ES2366122T3 - Beta-glucanasas de talaromyces emersonii. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido, que es una ß-glucanasa que se puede obtener de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.

Description

Campo de la Invención

La presente invención se relaciona con (β-)glucanasas novedosas (y también con celulasas) del hongo Talaromyces, en particular Talaromyces emersonii, y su uso en la degradación del glucano en celulosa.

Antecedente de la Invención

La composición de la pared celular de una planta es compleja y variable. Los polisacáridos se encuentran principalmente en la forma de cadenas largas de celulosa (el componente estructural principal de la pared celular de la planta), hemicelulosa (que comprende varias cadenas β-xilano, tal como xiloglucanos) y pectina.

El beta- glucano (o, más apropiadamente, (1→3)(1→4)β-D-glucano), PM de 10 a 14 kDa, es un componente de hemicelulosa de planta (PM de aproximadamente 700 kDa) y consiste de una estructura de residuos de glucopiranosa ligados a β-1,4 y 1,3. Otro componente es xilano que consiste de residuos xilosa ligados β-1,4, opcionalmente sustituidos con cadenas laterales tal como arabinosa y/o residuos de ácido glucurónico.

Existen diferencias básicas entre las monocotiledóneas (por ejemplo cereales y grasas) y dicotiledóneas (por ejemplo trébol, colza y soya) y entre la semilla y las partes del vegetal de las plantas Monocotiledóneas se caracterizan por la presencia de un complejo arabinoxilano como la estructura hemicelulosa principal, y la estructura principal de la hemicelulosa en las dicotiledóneas es un complejo xiloglucano. Se encuentran concentraciones mayores de pectina en las dicotiledóneas que en las monocotiledóneas. Las semillas son generalmente ricas en sustancias pecticas pero relativamente pobres en material celulósico.

Se utilizan enzimas que degradan la celulosa para el procesamiento del material de planta en el alimento así como también aplicaciones alimenticias o como un alimento o aditivo alimenticio debido a su capacidad de actuar en los sustituyentes principales de la pared celular de la planta.

La mayor parte de las enzimas que degradan la celulosa disponibles en la industria parecen ser glucanasas con un peso molecular relativamente bajo y una estabilidad moderada a altas temperaturas.

MOLONEY A. P. et al. (BIOCHEMICAL JOURNAL, Vol. 225, No. 2, 1985, páginas 365-374) describe cuatro endo-Glucanasas de T. emersonii que muestran una actividad óptima en un pH de 5,5 a 5,8 y a una temperatura de 75 °C a 80 °C.

Sin embargo, para ciertas aplicaciones es deseable utilizar una glucanasa con una termoestabilidad relativamente alta. Si se va a utilizar una glucanasa como un aditivo para alimento de animal entonces se prefiere una alta termoestabilidad debido a que se aplican alta temperatura durante la peletización del alimento del animal.

Resumen de la Invención

Ahora se proporcionan β-glucanasas novedosas (o celulasas) que son capaces de dividir el β-D-glucano (o celulosa) tal como está presente en el material de planta.

Se proporciona un polipéptido, que es una β-glucanasa que se puede obtener de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o

(ii)

una variante de (i) que es capaz de dividir el β-D-glucano que tiene por lo menos 80 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir β-D-glucano.

En su sentido más amplio, la invención se relaciona con β-glucanasas (o celulasas) de Talaromyces, tal como Talaromyces emersonii (un hongo). Estas β-glucanasas pueden dividir el β-D-glucano o celulosa, por ejemplo ellos son β-1,4-endoglucanasas, o tienen la actividad EC 3.2.1.4.

Las glucanasas pueden tener:

a.

un pH óptimo por debajo de 7.0 o 5.4, tal como por debajo de 5.0, por ejemplo de 4.4 a 5.2 o de 3.0 a 6.0 o 7.0; o

b.

una temperatura óptima de por lo menos 72°C, 75°C o incluso 81°C, tal como de 78°C a 85°C o de 83°C a 87°C. Más específicamente, la presente invención proporciona un polipéptido (aislado) β-glucanasa que comprende: la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No 4, o

(ii) una variante de (i) que es capaz de dividir β-D-glucano; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir el β-D-glucano De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido que comprende:

(a)

la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 3 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

(b)

una secuencia que es complementaria a, o que hibrida a, una secuencia como se define en (a) bajo condiciones rigurosas;

(c)

un fragmento de por lo menos 25 bp de la SEQ ID No. 3;

(d)

una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad en una secuencia como se define en (a) o (b) ; o

(e)

una secuencia que se degenera como un resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias como se define en (a) a (d)

(f)

una secuencia modificada de la SEQ ID No. 3 con hasta 100 sustituciones de nucleótido. La invención también proporciona:

-

un vector (por ejemplo de expresión) que comprende un polinucleótido de la invención y que puede ser capaz de expresar un polipéptido de la invención;

-

una estirpe celular o cepa que comprende un vector de la invención;

-

un método para producir un polipéptido de la invención cuyo método comprende mantener una estirpe celular o cepa de la invención bajo condiciones adecuadas para obtener la expresión del polipéptido y, si es necesario, aislar el polipéptido;

-

un método para degradar β-D-glucano, el método comprende poner en contacto un material que comprende el β-Dglucano con un polipéptido de la invención;

-

un método para la identificación de un compuesto que modula la actividad β-glucanasa, cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba en la presencia del β-D-glucano y monitorear o detectar cualquier modulación de la actividad;

-

un método para tratar un sujeto que tiene hiperlipemia cuyo método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido de la invención; y

-

uso del polipéptido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de hiperlipemia. Breve Descripción de las secuencias

La SEQ ID No. 1 es una secuencia de ADN de una primera β-glucanasa (CEA) de la invención de Talaromyces emersonii; La SEQ ID No. 2 es la secuencia de aminoácido de la primera β-glucanasa, CEA; La SEQ ID No. 3 es una secuencia de ADN de una segunda β-glucanasa (CEB) del mismo organismo; La SEQ ID No. 4 es la secuencia de aminoácido de la segunda β-glucanasa, CEB; La SEQ ID No. 5 es una secuencia de ADN de una tercera β-glucanasa (CEC) también del mismo organismo;

La SEQ ID No. 6 es la secuencia de aminoácido de la tercera β-glucanasa, CEC; y la SEQ ID Nos. 7 y 8 son cebadores PCR que hibridan a la SEQ ID No. 1 (y se utilizan para reclonar los insertos de cADN durante análisis genético de transformantes positivos).

Descripción Detallada de la invención

A. Polinucléotidos.

La presente invención proporciona un polinucléotido (por ejemplo aislado y/o purificado) que codifica los polipéptidos de la invención. La presente invención así proporciona un polinucleótido que codifica una β-glucanasa cuya secuencia de aminoácido se establece en la SEQ ID No. 4. La presente invención proporciona adicionalmente un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene homología de la secuencia de aminoácido sustancial a la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 4, también se incluye un polinucleótido seleccionado de:

(a)

un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o el complemento de la misma;

(b)

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido capaz de (por ejemplo selectivamente) hibridar a una secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o un fragmento de la misma;

(c)

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido capaz de (por ejemplo selectivamente) hibridar al complemento de la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o un fragmento de la misma; y/o

(d)

un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que se degenera como un resultado del código genético a un polinucleótido definido en (a), (b) o (c).

Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que:

(a)

codifica un polipéptido que tiene actividad β-glucanasa, cuyo polinucléotido es:

(1)

la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3;

(2)

una secuencia que hibrida selectivamente al complemento de la secuencia definido en (1); o

(3)

una secuencia que se degenera como un resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en

(1)

o (2); o

(b)

es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

Secuencias hibridables

El término "capaz de hibridar" significa que el polinucleótido objetivo de la invención puede hibridar al ácido nucleico utilizado como una sonda (por ejemplo la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ. ID No 3, o un fragmento de la misma o el complemento de la misma) en un nivel significativamente por encima del fondo. La invención también incluye las secuencias de nucleótido que codifican la β-glucanasa o las variantes de la misma así como también las secuencias de nucleótido que son complementarias a la misma. La secuencia de nucleótido puede ser ARN o ADN y así incluye ADN genómico, ADN sintético o cADN. Preferiblemente la secuencia de nucleótido es una secuencia de ADN y más preferiblemente, una secuencia de cADN. Típicamente un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es capaz de hibridar bajo condiciones selectivas a la secuencia de codificación o el complemento de la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3, según sea apropiado. Tales nucleótidos se pueden sintetizar de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica1.

Un polinucleótido de la invención puede hibridar a la secuencia de codificación o el complemento de la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3 (según sea apropiado) en un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridación de fondo puede ocurrir, por ejemplo, debido a que otros cADN están presentes en una colección de cADN. El nivel de señal (por ejemplo generado mediante la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia de codificación o complemento de la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3) es típicamente por lo menos 10 veces, preferiblemente por lo menos 100 veces, tan intenso como las interacciones entre otros polinucléotidos y la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3.

Se puede medir la intensidad de la interacción, por ejemplo, al radiomarcar la sonda, por ejemplo con 32P. La hibridación selectiva típicamente se puede lograr utilizando condiciones de baja rigurosidad (cloruro de sodio al 0.3M y citrato de sodio al 0.03M a aproximadamente 40°C), rigurosidad media (por ejemplo, cloruro de sodio al 0.3M y citrato de sodio al 0.03M a aproximadamente 50°C) o alta rigurosidad (por ejemplo, cloruro de sodio al 0.3M y citrato de sodio al 0.03M a aproximadamente 60°C). La hibridación se puede llevar a cabo bajo cualesquier condiciones adecuadas conocidas en la técnica1 y, como una guía, la baja rigurosidad puede ser 2 x SSC a 55°C, la rigurosidad media puede ser 0.5 1.0 x SSC a 60°C y la alta rigurosidad puede ser 0.1 o 0.2 x SSC a 60°C o más (por ejemplo a 68°C), todos a 0.5% de SDS.

Modificaciones

Los polinucléotidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Ellos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Ellos también pueden ser polinucléotidos que incluyen dentro de ellos uno o más nucleótidos sintéticos

o modificados. Se conocen en la técnica un número de diferentes tipos de modificaciones a los polinucléotidos. Estos incluyen estructuras de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas acridina o polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, se entiende que los polinucleótidos descritos aquí se pueden modificar mediante cualquier método disponible en la técnica.

Se entiende que las personas expertas pueden, utilizando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótido que no afectan la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso del codón de cualquier organismo anfitrión particular, por ejemplo en el que se van a expresar los polipéptidos de la invención.

La secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3 se puede modificar mediante sustituciones de nucleótido, por ejemplo desde o hasta 1, 2 o 3 a 10, 25, 50 o 100 sustituciones. El polinucleótido se puede modificar alternativamente o adicionalmente por una o más inserciones y/o eliminaciones y/o mediante una extensión en uno o ambos extremos. El polinucléotido modificado de manera general codifica un polipéptido que tiene actividad βglucanasa. Se pueden hacer sustituciones degeneradas y/o se pueden hacer sustituciones que resultarían en una sustitución de aminoácido conservadora cuando se traslada la secuencia modificada, por ejemplo como se discute con referencia a los últimos polipéptidos.

Homólogos

Una secuencia de nucleótido que es capaz de hibridar selectivamente a (por ejemplo el complemento de) la secuencia de codificación de ADN de la SEQ ID No. 3 puede tener por lo menos 50% o 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad de secuencia (u homología) con la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3. Esto se puede hacer sobre una región de por lo menos 20, preferiblemente por lo menos 30, por ejemplo por lo menos 40, por lo menos 60, más preferiblemente por lo menos 100 nucleótidos contiguos o de forma óptima sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 3. Para la identidad de secuencia de la SEQ ID No. 3 es preferiblemente por lo menos 85%.

Se puede utilizar cualquier combinación de los grados de homología mencionados anteriormente y el tamaño mínimo para definir los polinucléotidos de la invención, se prefiere con las combinaciones más rigurosas (es decir homología mayor sobre longitudes más largas). Así por ejemplo un polinucleótido que es por lo menos 80% o 90% homólogo sobre 25, preferiblemente sobre 30 nucléotidos forma un aspecto de la invención, como lo hace un polinucleótido que es por lo menos 90% homólogo sobre 40 nucléotidos.

Los homólogos de las secuencias de polinucléotido (o proteína) tienen típicamente por lo menos 70% homología, preferiblemente por lo menos 80, 90%, 95%, 97% o 99% homología, por ejemplo sobre una región de por lo menos 15, 20, 30, 100 más nucleótidos contiguos (o aminoácidos). La homología se puede calcular sobre la base de identidad de aminoácido (algunas veces denominado como "homología dura").

Por ejemplo el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que se puede utilizar para calcular la homología (por ejemplo utilizado en su configuración predeterminada5). Se pueden utilizar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o las secuencias alineadas (tal como identificar las secuencias equivalentes o correspondientes, por ejemplo en sus configuraciones predeterminadas6,7).

El software para desarrollar análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar el par de secuencia de alta clasificación (HSP) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coincida o satisfaga alguna clasificación T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina como el umbral de clasificación de palabra vecina 6,7. Estos aciertos de palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que se pueda incrementar la clasificación de alineación acumulada. Las extensiones para los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la clasificación de alineación acumulada cae en la cantidad X. de su valor máximo alcanzado; la clasificación acumulada va de cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de clasificación negativa; o se alcanza al final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza como predeterminado una longitud de palabra (W) de 11, la alineación de la matriz de clasificación BLOSUM628 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias9. Una medición de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurriría una coincidencia entre los dos nucléotidos o las secuencias de aminoácido por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0.1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menor de aproximadamente 0.001.

Cebadores y Sondas

Los polinucléotidos de la invención incluyen y se pueden utilizar como un cebador, por ejemplo un cebador PCR, un cebador para la reacción de amplificación alternativa, una sonda, o se pueden clonar los polinucleótidos dentro de los vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán por lo menos o hasta 20, por ejemplo por lo menos 25, 30 o 40 nucléotidos de longitud. Ellos tendrán típicamente hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 o 300 nucléotidos de longitud, o aún hasta unos pocos nucléotidos (tal como 5 o 10 nucléotidos) cortos de la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3.

En general, se producirán cebadores por medios sintéticos, que involucran una fabricación en forma de etapas de la secuencia de ácido nucleico de un nucléotido a la vez. Las técnicas para llevar a cabo esto utilizan técnicas automáticas que están disponibles en el arte. Ejemplos de los cebadores de la invención se establecen en la SEQ ID Nos 7 y 8.

Los polinucléotidos más largos se producirán de manera general utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando técnicas de clonación PCR (reacción de cadena polimerasa). Esto implicará elaborar un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15-30 nucléotidos) para una región de la β-glucanasa que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el mARN o el cADN obtenido a partir de una célula objetivo (por ejemplo levadura, bacteria, planta, procariótico u hongo), preferiblemente de una cepa Talaromyces, desarrollando una reacción de cadena polimerasa bajo condiciones que llevan a cabo la amplificación aproximada de la región deseada, que aísla el fragmento amplificado (por ejemplo al purificar la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa) y recupera el ADN amplificado. Se pueden diseñar cebadores que contienen los sitios de reconocimiento de restricción de enzima adecuados de tal manera que el ADN amplificado se puede clonar en un vector de clonación adecuado.

Se pueden utilizar tales técnicas para obtener toda o parte de la secuencia β-glucanasa descrita aquí. Los clones genómicos corresponden al cADN de la SEQ ID No. 3 o el gen β-glucanasa que contiene, por ejemplo, intrones y regiones promotoras también están dentro de la invención y también se pueden obtener en una forma análoga (por ejemplo medios recombinantes, PCR, técnicas de clonación), partiendo del ADN genómico de un hongo, levadura, planta bacteriana o célula procariótica.

Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar una marca reveladora, por ejemplo una marca radioactiva o no radioactiva. Las marcas adecuadas incluyen radioisótopos tal como 32P o 35S, las marcas de enzima, u otras marcas de proteína tal como biotina. Tales marcas se pueden agregar a los polinucléotidos o cebadores de la invención y se pueden detectar utilizando técnicas conocidas per se.

Los polinucléotidos, marcados o no marcados se pueden utilizar en pruebas con base en ácido nucleico o secuencia de β- glucanasa o una variante del mismo en una muestra (por ejemplo hongo). Tales pruebas para detección comprenden de manera general traer una muestra (por ejemplo hongo) (que se sospecha de) que contiene ADN en contacto con una sonda o cebador de la invención bajo condiciones de hibridación y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. Se puede lograr tal detección utilizando técnicas tal como PCR o al inmovilizar la sonda sobre un soporte sólido, remover el ácido nucleico en la muestra que no hibrida la sonda, y luego detectar el ácido nucleico que ha hibridado la sonda. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico se puede inmovilizar sobre un soporte sólido, y se puede detectar la cantidad de la sonda unida a tal un soporte.

Las sondas de la invención se pueden empacar de manera conveniente en la forma de un equipo de prueba en un contenedor adecuado. En tales equipos la sonda se puede unir a un soporte sólido en donde el formato de ensayo para el cual se diseña el equipo requiere tal unión. El equipo también puede contener reactivos adecuados para tratar la muestra que se va a sondear, hibridar la sonda a ácido nucleico en la muestra, reactivos de control, instrucciones, y similares.

Preferiblemente, el polinucleótido de la invención se puede obtener del mismo organismo que el polipéptido, tal como un hongo, en particular un hongo del género Talaromyces.

