CN102766613B

CN102766613B - Talaromyces emersonii的β-葡聚糖酶

Info

Publication number: CN102766613B
Application number: CN201210223481.3A
Authority: CN
Inventors: J·P·T·W·范登哈姆伯格; J-M·范德兰恩; J-M·G·达兰; M·A·赫威基尔; D·P·托伊费尔
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2021-03-20
Also published as: ES2366122T3; DK1272643T3; PL209206B1; ES2299486T5; EP1621628B1; AU2001262116A1; ES2299486T3; DE60132762D1; EP1272643B2; EP1272643B1; CN1426470A; EP1621628A2; EP1272643A1; RU2002128017A; DK1621628T3; PL358324A1; RU2321635C2; CA2403486C; PL209225B1; WO2001070998A1

Abstract

本发明公开了能降解植物提取物或植物材料中的纤维素并具有（内切）β-1,4-葡聚糖酶活性（EC3.2.1.4）的3个新多肽。因此它们是纤维素酶，并能切割β－D－葡聚糖聚合物内部相邻葡萄糖单位之间的（1－3，1－4或1－6）键。给出了获自Talaromyces emersonii真菌菌株的所有3个葡聚糖酶（CEA，CEB和CEC）的氨基酸序列和编码DNA序列。该葡聚糖酶可在食品和动物饲料的制造中用于处理纤维素。

Description

Talaromyces emersonii的β-葡聚糖酶

本申请是申请号为01808405.2、申请日为2001年3月20日、发明名称为“Talaromyces emersonii的β-葡聚糖酶”的中国专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及来自踝节菌属(Talaromyces)真菌、尤其是Talaromycesemersonii的(β-)葡聚糖酶（因此也涉及纤维素酶），以及它们用于降解纤维素中葡聚糖的用途。

发明背景

植物细胞壁的组成是复杂和多变的。多糖主要以纤维素(植物细胞壁的主要结构成分)、半纤维素(包含各种β-木聚糖链，如木葡聚糖(xyloglucan))和果胶长链形式存在。

β-葡聚糖(或，更适当地，(1→3)(1→4)β-D-葡聚糖)，MW为10至14kDa，是植物半纤维素(MW为约700kDa)的成分，由β-1,4和1,3-连接的吡喃型葡萄糖残基主链组成。另一成分是木聚糖，其由β-1,4连接的木糖残基组成，该木糖残基任选地被侧链如阿拉伯糖和/或葡糖醛酸残基取代。

单子叶植物(例如谷物和草)和双子叶植物(例如苜蓿、油菜籽和大豆)之间以及植物的种子和营养部分之间有着根本差异。单子叶植物的特征在于存在阿拉伯木聚糖复合物作为主要的半纤维素主链，而双子叶植物中半纤维素的主要结构是木葡聚糖复合物。双子叶植物中比单子叶植物中有较高的果胶浓度。种子通常具有高的果胶物质但相对低的纤维素物质。

由于能够作用于主要的植物细胞壁成分，纤维素降解酶被用于加工食物中的植物材料以及用于饲喂用途或作为食物或饲料添加剂。

工业上目前使用的大多数纤维素降解酶表现为是分子量相对低且较高温度下具有中等稳定性的葡聚糖酶。然而，对于某些应用，可能期望使用具有相对高热稳定性的葡聚糖酶。由于在制备动物饲料球团过程中要应用高的温度条件，所以在使用葡聚糖酶作为动物饲料添加剂时优选高的热稳定性。

发明概述

现提供新的β-葡聚糖酶(或纤维素酶)，其能够切割β-D-葡聚糖(或纤维素)如存在于植物材料中的那些。

最广义上讲，本发明涉及来自踝节菌属，如Talaromyces emersonii(真菌)的β-葡聚糖酶(或纤维素酶)。这些β-葡聚糖酶可以切割β-D-葡聚糖或纤维素，例如它们可以是β-1,4-内切葡聚糖酶，或具有EC 3.2.1.4的活性。

这些葡聚糖酶可以具有：

a.低于7.0或5.4，如低于5.0、如4.4至5.2或3.0至6.0或7.0的最适pH；或

b.至少72℃、75℃或甚至81℃，如78℃至85℃或83℃至87℃的最适温度。

更具体地，本发明提供(分离的)β-葡聚糖酶多肽，其包含：

(i)SEQ ID-NO:2、4或6的氨基酸序列；或

(ii)能够切割β-D-葡聚糖的(i)的变体；或

(iii)能够切割β-D-葡聚糖的(i)或(ii)的片段。

根据本发明的另一方面，提供如下多核苷酸，其包含：

(a)SEQ ID NO:1、3、或5的核酸序列，或编码本发明多肽的序列；

(b)可与(a)所定义的任何序列互补或杂交的序列；

(c)(a)或(b)中任何序列的片段；

(d)与(a)、(b)或(c)所定义的任何序列有至少60%一致性的序列；或

(e)由于遗传密码的原因而与(a)至(d)所定义的任何序列简并的序列。

本发明还提供：

-包含本发明多核苷酸并能够表达本发明多肽的(如表达)载体；

-包含本发明载体的细胞系或细胞株；

-制备本发明多肽的方法，该方法包括在适于实现该多肽表达的条件下维持本发明的细胞系或细胞株，和如果必要的话分离该多肽；

-降解β-D-葡聚糖的方法，该方法包括使包含β-D-葡聚糖的材料和本发明多肽接触；

-鉴定可调节β-葡聚糖酶活性的化合物的方法，该方法包括使本发明多肽与测试化合物在β-D-葡聚糖存在的情况下接触并监测或检测活性的任何改变。

-治疗患有高脂血症的患者的方法，该方法包括给患者使用有效量的本发明多肽；和

-该多肽在制备用于治疗或预防高脂血症的药物中的用途。

序列简述

SEQ ID NO:1是来自Talaromyces emersonii的本发明第一β-葡聚糖酶(CEA)的DNA序列；

SEQ ID NO:2是此第一β-葡聚糖酶CEA的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3是来自相同生物的第二β-葡聚糖酶(CEB)的DNA序列；

