) 5. El rendimiento teórico de etanol a partir del glucano fue calculado mediante: a) Cantidad de peso seco de fibra en un matraz de 250 mi; peso exacto (100,0 +/- 0.1 g) de pasta de fibra por el contenido de materia seca del material de partida (g de fibra dm) * 100/330 (preparamos 3 matraces de 100 g de cada masa a partir de una preparación de una pasta de 330 g de fibra después de ajustar el pH) como valor. Alrededor de 10 g de fibra en 100 g de pasta = 10% dm) b) La cantidad de glucano fue calculada multiplicando el contenido de glucano obtenido a partir de los proveedores de materia prima con el contenido de materia seca tal como lo determinamos por nuestra parte (3 - 4 g de glucano en un paquete no lavado / 100 g de pasta de fibra y 5 - 6 g de glucano en preparaciones de fibra lavadas) . c) La cantidad de glucosa potencial fue calculada multiplicando el glucano con 180/162 (factor de ganancia química debida a la hidrólisis del glucano (glucano = celulosa = polímero de glucosa) d) La cantidad de etanol potencial (asumiendo 0.79 g de etanol/ml de etanol al 100%) se calculo multiplicando la cantidad de glucosa potencial con el rendimiento máximo teórico de etanol sobre la glucosa siendo 0.511 g de etanol/g de glucosa y asumiendo un rendimiento de fermentación de 91.5% del máximo teórico (el promedio industrial se asume que es 91.5% +/- 1.5% (esto significa entre 90% y 93%) . e) % de hidrólisis (celulosa o glucano) = 100* cantidad de etanol producida (g) /etanol máximo teórico (g) .

Resultados y discusión Cuando se utilizan diferentes dosificaciones de enzimas, se obtuvieron cantidades de dosificación crecientes baja, media y alta de enzima (1, 2 y 3 respectivamente) .

La cantidad máxima teórica de etanol que podría a ver sido producida con un 10.2% de materia seca y 34% de contenido de glucano (análisis NREL) habría sido 102*0.34*180/162*0.91*0.511 = 17.9 g de etanol/L de medio.

Como se muestra en las figuras 5 y 6 puede verse que esta cantidad de etanol se alcanzo con la dosificación más alta de enzimas demostrando que la sacarificación completa es posible con Filtrase®NL. Sorprendentemente, esta enzima termofílica también es muy efectiva a una temperatura mesofílica de 33 °C.

Ejemplo 3 Sacarificación de heno de trigo utilizando Filtrase®NL Se trato heno de trigo con vapor a 195 °C durante 12 minutos como se describe por Jan Larsen et al. Chem. Eng. Technol. 2008, 31, No. 5, 1 - 9. La fibra fue hidrolizada utilizando Filtrase®NL con 8% de materia seca sin adición de ácido o base a pH 3.8 a 60 °C con agitación a 175RPM en un incubador con agitación.

Con un contenido de glucano del 50% en la fibra, se esperaría que se produjera un máximo de 40g/L de glucosa. En este experimento el rendimiento de la hidrólisis es > 85% y el potencial total de etanol de este hidrolizado seria 19 g/L a 92% de rendimiento de fermentación sobre los azúcares totales de 40 g/L. La figura 7 presenta los resultados de ese experimento demostrando que se alcanzo este nivel de glucosa. Así, las propiedades acidas de la preparación enzimática permiten de esta forma la producción de etanol sin adición alguna de ácido o base a pH 3.8 que también es óptimo para la levadura Saccharomyces cerevisiae .

Ejemplo 4 Sacarificación de heno de trigo utilizando Filbrase®NL En 10 L de materia prima de heno de trigo pre-tratada a 33- 34% de materia seca como la utilizada en el ejemplo 3 se mezclaron con agua una solución enzimática obtenida a partir de Filtrase®NL eliminando por diálisis el glicerol (el cual está presente en el producto comercial como un agente de la formulación) sobre una unidad UF de dialfiltración 10 kD a partir de la preparación comercial y concentrando la enzima 10 veces. La concentración total de materia seca en la preparación después de 6 horas es 28% de materia seca de heno de trigo. Véase Tabla 4.