Los polinucleótidos de la invención también incluyen variantes de la secuencia de la SEQ ID No. 3 que tienen actividad β- glucanasa. Las variantes se pueden formar mediante adiciones, sustituciones y/o eliminaciones y pueden tener la capacidad de dividir un polímero β-D-glucano.

Producción de polinucléotidos

Los polinucléotidos que no tienen 100% de identidad con la SEQ ID No. 3 pero caen dentro del alcance de la invención se pueden obtener en un número de formas. Así las variantes de la secuencia β-glucanasa descrita aquí se pueden obtener por ejemplo al sondear las colecciones de ADN genómico hechas de un rango de organismos, por ejemplo aquellas discutidas como fuentes de los polipéptidos de la invención. Adicionalmente, se pueden obtener otros homólogos de β-glucanasa de hongos, plantas o procarióticos y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar a la SEQ ID No. 3. Se pueden obtener tales secuencias al sondear las colecciones de cADN o las colecciones de ADN genómico de otras especies, y sondear tales colecciones con sondas que comprenden todo o parte de la SEQ ID. 3 bajo condiciones de rigurosidad media a alta (como se describió anteriormente). Las sondas de ácido nucleico que comprenden todo o parte de la SEQ ID No. 3 se pueden utilizar para sondear las colecciones de cADN de otras especies, tal como aquellas descritas como fuentes para los polipéptidos de la invención.

También se pueden obtener homólogos de especies utilizando PCR degenerado que utilizará cebadores designados para las secuencias objetivo dentro de las variantes y homólogos que codifican las secuencias de aminoácido conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas y se utilizarán en condiciones rigurosas menores que aquellas utilizadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia únicos contra las secuencias conocidas.

Alternativamente, se pueden obtener tales polinucléotidos mediante mutagenia dirigida al sitio de las secuencias βglucanasa o las variantes de las mismas. Esto puede ser útil cuando por ejemplo se requieren los cambios de codón inactivos a las secuencias para optimizar las preferencias de codón para una célula anfitriona particular en la que se expresan las secuencias de polinucleótido. Se pueden desear otros cambios de secuencia con el fin de introducir los sitios de reconocimiento de restricción de enzima, o de alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

La invención incluye polinucléotidos bicatenarios que comprenden un polinucleótido de la invención y su complemento.

La presente invención también proporciona polinucléotidos que codifican los polipéptidos de la invención descritos adelante. Debido a que tales polinucléotidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, no es necesario para ellos ser capaces de hibridar a la secuencia de la SEQ ID No. 3, aunque esto será generalmente deseable. De otra forma, tales polinucléotidos se pueden marcar, utilizar, y elaborar como se describió anteriormente si se desea.

B. Polipéptidos.

La presente invención se relaciona con β-glucanasas (por ejemplo (sustancialmente) purificadas y/o aisladas) (o celulasas) y variantes de las mismas. Los polipéptidos de la invención pueden consistir esencialmente de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4 o de una variante de esta secuencia. Los polipéptidos también se pueden codificar por un polinucleótido de la invención como se describió anteriormente.

Un polipéptido de la invención puede estar en una forma aislada o una forma sustancialmente purificada. Se entenderá que el polipéptido se puede mezclar con portadores o diluyentes que no interfieren con los propósitos pretendidos y/o la función del polipéptido y aún relacionarse como sustancialmente aislado. Esto comprenderá de manera general el polipéptido en una preparación en la que más de 20%, por ejemplo más de 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% o 99%, en peso del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la invención. Se pueden emplear métodos de rutina para purificar y/o sintetizar las proteínas de acuerdo con la invención1. Para algunas formulaciones (por ejemplo para usos no farmacéuticos) la cantidad del polipéptido presente puede ser pequeña, por ejemplo de 0.01 a 10%, tal como de 0.1 a 5%, o 2% o aún de 0.2 a 1%.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención se puede obtener de un microorganismo que posee un gen que codifica una actividad de enzima con β-glucanasa (o celulasa). Más preferiblemente el microorganismo es hongo, y de forma óptima un hongo filamentoso. Los organismos preferidos son así del género Talaromyces, tal como de las especies Talaromyces emersonii.

Actividad

Un polipéptido de la invención puede tener una o más de las siguientes características, a saber:

(1)

posee actividad β-glucanasa (o celulasa);

(2)

tiene un rango de pH óptimo de 3 a 6.5 o 7.0, tal como de 4 a 5.5 o 6.0, de forma óptima de 4.5 a 5.0;

(3)

tiene actividad óptima a una temperatura de 30°C a 100°C, tal como 60 a 95°C, de forma óptima de 75°C o 80°C a 90°C. Preferiblemente la temperatura óptima tiene por lo menos 75°C, tal como por lo menos 85°C;

(4)

tiene un peso molecular (desglucosilado) de 20 a 60 kDa, preferiblemente de 20 a 25, 3 5 a 45 o 23 a 50 kDa, de forma óptima de 36 a 40 kDa o (glucosilado) o de 40 a 45kDa;

(5)

tiene un punto isoeléctrico de 3.0 a 3.6 o 5.0, 3.8 a 4.5, 4.5 a 5.0 o de 6.0 a 7.0; y/o

(6)

posee actividad hidrolítica en el β- glucano de cereal o exhibe la actividad hidrolítica por debajo de pH 7.

El polipéptido puede tener la actividad de EC.3.2.1.4 (o actividad endoglucanasa). En general esta puede ser endohidrólisis de los ligados 1,4-β-D-glucosídicos en celulosa. "La actividad β-glucanasa" es la capacidad de dividir la celulosa o un polímero β- glucano (por ejemplo cuando se encuentra en las plantas por ejemplo avena o cebada). La actividad así permite la división entre las unidades terminales y/o no terminales de glucopiranosa adyacente. Preferiblemente la división ocurre en un ligado [glucosa (1-4), (1-3) o (1-6) glucosa]. El polipéptido se puede dividir preferiblemente entre dos unidades adyacentes (por ejemplo glucosa no sustituida). Esto así puede tener actividad endo (es decir ser una endoglucanasa). El polímero de sustrato se puede o no se puede sustituir. Preferiblemente el polipéptido no tendrá actividad xilanasa.

El polipéptido también puede tener la actividad de celulasa, es decir se activa en, o puede dividir, la celulosa. Como el β- glucano es un componente de celulosa, todas las glucanasas caen dentro del término más amplio de celulasas. Los polipéptidos de la presente invención son por lo tanto celulasas debido a que ellas pertenecen a la subclase de las glucanasas. Otros tipos de clases de actividad dentro de las celulasas, aparte de la endoglucanasa (EC 3.2.1.4, como se mencionó anteriormente) son exo-glucanasa/celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91), β-glucosidasa (EC 3.2.1.21), endo-1,6-glucanasa (EC 3.2.1.75), exo-1,3-glucanasa (EC 3.2.1.58), mananasa (EC 3.2.1.78) y endoglicoceramidasa (EC 3.2.1.123). Algunos de los polipéptidos se considera que tienen una, dos o más de estas actividades adicionales con base en su estructura y secuencia, mediante comparación con las enzimas conocidas y la familia de las hidrolasas en las que ellas caen. Así, en la especificación, en donde el contexto es apropiado, la actividad de glucanasa puede significar actividad de celulasa. Una lista de actividades (celulasa) para los polipéptidos se proporciona en el Ejemplo 11 adelante.

Preferiblemente el polipéptido cae dentro de una de las familias 5, 7 o 45, de acuerdo con la clasificación glicosida hidrolasa (CAZy). El polipéptido puede ser un donante glu/glu o asp/asp nucleófilo/protón.

Variantes y Homólogos

Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 4 o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de la secuencia y puede tener actividad β-glucanasa. En general, se prefiere la secuencia de aminoácido de ocurrencia natural se muestra en la SEQ ID No. 4.

En particular, el polipéptido de la invención puede comprender:

a.

la secuencia de polipéptido de la SEQ ID No. 4;

b.

una variante de ocurrencia natural o homólogo de especie de la misma; o

c.

una proteína con por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90, por lo menos 95, por lo menos 98 o por lo menos 99% de identidad de secuencia a (a) o (b).

Una variante puede ser una que ocurre naturalmente, por ejemplo en hongos, bacterias, levaduras o células de planta y que pueden funcionar de una forma sustancialmente similar a la proteína de la SEQ ID No. 4, por ejemplo esta tiene actividad β-glucanasa. De forma similar un homólogo de especie de la proteína será la proteína equivalente que ocurre naturalmente en otra especie y que puede funcionar como una enzima β-glucanasa. Las variantes incluyen variante alélicas de la misma cepa que el polipéptido de la invención o de una cepa diferente, pero del mismo género, o de la misma especie.

Se pueden obtener variantes y homólogos de especie mediante los siguientes procedimientos descritos aquí para la producción del polipéptido de la SEQ ID No. 4 y desarrollar tales procedimientos en una fuente de célula adecuada, por ejemplo una bacteria, levadura, hongo o célula de planta. También será posible utilizar una sonda como se definió anteriormente para sondear colecciones hechas de levadura, bacterias, hongos o células de planta con el fin de obtener clones que incluyen las variantes o la homología de las especies. Los clones se pueden manipular mediante técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención que luego se puede producir mediante técnicas recombinantes o sintéticas conocidas per se.

El polipéptido de la invención preferiblemente tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia en la proteína de la SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97% o por lo menos 99% de identidad de secuencia, por ejemplo sobre una región de por lo menos 60, por lo menos 100, 150, 200 o 300 aminoácidos contiguos o sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 4. Para la SEQ ID No. 4, la identidad de secuencia es preferiblemente por lo menos 60%.

La secuencia del polipéptido de la SEQ ID No. 4 y de las variantes y homólogos de las especies así se puede modificar para proporcionar los polipéptidos de la invención. Se pueden hacer sustituciones de aminoácido, por ejemplo de o hasta 1, 2 o 3 a 10, 20, 30, 50 o 100 sustituciones. También se puede hacer el mismo número de eliminaciones e inserciones. Estos cambios pueden hacer las regiones externas críticas para la función del polipéptido y aún puede resultar en una enzima activa. El polipéptido modificado de manera general retiene la actividad como una β-glucanasa.

Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos de los polipéptidos de longitud completa mencionados anteriormente y de variantes de los mismos, que incluyen los fragmentos de la secuencia establecida en la SEQ ID No. 4. Tales fragmentos retienen típicamente la actividad como una β- glucanasa. Los fragmentos pueden ser por lo menos 50, 100, 150, 200 o 250 aminoácidos largos o puede ser este número de aminoácidos cortos de la longitud completa (como se muestra en la SEQ ID No. 4).

Los polipéptidos de la invención si es necesario se pueden producir mediante medios sintéticos aunque ellos se harán usualmente recombinantemente como se describe adelante. Ellos se pueden modificar por ejemplo mediante la adición de los residuos histidina o un etiqueta T7 para asistir su identificación o purificación o mediante la adición de una secuencia de señal para promover su secreción de una célula.

5

10

15

20

25

30

35

El término "variantes" se refiere a polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o funcionalidad biológica básica como la β-glucanasa (o celulasa), e incluye variantes alélicas. El carácter esencial de la β-glucanasa es que esta es una enzima que exhibe la actividad EC 3.2.1.4 o que pueden dividir los enlaces 1→3, 1→4 y/o 1→6 en β-D-glucano, tal como cereal o avena escanda (β)-glucano. Preferiblemente una variante de polipéptido tiene la misma actividad como la β-glucanasa. Un polipéptido que tiene el mismo carácter esencial como β-glucanasa se puede identificar al utilizar un ensayo de degradación de celulosa o β- glucano, por ejemplo como se describe adelante.

Las variantes de la SEQ ID No. 4 también incluyen las secuencias que varían de la SEQ ID No. 4 pero que no se derivan necesariamente de la proteína β-glucanasa de ocurrencia natural. Se pueden describir estas variantes como que tienen un % de homología en la SEQ ID No. 4 o que tienen un número de sustituciones dentro de esta secuencia. Alternativamente una variante se puede codificar por un polinucleótido que hibrida a la SEQ ID No. 3.

La variantes se pueden definir en una forma similar a las variantes de la SEQ ID No. 3. Así las variantes pueden comprender secuencias variantes derivadas de otras cepas de Talaromyces. Otras variantes se pueden identificar de otras cepas Talaromyces al buscar la actividad de β-D-glucanasa y clonar y secuenciar como anteriormente. Las variantes pueden incluir la eliminación, modificación o adición de aminoácidos únicos o los grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de proteína, mientras que el péptido mantiene la funcionalidad biológica básica de la βglucanasa.

Se pueden hacer sustituciones conservadoras, por ejemplo de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir uno al otro. Preferiblemente las sustituciones no afectan el plegado o actividad del polipéptido.

ALIFÁTICO

No polar G A P

I L V

Polar no cargado

C S T M

N Q

Polar cargado

D E

K R

AROMÁTICO

H F W Y

Las secuencias de polipéptido más cortas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se considera un péptido de por lo menos 50 aminoácidos o hasta 60, 70, 80, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud por caer dentro del alcance de la invención mientras que esto demuestra la funcionalidad biológica básica de la β-glucanasa. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación cuando la proteína es un fragmento de la secuencia de proteína completa y puede comprender o representar una región de unión de β-Dglucano (o manosa) o una región de división β-D-glucano (o celulosa).

Modificaciones

Los polipéptidos de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo modificar post-translacionalmente. Por ejemplo, ellos se pueden glucosilar (una o más veces, mediante los mismos o diferentes azúcares) o pueden comprender los residuos de aminoácido modificados. Ellos también se pueden modificar mediante la adición de residuos histidina (para asistir su purificación) o mediante la adición de una secuencia de señal (para promover la inserción dentro de la membrana celular). El polipéptido puede tener una o más extensiones de terminal amino (N) o carboxilo (C), tal como un residuo de metionina de terminal amino, un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión (pequeña) que facilita la purificación, tal como una etiqueta polihistidina o T7, un epítopo antigénico o (por ejemplo maltosa) un dominio de unión14 (por ejemplo en el terminal C). Estas extensiones se pueden o no se pueden agregar por medio de un ligador.

Un polipéptido de la invención se puede marcar con una etiqueta de revelación. La etiqueta de revelación puede ser cualquier etiqueta adecuada que le permite al polipéptido ser detectado. Las marcas adecuadas incluyen radioisótopos, por ejemplo 125I, 35S, enzimas, anticuerpos, polinucléotidos y ligadores tal como biotina.

Se pueden modificar los polipéptidos por incluir aminoácidos de ocurrencia no natural o para incrementar la estabilidad del polipéptido. Cuando las proteínas o los péptidos se producen por medios sintéticos, tales aminoácidos se pueden introducir durante producción. Las proteínas o péptidos también se pueden modificar luego de la producción recombinante o sintética.

Los polipéptidos de la invención también se pueden producir utilizando, o comprende, (uno o más) D-aminoácidos.

Se conocen en la técnica un número de modificaciones de cadena lateral y se pueden hacer para las cadenas laterales de las proteínas o péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos mediante alquilación reductiva mediante reacción con un aldehído seguido por reducción con NaBH4, amidinación con metilacetimidato o acilación con anhídrido acético.

Las secuencias proporcionadas por la presente invención también se pueden utilizar como materiales de partida para la construcción de enzimas de "segunda generación". Las glucanasas de "segunda generación" son glucanasas, alteradas mediante técnicas de mutagenia (por ejemplo mutagenia dirigida a sitio), que tienen propiedades que difieren de aquellas glucanasas tipo natural o glucanasas recombinantes tal como aquellas producidas por la presente invención. Por ejemplo, la temperatura o pH óptimo, actividad específica, afinidad de sustrato o termoestabilidad se pueden alterar con el fin de que sean más adecuados para aplicación en un proceso definido.

Los aminoácidos esenciales para la actividad de las glucanasas de la invención, y por lo tanto preferiblemente sujetas a sustitución, se pueden identificar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagenia dirigida a sitio o mutagenia de exploración alanina10. En las últimas técnicas las mutaciones se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (por ejemplo actividad de glucanasa) para identificar los residuos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de enzima-sustrato también se pueden determinar mediante el análisis de la estructura de cristal como se determina mediante tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía o etiqueta de foto-afinidad 11,12,13 o modelamiento molecular:

El uso de levadura y células anfitrionas de hongos se espera que proporcione tales modificaciones posttranslacionales (por ejemplo procesamiento proteolítico, miristilación, glucosilación, truncación, y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según se pueda necesitar para conferir actividad biológica óptima en los productos de expresión recombinantes de la invención.

Se pueden proporcionar los polipéptidos de la invención en una forma de tal manera que ellos están afuera de su ambiente celular natural. Así, ellos se puede aislar o purificar sustancialmente, como se discutió anteriormente, o en una célula en la que ellos no ocurren en la naturaleza, por ejemplo una célula de otras especies de hongos, animales, levadura o bacterias.

C. Aspectos Recombinantes.

La invención también proporciona vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, que incluyen vectores de clonación y expresión, y métodos de crecimiento, que transforman o transfectan tales vectores en una célula anfitriona adecuada, por ejemplo bajo condiciones en la que ocurre la expresión de un polipéptido de la invención, También se proporcionan células anfitrionas que comprenden un polinucleótido o vector de la invención en donde el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula anfitriona. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula anfitriona, significa que el polinucleótido no ocurre naturalmente en el genoma de la célula anfitriona o que el polipéptido no se produce naturalmente mediante esta célula. Preferiblemente, la célula anfitriona es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces o una célula de hongo, por ejemplo del género Aspergillus.