SEQ ID NO:4是此第二β-葡聚糖酶CEB的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5是也来自相同生物的第三β-葡聚糖酶(CEC)的DNA序列；

SEQ ID NO:6是此第三β-葡聚糖酶CEC的氨基酸序列；和

SEQ ID NO:7和8是可与SEQ ID NO:1杂交的PCR引物（被用于在遗传分析阳性转化体过程中再次克隆cDNA插入片段）。

发明详述

A．多核苷酸

本发明提供编码本发明多肽的(例如分离的和/或纯化的)多核苷酸。因此，本发明提供编码具有SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列的β-葡聚糖酶的多核苷酸。本发明还提供编码具有与SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列实质上同源的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本发明还包括选自以下的多核苷酸：

(a)包含SEQ ID NO:1、3、或5所示核苷酸序列或它们的互补序列的多核苷酸；

(b)包含能够与SEQ ID NO:1、3、或5所示核苷酸序列或它们的片段（例如选择性地）杂交的核苷酸序列的多核苷酸；

(c)包含能够与SEQ ID NO:1、3、或5所示核苷酸序列或它们的片段的互补序列（例如选择性地）杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和/或

(d)包含由于遗传密码的原因而与(a)、(b)或(c)所定义的多核苷酸有简并性的多核苷酸序列的多核苷酸。

本发明多核苷酸也包括如下多核苷酸，其：

(a)编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽，该多核苷酸是：

(1)SEQ ID NO:1、3或5的编码序列；

(2)选择性地与(1)定义的序列的互补序列杂交的序列；或

(3)由于遗传密码的原因而与(1)或(2)定义的序列有简并性的序列；或

(b)是与(a)定义的多核苷酸互补的序列。

可杂交的序列

术语“可以杂交”意味着本发明靶多核苷酸可以和用作探针的核酸(例如SEQ ID NO:1、3或5所示核苷酸序列，或其片段，或它们的互补序列)以显著高于背景的水平发生杂交。本发明还包括编码β-葡聚糖酶或其变体的核苷酸序列以及与其互补的核苷酸序列。该核苷酸序列可以是RNA或DNA，并因此包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选地，该核苷酸序列是DNA序列，最优选cDNA序列。典型地，本发明多核苷酸包含（如果适当的话）能够在选择性条件下与SEQ ID NO:1、3或5的编码序列或该编码序列的互补序列杂交的连续核苷酸序列。这些核苷酸可以根据本领域熟知的方法合成¹。

本发明多核苷酸可以（如果适当的话）与SEQ ID NO:1、3或5的编码序列或编码序列的互补序列以显著高于背景的水平杂交。背景杂交可以由例如cDNA文库中存在的其它cDNA引起。信号水平（例如通过本发明多核苷酸和SEQ ID NO:1、3或5的编码序列或编码序列的互补序列之间的相互作用产生的）典型地是其它多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5的编码序列之间的相互作用的强度的至少10倍、优选至少100倍。相互作用的强度可以通过例如放射性标记探针(如用³²P)来测量。选择性杂交可以典型地使用低严紧条件(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约40℃)、中等严紧条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50℃)、或高严紧条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约60℃)实现。杂交可以在本领域已知的任何适当的条件¹下进行，作为一个说明，低严紧性可以是55℃下2×SSC，中等严紧性可以是60℃下0.5至1.0×SSC，高严紧性可以是60℃或更高温度(如68℃)下0.1或0.2×SSC，所有的均使用0.5% SDS。

修饰

本发明多核苷酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链。它们还可以是其中包括了一个或多个合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。许多不同类型的多核苷酸修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯或硫代磷酸酯主链和/或在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，应当理解本文所述多核苷酸可以通过本领域现有的任何方法进行修饰。

应当理解本领域技术人员可以使用常规技术进行核苷酸替代而不影响本发明多核苷酸编码的多肽序列，以反映任何特定宿主生物，例如表达本发明多肽的宿主生物的密码子使用。

SEQ ID NO:1、3或5的编码序列可以通过核苷酸替代（例如从或最多1、2、或3个替代至10、25、50或100个替代）进行修饰。作为替代方案或此外，多核苷酸可以通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在一端或两端延伸进行修饰。修饰的多核苷酸一般编码具有β-葡聚糖活性的多肽。可以进行简并替代、和/或可以进行这样的替代以便在修饰的序列翻译后导致保守性氨基酸替代，见例如随后参考多肽进行的讨论。

同系物

能够选择性地与SEQ ID NO:1、3或5的DNA编码序列(例如互补序列)杂交的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1、3或5的编码序列有至少50％或60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性(或同源性)。这可以跨SEQ ID NO:1、3或5的具有至少20、优选至少30、例如至少40、至少60、更优选至少100个连续核苷酸的区域，或最佳地横跨SEQ ID NO:1、3或5的全长。对于SEQ ID NO:1，序列一致性优选为至少75％、或80％，对于SEQ IDNO:3，优选为至少85％，对于SEQ ID NO:5，优选为至少85％。

可以使用上述同源性程度与最小大小的任何组合来定义本发明多核苷酸，优选较为严紧的组合（即较长区域内的较高同源性）。因此，例如横跨25、优选30个核苷酸有至少80％或90％同源性的多核苷酸形成了本发明的一个方面，同样横跨40个核苷酸有至少90％同源性的多核苷酸也形成了本发明的一个方面。

多核苷酸（或蛋白质）序列的同系物典型地在例如具有至少15、20、30、100或更多个连续核苷酸（或氨基酸）的区域内有至少70％同源性、优选至少80％、90％、95％、97％或99％同源性。该同源性可以基于氨基酸一致性（有时称作“硬同源性”）来计算。

例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，该程序（例如按其默认设置使用⁵）可以用于计算同源性。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或比对(line up)序列(例如按其默认设置^6,7确定对等或相应序列).