Tabla 4: Sacarificación de heno de trigo pretratado como materia prima en una operación de alimentación por lotes, revisión de las dosis a t=lh, t=3h y t=6h, a una dosificación enzimática alta (alta) y dosificación enzimática media (media) .

Edad (h) Compuesto Alta Media Mate ia 1000 g 1000 g prima 0 Enz ima 116 g 47 g celulasa Agua 154 g 227 g Materia 1600 g 1600 g prima 3 Enz ima 36 g 14 g celulasa Ag a 545 g 567 g Materia 3436 g 3436 g 6 prima - El pH fue controlado a 5.0 +/- 0.2 utilizando K0H 8N y H2S04 4N La temperatura fue controlada entre 55 y 60 °C.

La agitación se hizo a 700 RPM utilizando una turbina estándar Rushton Después de un día podían medirse ya concentraciones muy altas de glucosa de >110 g/L y después de dos días de incubación, se midió una concentración de glucosa de 128 g/L usando medición del azúcar por RMN en el sobrenadante después de eliminar los sólidos de lignina restantes por medios de centrifugación mostrando que la enzima es menos severa inhibida por la glucosa que lo esperado a partir de la literatura. Véase figura 8.

Esta concentración de glucosa es la concentración de glucosa más alta jamás observada con una preparación de celulosa con Talaromyces lo que permite que también los procesos comerciales SHF utilicen . esta enzima a la vez que alcanzan un máximo teórico de 65 g/L de etanol cuando toda la glucosa se convierta en etanol (= 0.511*128 g/L) .

Rendimiento máximo teórico El rendimiento máximo teórico (Yps max en g de producto por gramo de glucosa) en una fermentación se calculo como sigue. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 g) produce de acuerdo con la ruta de fermentación por glicólisis normal en levadura 2 moles de etanol (= 2x26 = 92 g de etanol) . El rendimiento máximo teórico de etanol en glucosa es 92/180 = 0.511 g de etanol / g de glucosa.

Para el butanol (PM 74 g/mol) o isobutanol, el rendimiento máximo teórico es 1 mol de butanol por mol de glucosa. Así el Yps máximo para (iso) butanol = 74/180 = 0.411 g de (iso) butanol / g de glucosa.

Para el ácido láctico el rendimiento de la fermentación por fermentación homoláctica es 2 moles de ácido láctico (PM 90 g/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequiométría, el Yps max = 1 g de ácido láctico / g de glucosa .

Tabla 5: Concentraciones de glucosa alcanzable en SHF y concentraciones de producto alcanzables en SSF para productos con diferentes Yps max (g/g) .

SHF SSF Yps max 0, 511 0, 411 1 (g/g) Ácido Glucosa Etanol Butanol láctico Concentración alcanzable g/L g/L g/L g/L Mínimo 25 12, 8 10, 3 25,0 Máximo 250 127, 8 102, 8 250, 0 Sin inhibición de glucosa La Tabla 6 muestra una comparación cinética de beta glucosidasas . Es claro a partir de esta tabla que el Ki (glucosa) de la beta glucosidasa del Talaromyces es muy bajo (0.045), lo que muestra que la composición de acuerdo con la invención no es reprimida por la glucosa.

Tabla 6: Comparación cinética de beta glucosidasas a partir de diferentes fuentes: Talaromyces Trichoderma A. niger B. oryzae Unidad Vmax 1080 470 400 10131 g/g (celobiosa) proteína/hora Km 0, 02 0, 68 0, 05 2,39 g/L (celobiosa) Ki (glucosa) 0, 045 0, 108 3 245 g/L S 2,5 2,5 2,5 2, 5 g/L (celobiosa)

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento de material Lignocelulósico, caracterizado porque comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con una composición que comprende dos o más actividades enzimáticas, siendo dichas actividades enzimáticas, actividades de celulasa y/o hemicelulasa, donde el pH durante el tratamiento es aproximadamente 4.5 o menos, y el tratamiento se lleva a cabo sobre un contenido de materia seca de 15% o más.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH durante el tratamiento es 4.0 o menos .