Los polinucléotidos de la invención se pueden incorporar en un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de expresión o de clonación. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. Así en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar los polinucléotidos de la invención al introducir el polinucléotido de la invención dentro de un vector replicable, introducir el vector dentro de una célula anfitriona compatible, y hacer crecer la célula anfitriona bajo condiciones que traen la replicación cercana del vector. El vector se puede recuperar de la célula anfitriona. Las células anfitrionas adecuadas se describen adelante en conexión con los vectores de expresión.

Vectores

El polinucleótido de la invención se puede insertar dentro de un casete de expresión. El vector dentro del cual el casete de expresión o el polinucléotido de la invención se inserta puede ser cualquier vector que se puede someter de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente en la célula anfitriona en la cual este se introduce. Así, el vector puede ser un vector automáticamente replicante, es decir un vector que existe como una entidad extra-cromosómica, la replicación de la cual es independiente de replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno, cuando se introduce dentro de una célula anfitriona, se integra dentro del genoma de la célula anfitriona y se replica junto con los cromosomas en la que esta se ha integrado.

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector se liga operablemente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación mediante la célula anfitriona, es decir el vector es un vector de expresión. El término "ligado operablemente” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en un relación que les permiten funcionar en una forma pretendida. Una secuencia reguladora tal como un promotor, mejorador u otra señal de regulación de expresión "ligada operablemente" a una secuencia de codificación se posiciona en tal una forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condición compatible con las secuencias de control.

El vector puede ser un plásmido, cósmido, virus o vector de fago, proporcionado usualmente con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un mejorador y/o un regulador del promotor. Puede estar presente una secuencia terminadora, como puede estar presente una secuencia de poliadenilación. El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina (en el caso de un plásmido bacteriano) o un gen de resistencia a neomicina (para un vector de mamífero). Se pueden utilizar vectores in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o se pueden utilizar para transfectar o transformar una célula anfitriona. Ellos pueden comprender dos o más polinucléotidos de la invención, por ejemplo para sobreexpresión.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido se introduce preferiblemente dentro de un anfitrión adecuado como parte de un casete de expresión (o construcción) en el que la secuencia de ADN se liga operablemente a las señales de expresión que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células anfitrionas. Para la transformación del anfitrión adecuado están disponibles los procedimientos de transformación de construcción de la expresión que son bien conocidos por la persona experta3,4. La construcción de expresión se puede utilizar para la transformación del anfitrión como parte de un vector que lleva un marcador seleccionable, o la construcción de expresión se puede co-transformar como una molécula separada junto con el vector que lleva un marcador seleccionable. El vector puede comprender uno o más genes marcadores seleccionables.

Los marcadores seleccionables preferidos15,16 incluyen pero no se limitan a aquellos que complementan un defecto en la célula anfitriona o confiere resistencia a un fármaco. Ellos incluyen por ejemplo genes marcadores versátiles que se pueden utilizar para la transformación de la mayor parte de hongos filamentosos y levaduras tal como genes acetamidasa o cADN (los genes amdS, niaD, facA s o cADN de A. nidulans, A.oryzae, o A.niger), o genes que proporcionan resistencia a los antibióticos como resistencia a G418, higromicina, bleomicina, canamicina, fleomicina

o benomilo (benA). Alternativamente, se pueden utilizar marcadores de selección específicos tal como marcadores auxotróficos que requieren cepas de anfitrión mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger), argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una realización preferida el marcador de selección se elimina de la célula anfitriona transformada después de la introducción de la construcción de expresión con el fin de obtener las células anfitrionas transformadas capaces producir el polipéptido que son libres de los genes marcadores de selección21,22.

Otros marcadores incluyen sintetasa ATP, subunidad 9 (oliC), orotidina-5’ fosfato= descarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia bacteriana G418 (este también se puede utilizar en la levadura, pero no en el hongo), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen uidA E. coli, que codifica la β-glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o se pueden utilizar para transfectar o transformar una célula anfitriona.

Para la mayor parte de hongos filamentosos y levadura, el vector o la construcción de expresión se integra preferiblemente en el genoma de la célula anfitriona con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episómicos adecuados en los que se puede incorporar la construcción de expresión para la expresión estable y de alto nivel, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2P y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo AMA1 de Aspergillus3,20). En el caso que se integren las construcciones de expresión en el genoma de células anfitrionas, las construcciones se integran en el sitio aleatorio en el genoma, o en el sitio objetivo predeterminado utilizando la recombinación homóloga, en cuyo caso el sitio objetivo comprende preferiblemente un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo mARN se puede hacer por lo menos 0.01% (p/p) del mARN celular toral, por ejemplo bajo condiciones inducidas, o alternativamente, un gen cuyo producto de gen se puede hacer por lo menos 0.2% (p/p) de la proteína celular total, o, en el caso de un producto de gen secretado, se puede secretar en un nivel de por lo menos 0.05g/l. Se proporcionan adelante un número de ejemplos de genes altamente expresados adecuados.

Un vector o construcción de expresión para una célula anfitriona dada puede comprender los siguientes elementos, ligados operablemente uno al otro en un orden consecutivo del extremo 5’ al extremo 3 con relación a la cepa codificante de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención:

(1)

una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en la célula anfitriona dada;

(2)

opcionalmente, una secuencia de señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido de una célula anfitriona dada dentro de un medio de cultivo;

(3)

una secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferiblemente una forma activa del polipéptido; y preferiblemente también

(4)

una región de terminación de transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción en la dirección 5’ de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

La dirección 3’ de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido puede ser una región no traducida 3’ que contiene uno o más sitios de terminación de transcripción (por ejemplo un terminador). El origen del terminador es menos crítico. El terminador por ejemplo puede ser nativo en la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente se utiliza un terminador de levadura en las células anfitrionas de levadura y un terminador de hongo filamentoso se utiliza en células anfitrionas de hongo filamentoso. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula anfitriona (en la que se expresa la secuencia de ADN que codifica el polipéptido).

La expresión mejorada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención también se puede lograr mediante la selección de las regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo las secuencias promotoras, líderes de secreción y/o terminadoras, que pueden servir para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del anfitrión de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.

Aparte del promotor nativo al gen que codifica el polipéptido de la invención, se pueden utilizar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el anfitrión de expresión deseado.

Los promotores/mejoradores y otras señales de regulación de la expresión se pueden seleccionar por ser compatibles con la célula anfitriona para el cual se designa el vector de expresión. Por ejemplo se pueden utilizar promotores procarióticos, en particular aquellos adecuados para uso en las cepas E. coli. Cuando se lleva a cabo la expresión en las células de mamífero, se pueden utilizar promotores de mamífero. Los promotores específicos de tejido, por ejemplo los promotores específicos de célula de hepatocito, también se pueden utilizar. Los promotores víricos también se pueden utilizar, por ejemplo el virus de leucemia Moloney de murino de repetición de terminal largo (MMLV LTR), promotor LTR del virus promotor de sarcoma rous (RSV), promotor SV40 (por ejemplo antígeno T largo), promotor IE de citomegalovirus humano (CMV), promotores del virus de herpes simplex o promotores de adenovirus, promotores HSV tal como los promotores HSV IE), o promotores HPV, particularmente la región reguladora en la dirección 5’ HPV (URR). Los promotores de levadura incluyen los promotores S. cerevisiae GAL4 y ADH, el promotor S. pombe nmt 1 y adh. Los promotores de mamífero incluyen el promotor metalotioneina que se puede inducir en respuesta a los metales pesados tal como promotores de cadmio y β-actina. Los promotores específicos de tejido, en particular promotores específicos de célula endotelial o neuronal (por ejemplo los promotores DDAHI y DDAHII), se prefieren especialmente.

Se puede utilizar una variedad de promotores15,16 que son capaces de dirigir la transcripción en las células anfitrionas de la invención. Preferiblemente la secuencia promotora se deriva de un gen altamente expresado como se definió previamente. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos de los que los promotores se derivan preferiblemente y/o se comprenden en el sitio objetivo predeterminado para la integración de las construcciones de expresión, que incluyen pero no se limitan a genes que codifican las enzimas glucolíticas tal como isomerasas triosafosfato (TPI), deshidrogenasas gliceraldehído-fosfato (GAPDH), quinasas fosfoglicerato (PGK), quinasas piruvato (PYK), deshidrogenasas de alcohol. (ADH), así como también genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, β-galactosidasas, oxidasas de alcohol (metanol), factores de elongación y proteínas ribosómicas. Ejemplos específicos de genes altamente expresados adecuados incluyen por ejemplo el gen LAC4 de Kluyveromyces sp., los genes de oxidasa metanol (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes glucoamilasa (glaA) de A.niger y A.awamori, el gen A.oryzae TAKA-amilasa, el gen A. nidulans gpdA y los genes T.reesei celobiohidrolasa.

Ejemplos de promotores constitutivos fuertes y/o inducibles que se prefieren para uso anfitriones de expresión fúngicos15,16 son aquellos que se pueden obtener de los genes fúngicos para promotores xilanasa ( xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 oliC), isomerasas de fosfato triosa ( tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), α-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG – del gen glaA), acetamidasa (amdS) y deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (gpd).

Ejemplos de promotores de levadura fuertes son aquellos que se pueden obtener de los genes para el alcohol deshidrogenasa, lactasa, quinasa 3-fosfoglicerato e isomerasa triosefosfato.

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores α-amilasa y SPo2 así como también los promotores de genes proteasa extracelulares.

Los promotores adecuados para células de planta incluyen sintasa napalina (nos), sintasa octopina (ocs), sintasa manopina (mas), la subunidad pequeña ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, virus mosaico del coliflor (CMV) 35S y 19S y promotores de circovirus. Todos estos promotores están disponibles fácilmente en la técnica.

El vector puede incluir adicionalmente las secuencias que flanquean el polinucleótido que surge de ARN que comprende las secuencias homólogas a las secuencias genómicas eucarióticas, preferiblemente secuencias genómicas de mamífero, o secuencias genómicas víricas. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención dentro del genoma de las células eucarióticas o los virus mediante recombinación homóloga. En particular, un vector de plásmido que comprende el casete de expresión flanqueado por las secuencias víricas que se pueden utilizar para preparar un vector vírico adecuado para suministrar los polinucleótidos de la invención en una célula de mamífero. Otros ejemplos de los vectores víricos adecuados incluyen vectores víricos de herpes simplex 18,19 y retrovirus, que incluyen lentivirus, adenovirus, virus asociados adeno y virus HPV (tal como HPV-16 o HPV-18). Las técnicas de transferencia de gen que utilizan estos virus se conocen por aquellos expertos en la técnica. Los vectores de retrovirus se pueden utilizar por ejemplo para integrar establemente el que surge para el ARN anticodificante dentro del genoma anfitrión. Los vectores de adenovirus de replicación defectuosa por contraste permanece episómico y por lo tanto permite la expresión transitoria.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección anticodificante para proporcionar la producción del ARN anticodificante. Esto se puede utilizar para reducir, si es deseable, los niveles de la expresión del polipéptido.

Células anfitrionas y Expresión

En un aspecto adicional la invención proporciona un proceso para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención que comprende cultivar una célula anfitriona (por ejemplo transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente) bajo condiciones para proporcionar la expresión (mediante el vector) de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido, y opcionalmente recupera el polipéptido expresado. Los polinucléotidos de la invención se pueden incorporar dentro de un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. Así en una realización adicional, la invención proporciona un método para elaborar un polinucleótido de la invención al introducir un polinucleótido de la invención dentro de un vector replicable, introducir el vector en una célula anfitriona compatible, y hacer crecer la célula anfitriona bajo condiciones que llevan la replicación cercana del vector. El vector se puede recuperar de la célula anfitriona. Las células anfitrionas adecuadas incluyen bacterias tal como E. coli, levadura, estirpes celulares de mamífero y otras estirpes celulares eucarióticas, por ejemplo células de insectos tal como células Sf9 y células de hongos (por ejemplo filamentosos).

Preferiblemente el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica una forma madura del polipéptido en la construcción de expresión se liga operablemente a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de señal. Preferiblemente la secuencia de señal es nativa (homólogo) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Alternativamente la secuencia de señal es externa (heteróloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia de señal es preferiblemente endógena a la célula anfitriona en la que se expresa la secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias de señal adecuados para las células anfitrionas de levadura son las secuencias de señal derivadas de genes de factor α de levadura. De forma similar, una secuencia de señal adecuada para las células anfitrionas de hongos filamentosos es por ejemplo una secuencia de señal derivada de un gen amiloglucosidasa (AG), por ejemplo el gen A. niger glaA. Esto se puede utilizar en combinación con el promotor amiloglucosidasa (también llamado (gluco)amilasa) en sí mismo, así como también en combinación con otros promotores. Las secuencias de señal de híbrido también se pueden utilizar con el contexto de la presente invención.

Las secuencias líderes de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan del gen amiloglucosidasa fúngico (AG) (glaA – ambas versiones 18 y 24 de aminoácido por ejemplo de Aspergillus), el gen de factor α (levaduras por ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen α-amilasa (Bacillus.)

Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula anfitriona adecuada como se describió anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula anfitriona transformada con un vector de expresión como se describió anteriormente bajo condiciones para proporcionar la expresión mediante el vector de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido.

Un aspecto adicional de la invención así proporciona las células anfitrionas transformadas o transfectadas con o que comprende un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente el polinucleótido se lleva en un vector para la replicación y la expresión del polinucleótido. Las células se seleccionarán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser por ejemplo células procarióticas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o de planta.

También se puede seleccionar un anfitrión heterólogo en donde el polipéptido de la invención se produce en una forma que es sustancialmente libre de otras enzimas de degradación de celulosa. Esto se puede lograr al seleccionar un anfitrión que no produce normalmente tales enzimas tal como Kluyveromyces lactis.

La invención abarca los procesos para la producción del polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito la secuencia de ADN de la invención se puede utilizar para amplificación de gen y/o intercambio de las señales de expresión, tal como promotores, secuencias de señal de secreción, con el fin de permitir la producción del polipéptido en una célula anfitriona homóloga o heteróloga adecuada. Una célula anfitriona homóloga se define aquí como una célula anfitriona que es de la misma especie o que es una variante dentro de la misma especie como la especia de la cual se deriva la secuencia de ADN.

Las células anfitrionas adecuadas son preferiblemente microorganismos procarióticos tal como bacterias, o más preferiblemente organismos eucarióticos, por ejemplo hongos, tal como levaduras o hongos filamentosos, o células de plantas. En general, se prefieren las células de levadura sobre las células de hongos debido a que ellas son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan pobremente de las levaduras, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por ejemplo hiperglucosilación en levadura). En estos casos, se puede seleccionar un organismo anfitrión fúngico.

La célula anfitriona puede sobreexpresar el polipéptido, y las técnicas para sobreexpresión por ingeniería son bien conocidas3. El anfitrión así puede tener dos o más copias del polinucléotido codificante (y el vector así puede tener dos o más copias de acuerdo con lo anterior).

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como anfitriones heterólogos debido a su capacidad de secretar las proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como anfitriones son aquellas del género Streptomyces y Pseudomonas. Una célula anfitriona de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces. Más preferiblemente un célula anfitriona de levadura se selecciona del grupo que consiste de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocido como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, y Schizosaccharomyces pombe.

Son más preferidas, sin embargo, las células anfitrionas de hongos (por ejemplo filamentosos). Las células anfitrionas de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del grupo que consiste del género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichurn, Thielavia, y Talaromyces. Más preferiblemente una célula anfitriona de hongo filamentoso es de la especie Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o una especie del Grupo Aspergillus niger (como se define por Raper and Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965). Estos incluyen pero no se limitan a Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus ficuum, y consiste adicionalmente de las especies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.

Ejemplos de anfitriones de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención son hongos tal como las especies Aspergillus (descritas en la EP-A-184,438 y EP-A-284,603) y las especies Trichoderma; bacterias tal como las especies Bacillus (descrito en la EP-A-134,048 y EP-A-253,455), por ejemplo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, las especies Pseudomonas; y levaduras tal como las especies Kluyveromyces (descritas en la EP-A-096,430 por ejemplo Kluyveromyces lactis en la EP-A-301,670) y las especies Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.

Las células anfitrionas de acuerdo con la invención incluyen células de plantas, y la invención por lo tanto se extiende a organismos transgénicos, tal como plantas y partes de las mismas, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o genéticamente modificada) por lo tanto puede insertar (por ejemplo establemente) dentro de su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de las células de planta se puede desarrollar utilizando técnicas conocidas, por ejemplo utilizando un plásmido Ti o a Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) así puede contener las secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear los derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

Alternativamente se puede efectuar la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica la planta que se va a infectar se puede herir, por ejemplo al cortar planta con una navaja o puncionar la planta con una aguja o se frota la planta con un abrasivo. La herida luego se inocula con el Agrobacterium. La planta o parte de la planta luego se puede hacer crecer en un medio de cultivo adecuado y permite desarrollar en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en las plantas genéticamente modificadas se puede lograr al utilizar las técnicas conocidas, por ejemplo al seleccionar los brotes transformados utilizando antibiótico y al sub-cultivar los brotes en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de planta y similares.17

Cultivo de las células anfitrionas y producción recombinante

La invención también incluye células que se han modificado para expresar la β-glucanasa o una variante de la misma. Tales células incluyen estirpes celulares eucarióticas mayores preferiblemente estables, o transitorias, tal como células de mamífero o células de insecto, células eucarióticas inferiores, tal como levadura y células de hongos (por ejemplo filamentosos) o células procarióticas tal como células bacterianas.

También es posible para las proteínas de la invención ser expresadas transitoriamente en una estirpe celular o en una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión baculovirus. Tales sistemas, que se adaptan para expresar las proteínas de acuerdo con la invención, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención se puede efectuar mediante el cultivo de los anfitriones de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucléotidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes convencional.