进行BLAST分析的软件可以通过生物技术信息国家中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过在查询序列中确定长度W的如下短字来鉴定高得分序列对(HSP)，其中所述短字为在与数据库序列中相同长度的字比对时符合或满足某个正阈值分数T的短字。T被称作相邻字分数阈值^6,7。这些最初的相邻字命中点用作开始检索的出发点以发现含有它们的HSP。将这些字命中点沿每个序列向两个方面延伸，只要累积的比对分数可以增加即可。当：累积的比对分数从获得的最大值下降数量X时；由于累积一个或多个负分残基比对，累积分数趋于零或更低时；或达到任一序列的末端时，终止这些字命中点向两个方向的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。BLAST程序使用如下默认值：字长(W)为11、BLOSUM62比对评分矩阵⁸(B)为50，期望值(E)为10、M=5、N=4、和双链比较。

BLAST算法在两个序列之间进行相似性的统计分析⁹。BLAST算法提供的一种相似性测量方法是最小总和概率(the smallest sumprobability)(P(N))，其指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的可能性。例如，如果一个序列和另一个序列的比较中最小总和概率小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则第一个序列被认为与第二个序列相似。

引物和探针

本发明多核苷酸包括并可以用作引物如PCR引物、用于其它扩增反应的引物，以及探针，或可以将这些多核苷酸克隆在载体中。这些引物、探针和其它片段可以长至少或不超过20、例如至少25、30或40个核苷酸。它们可以典型地不超过40、50、60、70、100、150、200或300个核苷酸，或甚至不超过几个核苷酸（例如5或10个核苷酸）长，并且无SEQ ID NO:1、3或5的编码序列。

一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备期望的核酸序列。应用自动化技术进行合成的技术是本领域易于获得的。本发明引物的例子列在SEQ ID NO 7和8中。

较长的多核苷酸一般可以使用重组手段，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术制备。这涉及制备针对期望克隆的β-葡聚糖酶区域的成对引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从靶细胞(例如酵母、细菌、植物、原核生物或真菌)、优选踝节菌属菌株的细胞获得的mRNA或cDNA接触，在造成期望区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段（例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物）并回收该扩增的DNA。可以对引物进行设计以含有适宜的限制性酶识别位点以便可以将扩增的DNA克隆至适当的克隆载体中。

可以使用这样技术获取本文所述β-葡聚糖酶序列的全部或部分。相应于SEQ ID NO:1、3或5的cDNA的基因组克隆、或含有例如内含子和启动子区域的β-葡聚糖酶基因也在本发明范围内，并也可以通过类似手段（例如重组手段、PCR、克隆技术）使用来自真菌、酵母、细菌、植物或原核细胞的基因组DNA作为起始物来获得。

多核苷酸或引物可以带有显示标记(revealing label)，例如放射性或非放射性标记。适当的标记包括放射性同位素如³²P或³⁵S、酶标记或其它蛋白质标记如生物素。可以将这些标记添加到本发明多核苷酸或引物上，并可以使用本质上已知的技术进行检测。

标记的或未标记的多核苷酸可以用于基于核酸的实验中以检测(例如真菌)样品中的β-葡聚糖酶或其变体，或对其进行测序。这些用于检测的实验一般包括使(怀疑)含有DNA的(例如真菌)样品与本发明探针或引物在杂交条件下接触，并检测在探针和样品核酸之间形成的任何双链。该检测可以使用诸如PCR等技术来实现，或通过将探针固定在固相支持物上、去除样品中未与探针杂交的核酸、然后检测与探针杂交的核酸来实现。或者，可以将样品核酸固定在固相支持物上，然后可以检测与该支持物结合的探针量。

可以方便地以测试试剂盒的形式将本发明探针包装在适当的容器中。在此试剂盒中，当试剂盒所设计用于的分析形式要求探针和固相支持物结合时，探针可以是和固相支持物相结合的。试剂盒还可以含有用于处理待探测的样品和使探针和样品核酸杂交的试剂、对照试剂、说明书等。

优选地，本发明多核苷酸与多肽可以从相同的生物体，例如真菌，尤其是踝节菌属真菌获得。

本发明多核苷酸还包括具有β-葡聚糖酶活性的SEQ ID NO:1、3或5序列的变体。变体可以通过添加、替代和/或缺失而形成，并且可以具有切割β-D-葡聚糖聚合物的能力。

多核苷酸的制备

与SEQ ID NO:1、3或5并非100％一致但落入本发明范围内的多核苷酸可以通过许多途径获得。因此，本文所述β-葡聚糖酶序列的变体可以通过例如对从一组生物（例如作为本发明多肽的来源而被讨论的那些）制备的基因组DNA文库进行探测来获得。此外，还可以获得其它真菌、植物或原核生物的β-葡聚糖酶同系物，这些同系物和它们的片段一般能够与SEQ ID NO:1、3或5杂交。这些序列可以通过使用包含SEQ IDNO:1、3或5的全部或部分的探针在中等至高严紧条件（见上述）下探测来自其它物种的cDNA文库或基因组DNA文库而获得。可以使用包含SEQ ID NO:1、3或5的全部或部分的核酸探针探测来自其它物种（例如作为本发明多肽的来源而被描述的那些）的cDNA文库。

也可以使用简并PCR获得物种同系物，所述简并PCR使用的引物被设计靶向变体和同系物中编码保守氨基酸序列的序列。这些引物可以含有一个或多个简并位置，与使用针对已知序列的单一序列引物进行序列克隆时的条件相比，简并引物所使用的条件的严紧性较低。

或者，可以通过定点诱变β-葡聚糖酶序列或其变体获得这些多核苷酸。当例如为了针对表达多肽序列的具体宿主细胞进行密码子偏依性优化而需要在序列中引入沉默密码子改变时，这可能是有用的。还可能期望进行其它的序列改变，以便引入限制性酶识别位点、或改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。