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una de las actividades enzimáticas es derivada de Talaro yces emersonii .

4. Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dos o más de las actividades enzimáticas se derivan del Talaromyces emersonii.

5. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las actividades enzimáticas son termoestables .

6. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las actividades enzimáticas son capaces de actuar a pH bajo.

7. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la composición comprende una, dos o todas las actividades de endoglucanasa, celobiohidrolasa o ß-glucosidasa.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la composición comprende una endoglucanasa, celobiohidrolasa y ß -glucosidasa todas las cuales son derivadas de Talaromyces emersonii.

9. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la composición comprende actividad de endo-1,3 (1,4)-ß glucanasa y actividad de endo- ß-1 , -glucanasa, derivándose ambas actividades de Talaromyces emersonii .

10. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la composición comprende una o más actividades de xilanasa.

11. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones. precedentes, caracterizado porque la composición comprende una expansina, una proteína similar a la expansina, una proteína inducida por la celulosa, una proteína integradora de la celulosa, una escafoldina o una proteína similar a la escafoldina, opcionalmente derivadas de Talaromyces emersonii.

12. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tratamiento comprende la degradación, por ejemplo hidrólisis y/o modificación de la celulosa y/o hemicelulosa.

13. Un método para producir un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico , caracterizado porque comprende poner en contacto dicho material lignocelulósico con una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los azúcares son azúcares monoméricos y/o multiméricos .

15. Un método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque al menos unos de los azúcares producidos es un azúcar fermentado.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque al menos uno de los azúcares producido es glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucorónico, mañosa, ramnosa, sacarosa o fructosa .

17. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el material lignocelulósico está sometido a un pre- tratamiento antes de ser puesto en contacto con la composición.

18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el pretratamiento comprende exponer el material lignocelulósico a un ácido (tal como ácido diluido) , una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, desgarro, trituración, molienda mecánica o despresurización rápida, o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.

19. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el material lignocelulósico es imprimaciones de huerto, chaparral, residuos de molienda, residuos urbanos de madera, residuos municipales, residuos de tala, residuos de madera forestal, cultivos maderables de rotación corta, residuos industriales, cortezas de trigo, cortezas de avena, cortezas de arroz, cortezas de cebada, cortezas de centeno, cortezas de lino, cascarillas de soya, cascarillas de arroz, cortezas de arroz, harina de gluten de maíz, cascarillas de avena, caña de azúcar, residuos de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cascarillas de maíz, pastos de conmutación, miscantus, sorgo dulce, tallos de cañóla, tallos de soya, hierba de pradera, maicillo, cola de zorro, pulpa de remolacha de azúcar, pulpa de cítricos, cascarillas de semilla, residuos celulósicos de animales, recortes de césped, algodón, algas, arboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, pastos, trigo, residuos de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cascarillas de maíz, placas de cocción de maíz, grano de maíz, fibra de granos, productos y sub-productos de molienda en húmedo o en seco de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, residuos de jardinería, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pulpa, residuos de la molienda del papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, cortezas de maíz, cultivos para energía, bosques, frutos, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, cortezas, agujas, troncos, raíces, plantones, arbustos, pastos de conmutación, árboles, vegetales, cáscaras de frutas, viñedos, pulpa de remolacha de azúcar, cascarilla de avena, madera blanda o dura, material de desecho orgánico generado de un proceso agrícola, residuos forestales o una combinación de dos o más de los mismos.

20. Un método para producir un producto de fermentación, caracterizado porque comprende: Producir un azúcar fermentable utilizando un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y Fermentar el azúcar resultante fermentable, para producir así un producto de fermentación.

21. Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el producto de fermentación es el etanol butanol, ácido láctico, un plástico, un ácido orgánico, un solvente, un suplemento para alimentación animal, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque no se añade ácido o base en el proceso.

23. Uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el tratamiento de un material lignocelulósico .

24. Uso de una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la producción de un azúcar o azúcares a partir de material lignocelulósico.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el material lignocelulósico es como se define en la reivindicación 17.