Las células anfitrionas recombinantes de acuerdo con la invención se pueden cultivar utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula anfitriona, está disponible la condición de cultivo que es conductiva para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de lograr la densidad celular deseada o el título del cultivo de polipéptido se detiene y el polipéptido se recupera utilizando los procedimientos conocidos.

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbón (por ejemplo glucosa, maltosa, molasas, celulosa, β- glucano etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.); una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutriente inorgánicas (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, se puede incluir un inductor (por ejemplo celulosa, β-glucano, maltosa o maltodextrina).

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del anfitrión de expresión y/o con base en los requerimientos reguladores de la construcción de expresión. Tales medios se conocen por aquellos expertos en la técnica. El medio, si se desea, puede contener componentes adicionales que favorecen los anfitriones de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se puede desarrollar durante un periodo de 0.5-30 días. Puede ser un proceso por lote, continuo o por lote-carga, de forma adecuada a una temperatura en el rango de entre 0 y 45°C y, por ejemplo, en un pH entre 2 y 10. Las condiciones de fermentación preferidas son a una temperatura en el rango entre 20 y 37°C y/o un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas se seleccionan usualmente con base en la elección del anfitrión de expresión y la proteína que se va a expresar.

Después de fermentación, si es necesario, las células se pueden remover del caldo de cultivo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después que se ha detenido la fermentación o después de la remoción de las células, el polipéptido de la invención luego se puede recuperar y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales.

D. Usos de los polipéptidos y métodos para procesar materiales que contienen celulosa o planta

Los polipéptidos de la invención que poseen actividad β-glucanasa (o celulasa) se pueden utilizar para tratar el material de planta o fúngico que incluye pulpa de planta y extracto de plantas. Por ejemplo, ellos se pueden utilizar para tratar cereales, vegetales, frutas o extractos de los mismos. Ellos se pueden utilizar para composiciones de lavado (líquido o sólido, por ejemplo polvo) y/o en composiciones de detergente. Convenientemente el polipéptido de la invención se combina con portadores o diluyentes adecuados (sólido o líquido) que incluyen amortiguadores para producir una preparación de composición/ enzima. El polipéptido se puede unir a o mezclar con un portador, por ejemplo se inmoviliza en un portador sólido. Así la presente invención proporciona en un aspecto adicional una composición que comprende un polipéptido de la invención. Esto puede estar en una forma adecuada para empaque, transporte y/o almacenamiento, preferiblemente cuando se retiene la actividad glucanasa. Las composiciones incluyen pasta, líquido, emulsión, polvo, hojuela, granulado, glóbulo u otra forma de extrudido.

La composición puede comprender adicionalmente ingredientes adicionales tal como una o más enzimas, por ejemplo pectinasas, que incluyen (por ejemplo endo)-arabinanasa y ramnogalacturonasa, otras celulasas, xilanasas, galactanases, mananasas y/o xiloglucanasas. El polipéptido es típicamente estable se formula en líquida o forma seca. Típicamente, el producto se hace como una composición que incluirá opcionalmente, por ejemplo, un amortiguador estabilizante y/o conservante. Las composiciones también pueden incluir otras enzimas capaces de digerir el material de planta o celulosa, por ejemplo otras celulasas, por ejemplo (β-D-)glucanasas. Para ciertas aplicaciones, se puede preferir la inmovilización de la enzima en una matriz sólida o la incorporación o en partículas de portador sólidas. La composición también puede incluir una variedad de otros materiales de enzimas que degradan la planta, por ejemplo (otras) celulasas y otras pectinasas.

Los polipéptidos y composiciones de la invención por lo tanto se pueden utilizar para un método para procesar material de planta para degradar o modificar los constituyentes de celulosa (por ejemplo β-D-glucano) de las paredes celulares de la planta o material fúngico. Así en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para degradar o modificar una célula de planta o celulosa cuyo método comprende poner en contacto la planta, célula de hongo o celulosa con un polipéptido o composición de la invención.

La invención también proporciona un método para procesar un material de planta cuyo método comprende poner en contacto el material de planta con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material de planta. Preferiblemente el material de planta es una pulpa de planta o extracto de planta.

En particular, la degradación preferiblemente comprende la división de las subunidades ß- glucano de una celulosa de la pared celular de la planta. El material de planta es preferiblemente un cereal, vegetal, fruta o vegetal o pulpa o extracto de fruta. La presente invención proporciona adicionalmente un material de planta procesado que se puede obtener al poner en contacto un material de planta con un polipéptido o composición de la invención.

La presente invención también proporciona un método para reducir la viscosidad de una planta extracto cuyo método comprende poner en contacto el extracto de planta con un polipéptido o composición de la invención en una cantidad efectiva en degradar celulosa (o β-D-glucano) contenida en el extracto de planta.

Los materiales que contienen celulosa y planta incluyen pulpa de planta, partes de plantas y extracto de plantas. En el contexto de esta invención un extracto de un material de planta es cualquier sustancia que se puede derivar de material de planta mediante extracción (mecánica y/o química), procesamiento o mediante otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base, o concentrados hechos de los mismos. El polipéptido se puede utilizar en (por ejemplo total) licuefacción y/o maceración (avanzada), por ejemplo en preparar jugos (frutas). El material de planta puede comprende o se puede derivar de vegetales, por ejemplo, zanahoria, apio; cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soya, semilla de soya, guisantes) o frutos, por ejemplo, frutos de semilla o de pepita (manzanas, peras, membrilla etc.), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y partes de las mismas (por ejemplo polen, de árboles de pino), o cereal (avena, cebada, trigo, maíz, arroz).

Los polipéptidos de la invención así se pueden utilizar para tratar el material de planta que incluye pulpa de planta y extracto de plantas. Ellos también se pueden utilizar para tratar alimentos líquidos o sólidos o ingredientes de alimentos comestibles.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se utilizan como una preparación de composición/ enzima como se describió anteriormente. La composición se agregará generalmente a la pulpa de planta que se puede obtener mediante, por ejemplo procesamiento mecánico tal como triturado o molido del material de planta. La incubación de la composición con la planta se llevará a cabo típicamente durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente 10-55°C, por ejemplo de 15 a 25°C, de forma óptima aproximadamente 20°C y uno puede utilizar 10-300 g, preferiblemente 30-70 g, de forma óptima aproximadamente 50 g de enzima por ton de material a ser tratado. Todas las enzimas o sus composiciones utilizadas se pueden agregar secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa de planta. Dependiendo de la composición de la preparación de enzima el material de planta primero se puede macerar (por ejemplo en un puré) o licuificar. Utilizando los polipéptidos de la invención se pueden mejorar los parámetros de procesamiento tal como el rendimiento de la extracción, viscosidad del extracto y/o calidad del extracto.

Alternativamente, o en adición a lo anterior, se puede agregar un polipéptido de la invención al jugo crudo obtenido de prensa o licuefacción de la pulpa de planta. El tratamiento del jugo crudo se llevará a cabo en una forma similar a la pulpa de planta con respecto a la dosificación, la temperatura y el tiempo de mantenimiento. De nuevo, se pueden incluir otras enzimas tal como aquellas discutidas previamente. Las condiciones de incubación típicas son como se describe en el párrafo anterior. Una vez se ha incubado el jugo crudo con los polipéptidos de la invención, el jugo luego se centrifuga o (ultra) se filtra para producir el producto final.

Una composición que contiene un polipéptido de la invención también se puede utilizar durante la preparación de purés de frutas o de vegetales.

El polipéptido de la invención también se puede utilizar en elaboración de cerveza, elaboración de vinos, destilación

o panadería. Este por lo tanto se utiliza en la preparación de bebidas alcohólicas tal como vino y cerveza, por ejemplo para mejorar la capacidad de filtración o la claridad del vino. En panadería el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su pegajosidad o flexibilidad, mejorar el volumen de hojas y/o la estructura de la migaja.

El polipéptido de la invención se puede utilizar en elaboración de cerveza. En la elaboración de la cerveza, los problemas de filtración pueden resultar en la selección de granos y mezcla, que incluyen maltas sobremodificadas, debido a la presencia de β-glucanos liberados en altas temperaturas. La reducción en la velocidad de filtración de mosto puede ser uno de los problemas principales encontrados. Los problemas adicionales son estabilidad coloidal y formación de neblina en la cerveza final. Estos se pueden originar por los mismos complejos de carbohidrato, especialmente durante la fabricación de cerveza a alta de gravedad. Los polipéptidos de la invención pueden ser capaces de mejorar la capacidad de filtración del mosto, por ejemplo después de maceración. En esta forma, se puede retener menos mosto de licor en los granos gastados, y el rendimiento del extracto se puede mejorar. Una filtración más eficiente puede resultar en una eficiencia incrementada de la cervecería. Así, en general, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para mejorar la capacidad de filtración o el índice de filtración de la cerveza (por ejemplo final).

Los polipéptidos de la invención también pueden evitar o por lo menos mitigar la formación de neblina durante la fabricación de la cerveza. Los β-glucanos encontrados en las paredes de endospermo de los cereales se pueden llevar a cabo en la cerveza final. Esto puede generar neblina y pérdida de claridad. Los polipéptidos de la invención pueden evitar o por lo menos mitigar la acumulación de partículas debido a la hidrólisis del β-glucano. Por lo tanto los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para incrementar la estabilidad coloidal de la cerveza (por ejemplo final).

Los polipéptidos encuentran uso en un número de áreas industriales debido a su actividad glucanasa. Estos pueden incluir no solo producción de alcohol, sino también en biometanación, en elaboración de pan y en panadería, en higiene dental (por ejemplo composiciones dentales u orales), en el tratamiento o fabricación de telas, prendas o cuero, en la fabricación de papel, en farmacéuticos, en te, en la preparación o en el tratamiento de textiles, en composiciones de detergente o de lavado, y en el tratamiento de desperdicios. Un aspecto de la invención es por lo tanto un alimento o producto alimenticio que comprende el polipéptido, tal como una bebida alcohólica, pan, masa o tea. El polipéptido se puede formular en una composición adecuada para cualquiera de estos usos. El polipéptido puede estar presente en una composición acuosa (por ejemplo agua caliente), preferiblemente con uno o más fungicidas, con el fin de tratar el material de planta (por ejemplo bulbos), especialmente para controlar los insectos parasíticos, ácaros y nemátodos.

Como los polipéptidos de la invención pueden degradar el glucano se puede agregar a los alimentos o productos alimenticios (por ejemplo mediante el consumo por los humanos). Se sabe que el β-D-glucano soluble se asocia con la disminución de los triglicéridos y el colesterol en suero, y por lo tanto los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para disminuir el colesterol en el suero y los niveles de triglicérido en humanos o animales, por ejemplo en individuos hiperlipidémicos. La invención por lo tanto incluye composiciones farmacéuticas y veterinarias que comprenden el polipéptido de la invención y el portador farmacéuticamente o veterinariamente aceptable. Los polipéptidos así se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para evitar o tratar hiperlipemia, o altos niveles de triglicéridos y colesterol en suero o trastornos que resultan de los mismos.

Los polipéptidos de la invención también pueden exhibir actividad antifúngica. Ellos pueden ser capaces de degradar las paredes celulares de los hongos, y así se pueden emplear para la lisis de la pared celular del hongo, con el fin de abrir las células. Ellos pueden liberar las proteínas extracelulares. En tal una forma los polipéptidos se pueden utilizar para preparar extractos de levadura y/o hongos.

E. Alimentos para Animales

La invención adicionalmente se relaciona con productos alimenticios o una composición de alimento para animal que comprende uno o más polipéptidos de la invención. El polipéptido puede estar presente en el alimento en una concentración diferente de su concentración natural. Las cantidades preferidas son de 0.1 a 100, tal como 0.5 a 50, preferiblemente 1 a 10, mg por kg de alimento.

La invención también se relaciona con un proceso para la preparación de una composición de alimento para animal, el proceso comprende agregar a una o más sustancias o ingredientes de alimento comestible un polipéptido de la invención. Los polipéptidos se pueden agregar a la composición de alimento del animal en forma separada de las sustancias o los ingredientes de alimento, individualmente o en combinación con otros aditivos de alimento. El polipéptido puede ser una parte integral de una de las sustancias o ingredientes de alimento.

Los polipéptidos de la invención también se pueden agregar a alimentos ricos en celulosa para animales para mejorar la degradación de la pared de la célula de planta que conduce a la utilización mejorada de los nutrientes de la planta por el animal. Los polipéptidos de la invención se pueden agregar al alimento o ensilaje si se pre-enjuagan

o se prefieren dietas húmedas. De manera ventajosa, los polipéptidos de la invención pueden continuar degradando la celulosa en el alimento in vivo. Los polipéptidos derivados fúngicos de la invención en particular de manera general tienen un pH menor óptimo y son capaces de liberar nutrientes importantes en tales ambientes acídicos como el estómago de un animal. La invención así también contempla alimentos (por ejemplo para animal) o productos alimenticios que comprenden uno o más polipéptidos de la invención.

Los polipéptidos de la invención también se pueden utilizar durante la producción de sustitutos de la leche (o sustitutos) de soya. Estos sustituyentes de la leche se pueden consumir por los humanos y animales. Un problema típico durante la preparación de estos sustituyentes de leche es la alta viscosidad de la suspensión de soya, que resulta en la necesidad de una dilución indeseable de la suspensión en una concentración de sólidos secos de 10 a 15%. Una preparación de enzima que contiene un polipéptido de la invención se puede agregar a, o durante el procesamiento de, la suspensión, permite el procesamiento en una concentración mayor (típicamente 40 a 50%) sólidos secos. La enzima también se puede utilizar en la preparación de productos saborizantes, por ejemplo de soya.

La composición puede comprender adicionalmente (particularmente cuando se formula para uso en alimento para animal) uno o más ionóforos, agentes de oxidación, tensoactivos, rumen protegido contra aminoácidos, mejoradores de enzima o enzimas que se pueden producir naturalmente en el tracto gastro-intestinal de los animales que se van a alimentar.

Cuando se agregan a los alimentos (que incluyen silaje) para rumiantes o animales monogástricos (por ejemplo aves

o cerdos) los alimentos pueden comprender cereales tal como subproductos del cereal, trigo, maíz, centeno o cebollas o cereal tal como salvado de trigo o salvado de maíz, u otro material de plantas tal como soya y otras legumbres. Las enzimas pueden mejorar significativamente el rompimiento de las paredes celulares de la planta que conduce a la mejor utilización de los nutrientes de planta por el animal. Como una consecuencia, se puede mejorar el índice de crecimiento y/o la conversión del alimento. Los polipéptidos de la invención se pueden agregar al alimento (directamente o como un aditivo o ingrediente) o celulosa tratada (por ejemplo glucano) se puede agregar en su lugar.

Un método particularmente preferido para la adición (exógena) de la β-glucanasa es agregar el polipéptido de la invención como material transgénico de planta y/o semilla (por ejemplo transgénica) El polipéptido así se ha sintetizado a través de la expresión de gen heterólogo, por ejemplo el gen que codifica la enzima deseada se puede clonar en un vector de expresión de planta, bajo el control de las señales de expresión de planta apropiadas, por ejemplo un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de semilla. El vector de expresión que contiene el gen que codifica el polipéptido se puede transformar posteriormente en células de planta, y las células transformadas se pueden seleccionar para la regeneración en plantas completas. Las plantas transgénicas así obtenidas se pueden hacer crecer y cosechar, y aquellas partes de las plantas que contienen el polipéptido heterólogo (a la planta) se puede incluir en una de las composiciones, como tal o después de procesamiento adicional. Se conocen los métodos generales para la expresión (heterológa) de las enzimas en plantas (transgénicas), que incluyen los métodos para la expresión específica de semilla de las enzima23. El polipéptido heterólogo se puede contener en la semilla de las plantas transgénicas o se puede contener en otras partes de planta tal como raíces, tallos, hojas, madera, flores, corteza y/o fruto. La planta puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. Las plantas adecuadas incluyen cereales, tal como avena, cebada, trigo, maíz y arroz. Preferiblemente el polinucleótido de la invención se incorpora establemente dentro del genoma de la planta.

La adición del polipéptido en la forma del material transgénico de la planta, por ejemplo en semilla tansgénica puede requerir el procesamiento del material de planta con el fin de hacer la enzima disponible, o por lo menos mejora su disponibilidad. Tales técnicas de procesamiento pueden incluir varios tratamientos mecánicos (por ejemplo molido y/o triturado) o tratamientos termomecánicos tal como extrusión o expansión.

La presente invención así también se relaciona con un proceso para promover el crecimiento y/o la conversión del alimento en un animal monogástrico o animal no rumiante, el proceso que comprende alimentar el animal con el polipéptido de la invención. Los animales adecuados incluyen animales de granja, animales monogástricos y/o no rumiantes tal como cerdos (o lechones), aves (tal como pollos, pavos), becerros o terneras o animales acuáticos (por ejemplo marinos) (por ejemplo peces).

Ensayos para Enzimas que Degradan la Celulosa

También está dentro de la presente invención el uso de polipéptidos de acuerdo con la invención en métodos de detección para identificar los compuestos que pueden actuar como agonistas o antagonistas que pueden modular la β-glucanasa. En términos generales, tales métodos de detección pueden involucrar poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba y luego medir la actividad o incubar un polipéptido de la invención con una sustancia de prueba y luego detectar cualquier modulación de la actividad β- glucanasa. Los agentes que se unen a los polipéptidos de la presente invención también se pueden identificar mediante ensayos de unión.