本发明包括含有本发明多核苷酸和其互补多核苷酸的双链多核苷酸。

本发明还提供编码下述本发明多肽的多核苷酸。由于这些多核苷酸可以用于重组制备本发明多肽，所以对于它们而言能够与SEQ ID NO:1、3或5的序列杂交并不是必需的，但这一般是理想的。另外，如果期望的话，可以按上述对这些多核苷酸进行标记、使用、以及制备。

B．多肽

本发明涉及(例如(实质上)纯化的和/或分离的)β-葡聚糖酶(或纤维素酶)和其变体。本发明多肽可以基本上由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列或该序列的变体组成。多肽也可以是由上述本发明多核苷酸编码的。

本发明多肽可以是分离的或基本上纯化的形式。应当理解多肽可以和不干扰多肽的预期目的和/或功能的载体或稀释剂混合，并仍被认为是实质上分离的。一般可以在如下制剂中包含该多肽，该制剂中大于20％、例如大于30％、40％、50％、80％、90％、95％或99％重量的多肽是本发明多肽。可以使用常规方法纯化和/或合成根据本发明的蛋白质¹。对于某些制剂（例如非药物用途的制剂），多肽可以少量存在，例如0.01至10％、例如0.1至5％、或2％、或甚至0.2至1％。

优选地，本发明多肽可以从含有编码具β-葡聚糖酶(或纤维素酶)活性的酶的基因的微生物中获得。更优选地，该微生物是真菌、最佳是丝状真菌。因此，优选的生物是踝节菌属，例如Talaromyces emersonii种。

活性

本发明多肽可以具有一个或多个以下特征，即其：

(1)具有β-葡聚糖酶(或纤维素酶)活性；

(2)具有3至6.5或7.0，例如4至5.5或6.0，最佳4.5至5.0的最适pH；

(3)在30℃至100℃，例如60至95℃，最佳75℃或80℃至90℃的温度下具有最佳活性，优选地最适温度为至少75℃，例如至少85℃；

(4)具有(脱糖基化的)20至60kDa，优选20至25、35至45或23至50kDa，最佳36至40kDa或(糖基化的)40至45kDa的分子量；

(5)具有3.0至3.6或5.0，3.8至4.5，4.5至5.0或6.0至7.0的等电点；和/或

(6)具有水解谷物β-葡聚糖的活性，或在低于pH7时表现出水解活性。

该多肽可以具有EC 3.2.1.4活性(或内切葡聚糖酶活性)。一般地，这可指内切水解纤维素中的1,4-β-D-葡糖苷键。“β-葡聚糖酶活性”是指切割纤维素或β-葡聚糖聚合物(例如植物如燕麦或大麦中存在的)的能力。因此，该活性允许在相邻吡喃型葡萄糖末端和/或非末端单位之间进行切割。优选地，该切割发生在[葡萄糖(1-4),(1-3)或(1-6)葡萄糖]键位置。该多肽可以优选在两个相邻(例如非取代的葡萄糖)单位之间进行切割。因此，它可以具有内切活性（即，为内切葡聚糖酶）。底物聚合物可以是取代的或也可以是未被取代的。优选该多肽不具有木聚糖酶活性。

该多肽还可以具有纤维素酶活性，也就是说它对纤维素具有活性，或可以切割纤维素。因为β-葡聚糖是纤维素的一个成分，因此所有的葡聚糖酶都在纤维素这一更宽术语的范围内。因此，由于本发明多肽属于葡聚糖酶的一个亚类，故也是纤维素酶。除了内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4，正如以上提及的)外，属于纤维素酶的其它类型活性还有外切葡聚糖酶/纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、内切1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)、外切1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)、甘露聚糖酶(mannanase)(EC 3.2.1.78)、和内切N-脂酰基鞘氨醇葡糖苷酶(endo-glycoceramidase)(EC 3.2.1.123)。通过与已知酶及它们所属的水解酶家族进行比较，一些多肽根据其结构和序列被认为具有这些其它活性中的一种、两种或多种活性。因此，在本说明书中，如果上下文适当的话，葡聚糖酶活性可以指纤维素酶活性。以下实施例11中给出了此多肽的(纤维素酶)活性列表。

优选地，根据糖苷水解酶(CAZy)的分类，该多肽属于家族5、7或45中的一个。该多肽可以是glu/glu或asp/asp亲核/质子供体。

变体和同系物

本发明多肽可以包含SEQ ID NO:2、4或6所示氨基酸序列或这些序列的基本上同源的序列、或片段，并可以具有β-葡聚糖酶活性。一般地，优选SEQ ID NO：2、4或6所示的天然氨基酸序列。

具体地，本发明多肽可以包括：

a.SEQ ID NO:2、4或6的多肽序列；

b.其天然变体或同系物；或

c.与(a)或(b)有至少70、至少80、至少90、至少95、至少98、或至少99％的序列一致性的蛋白。

变体可以是天然存在于例如真菌、细菌、酵母或植物细胞中并可以以基本上类似于SEQ ID NO:2、4或6蛋白质的方式发挥作用的变体，例如它可以具有β-葡聚糖酶活性。类似地，该蛋白质的物种同系物可以是天然存在于另一物种中并可以发挥β-葡聚糖酶作用的相应蛋白质。变体包括与本发明多肽来自相同菌株或来自不同菌株但相同属、或相同物种的等位变体。

变体和物种同系物可以按照本文所述制备SEQ ID NO:2、4或6的方法，在适当的细胞来源例如细菌、酵母、真菌或植物细胞上实施该方法来获得。还可以利用上述定义的探针探测从酵母、细菌、真菌或植物细胞制备的文库，以便获得包括变体或物种同系物的克隆。这些克隆可以通过常规技术进行操作以产生本发明多肽，然后可以通过本身已知的重组或合成技术制备本发明多肽。

本发明多肽优选在例如SEQ ID NO:2、4或6的至少60、至少100、150、200或300个连续氨基酸区域或全长范围内，与SEQ ID NO:2、4或6蛋白质有至少70％序列一致性、更优选地至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％的序列一致性。对于SEQ ID NO:2，序列一致性优选为至少70％，对于SEQ ID NO:4，为至少60％，而对于SEQ ID NO:6，为至少65％。

因此，可以对SEQ ID NO:2、4或6多肽和变体及物种同系物的序列进行修饰以提供本发明多肽。可以进行氨基酸替代，例如从或不超过1、2或3至10、20、30、50或100个替代。也可以进行相同数目的缺失和插入。这些改变可以在多肽功能的关键区之外进行，因此可以仍导致具有活性的酶。该修饰多肽一般仍保留作为β-葡聚糖酶的活性。

本发明多肽包括上述全长多肽和其变体的片段，包括SEQ ID NO:2、4或6所示序列的片段。这些片段典型地保留作为β-葡聚糖酶的活性。片段可以长至少50、100、150、200或250个氨基酸或可以比全长序列(SEQID NO:2、4或6所示)少此数目的氨基酸。

本发明多肽通常可以按下述采用重组方式进行制备，但如果必要的话也可以通过合成手段制备。可以对其进行修饰，例如通过添加组氨酸残基或T7标签以有助于其鉴定或纯化，或通过添加信号序列以促使其向细胞外分泌。

术语“变体”是指与β-葡聚糖酶(或纤维素酶)具有相同的实质特征或基本的生物学功能的多肽，包括等位变体。β-葡聚糖酶的本质特征是指它作为酶表现出EC 3.2.1.4活性或可以切割β-D-葡聚糖(例如谷物或燕麦斯卑尔脱小麦(oat spelt)(β)-葡聚糖)的1→3、1→4和/或1→6键。优选变体多肽和该β-葡聚糖酶具有相同活性。与β-葡聚糖酶具有相同的本质特征的多肽可以使用纤维素或β-葡聚糖降解试验（例如下文描述的）来鉴定。

SEQ ID NO:2、4或6的变体还包括不同于SEQ ID NO:2、4或6但并不一定来源于天然的β-葡聚糖酶蛋白质的序列。可以按与SEQ IDNO:2、4或6有%同源性或在该序列中有多个替代来描述这些变体。或者，变体可以由与SEQ ID NO:1、3或5杂交的多核苷酸编码。

这些变体可以按定义SEQ ID NO:1、3或5的变体的相似方式定义。因此，这些变体可以包括来源于踝节菌属其它菌株的变体序列。其它变体可以从其它踝节菌属菌株通过寻找β-D-葡聚糖酶活性并如前进行克隆和测序来鉴定。变体可以包括在蛋白质序列中缺失、修饰或添加单个的氨基酸或氨基酸组，只要该肽仍保持β-葡聚糖酶的基本生物学功能即可。

保守替代可以例如根据下表进行。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列同行的氨基酸可以彼此替代。优选替代不影响多肽的折叠或活性。

较短的多肽序列也在本发明范围内。例如，长至少50个氨基酸或不超过60、70、80、100、150或200个氨基酸的肽，只要它表现出β-葡聚糖酶的基本生物学功能即被认为在本发明范围内。具体地，但不是排他性地，本发明此方面包括蛋白质是完整蛋白质序列的片段并可以包含或是β-D-葡聚糖(或甘露糖)结合区或β-D-葡聚糖(或纤维素)切割区的情况。

修饰

本发明多肽可以通过化学途径修饰，例如翻译后修饰。例如，可以对其进行糖基化(一次或多次，由相同或不同的糖进行)或使其包含修饰的氨基酸残基。也可以通过添加组氨酸残基(以帮助纯化)或通过添加信号序列(以促使其插入细胞膜中)，对其进行修饰。该多肽可以具有一个或多个(N)氨基或(C)羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基、不超过约20－25个残基的小接头肽，或利于纯化的(小)延伸例如聚组氨酸或T7标签、抗原表位或(例如麦芽糖)结合域¹⁴(例如，在C端)。这些延伸可以或也可以不通过接头添加。

本发明多肽可以使用显示标记来标记。所述显示标记可以是允许多肽得以检测的任何适宜标记。适宜的标记包括放射性同位素，例如¹²⁵I、³⁵S、酶、抗体、多核苷酸和接头如生物素。

这些多肽可以经修饰包括非天然氨基酸或增加多肽的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质或肽时，可以在制备过程中引入这些氨基酸。也可以在合成或重组制备后对蛋白质或肽进行修饰。

本发明多肽还可以使用D-氨基酸制备，或包含(一个或多个)D-氨基酸。

许多侧链修饰是本领域已知的，并可以对本发明蛋白质或肽的侧链进行这些修饰。这些修饰包括例如通过还原性烷基化（与醛反应，然后用NaBH₄进行还原）、使用methylacetimidate进行酰胺化或用乙酸酐进行乙酰化来修饰氨基酸。

本发明提供的序列还可以用作起始物以构建“第二代”酶。“第二代”葡聚糖酶是经诱变技术(例如定点诱变)改变的，与野生型葡聚糖酶或重组葡聚糖酶例如本发明制备的那些葡聚糖酶有不同性质的葡聚糖酶。例如，最适温度或pH、比活性、底物亲和性或热稳定性可以经改变以更好地适应于在指定程序中的应用。

对于本发明葡聚糖酶的活性必需的并由此优选进行替代的氨基酸，可以根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变¹⁰来鉴定。在后一技术中，在分子的每个残基位置引入突变，然后检测所获突变分子的生物学活性(例如葡聚糖酶活性)以鉴定出对于该分子活性关键的氨基酸残基。酶底物相互作用位点还可以通过分析晶体结构确定，其中晶体结构可以利用诸如核磁共振、晶体学或光亲和标记^11,12,13或分子模拟等技术来测定。

预期可以使用酵母和真菌宿主细胞来实现对于赋予本发明重组表达产物最佳生物学活性可能是必需的翻译后修饰（例如蛋白水解加工、十四烷基化、糖基化、截短、和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化）。