La actividad moduladora se puede determinar al poner en contacto las células que expresan un polipéptido de la invención con una sustancia bajo investigación y al monitorear el efecto mediado por los polipéptidos. Las células que expresan el polipéptido puede ser in vitro y preferiblemente, el ensayo se lleva a cabo in vitro utilizando células que expresan el polipéptido recombinante.

Los ensayos y sustratos descritos aquí han permitido la identificación y confirmación de la actividad ß-glucanasa. Sin embargo, se pueden utilizar estos ensayos para detectar otras enzimas que degradan la celulosa, si o no ellas tienen actividad β-glucanasa. El sustrato que se puede utilizar para este ensayo puede comprender ß-glucano.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un ensayo para identificar o detectar un polipéptido que es capaz de degradar la celulosa. La actividad puede ser una glucanasa (por ejemplo ß-glucanasa) o celulasa o xiloglucanasa. El ensayo puede comprender:

(a)

proporcionar, como un sustrato para un compuesto candidato (usualmente un polipéptido) el sustrato descrito en el párrafo anterior; y

(b)

poner en contacto el sustrato con el compuesto candidato, y detectar si se producen cualesquier carbohidratos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Se puede medir la cantidad de estos de estos carbohidratos. Si es necesario, ellos luego se pueden comparar como la cantidad de los carbohidratos producidos en un experimento de control, en la ausencia del compuesto candidato.

Se pueden emplear ensayos anteriores para identificar los moduladores de la actividad β-glucanasa.

Los rasgos y características preferidas de un aspecto de la invención son aplicables a otro aspecto mutatis mutandis.

La invención ahora se describirá con referencia a los siguientes Ejemplos que están destinados a ser solo ilustrativos y no limitantes.

EJEMPLOS

Procedimientos General

Las técnicas de clonación molecular estándar tal como aislamiento de ADN, electroforesis de gel, modificaciones de restricción enzimática de ácidos nucleicos, análisis Southern, transformación E. coli, transferencia de colonias e hibridaciones de filtro etc., se desarrollan utilizando técnicas estándar1,2. Se obtienen oligo desoxinucleótidos sintéticos de ISOGEN Bioscience (Maarssen, los Países Bajos). Se desarrollan análisis de secuencia de ADN en un secuenciador de ARN de Applied Biosystems 373, de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

Se conducen hibridaciones y marcado de ADN de acuerdo con el marcado de ácido nucleico directo ECL™ y los sistemas detección (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Inglaterra) o de acuerdo con las técnicas de marcado radioactivo estándar.1

Ejemplo 1: Aislamiento de ARN de T. emersonii y síntesis de cADN

La cepa T. emersonii CBS 393.64 se fermenta bajo condiciones que inducen celulasa. En varios puntos de tiempo el micelio y los sobrenadantes de cultivo se cosechan mediante filtración utilizando envoltura de filtración Miracloth. El micelio se lava extensivamente con agua desmineralizada y se exprime entre toallas de papel para remover el agua excesiva. El micelio de los puntos de tiempo seleccionados (con base en las mediciones de celulasa en los sobrenadantes de cultivo) se congela inmediatamente en nitrógeno líquido y se muele en un polvo fino utilizando un mortero y pistilo. El polvo resultante se transfiere a un tubo estéril de 50 ml y se pesa: para cada 1-1.2 g de micelio molido se agrega 10 ml de reactivo TRIzol (Gibco/BRL) (max. 25 ml por tubo). El polvo micelial se solubiliza inmediatamente mediante mezcla vigorosa (centrifugado, 1 min), seguido por 5 minutos a incubación en temperatura ambiente con mezcla ocasional. Se agrega un volumen de 0.2 (TRIzol original) de cloroformo (así 2 ml para cada 10 ml de TRIzol se utiliza originalmente), se centrifuga y se deja a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente, la mezcla se centrifuga a 4°C, 6000 g durante 30 minutos. La fase acuosa superior se transfiere a un tubo fresco y el ARN total se precipita mediante la adición de un volumen 0.5 (TRIzol original) de alcohol isopropilo (así 5 ml de alcohol isopropilo para cada 10 ml de TRIzol se utiliza originalmente). Después de 10 minutos de precipitación a temperatura ambiente, el ARN se recupera mediante centrifugación durante 30 minutos a 6000 g. Sobre la remoción se enjuaga el sobrenadante del glóbulo de ARN con un volumen de 70% de etanol. Después de la remoción del etanol, el glóbulo de ARN se seca al aire. El glóbulo de ARN seco se disuelve en 3 ml de amortiguador GTS (100 mM de Tris-Cl, pH 7.5,4 M de tiocianato de guanidio, 0.5 % de lauril sarcosinato de sodio). Se utiliza 10 µl de solución de ARN para determinar la calidad y concentración de los ácidos nucleicos.

Se desarrolla análisis Northern3 y el ARN aislado se purifica adicionalmente.1,3. Para el aislamiento del mARN un protocolo modificado (utilizando flujo de gravedad en lugar de centrifugación) del equipo de purificación PHARMACIA (Cat no. 27-9258-02) se utiliza.3 Para la síntesis de cADN el EQUIPO de síntesis de cADN STRATAGENE se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto para un número de optimizaciones para utilizar los vectores pGBFIN con cambios principales como se describió previamente.3

La cantidad de cADN sintetizado se estima mediante precipitación TCA y se analiza posteriormente por medio de electrofóresis en geles de agarosa alcalinos.3

Ejemplo 2: Preparación de una colección de cADN de mARN T. emersonii

El grupo de cADN obtenido en el Ejemplo 1 se debilita, se liga con adaptadores y se digiere la enzima de restricción.3

La clonación del cADN en el vector de expresión pGBFIN-11 (ver la WO-99/32617 para la construcción de este vector) requiere la presencia de un sitio EcoRI en el 5’-y de un sitio XhoI en el extremo 3’- del cADN. Por lo tanto, la primer hebra que ceba el oligonucleótido y las secuencias adaptadoras utilizadas (Pharmacia) se seleccionan para cumplir con los prerrequisitos establecidos para el vector de expresión.

Los cADN obtenidos se separan por medio de fraccionamiento de tamaño a través de una matriz de SEFAROSA CL2B, luego de lo cual el tamaño de los grupos individuales obtenidos se analiza por medio de electroforesis de gel no desnaturalizante.3. Se seleccionan dos grupos de los cADN, obtenidos por medio de concesiones a 0.5 kb y 1.0 kb respectivamente, para la construcción de la colección de cADN en pGBFIN- 11. Para el pGBFIN-11, se prepara un grupo del vector pGBFIN-11 doble completamente digerido (EcoRI- XhoI) (ligación de fondo < 1%). Los grupos de cADN seleccionados se ligan en el vector pGBFIN-11 y se transforman en células bacterianas Gold E. coli XL10para generar dos colecciones primarias de cADN. Las frecuencias de transformación de los dos grupos son >1.0 x

106. A partir de la fracción del las colecciones de cADN de E. coli, se seleccionan colonias aleatoriamente y se aísla el ADN de plásmido. El análisis de este ADN de plásmido demuestra que ambas colecciones de cADN tienen porcentajes de inserto entre 90 y 95%.

Adicionalmente, se realizan transferencias de colonia a partir de la fracción de la colección y los filtros generados se hibridan posteriormente con el gen T. emersonii gpdA, que codifica el gendeshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato. Luego, se aísla el ADN de plásmido y por medio de análisis de restricción se demuestra que todo el plásmido contiene insertos únicos en la orientación correcta. El secuenciamiento de los extremos 5’ de los cADN dentro de estos T. emersonii gpdA que contienen los plásmidos demuestra que > 85% es de longitud completa.

Ejemplo 3: Transformación de la colección de expresión para A. niger

Se aísla el ADN de la colección de cADN de E. coli como se describió anteriormente. El ADN de plásmido total se digiere durante 4 horas a 37°C con NotI para remover el E. coli derivado de las secuencias de plásmido. Después de purificación, el ADN se disuelve en agua desmineralizada estéril.

Se desarrolla transformaciones múltiples de A. niger DS29783 utilizando protoplastos 1.5 x 107 B 3.0 x 107 y 10 ug de ADN de plásmido por transformación. Los transformantes se seleccionan para la presencia del marcador de selección amdS mediante crecimiento en acetamida como la fuente N única. Debido a que ambos marcadores de selección amdS y el casete de expresión de cADN que están presentes en el fragmento de integración que crece en acetamida son indicadores de la presencia de un casete de expresión de cADN.

Después de aproximadamente 7-10 días de incubación a 30°C, se purifican 10,000 transformantes: los transformantes Aspergillus niger se transfieren robóticamente (automatizador picker FlexysJcolony) de las placas de transformación hacia Placas Maestras MTP de 96 pozos (MP) que contienen 150 µl por pozo de medio selectivo solidificado (SM) (por 1000ml: 0.52 g de KCl, 1.52 g de K2 HPO4, 0.52 g de MgSO4, 20g de glucosa, 1g de acetamida, 0.1M de amortiguador MES, 15g de agar, 1ml de solución de elemento de traza [solución de los elementos de traza (que contiene por 1 litro): 2.2g de ZnSO4 / 7H2O, 1.1g de H3BO3, 0.5g de FeSO4/7H2O, 0.17g de CoCl2/6H2O, 0.16g de CuSO4/5H2O, 0.15g de NaMoO4/2H2O, 5.0g de EDTA, pH 6.5] pH 5.5. Los transformantes se hacen crecer en SM durante 5 días a 34°C. El conjunto así generado de los MP que se utiliza en 1) inocula los MTP para crecimiento y detección de enzima posterior y 2) las placas de fondo (BP) de la colección de cADN que se almacenan a -80°C.

Ejemplo 4: Análisis de la colección de expresión T. emersonii

Se miden MP de 5 días de crecimiento como plantilla de replicación y las placas se replican en placas (SM) de medio selectivo fresco, que contiene por litro: 0.52 g de KCl, 1.52 g de K2HPO4, 0.52 g de MgSO4, 20g de glucosa, 1g de acetamida, 0.1M de amortiguador MES, 15g de agar, 1ml de solución de elemento de traza [solución de los elementos de traza (por 1 litro): 22g de ZnSO4/7H2O, 1.1g de H3BO3, 0.5g de FeSO4/ 7H2O, 0.17g de CoCl2/6H2O, 0.16g de CuSO4/5H2O, 0.15g de NaMoO4/2H2O, 5.0g de EDTA, pH 6.5] pH 5.5.

Una vez inoculadas las placas se incuban a 34°C durante 48h. Posteriormente las placas se llenan con una carboximetilcelulosa que contiene agar superior (CMC) (5g de agarosa, 0.5g CMC (Sigma ref C4888) preparada en 1000ml de 50 mM de amortiguador de fosfato pH 7). Una vez el agar superior se solidifica, las placas se dejan a 65°C durante 4 horas. Para la visualización de la actividad, las placas se tiñen con una solución de rojo Congo (10 g de rojo Congo en 1000ml de amortiguador de fosfato pH7) durante 15 minutos. La solución teñida se descarga y las placas se lavan con 1M de NaCl (58.44g en 1 litro de agua destilada). La última etapa se repite dos veces. Los clones positivos aparecen al formar un halo de depuración pálido en un fondo rojo.

Los clones de celulasa positivos de esta primera detección (demuestran un halo claro después de la detección con rojo congo) se vuelven a inocular en medio fresco SM y se hacen crecer durante 5 días a 34°C. La placa de plantilla así obtenida luego se replica en medio selectivo y en medio selectivo que contiene 0.075% (p/v) de AZCL-celulosa (Megazyme catálogo ref. IAZCEL). Las placas SM se tratan y se clasifican como se describió previamente (que crece a 34°C y posteriormente se detecta por medio de incrustación que contiene celulosa y teñido con rojo Congo) mientras que las placas de SM-AZCEL-celulosa se incuban a 34°C durante 48 h y luego se incuban adicionalmente a 65°C durante 8 h. Las placas de SM-AZCL-celulosa se clasifican antes y después de la incubación a alta temperatura. Los clones de celulasa positivos resultan en un halo azul difuso.

Finalmente, se identifican 20 clones positivos de celulasa. La celulasa que produce los transformantes Aspergillus, como se identifica en el ensayo de placa xilanasa, se hacen crecer en fermentación de matraz de agitación.3 Las muestras del medio se toman después de 5 días de fermentación y se analizan para la actividad como se describe adelante.

Ejemplo 5: Análisis genético de transformantes positivos

Se hacen crecer transformantes identificados positivos (re-confirmados) en medio líquido, el micelio se cosecha y se aísla el ADN total (cromosómico) utilizando el Sistema de Aislamiento Puregene (Biozym B.V.) para el aislamiento de ADN de los hongos filamentosos. El aislamiento del ADN y la purificación se desarrollan de acuerdo con el protocolo de los proveedores, pero modificado ligeramente: se repiten las etapas de precipitación de proteína 3 y 4.

Se utiliza el ADN cromosómico como una plantilla en una reacción PCR utilizando los cebadores 12207 (SEQ ID No. 8) y 11937 (SEQ ID No. 7) para amplificar los insertos presentes en el casete de expresión integrado en el ADN cromosómico.

Los PCR directos en los transformantes se desarrollan de acuerdo con una versión adaptada de un protocolo conocido4 en donde el micelio obtenido se trata posteriormente con GlucanexJ (Novo Nordisk) en concentraciones de 5 mg/ml en ligar de NOVOzima.

Las reacciones PCR contienen amortiguador B eLONGase™ (Life Technologies, Breda, Países Bajos), dNTP (200 µM de cada uno), 1 µl de Mezcla de Enzima eLONGase™, 1-5 µl de plantilla, y 10-30 pmol de cada oligo, en un volumen final de 50 µl. La cantidad óptima de los oligos se determina experimentalmente para cada tanda comprada. En promedio, se utiliza 10 a 30 pmol. Las reacciones se desarrollan con las siguientes condiciones de ciclo: 1x (2 min) 94°C, 35x (1min 94°C, 1 min 55°C, 6 min 72°C), 1x (7 min 72°C). Las muestras se cargan sobre geles de agarosa para análisis de los productos PCR.

El producto PCR así obtenido se subclona en el vector de clonación E. coli pcr2.1 (Invitrogen, de acuerdo con las instrucciones de proveedor), que resulta en plásmido pGBCEA-1.

Se secuencia el producto PCR subclonado. La secuencia de nucléotido resultante de la región codificante se describe en la SEQ ID NO 1 y la secuencia deducida de aminoácido de la proteína en la SEQ ID NO 2. Esta proteína se ha nombrado CEA.

Ejemplo 6: Detección viscométrica de una Colección de Expresión de cADN utilizando el Visco-robot Hamilton.

Mediciones viscométricas

Los viscómetros capilares son el tipo más comúnmente utilizado de viscómetros utilizados para las mediciones de los líquidos viscosos. En general, el líquido de interés se hace para fluir a través de un tubo capilar bajo una diferencia de presión conocida. Luego se mide el índice de flujo, usualmente al notar el tiempo tomado para un volumen dado de líquido para pasar una marca de graduación. Otros tipos de viscómetros capilares fuerzan el líquido a través de un capilar en un índice de flujo predeterminado, y la caída de presión por lo tanto que se produce a través del capilar se mide con el fin de determinar la viscosidad de los líquidos. La degradación enzimática controlada de las soluciones viscosas poliméricas se puede utilizar para determinar la actividad de la enzima. Se conoce proporcionar la relación numérica entre la viscosidad y se puede estimar la concentración del líquido, los parámetros cinéticos tal como la constante Michaelis- Menten.

I. El Sistema de Detección

(a) La configuración del viscorobot Hamilton

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El robot de pipeteo Hamilton (Hamilton Workstation Microlab 2200, Hamilton Company, Reno, USA) se controla mediante un programa de software llamado Eclipse (Hamilton Company). Este software permite al usuario dirigir el brazo de sonda en una cierta posición dentro del espacio de trabajo Hamilton. Se desarrolla un programa Eclipse de visco-ensayo estándar. Este programa trabaja en MTP de 96 pozos, en donde cada pozo se puede tratar individualmente. Se utilizan jeringas para aspirar o dispensar el líquido de muestra en una posición especificada Eclipse a través del orificio de la aguja. Se especificará la velocidad de aspiración y dispensación (en seg/ml) así como también los volúmenes de aspiración y dispensación (en µl). Al implementar las definiciones de estante, se pueden accesar múltiples contenedores de reactivos en una forma eficiente y de ahorro de tiempo. Se evita la sobrecarga del líquido de muestra de una etapa de pipeteo a la siguiente al dar instrucciones al Eclipse para enjuagar el tubo con el fluido del sistema. La velocidad de aspiración de 10 seg/ml (algunas veces 15 seg/ml) es adecuada para distinguir la mayor parte de las viscosidades al buscar las alturas del pico. Usualmente se aspira y se dispensa 200 – 250 µl del líquido de muestra.

(b)

Configuración del Hamilton

La aspiración del líquido de muestra produce una caída de presión a través del tubo se llenado de agua. La magnitud de la caída depresión depende de la aspiración (o movimiento de émbolo) y de la viscosidad del líquido de muestra. La caída de presión mayor se crea en la punta de la aguja, debido a que el radio es más pequeño (aproximadamente 0.3 mm). La aspiración del líquido de muestra provoca cambios de presión, que se transmiten de la unión T en el transductor de presión. El transductor (Dépex B.V., de Bilt, Países Bajos) convierte la magnitud de la baja presión en una corriente eléctrica. La corriente eléctrica se lee mediante el Datataker una vez por segundo, y posteriormente se almacena en la memoria del Datataker en un formato digital. Un computador que se conecta al Datataker permite (por medio del software Delogger) la carga de los archivos en la memoria del Datataker. Ellos a su vez se pueden leer y analizar mediante programas de hoja de cálculo comunes (tal como Microsoft Excel). Debido a que la presión se mide con el tiempo, el resultado final se puede visualizar al graficar la magnitud de la baja presión (en mV) contra el tiempo (en segundos). Luego del desplazamiento de la unión T en una posición derecha entre la aguja, la señal de presión es menos dependiente del volumen de aspiración.