可以以一定形式提供本发明多肽，以便它们脱离其天然的细胞环境。因此，它们可以基本上是分离的或纯化的，见以上讨论，或可以位于非其天然存在的细胞中，例如其它真菌物种、动物、酵母或细菌的细胞中。

C.重组方面

本发明还提供包含本发明多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，以及在适当宿主细胞中，在例如造成本发明多肽表达的条件下培养、转化或转染这些载体的方法。本发明还提供包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞，其中该多核苷酸与宿主细胞基因组异源。术语“异源”通常相对于宿主细胞而言，是指多核苷酸非天然存在于该宿主细胞的基因组中或该多肽不是该细胞天然产生的。优选地，宿主细胞是酵母细胞，例如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或糖酵母属(Saccharomyces)的酵母细胞，或真菌细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞。

可以将本发明多核苷酸并入重组可复制载体中，例如克隆或表达载体中。该载体可以用于在相容的宿主细胞中复制该核酸。因此，再一实施方案中，本发明提供通过如下方式制备本发明多核苷酸的方法：将本发明多核苷酸引入可复制载体中、将该载体导入相容宿主细胞、然后在造成载体复制的条件下培养该宿主细胞。可以从宿主细胞中回收载体。适当的宿主细胞与表达载体相联系描述如下。

载体

可以将本发明多核苷酸插入表达盒中。插入了本发明表达盒或多核苷酸的载体可以是任何可以方便地进行重组DNA方法操作的载体，而且载体的选择常常取决于其引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在且其复制独立于染色体的复制的载体，例如质粒。或者，载体可以是当导入宿主细胞中后可以整合在宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起进行复制的载体。

优选地，本发明多核苷酸在载体中与能够使宿主细胞实现该编码序列的表达的调节序列可操作地连接，即该载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指将所述成分并置，其中所述成分之间形成一定的关系，这种关系使得它们可以按其预期的方式发挥功能。以一定方式放置与编码序列“可操作地连接”的调节序列例如启动子、增强子或其它表达调节信号，以便在与这些控制序列相容的条件下编码序列能够得以表达。

载体可以是质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体，通常具备复制起点、任选地用于多核苷酸表达的启动子和任选地该启动子的增强子和/或调节基因。可以存在终止序列，也可以存在聚腺苷酸化序列。载体可以含有一个或多个选择标记基因，例如氨苄青霉素抗性基因（对于细菌质粒）或新霉素抗性基因（对于哺乳动物载体）。载体可以用于体外例如制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。它们可以包含两个或多个本发明多核苷酸，以便例如实现超量表达。

优选将编码本发明多肽的DNA序列作为表达盒（或结构）的一部分导入适当宿主中，在该表达盒(或结构)中该DNA序列与能够指导该DNA序列在此宿主细胞中表达的表达信号可操作地连接。对于使用表达结构转化适当宿主，转化方法是现成的并是本领域技术人员熟知的^3，4。可以将表达结构作为携带选择标记的载体的一部分用于转化宿主，或可以将表达结构作为一个独立的分子与携带选择标记的载体一起进行共转化。该载体可以包含一个或多个选择标记基因。

优选的选择标记^15,16包括但不限于弥补宿主细胞缺陷或赋予药物抗性的那些。它们包括例如可以用于大多数丝状真菌和酵母的转化的多种标记基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(来自构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、或黑曲霉(A.niger)的amdS、niaD、facA基因或cDNA)、或提供抗生素抗性如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)的基因。或者，可以使用特异的选择标记如要求相应突变宿主株的营养缺陷型标记：例如URA3(来自酿酒酵母(S.cerevisiae)，或来自其它酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自构巢曲霉或黑曲霉)、argB(来自构巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在一个优选实施方案中，在导入表达结构后选择标记从转化的宿主细胞中缺失，以致获得能够产生该多肽且不带有选择标记基因的转化宿主细胞^21,22。

其它标记包括ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(pvrA)，细菌G418抗性基因(这也可以用于酵母，但不能用于真菌)，氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌(E.coli))，新霉素抗性基因(芽孢杆菌(Bacillus))，和编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。载体可以用于体外例如制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。

对于大多数丝状真菌和酵母，载体或表达结构优选整合在宿主细胞基因组中以便获得稳定转化体。然而，对于某些酵母，也可获得适当的附加型载体，可以将表达结构并入其中以实现稳定和高水平的表达，其例子包括分别来源于糖酵母和克鲁维酵母属的2μ和pKD1质粒的载体，或含有AMA序列(例如来自曲霉属的AMA1^3，20)的载体。在表达结构整合在宿主细胞基因组中的情况下，这些结构可以整合在基因组中的随机位点，或通过同源重组整合在预先确定的靶位点，在此情况下靶位点优选包含高效表达的基因。高效表达的基因是指该基因的mRNA例如在诱导条件下可以占总细胞mRNA的至少0.01%(w/w)，或者是该基因的基因产物可以占总细胞蛋白质的至少0.2%(w/w)，或者对于分泌型基因产物，该基因产物可以分泌达到至少0.05g/l水平。

用于指定的宿主细胞的载体或表达结构可以包含如下元件，它们可操作地按连续顺序从5’末端至3’末端（相对于编码本发明多肽的序列的编码链而言）彼此连接：

(1)能够指导编码多肽的DNA序列在指定宿主细胞中转录的启动子序列；

(2)任选地，能够指导多肽自指定宿主细胞分泌至培养基中的信号序列；

(3)编码成熟多肽、优选活性形式的多肽的DNA序列；和优选地还有

(4)能够使转录在编码多肽的DNA序列的下游终止的转录终止区(终止子)。

在编码多肽的DNA序列的下游可以有含有一个或多个转录终止位点(例如，终止子)的3’非翻译区。终止子的起点不大关键。该终止子可以例如是编码该多肽的DNA序列本身的。然而，优选在酵母宿主细胞中使用酵母终止子，而在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，该终止子是宿主细胞（其表达编码该多肽的DNA序列）的内源终止子。

还可以通过选择异源调节区如启动子、分泌前导序列和/或终止子区增强编码本发明多肽的多核苷酸的表达，其中所述异源调节区可以用于增加表达并且如果期望的话，增加目的蛋白自表达宿主向外分泌的水平和/或为本发明多肽表达提供可诱导控制。

除了编码本发明多肽的基因本身的启动子外，还可以使用其它启动子指导本发明多肽的表达。可以对启动子进行选择以便有效地指导本发明多肽在期望的表达宿主中表达。

可以选择启动子/增强子和其它表达调节信号以便与设计用于该表达载体的宿主细胞相容。例如，可以使用原核启动子，尤其是那些适用于大肠杆菌菌株的启动子。当在哺乳动物细胞中进行表达时，可以使用哺乳动物启动子。也可以使用组织特异性启动子，例如肝细胞特异性启动子。也可以使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠类白血病毒长末端重复(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40(例如大T抗原)启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、单纯疱疹病毒启动子或腺病毒启动子、HSV启动子如HSV IE启动子、或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。酵母启动子包括酿酒酵母GAL4和ADH启动子，栗酒裂殖糖酵母(S.pombe)nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括可以响应重金属如镉得以诱导的金属硫蛋白启动子和β-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子，尤其是内皮或神经元细胞特异性启动子（例如DDAHI和DDAHII启动子），是特别优选的。

可以使用能够在本发明宿主细胞中指导转录的多种启动子^15,16。优选启动子序列来源于之前定义的高效表达基因。启动子优选来源的和/或包含在用于整合表达结构的优选预先确定靶位点中的优选高效表达基因的例子，包括但不限于编码糖酵解酶例如丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。适当的高效表达基因的具体例子包括例如来自克鲁维酵母属种的LAC4基因、分别来自汉逊氏酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属(Pichia)的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、来自黑曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)基因、米曲霉的TAKA淀粉酶基因、构巢曲霉gpdA基因和T.reesei纤维二糖水解酶基因。

优选用于真菌表达宿主的强组成型和/或诱导型启动子的例子^15,16是可从编码木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP合成酶亚基9(oliC)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、α淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG－来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因获得的那些。

强酵母启动子的例子是可从编码醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸异构酶的基因获得的那些。

强细菌启动子的例子是α-淀粉酶和SPo2的启动子以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。

适于植物细胞的启动子包括napaline合成酶(nos)、章鱼碱合成酶(ocs)、甘露碱合成酶(mas)、核酮糖小亚基(核酮糖二磷酸羧化加氧酶ssu)、组蛋白、水稻肌动蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花叶病毒(CMV)35S及19S、和环状病毒的启动子。所有这些启动子均是本领域容易得到的。

载体还可以在产生RNA的多核苷酸的侧翼包括含有与真核基因组序列，尤其是哺乳动物基因组序列，或病毒基因组序列同源的序列的序列。这使得可以通过同源重组将本发明多核苷酸引入真核细胞或病毒的基因组中。具体地，可以使用包含侧翼为病毒序列的表达盒的质粒载体制备适于将本发明多核苷酸递送至哺乳动物细胞的病毒载体。适宜的病毒载体的其它例子包括单纯疱疹病毒载体^18,19和逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒和HPV病毒(例如HPV-16或HPV-18)。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。例如，可以使用逆转录病毒稳定地使产生反义RNA的多核苷酸整合在宿主基因组中。相反，复制缺陷型腺病毒载体保持为附加体形式，由此允许进行瞬时表达。

载体可以含有按反义方向取向的本发明多核苷酸以便产生反义RNA。如果期望的话，这可以用于减少多肽表达的水平。

宿主细胞和表达

在再一方面，本发明提供制根据本发明多肽的方法，包括在利于(载体)表达编码该多肽的编码序列的条件下培养宿主细胞(例如使用上述表达载体转化的或转染的)，和任选地回收表达的多肽。可以将本发明多核苷酸并入重组可复制载体如表达载体中。该载体可以用于在相容宿主细胞中复制该核酸。因此，在再一实施方案中，本发明提供通过如下方式制备本发明多核苷酸的方法：将本发明多核苷酸导入可复制载体中，将该载体引入相容宿主细胞，然后在造成载体复制的条件下培养该宿主细胞。可以从宿主细胞中回收载体。适当的宿主细胞包括细菌如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，如昆虫细胞如Sf9细胞和(例如丝状)真菌细胞。

优选地，多肽以分泌蛋白形式产生，在此情况下编码多肽成熟形式的DNA序列在表达结构中与编码信号序列的DNA序列可操作地相连。优选地，该信号序列是编码该多肽的DNA序列自身的（同源的）。或者，该信号序列对于编码该多肽的DNA序列而言是外来的（异源的），在此情况下信号序列优选对于表达该DNA序列的宿主细胞而言是内源的。对于酵母宿主细胞适当的信号序列的例子是来源于酵母α因子基因的信号序列。类似地，对于丝状真菌宿主细胞，适宜的信号序列是例如来源于丝状真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因，如黑曲霉glaA基因的信号序列。这可以和淀粉葡糖苷酶(又称(葡糖)淀粉酶)启动子本身组合使用，以及和其它的启动子组合使用。根据本发明上下文还可以使用杂合信号序列。

优选的异源分泌前导序列是来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24个氨基酸版本，如来自曲霉属)、α-因子基因(酵母如糖酵母属和克鲁维酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的那些。

可以使用载体转化或转染上述适当的宿主细胞以实现本发明多肽的表达。该方法可以包括在利于载体表达编码该多肽的编码序列的条件下培养使用上述表达载体转化的宿主细胞。

因此，本发明的再一方面提供使用本发明多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞或包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，该多核苷酸由载体携带以便实现该多核苷酸的复制和表达。可以对细胞进行选择以便和所述载体相容，这些细胞可以是例如原核（例如细菌）、真菌、酵母或植物细胞。

也可以选择异源宿主，在该宿主中可以以基本上不含有其它纤维素降解酶的形式产生本发明多肽。这可以通过选择正常不产生这些酶的宿主如乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)来实现。