(c)

Preparación de curvas de calibración que permite la determinación de la viscosidad de cualquier líquido

De acuerdo con la ley de Poisseuille, la caída de presión medida debe ser directamente proporcional a la viscosidad, debido a

imagen1

Con esta fórmula es posible relacionar la baja presión de salida milli-Volt en la viscosidad desconocida del líquido de muestra. Esto se hace al aspirar un volumen constante definido del líquido de calibración (usualmente glicerol, cuando este cubre un amplio rango de viscosidades y se comporta de una forma Newtonina) en varias concentraciones. La baja presión así creada se relaciona con la salida mV mediante un factor F desconocido. Debido a que se conocen las viscosidades absolutas de varias concentraciones de glicerol, una gráfica de baja presión mV para varias concentraciones de glicerol conocidas contra las viscosidades absolutas conocidas de las mismas concentraciones de glicerol produce una línea recta a lo largo del origen (debido a P = (mV)*F = η/k).

(d) Programa Eclipse utilizado para Detección a Gran Escala.

Un ciclo de medición único consiste de la aspiración de 250 µl de la muestra y la mezcla de sustrato del sobrenadante) en una velocidad de aspiración de 10 seg/ml. Antes de la aspiración del fluido de muestra, se aspira 40 µl de aire para separar el sistema del fluido de la muestra. Una vez se completa la aspiración del líquido de muestra, esto sigue mediante suministro de 290 µl de la muestra y aire. Este ciclo de medición se repite seis veces, y seguido por una etapa de lavado de 5ml con el fin de limpiar el tubo. I

II. Desarrollo del Ensayo

(e) Establecer la mezcla de sustrato óptima de pectina y xilano para detección.

Utilizando más de un sustrato viscoso a la vez tiene varias ventajas. Uno puede detectar diferentes tipos de enzimas al mismo tiempo. Esto gasta una gran cantidad de esfuerzo y tiempo mientras se requiere menos sustrato. En adición a xilano de avena escanda se decide utilizar pectina como el segundo sustrato. Una solución 1:1 de 1% de pectina y 7% de xilano de avena escanda parece que es más adecuada para detección. Debido a que existen pocos clones proporcionalmente positivos en la colección, la mayor parte de los picos tiene una altura aproximada de 435mV. En el caso de una muestra positiva de xilanasa, se deja todo o la mayor parte del xilano se degrada ya que solo 0.5% de pectina. Por lo tanto, un clon de xilanasa positiva produce una altura pico de 280mV. En el caso de un clon de degradación pecteno, la altura pico es 220mV.

(f)

Determinación de la actividad xilanasa mínima necesaria para detectar con el viscorobot Hamilton.

La detección se lleva a cabo con volúmenes muy pequeños de sustrato y sobrenadante, debido a que los pocos MTP únicos se mantienen en casi 360Pl. Adicionalmente, la mayor parte de sobrenadante agregado, la mayor parte del sustrato se diluye, y se reduce la viscosidad más inicial. Se dispensa µl de 6% de xilano de avena escanda en los pozos de un MTP. La dilución de una serie de una xilanasa de referencia (A. tubigensis xylanase con una actividad de 685,400 EXU/g, en donde 1 EXU =4.53 mol de azúcares de reducción /min/g) se preparan y 30 µl de cada dilución se agrega al sustrato. Después de incubación durante 24 horas a 50°C, se mide la viscosidad de cada muestra. La concentración de enzima detectable menor corresponde con 53.6 ng/ml o 0.0367 de EXU/ml. Por lo tanto, la adición de 20 µl del sobrenadante a 300 µl de sustrato permitirá la detección de actividades de enzima extremadamente bajas.

(g)

Configuración de la detección para la identificación de enzimas termoestables.

Con el fin de recoger solo las enzimas termoestables de la colección y con el fin de evitar la interferencia del anfitrión- actividad de las enzimas A. niger, las placas con los clones que contienen las enzimas de candidato termoestable se somete a tratamiento con calor. El sistema se valida utilizando cepas anfitrionas de vacío, las cepas anfitrionas que expresan enzimas termolábiles y las cepas anfitrionas que expresan enzimas termoestables. Después del crecimiento de las cepas y la producción de la enzima se calientan las placas MTP a 72°C durante 30 minutos. Posteriormente se agrega 20 µl de sobrenadante a 300 µl de 6% de xilano de avena escanda. A lo largo de los controles negativos (la adición de 20 µl de agua), las placas que contienen las muestras se sellan con tapa con pegante y se incuban a 60°C en el horno. La alta temperatura puede incrementar cualquier actividad de enzima termoestable pero destruye el anfitrión de fondo – la actividad que interfiere con la enzima A. niger y las actividades de enzima no termoestable se expresan mediante la colección. Después de 20 horas de incubación, no s encuentra reducción de la altura del pico notable para los clones xilanasa lábiles, que indican que la actividad xilanasa anfitriona se ha inactivado vigorosamente. En adición a los clones de la enzima xilanasa termolábil de Aspergillus niger se incluyen como un control. En este caso no se puede detectar actividad residual, aunque por otra parte la xilanasa resistente al calor que se incluye como un control es aún activa. La inactivación por calor durante 30 minutos a 72°C y los tiempos de incubación de la muestra de 24 horas o menos nos permite detectar específicamente las xilanasas T. emersonii termoestables.

III. Detección de la colección de expresión de cADN utilizando el Visco-robot Hamilton

(h)

Replicación de la colección de expresión de cADN y expresión de la colección.

Un ciclo de replicación involucra la inoculación de dos veces de ambos medios selectivos (SM) (que contienen por litro: 0.52g de KCl, 1.52g de K2HPO4, 0.52g de MgSO4, 20g de glucosa, 1g de acetamida, 0.1M de amortiguador MES; 15g de agar, 1ml de solución de elemento de traza [solución de los elementos de traza (por litro): 2.2g de ZnSO4/7H2O, 1.1g de H3BO3, 0.5g de FeSO4 /7H2O, 0.17g de CoCl2/6H2O, 0.16g de CuSO4/ 5H2O, 0.15g de NaMoO4/2H2O, 5.0g de EDTA, pH 6.5] pH 5.5) y medio de crecimiento líquido (GM) (que contiene, por litro, 70g de glucosa, 25g de hidrolisato de caseína, 12.5g de extracto de levadura, 1g de KH2PO4, 0.5g de K2SO4, 2g de MgSO4, 0.03g de ZnCl2, 0.02g de CaCl2, 0.01g de MnSO4, 0.3g de FeSO4, pH 5.6).La colección se almacena en los MTP estándar, en donde las colonias A. niger recombinantes esporuladas crecen en cada pozo sobre SM en la presencia de 10% de glicerol. Durante el almacenamiento, estas placas (placas maestras, MP) se mantienen en un estado congelado (-80°C). Antes de la replicación de los MP, ellos se descongelan durante una hora en una campana extractora de humo esterilizada para evitar la contaminación microbiana. La replicación de los MP se desarrolla con el Replicador de Colonia PBA Flexys. Se utilizan Placas Maestras de 5 días de crecimiento como plantilla de replicación y las placas se replican en MTP de 96 pozos llenos con medio de crecimiento líquido (GM). Las placas agar SM frescamente inoculadas se colocan en una incubadora a 32°C y posteriormente se almacenan a -80°C después de la adición de 150 µl de 10% de glicerol por pozo. Las placas de producción GM se incuban en un Agitador Tomtec Quadrastor 96000 saturado con agua (32°C). Las placas muestran crecimiento de micelio después de 2-3 días. Las placas GM se incuban durante 6 días.

(i)

Muestra de los sobrenadantes después que se completa el crecimiento.

Después de 6 días de crecimiento, el medio de crecimiento líquido GM restante (que contiene productos de expresión extracelulares) se extrae y se transfiere en los MTP frescos. Los sobrenadantes se transfieren en los MTP frescos utilizando un robot de pipeteo Tecan de 4 canales. El volumen promedio del sobrenadante recuperado está entre 120 y 140 µl. Estas placas de sobrenadante se congelan y se ensayan posteriormente para actividad xilanasa.

(j)

Preparaciones para la detección a gran escala.

Las placas de sobrenadante de la colección de expresión se descongelan y se colocan en un baño de agua cerrado a 72°C durante 35-40 minutos. Utilizando una pipeta de 12 canales y puntas de pipeta preparada comercial en estantes de formato MTP desechables (suministrado por Eppendorf), 20 µl se cada sobrenadante se transfiere a la mezcla de sustrato que contiene MTP que se ha calentado a 60°C antes de agregar los sobrenadantes. La mezcla de sustrato consiste de una mezcla de 1:1 de 1% de pectina (ver (k) adelante) y 7% de xilano de avena escanda (ver

(1)

adelante), con un pH final de 4.12. Los MTP de ensayo se llenan con 310 ml de sustrato/pozo. La mezcla de los sobrenadantes con la mezcla de sustrato se logra al agitar las puntas de pipeta en los pozos de muestra directamente después de dispensar los sobrenadantes. Posteriormente las placas se colocan en un horno a 60°C durante un periodo de incubación de 18-24 horas. Después de la incubación, a los MTP se les permite enfriar y detectar una reducción de la viscosidad utilizando el visco-robot Hamilton (Hamilton Company, Reno, USA).

(k)

Preparación de 1% de pectina, pH 4.1

Se prepara amortiguador de fosfato-ácido cítrico (amortiguador Mc Ilvaine) al agregar 0.2M de solución de Na2HPO4 a 250 ml de solución de ácido cítrico al 0.1M hasta que se obtiene un pH de 5.5. Esto hace hasta un litro con agua destilada, y el pH se vuelve a ajustar si es necesario. Se hace una solución al 0.5% de pectina al agregar lentamente 0.5g de pectina altamente metilada (tipo Ruban Brun) en un matraz que contiene 50ml del amortiguador McIlvaine anterior y 25ml de agua destilada a 60°C. La agitación vigorosa asegura que la pectina se disuelve bien. Esto hace hasta 100ml, y se revisa de nuevo el pH. La pectina utilizada aquí disminuye el pH de la solución, bajo estas condiciones la solución tiene un pH de 5.1. Si la solución de e pectina es nubosa, esta es útil para centrifugar la solución a 15g durante 15 minutos con el fin de remover cualesquier partículas no disueltas.

(l)

Preparación de 7% de xilano de avena escanda tratado con alcalino, pH 4.1.

Se calienta 20ml de 2M de NaOH hasta 60°C en un beaker de 150ml. En un beaker separado se agrega 7g de xilano de avena escanda (de Sigma company) a 20ml de agua, de tal manera que se forma una masa marrón brillante. Si es necesario, se agrega más agua, pero no más de 30 ml en total. Utilizando una cuchara de acero, esta masa de xilano de avena escanda en agua se agrega lentamente a la solución de NaOH caliente. Se requiere un dispositivo de agitación potente para disolver el xilano en la solución de hidróxido, manteniendo por lo tanto la temperatura en un estado de 60°C. Una vez que se ha disuelto todo el xilano, la solución se torna café oscura y semeja un jarabe claro, muy viscoso. Luego el resto del agua se agrega de tal manera que se ha agregado una cantidad general de 50ml. A la solución se le permite enfriar y se agrega 4N de HCI hasta que se logra el pH deseado (usualmente pH 4.1-4.2). La solución se hace hasta 100 ml y el pH se vuelve a ajustar si es necesario. La centrifugación a 20,000g durante 15 minutos a 10°C produce un sobrenadante amarillento claro (cuya viscosidad depende de la cantidad inicial del xilano de avena escanda agregado).

(m)

La detección de la colección

El inconveniente de detectar la colección de Talaromyces emersonii clonada en A. niger es 119 gráficas que corresponden con los 119 MTP probados. Cada gráfica muestra la viscosidad de los 96 pozos representado como 96 picos que miden la sobrepresión por pozo en mV. Las gráficas se analizan para picos bajos, que indica que se reduce la viscosidad. Los picos que son menores que la altura del pico promedio se seleccionan para volver a probar. Algunas placas producen muy poca variación, debido a que es fácil la selección de clones positivos putativos para volver a probar. Otras placas muestran una gran cantidad de variación, por lo tanto frecuentemente más de o 6 clones putativos se seleccionan para volver a probar. Por tener un control positivo, después de la incubación de 10 µl de una endoxilanasa se agrega a una placa aleatoria en una posición fija. A partir de aquellos controles positivos, se encuentra que si existe actividad xilanasa, debemos esperar una altura de pico entre 240 y 280mV.

Las placas de la colección Talaromyces que se prueban también contienen cinco clones de xilanasa termoestable confirmados que se encuentran antes de utilizar un ensayo de detección de tinte con base en la solubilización de los tintes que se unen químicamente al sustrato polimérico insoluble. Sin excepción, aquellos cinco clones se encuentran independientemente con el ensayo viscométrico ya en la primera ronda de detección. Todos los picos para los clones conocidos están en un nivel mucho menor que el resto de los picos (a 250mV). En general, se seleccionan 118 placas de cultivo para volver a probar, excluyendo aquellas con clones xilanasa encontrados previamente.

(n) Volver a probar los 118 clones putativos

Volver a probar se basa en el ensayo viscométrico de acuerdo con el principio utilizado con la detección a escala completa. En este tiempo, sin embargo, se utiliza un volumen de ensayo mayor, debido a una distinción más clara entre la actividad de enzima termoestable y se pueden hacer picos bajos irregulares. Se llenan dos MTP grandes (2ml/pozo) con 1.2ml de 9% de xilano de avena escanda. Para los primeros dos pozos de cada fila de 50 µl de agua se agrega (control negativo). Para el último pozo de cada fila, se agrega 50 µl de una solución de endoxilanasa de referencia con el fin de tener un control positivo. Los pozos 3 a 11 de cada fila se utilizan para volver a probar los clones de xilanasa putativos (adición de 50 µl de sobrenadante4). Después de mezcla e incubación durante 24 horas a 60°C, se miden las viscosidades con un programa Eclipse diseñado específicamente (Volumen de aspiración: 800 µl, Velocidad de aspiración: 10 seg/ml).

Se identifican varios clones positivos debido a que sus picos están exactamente al mismo nivel como los controles positivos, que indica la degradación completa del xilano. En total se identifican trece cepas putativas en la reprueba de viscodetección. Los insertos de cADN se clonan directamente al vector pCR2.1 por medio de amplificación PCR ejecutada en el ADN cromosómico. De las 12 cepas de colección se obtienen dieciséis insertos de cADN, utilizando pwo-polimerasa y el cebador establecido 2 (11937/12207, SEQ ID Nos. 7 y 8). La orientación del inserto cADN en el vector pCR2.1 se determina mediante digestión XhoI, que se ubica en el vector y en el 3’ del cADN. El análisis de secuencia de ADN se ejecuta en el extremo 5’ de los insertos de cADN.

Se desarrolla reprobado para las posibles enzimas que degradan pectina en una forma similar como para la xilanasa, excepto que se utiliza 1% de pectina en lugar de 9% de xilano de avena escanda. Solo se vuelven a probar diez clones posibles, que son aquellos que producen picos muy bajos en la ronda de detección primaria pero que no muestran ninguna actividad durante el reprobado de la xilanasa. De forma reproducible un clon produce una enzima que degrada la pectina. El valor de presión medido de 200mV corresponde a la viscosidad de agua pura. Debido a que la pectina utilizada no se metila completamente, esta se puede haber degradado mediante poligalacturonasa termoestable, liasa pectato o liasa pectina.

(o) Beneficios de la Viscodetección

El desarrollo de un método de detección viscométrica para identificar las enzimas termoestables se facilita por tres factores clave. Primero, la posibilidad de termo-inactivación de la actividad xilanasa anfitriona nativa que permite el desarrollo más rápido de las condiciones de reacción apropiadas. Segundo, el hecho que cuando los clones con enzimas termo-lábiles conocidas se prueban, la termoinactivación destruye toda la actividad de tal manera que solo se recogen las enzimas más termoestables. En tercer lugar las temperaturas elevadas incrementan las actividades enzimáticas de tal manera que la detección llega a ser aún más sensible. Se identifican los once clones de Xilano de avena escanda (Sigma) que son capaces de reducir la viscosidad significativa y en la pectina se identifica un clon que degrada la pectina definido. Adicionalmente, se vuelven a descubrir de manera indeppendiente cinco clones xilanasa termoestables que se han identificado previamente.

Ejemplo 7: Caracterización del primer Talaromyces emersonii termoestable β-glucanasa (CEA) del transformante A. niger

Ensayos de actividad y definiciones

Definición de la Unidad de Celulasa PAHBAH (CPU)

Se define una unidad de la actividad de celulasa como la cantidad de enzima requerida para liberar un Pmol de azúcares de reducción por minuto a pH 5.0 y 60°C en una concentración de sustrato de 5% de Carboxi Metil Celulosa (CMC), utilizando una curva de calibración de glucosa.

La actividad de la enzima de acuerdo con el método CPU se mide al detectar los azúcares de reducción utilizando hidrazida de ácido 4-hidroxibenzoico (PAHBAH). El ensayo se basa en Lever, M., Powell, J.C., Killip, M., Small, C.W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649-655 con algunas modificaciones. La modificación para el reactivo PAHBAH es como sigue: 0.05 M de citrato trisodio, 0.1 M de Na2SO3, 0.02M de CaCl2, 0.5M de NaOH y 0.1M de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PAHBAH). El pH final es 12. El reactivo que contiene PAHBAH en la solución alcalina, que se almacena a temperatura ambiente, se debe utilizar dentro de un día. Se utiliza glucosa como el azúcar de reducción de referencia (curva de calibración). Para la curva de calibración de este ensayo, las concentraciones finales de la glucosa están entre 0-300 mM. La actividad CPU se evalúa al mezclar 100 µl de solución de enzima con 400 µl de 5% de CMC en 0.1 M de amortiguador de acetato de sodio (pH 5.0). Las copas Eppendorf con el sustrato (CMC) se preincuban durante 5 minutos a 60°C. La reacción se inicia al agregar la solución de enzima. Después de 15 minutos la reacción se detiene al agregar 1.0 ml de reactivo PAHBAH. Las copas Eppendorf se calientan durante 5 minutos a 100°C y luego se enfrían en hielo. Las muestras se centrifugan en la velocidad apropiada con el fin de hacer girar cualesquier materiales sólidos (1 minuto a velocidad completa en Microfuga E de Beckman). La absorbancia se mide a 420 nm. Se prepara un blanco al agregar 100 µl de 0.1M de amortiguador de acetato de sodio en lugar de solución de enzima.

Definición de Unidad Beta Glucanasa (BGU)

La Unidad Beta Glucanasa es la actividad requerida para liberar 0.258 µmol de los azúcares de reducción (medido como equivalentes de glucosa) por minuto a pH 3.5 y 40°C, en una concentración de sustrato de 0.5% del β-glucano de cebada.

En adición a la determinación anterior de la actividad de celulasa (CPU), se lleva a cabo un ensayo más específico para detectar la actividad ß-glucanasa. El principio del ensayo es la velocidad en la cual la viscosidad reduce una solución de la viscosidad media de ß- glucano de cebada (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) luego de la adición de una cierta cantidad de enzima. El β-glucano de cebada, la viscosidad media (Megazyme Australia), se disuelve en 0.425 M de amortiguador de citrato de sodio pH 3.5 en una concentración de 6.25 mg/ml. El sustrato se incuba a 40°C durante 10 minutos. Posteriormente se agrega una cantidad pequeña de la enzima (en el rango de 0.005-0.062 Unidades/ml) y a la reacción se le permite proceder. En un tiempo de reacción de 60 minutos la viscosidad de la muestra se determina con relación a una muestra de referencia que se incuba con una endo-glucanasa estándar de actividad enzimática conocida. Las actividades absolutas para el estándar se determinan mediante un método de azúcar de reducción utilizando Fe-III-hexocianuro y 4.76 mg/ml de ß-glucano de cebada como la concentración de sustrato inicial.

Definición de la Unidad Endo Xilanasa (EXU)

La unidad de actividad xilanasa (EXU) se define como la cantidad de enzima (endoI endo-1,4-β-xilanasa de Asp. niger, como se describe en la EP-A-0,463,706 (Gist-brocades B.V.)) que libera los azúcares de reducción de 4.53 (medido como equivalentes xilosa) por minuto bajo condiciones de ensayo. Las condiciones de ensayo comprenden: 5 mg/ml de arabinoxilano de harina de trigo (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) en 100 mM de amortiguador de citrato de sodio (pH 3.5), temperatura 40°C, en un tiempo de reacción de 60 minutos. Las reacciones se detienen al agregar 1M de NaOH. La detección se hace colorimétricamente a 420 nm después de incubar las muestras con Fe-III-hexocianuro durante 15 minutos en agua hervida. El reactivo de hexacianoferrato se hace al disolver 1.17g KFe(CN) y 19.5g de carbonato de sodio anhidro en 1 litro de agua.

En adición a la determinación absoluta anterior de la actividad xilanasa, se utiliza un método relativo luego de la reducción en la viscosidad de una solución de arabinoxilano de trigo (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) luego de la adición de una cierta cantidad de enzima. Se disuelve arabinoxilano de trigo en

0.425 M de amortiguador de citrato de sodio (pH 3.5) en una concentración de 8.3 mg/ml. El sustrato se incuba a 55°C durante 10 minutos. Posteriormente se agrega una cantidad pequeña de la enzima (en el rango de 0.01-0.05 Unidad/ml) y se le permite a la reacción proceder. Después de 60 minutos de tiempo de reacción se determina la viscosidad de la muestra con relación a una referencia que se incuba con un estándar Aspergillus niger endoxilanasa de la actividad EXU conocida (EP-A-0,463,706). Las actividades absolutas en EXU para el estándar se determinan al reducir el método de azúcar utilizando Fe-III-hexocianuro como se describió anteriormente. Se determina la viscosidad manualmente utilizando un aparato de viscosidad de caída de bolas Haake.

Definición de la Unidad de Celulasa (CXU)

La unidad de la actividad beta-glucanasa (BGU) se define como la cantidad de celulasa que hidroliza en una hora un número de enlaces glucosídicos equivalentes a la producción de 0.5 mg de glucosa bajo las condiciones del ensayo. Las condiciones de ensayo comprenden: 9mg/ml de carboximetilcelulosa en 5mM de amortiguador de acetato de sodio (pH=4.6), temperatura 37°C. Se determina la glucosa liberada al reducir el método de azúcar utilizando el reactivo DNS.

En adición a la determinación absoluta anterior de la actividad de celulasa, se utiliza un método relativo que sigue la reducción en la viscosidad de una solución de carboximetilcelulosa luego de la adición de una cierta cantidad de enzima. Se disuelve la carboximetilcelulosa en 5 mM de amortiguador de citrato de sodio (pH=4.6) en una concentración que depende de la viscosidad de la tanda. El sustrato se incuba a 37°C durante 10 minutos.

Posteriormente se agrega una cantidad pequeña de la enzima y a la reacción se le permite proceder. Después de 60 minutos de tiempo de reacción se determina la viscosidad de la muestra con relación a una referencia que se incuba con un estándar de la actividad CXU conocida.

Actividad wrt pH

5 Se produce el T. emersonii ß-glucanasa mediante los transformantes A. niger apropiados en matraces de agitación como se describe en el Ejemplo 3 después que el micelio que crece se remueve mediante filtración. El filtrado se utiliza para este experimento. La actividad del filtrado se mide en diferentes valores de pH a una temperatura fija de 60°C. La actividad se mide de acuerdo con el método CPU.- En lugar de utilizar el pH fijo de pH 5.0, el sustrato CMC se diluye con un amortiguador de citrato del pH apropiado con el fin de obtener el pH de la medición. El experimento

10 se repite dos veces y los resultados se muestran adelante en la Tabla 1. El pH óptimo de la enzima se encuentra que está entre pH 4.5 y 5.0, a aproximadamente pH 4.8.

Tabla 1. Perfil de pH a 60° C

pH

actividad (µM de duplicado) glucosa/15 minutos) a 60°C (mediciones del

3

27.2 27.7

3.5

66.6 64.2

4

109.3 102.6

4.5

133.8 120.6

5

121.3 135.5

5.5

116.4 107.4

6

68.7 69.3

Actividad de temperatura wrt

15 La actividad de esta β-glucanasa luego se mide en diferentes temperaturas. Se llevan a cabo mediciones de la actividad de acuerdo con el método CPU a pH 4.0. En lugar de incubar a una temperatura fija de 60°C, las incubaciones de desarrollan en varias temperaturas. El experimento se desarrolla dos veces y los resultados se muestran adelante en la Tabla 2. La temperatura óptima se encuentra que está entre 80°C y 85°C. El Topt parece que es de aproximadamente 84°C (aunque esta puede ser 82°C, 83°C o 85°C, dependiendo de cómo las líneas se

20 dibujan y se interpolan entre los puntos de datos).

Tabla 2: Perfil de temperatura a pH 4

Temperatura (°C)

Actividad (µM de glucosa/15 minutos): (mediciones en duplicado)

60

87.8 102.1

70

156.4 154.6

80

208.5 213.1

90

185.4 176.4

Actividad wrt de otras enzimas

5

10

15

20

25

30

35

En adición se mide la actividad a 30-60°C utilizando el método BGU para la β-glucanasa y se compara con una célula T. reesei comercialmente disponible de caldo de cultivo libre que tiene celulasa y actividad glucanasa como una referencia. El caldo de cultivo libre de célula de. T. reesei consiste de una mezcla de diferentes enzimas entre las cuales son una o más β-glucanasas pero en donde estas actividades no se han caracterizado. Para comparar las actividades de T.emersonii β-glucanasa de la invención y T.reesei celulasas/glucanasas, las enzimas se dosifican a aproximadamente actividad igual a 40°C. La actividad de T. emersonii β-glucanasa A a 40°C es establece en una y otras activas que se relacionan con esto. Los resultados se muestran adelante en la Tabla 3.

Tabla 3: Actividad relativa wrt de enzimas T. reesei

Temperatura (°C)

Actividad Relativa: β-glucanasa (CEA) Actividad Relativa: Celulasas/glucanasas T. reesei

30

0.50 0.44

40

1.00 1.13

50

1.57 1.32

60

2.40 1.59

A temperaturas por encima de 40°C la actividad celulasa/glucanasa T. reesei inicia el nivel cuando se compara con la β-glucanasa T. emersonii. Por encima de 40° C las actividades divergen, el CEA es más efectivo. También, mientras que la actividad relativa sea mayor a temperaturas elevadas, en temperaturas moderadas la actividad se mantiene con relación a la mezcla T. reesei. Esto ilustra el rango amplio de temperatura sobre el cual la β-glucanasa es activa.

Purificación y Actividad Específica

La purificación del β-glucanasa T. emersonii inicia a partir del filtrado. Se desalina aproximadamente 25 ml de caldo de cultivo libre con una columna PD 10 y se coloca en una columna de intercambio de anión Q de 6 ml que se equilibra en 10 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 5.0). La elución se lleva a cabo con un gradiente lineal de 10-300 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH 5.0). (Gradiente lineal A a B; índice de flujo: 6 ml/min; tiempo de corrida: 54 min; monitor de longitud de onda: 280 nm, 254 nm, 214 nm). Las fracciones activas se recolectan (20 ml), se concentran con concentradores Microsep (3.5 ml, 10 K) y se lavan dos veces con 0.1 M de amortiguador de fosfato de sodio (pH 5.0). La pureza de las fraccione se analiza por HPL-SEC (cromatografía de tamaño de exclusión) y SDS-PAGE.

Mediciones de la actividad específica

El coeficiente de extinción molar calculado de la β-glucanasa a 280 nm es 81550 M-1.cm-1. La concentración de la proteína de la enzima purificada se deriva de las mediciones E280 utilizando una absorción específica de E2801cm=2.33 durante 1 mg/ml. La actividad específica de la muestra purificada se determina en BGU (sustrato: beta-glucano de cebada) y es 1027 BGU/mg. Utilizando el método CPU la actividad específica es 628 unidad/mg. Como la actividad de acuerdo con el método viscométrico produce un alto número en comparación con el método de azúcar de reducción, se concluye que el β- glucanasa T. emersonii exhibe actividad endo-glucanasa significativa. Una exo-glucanasa típica se desarrollaría muy bien en un ensayo de azúcar de reducción mientras se desarrolla muy mal en el ensayo viscométrico.

Punto isoeléctrico

Se desarrolla IEF-PAGE como sigue. El equipo es el sistema Phast (Pharmacia Biotech), IEF 3-9 PhastGel (Pharmacia Biotech). Los geles corren y se tiñen (Coomassie) de acuerdo con los métodos de sistema Phast estándar. El punto isoeléctrico se determina en PhastGel IEF3-9 y resulta que es 3.3.

Determinación del Peso Molecular

Se desarrolla SDS-PAGE como sigue. El equipo es de nuevo el sistema Phast (Pharmacia Biotech); 12.5% de geles homogéneos (Pharmacia Biotech); bandas de amortiguador SDS (Pharmacia Biotech). Tratamiento de la muestra: un volumen (5 muestras) amortiguador (500 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 10% de SDS, 0.1% de Bromo-azul phdnol) se mezcla con 4 volúmenes de la muestra y se hierve durante 3 minutos. Los geles corren y se tiñen (Coomassie) de 5 acuerdo con los métodos de sistema Phast estándar. Se lleva a cabo cromatografía de exclusión de tamaño HPLC utilizando la Columna: TSK G3000SW, cat. no. 05103 (TosoHaas). Método: los eluyentes son: 0.1 M deamortiguador de fosfato de sodio pH 7.0, Índice de flujo: 1ml/min, Tiempo de corrida: 30 min, Monitor de longitud de onda: 280 nm. La desglucosilación de la enzima: mezcla de 5 µl de enzima purificada (7 mg/ml) con 20 µl 0.5% de SDS y 25 µl de 1% de ß-mercaptoetanol. Esta mezcla se hierve durante 4 minutos. Después de enfriar, se agregan 10 20 µl de N-glicosidasa F (500 U/ml) y 20 µl de 3% de Triton X-100 en 1 M de amortiguador de fosfato de sodio a pH

7.0. Este se incuba durante la noche y la desglucosilación se analiza con SDS-PAGE.

El peso molecular determinado en gel SDS-PAGE y el HP-SEC resulta ser de 43 kDa. Después de la desglucosilación sobre SDS-PAGE una banda recta se ve a 37 kDa.

Termoestabilidad

15 Se determina la termoestabilidad T50 con las celulasas/glucanasas T. reesei como una referencia. El T50 es la temperatura en la que, después de 20 minutos de incubación, se deja 50% de la actividad. La Tabla 4 muestra las diferencias en termoestabilidad T50 y entre la β-glucanasa purificada de la mezcla de celulasa/glucanasas T. emersonii y T.reesei utilizada antes en este Ejemplo (la actividad inicial se establece en uno: las enzimas se incuban durante 20 minutos y después de enfriar la actividad se mide utilizando el método CPU). Cada experimento se repite

20 dos veces y así la Table 4 muestra mediciones en duplicado. La termoestabilidad T50 de la β-glucanasa purificada se encuentra alrededor de 93.4°C y la termoestabilidad T50 de las celulasas / glucanasas T. reesei alrededor de 64.9°C.

Tabla 4: termoestabilidad de enzimas wrt T. reesei

Temperatura (°C)

Actividad Residual glucanasas T. reesei (%) de celulasas/ Actividad Residual (%) de β-glucanasa (CEA)

40

97 98

50

96 100 100 99

60

85 83 100 99

70

14 14 98 95

75

0 0 93 96

80

0 0 88 90

85

0 0 89 94

90

0 0 65 64

110

0 0

25 Ejemplo 8: Mediciones de Actividad

Las dos cepas de colección se identifican en la viscodetección en el Ejemplo 6, utilizando Xilano de avena escanda como un sustrato, se transfieren en matraces de agitación utilizando el medio GM (las cepas originales se marcan AD009.21 y AD011.31). En adición se incluye la cepa marcada AD021.B6 (CEA) que se identifica en los Ejemplos 4 y 5 para expresar la actividad β-glucanasa. Se desarrollan varios ensayos y los resultados se muestran adelante. De

5

10

15

20

25

30

35

40

forma sorprendente las cepas AD009.21 y AD011.31 muestran poca actividad xilanasa. En lugar de esto parece que el AD009.21 y AD011.31 tiene actividad celulasa aún cuando los clones se identifican en la viscodetección utilizando xilano de avena escanda. En particular el p D009.21 es muy activo en el β- glucano de cebada.

Tabla 5: Fermentación del matraz de agitación de las cepas de celulasa; actividad Xilanasa (EXU/ml), ß-glucanasa (BGU/ml) y celulasa (CXU/ml).

Cepa (y designación de glucanasa)

EXU/ml BGU/ml CXU/ml

AD021.B6 (CEA)

<10 160 524

AD009.21 (CEB)

<10 884 254

AD011.31 (CEC)

<10 <10 7

Los límites de detección se establecen adelante 10 para los ensayos EXU y BGU, y 5 para el ensayo CXU.

Los análisis de ADN en las cepas AD 009.21 y AD 011.31 (como se describió anteriormente en el Ejemplo 6) muestra las dos nuevas β-glucanasas, llamadas CEB y CEC. Las secuencias de nucleótido de las regiones codificantes son las SEQ ID Nos. 3 y 5 y que corresponden a las secuencias de aminoácidos son las SEQ ID Nos. 4 y 6, respectivamente.

La cepa CEB muestra alta actividad β-glucanasa. La cepa CEA muestra una actividad de celulosa relativa alta en comparación con la cepa CEB. La relación entre la actividad β-glucanasa y la actividad celulasa es diferente para CEA y CEB. La cepa CEC muestra la actividad celulasa pero su actividad de β-glucanasa o xilanasa está por debajo de los límites de detección en estos ensayos. Sin embargo, los estudios de homología sugieren fuertemente la actividad β-glucanasa, y esto puede ser mucho mayor en pH diferentes.

Se utiliza más de un sustrato para que la detección sea factible. De forma sorprendente resulta en el lugar de los dos sustratos a la vez, se pueden utilizar tres sustratos diferentes en la viscodetección. Uno de los sustratos es una impureza de polímero de glucosa, probablemente material de glucano o celulosa. Se muestra que el uso de xilano de avena escanda, pectina y celulosa como material resulta en la identificación de tres tipos de enzimas, xilanasas, pectinasas y celulasas en una ronda de detección. El ensayo viscométrico mantiene una ventaja mayor con respecto al ensayo de detección de tinte común. El ensayo de detección de tinte se basa en tintes químicamente ligados a un sustrato. Este tipo de sustrato está comercialmente disponible solo para unos pocos compuestos. El ensayo viscométrico, sin embargo, puede trabajar con cualquier tipo de sustrato viscoso, aún uno natural que no requiere ningún pretratamiento químico. Este aspecto es de importancia como, a partir de un punto de vista comercial o industrial, uno puede detectar las actividades de enzima en los sustratos cuya viscosidad se reduce (es decir jugos de frutas) o la viscosidad se incrementa (es decir productos) lácteos es de importancia comercial.

Ejemplo 9: Desempeño en panadería de la endoglucanasa Talaromyces emersonii (CEC)

La preparación de pan de molde en un proceso de panadería estándar se desarrolla al mezclar 3500 g de harina de trigo (una mezcla de 80% de Kolibri y 20% de harinas de trigo Ibis (Meneba, Países Bajos) a aproximadamente 21°C), 77g de levadura comprimida (Konings), 70 g de sal, 25 ppm de ácido ascórbico, 10 ppm de α-amilasa fúngica Fermizyme™P200, (DSM N.V., Bakery Ingredients, Delft, Países Bajos) y diferentes cantidades de la enzima endoglucanasa CEC (de 4 diferentes clones, identificados mediante su número AD) y 2030 mL de agua (8-15°C) en un mezclador en espiral (Hobart) durante 2 minutos (en velocidad 1) y durante aproximadamente 6 minutos (en velocidad 2) para poner en 125Wh (Vatios-horas) de energía. La temperatura de la masa es 28°C. La maquinabilidad de la masa se analiza manualmente por un panadero calificado.

Directamente después de mezclar la masa se divide en 6 piezas cada una de 875 g, se redondea y se prueba durante 35 minutos en una cabina de pruebas a 34°C y 85% de RH (humedad relativa). Al final del este periodo las masas se forman y se moldea y se da una prueba final de 75 minutos en una cabina de prueba a 38°C y 87% de RH. Después de esto las masas completamente probadas se hornean en un horno eléctrico a 210°C durante 30 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente se determinan los volúmenes de las hogazas de pan mediante el método de desplazamiento de semilla de colza. Después de 16-24 horas de almacenamiento en bolsas de polietileno selladas a temperatura ambiente se evalúa la calidad de la miga por un panadero calificado. Se identifican cuatro cepas de colección para expresar el CEC, se fermentan en matraces agitados y se prueban en esta prueba de panadería. Los resultados se muestran en las Tablas adelante.

Nivel de dosificación de CEC AD 011.31 (harina CXU/kg)

Volumen de carga Manipulación de la masa Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

0

4105 100 fácil, no pegajoso 6

56

4357 106 más fácil, no pegajoso 6

189

4289 104 más fácil, algo de pegajosidad 6.5

Nivel de dosificación de CEC AD 0.46b.21 (harina CXU/kg)

Volumen de carga Manipulación de la masa Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

0

4105 100 fácil, no pegajoso 6

56

4427 108 más fácil, no pegajoso 6

189

4419 108 más fácil, algo de pegajosidad 6

Nivel de dosificación de CEC AD 050.13 (harina CXU/kg)

Volumen de carga Manipulación de la masa Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

0

4105 100 fácil, no pegajoso 6

56

4432 108 más fácil, no pegajoso 5.5

189

4622 113 más fácil, no pegajoso 6

Nivel de dosificación de CEC AD 078.50 (harina CXU/kg)

Volumen de carga Manipulación de la masa Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

0

4105 100 fácil, no pegajoso 6

56

4450 108 más fácil, no pegajoso 5.5

189

4553 111 más fácil, algo de pegajosidad 6

La calidad de las masas es muy buena. En la dosificación mayor para la endoglucanasa CEC existe un poco de pegajosidad experimentada durante la manipulación de la masa. Sin embargo esta poca pegajosidad no influencia la maquineabilidad de la masa. Todas las masas que contienen la endoglucanasa CEC son muy sensibles y fáciles de

5 manipular.

A partir de estos resultados de panadería se concluye que la endoglucanasa CEC es muy efectiva en mejorar la calidad del pan, en términos de volumen de hogaza y en términos de calidad de la miga. A pesar de los grandes volúmenes de las hogazas la estructura de la miga es aún muy regular y fina.

Ejemplo 10: Comparación de desempeño de panadería de la enzima Talaromyces emersonii (CEC) con10 endoxilanasa de Asp. niger

El desempeño de panadería del CEC se compara en la producción de pan de molde Holandés con un corriente utilizada de endoglucanasa fúngica de Aspergillus niger. Esta endoglucanasa A. niger se suministra en su forma pura comercialmente disponible, es decir Fermizyme™ HS2000.

Se repite el procedimiento exacto del Ejemplo 9 excepto que se utilizan diferentes cantidades de la endoglucanasa 15 CEC o Fermizyme™ HS2000.

Enzima

Nivel de dosificación (CXU/kg de harina) Volumen de carga Manipulación la masa de Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

Endonucleasa CEC 050.13

0 4105 100 Bueno, pegajoso no 6

56

4432 108 Flexible, pegajoso no 5.5

189

4622 113 Flexible, pegajoso no 6

Enzima

Nivel de dosificación (EXU/kg de harina) Volumen de carga Manipulación de la masa Calidad de la miga (escala 0-7)

(ML)

(%)

FermizimeTM HS2000

0 4123 100 Bueno, no pegajoso 6

527

4361 106 Flexible, no pegajoso 6

1056

4535 110 Flexible, un poquito pegajoso 7

A partir de los resultados es claro que la endoglucanasa CEC mejora el volumen de carga en un grado mayor que el obtenido al introducir Fermizyme™ HS2000. Más aún, se necesitad menos unidades de endoglucanasa /kg de harina para alcanzar un cierto nivel en el volumen de carga cuando se utiliza CEC en lugar de Fermizyme™ HS2000.

Ejemplo 11

Una comparación de algunas de las propiedades moleculares y bioquímicas de las tres glucasas se proporciona las Tablas adelante.

Glucanasa

MW (después de glucosilación) Longitud (residuos de aminoácido) Actividad Familia No. * pH óptimo pl Temperatura óptima

CEA

43 kDa (37 kDa) 335 3.2.1.4 (endoglucanasa) 5 (estructura 3D: α8β8 depósito TIM) 4.8 3.3 (4.5+) 85° C

2.CEB

44 kDa* 414 3.2.1.4 (endoglucanasa) 7 (estructura 3D: gelatina B) 42 > 75° C

CEC

23 kDa* 222 3.2.1.4 (endoglucanasa) 45 (estructura 3D: mezcla de depósito β) 4.0 > 75° C

* Con base en la clasificación de hidrolasa glucosida (CAZy) + Predicho de la secuencia de aminoácido

Glucanasa/celulasa

Familia Actividades conocidas Actividades conocidas Conclusión

CEA

5 EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.75 EC 3.2.1.58 EC 3.2.1.78 EC 3.2.1.123 Celulasa Endo 1,6 glucanasa Exo 1,3 glucanasa Mananasa Endoglicoceramidasa Actividad BGU/CXU Considerado no probable

CEB

7 EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.91 Celulasa Celobiohidrolasa Actividad BGU/CXU Considerado no probable

CEC

45 EC 3.2.1.4 Celulasa Actividad BGU/CXU Pero en pH diferente

de aquel probado

Glucanasa/celulasa

Familia 3D Nucleófilo/Donante de Protón Mecanismo

CEA

5 TIM 8 Glu/glu Retenido

CEN

7 Gelatina Glu/glu Retenido

CEC

45 Mezcla de depósito Asp/asp Retenido

16

Gelatina Glu/glu Retenido

El CEB, el CEC son todas celulasas que exhiben actividad EC 3.2.1.4. Muchas celulasas también pueden hidrolizar 1,4 enlaces en cebada - glucano que las hace particularmente útiles para ciertas aplicaciones tal como por ejemplo

5 eliminando los factores anti-nutricionales en el alimento. Cuando se mide la actividad por medio del ensayo de viscosidad es probable que la celulasa exhíbita la actividad endo. Esto no puede excluir sin embargo que también 1,3 ligados se hidrolizan. Por lo tanto, en las observaciones, las actividades EC 3.2.1.73, 3.2.1.39 y 3.2.1.6 no se pueden descartar aún cuando estas actividades se encuentran en la familia 16: las características de las familias 7 y 16 parecen ser similares.

10 Como explicación, las celulasas (EC 3.2.1.4) son capaces usualmente de catalizar la hidrólisis endo de ligado 1,4-Dglucosídico en la celulosa. El nombre sistemático de las celulasas es 1,4-(2,3;1,4)-D- glucano 4-glucanohidrolasa. Las endo-1,4-D-glucanasa y endoglucanasa D son sinónimos de 1,4-(1,3;1,4)-D- glucano 4-glucanohidrolasa. La celulasa también puede hidrolizar 1,4- ligados en -D-glucanos que contiene también 1,3 ligados, que los hacen particularmente útiles para ciertas aplicaciones tal como por ejemplo eliminar los factores anti-nutricionales en el

15 alimento. Tales enzimas que exhiben la actividad endo-glucanasa se denominan en general como glucanasas. En adición a la hidrólisis del glucano se puede lograr mediante lichenasa (1,3-1,4-D-glucano glucanohidrolasa (EC 3.2.1.73)) y endo-1,3(4)-glucanasa (1,3-(1,3;1,4)-D- glucano 3(4) glucanohidrolasa (EC 3.2.1.6)).

Una revisión de las actividades de celulasa se muestra en la tabla adelante.

Número EC

Actividad Nombre Sistemático recomendado Sinónimo

3.2.1.4

Hidrólisis del ligado endo de 1,4β-D-glucosídico en celulosa. También hidrolizará 1-4 ligados en β-D-glucanos que también contienen los ligados 1,3. 1,4- 1,4-(1,3;1,4)-β-Dglucano 4-Glucanohidrolasa Celulasa Endo-1,4-β-Dglucanasa endoglucanasa D

3.2.1.73

Hidrólisis de ligados 1,4-β-Dglicosídicos en β-D-glucanos que contienen 1,3 y 1,4 enlaces. Actúan enlichenina y cereal βglucanos, pero no en β-Dglucanos que contienen solo 1,3 o solo 1,4 enlaces. 1,3-1,4-β-D-glucano glucanohidrolasa Lichenasa

(continuación)

Número EC

Actividad Nombre Sistemático recomendado Sinónimo

3.2.1.39

Hidrólisis de ligados 1,3 β-Dglucosídicos en 1,3 P-Dglucanos. Actividad limitada en (1,3-1,4) β-Dglucanos mezclados 1,3-β-D-glucano Glucanohidrolasa Glucan endo1,3-β-Glucosidasa endo 1,3 β-Dglucanasa β 1,3 glucanasa Oligo 1,3 glucosidasa

3.2.1.58

Hidrólisis sucesiva de unidades β-D-glucosa de los extremos de no reducción de 1,3-β-Dglucanos, que liberan la αglucosa 1,3-β-D-glucano glucohidrolasa glucano 1,3-β-glucosidasa exo β-1,3glucanasa

3.2.1.75

Hidrólisis aleatoria de 1,6 ligados en 1,6-β-D-glucosidas. Actúa en lutean, pustulan, 1,6oligo-β-D-glucosidas 1,6-β-D-glucano glucanohidrolasa glucano endo1,6-β-glucosidasa endo-β-1,6glucanasa β-1,6-glucano hidrolasa

3.2.1.6

Endohidrólisis de 1,3 o 1,4 ligados en β-Dglucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo de reducción se involucra en el ligado a ser hidrolizado se sustituye en mismo en C-3. Los sustratos incluyen D-glucanos de cereal, laminarin, lichenina 1,3-(1,3;1,4)-β-Dglucano 3(4) glucanohidrolasa endo-1,3(4)-βglucanasa β-1,3-glucanasa beta-1,3-1,4glucanasa endo-β,1,3 (4)-glucanasa

3.2.1.91

Hidrólisis de ligados 1,4-β-Dglucosídicos en celulosa y celotetraosa, que libera celobiosa del extremo de no reducción. 1,4-D-glucano celobiohidrolasa celulosa 1,4-βexoglucanasa celobiosidasa celobiohidrolasa exocelobiohidrolasa

REFERENCIAS

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22.

WO-A-98/46772

23.

WO-A-91/14772 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM NV

<120> BETA GLUCANASA NOVEDOSA

<130> N78454A

<140>

<141>

<150> GB 00302263.9

<151> 2000-03-20

<160> 8

<170> PatentIn version 3.0

<210> 1.

<211> 1008

<212> ADN

<213> Talaromyces emersonii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1008)

<400> 1

imagen2

imagen2

<210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 2

imagen2

<210> 3

<211> 1245

<212> ADN

<213> Talaromyces emersonii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1245)

<400> 3

imagen2

imagen2

<210> 4

<211> 414

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 4

imagen2

imagen2

<210> 5

<211> 669

<212> ADN

<213> Talaromyces emersonii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(669)

<400> 5

imagen3

imagen2

<210> 6

<211> 222

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 6

imagen2

imagen2

<210> 7

<211> 28

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucléotido

<400> 7

tatagcgaaa tggattgatt gtacgctc 10 <210> 8

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> cebador de oligonucléotido

<400> 8 atccccagca tcattacacc tcagtg

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido, que es una β-glucanasa que se puede obtener de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende:

   (i)

   la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o

   (ii)

   una variante de (i) que es capaz de dividir el β-D-glucano que tiene por lo menos 80 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o

   (iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir el β-D-glucano.

2. 2.

   El polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 en donde la variante (ii) tiene por lo menos 85 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4 y/o el fragmento de (iii) tiene por lo menos 150 aminoácidos contiguos de longitud.

3. 3.

   El polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 o 2, que tiene un pH óptimo por debajo de 5.4 o una temperatura óptima de >75 °C.

4. 4.

   Un polinucleótido que comprende:

   (a)

   la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 3 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

   (b)

   una secuencia que es complementaria a, o que hibrida a, una secuencia como se define en (a) bajo condiciones rigurosas;

   (c)

   un fragmento de por lo menos 25 bp de la SEQ ID No. 3;

   (d)

   una secuencia que tiene por lo menos 80%, identidad en una secuencia como se define en (a) o (b) ; o

   (e)

   una secuencia que se degenera como un resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias como se define en (a) a (d)

   (f)

   una secuencia modificada de la SEQ ID No. 3 con hasta 100 sustituciones de nucleótido.

5. 5.

   El polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 4 en donde la secuencia codifica un polipéptido que tiene actividad β-glucanasa.

6. 6.

   El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 5, que es una secuencia de ADN.

7. 7.

   Un vector que comprende una secuencia de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 6.

8. 8.

   El vector de acuerdo con la Reivindicación 7, que es un vector de expresión, tal como cuando una secuencia de ADN de acuerdo con la Reivindicación 6 se liga operablemente a una secuencias reguladora.

9. 9.

   Una célula anfitriona, que comprende, como una secuencia heteróloga, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 7.

10. 10.

    Una célula anfitriona, que expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

11. 11.

    Una célula anfitriona transformada con la secuencia de ADN de la Reivindicación 6 como una secuencia heteróloga o un vector de la Reivindicación 8.

12. 12.

    Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, el proceso comprende cultivar una célula anfitriona como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11 bajo condiciones que proporcionan la expresión del polipéptido.

13. 13.

    El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para tratar hiperlipemia y/o altos niveles de triglicéridos y colesterol en suero en un individuo o un trastorno que resulta del mismo.

14. 14.

    Un método para identificar un compuesto que modula la actividad β-glucanasa, el método comprende poner en contacto un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 con un compuesto de prueba y monitorear la actividad β-glucanasa.

15. 15.

    Un método para tratar material de planta, el método comprende poner en contacto el material de planta con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

16. 16.

    Un método de acuerdo con la Reivindicación 15 en donde el tratamiento comprende degradar o modificar la celulosa, tal como β- glucano, en el material de planta.

17. 17.

    Un método de acuerdo con la Reivindicación 16 para degradar o modificar las paredes celulares de la planta.

18. 18.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 17 en donde el tratamiento comprende la división de las subunidades de glucosa de un componente β-D-glucano del material.

19. 19.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 17 en donde el material comprende una planta, pulpa de planta, extracto de planta o un alimento comestible o ingrediente del mismo, o una tela, textil o prenda que contiene el material de planta.

20. 20.

    Un método para reducir la viscosidad de un material de planta, el método comprende poner en contacto el material de planta con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para degradar la celulosa contenida en el material.

21. 21.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en un método para tratar el material de planta.

22. 22.

    Uso de acuerdo con la Reivindicación 21 en donde el tratamiento comprende dividir los polímeros β-D-glucano en el material de planta.

23. 23.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en un método para procesar pulpa de planta, jugo o extracto cuyo método comprende incubar la pulpa, jugo o extracto con el polipéptido o composición por lo menos para degradar parcialmente la celulosa.

24. 24.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en fabricación de cerveza, destilación, biometanación, higiene dental, tratamiento de cuero, fabricación de papel, tratamiento o fabricación textil, panadería o elaboración de pan, lavado o tratamiento con detergente, tratar bulbos de lores o en el alimento de un animal.

25. 25.

    Un alimento o producto alimenticio que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

26. 26.

    Un alimento o producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 25, que es una bebida alcohólica, pan, masa o te.

27. 27.

    Un organismo de planta transgénica que comprende una célula de acuerdo con la Reivindicación 10 u 11.