本发明包括通过重组表达编码本发明多肽的DNA序列制备本发明多肽的方法。为了此目的，可以将本发明DNA序列用于基因扩增和/或改变其表达信号如启动子、分泌信号序列，以便使得可以在适当的同源或异源宿主细胞中经济地产生该多肽。同源宿主细胞在本文中定义为这样的宿主细胞，其所属物种与DNA序列来源的物种相同或是相同物种中的变体。

适当的宿主细胞优选是原核微生物如细菌，或更优选真核生物如真菌，如酵母或丝状真菌、或植物细胞。一般地，酵母比真菌细胞更为优选，这是因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质难于从酵母分泌，或在某些情况下不能得到正确加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应当选择真菌宿主微生物。

宿主细胞可以超量表达多肽，用于实现超量表达的技术是熟知的³。因此，宿主可以具有一个或多个拷贝的编码多核苷酸(而且因此载体可以具有两个或多个拷贝)。

芽孢杆菌属细菌极为适宜作为异源宿主，因为它们能够将蛋白质分泌至培养基中。其它适宜作为宿主的细菌是链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)的那些细菌。用于表达编码本发明多肽的DNA序列的优选酵母宿主细胞是糖酵母属、克鲁维酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤酵母属、Yarrowia和裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母细胞。更优选地，酵母宿主细胞选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳克鲁维酵母(又称作Kluyveromyces marxianus var.lactis)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Yarrowia lipolytica和栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

然而，最优选（如丝状）真菌宿主细胞。优选的丝状真菌宿主细胞选自：曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢属(Fusarium)、Disporotrichum、青霉属(Penicillium)、支顶孢属(Acremonium)、链孢霉属(Neurospora)、热子囊菌属(Thermoascus)、毁丝菌属(Myceliophtora)、孢子丝菌属(Sporotrichum)、草根霉属(Thielavia)、和踝节菌属(Talaromyces)。更优选地，丝状真菌宿主细胞是米曲霉(Aspergillusoyzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、构巢曲霉的种、或黑曲霉组的种(按Raper和Fennell的定义，曲霉属(The Genus Aspergillus)，The Williams& Wilkins Company,Baltimore,pp293-344,1965)的细胞。这些包括但不限于黑曲霉、泡盛曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、构巢曲霉、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉和无花果曲霉(Aspergillus ficuum)，并还包括物种Trichoderma reesei、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichumcellulophilum、Disporotrichum dimorphosporum和Thielavia terrestris。

本发明范围内的优选表达宿主的例子是真菌如曲霉属种(描述于EP-A-184,438和EP-A-284,603)和木霉属种；细菌如芽孢杆菌属种(描述于EP-A-134,048和EP-A-253,455)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，假单胞菌属种；和酵母如克鲁维酵母属种(描述于EP-A-096,430，例如EP-A-301,670中的乳克鲁维酵母)和糖酵母属种如酿酒酵母。

根据本发明的宿主细胞包括植物细胞，因此本发明延伸至含有一个或多个本发明细胞的转基因生物，如植物和其部分。这些细胞可以异源地表达本发明多肽或可以异源地含有一个或多个本发明多核苷酸。因此，该转基因(或遗传修饰的)植物可以在其基因组中插有编码一个或多个本发明多肽的序列。植物细胞的转化可以使用已知技术，例如使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti或Ri质粒来进行。因此，该质粒(或载体)可以含有感染植物所必需的序列，并且可以使用Ti和/或Ri质粒的衍生物。

或者，可以直接感染植物的一个部分，如叶、根或茎。在此技术中可以通过例如用刀片切割植物或针刺植物或使用研磨剂摩擦植物以损伤待感染的植物。然后将农杆菌(Agrobacterium)接种在伤口处。然后在适当的培养基中培养此植物或植物部分，并允许其发育为成熟植株。可以使用已知技术，例如通过使用抗生素选择转化苗并通过在含有适当养料、植物激素等的培养基上继代培养这些苗¹⁷，使转化细胞再生为遗传修饰的植物。

宿主细胞培养和重组制备

本发明还包括经修饰表达β-葡聚糖酶或其变体的细胞。这些细胞包括瞬时或优选稳定的高等真核细胞系，如哺乳动物细胞系或昆虫细胞系、低等真核细胞，例如酵母和(例如丝状)真菌细胞、或原核细胞如细菌细胞。

也可以在细胞系中或细胞膜上，如在杆状病毒表达系统中瞬时表达本发明蛋白质。适用于表达本发明蛋白质的这些系统也包括在本发明范围内。

根据本发明，可以通过在常规营养发酵培养基中培养用一个或多个本发明多核苷酸转化的微生物表达宿主来制备本发明多肽。

根据本发明的重组宿主细胞可以使用本领域已知方法培养。对于启动子和宿主细胞的每种组合，利于编码该多肽的DNA序列表达的培养条件是现成的。在达到期望的细胞密度或多肽滴度后，终止培养并使用已知方法回收该多肽。

发酵培养基可以包括含有碳源(如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、纤维素、β-葡聚糖等)、氮源(例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等)、有机氮源(例如酵母提取物、麦芽汁、蛋白胨等)和无机营养源(例如磷酸、镁、钾、锌、铁等)的已知培养基。任选地，可以包括诱导物(例如纤维素、β-葡聚糖、麦芽糖或麦芽糖糊精)。

适当培养基的选择可以基于对表达宿主的选择和/或基于调节表达结构的必要条件来进行。该培养基是本领域技术人员已知的。如果期望的话，该培养基可以含有利于转化的表达宿主生长超过其它潜在的污染微生物的其它成分。

发酵可以进行0.5至30天。其可以是分批、连续或补料分批发酵，适当的温度在0至45℃范围内，并且pH在例如2和10之间。优选的发酵条件是20至37℃的温度和/或3至9的pH。适宜的条件通常是基于对表达宿主的选择和待表达的蛋白质来选择的。

发酵后，如有必要，可以从发酵培养物中通过离心或过滤除去细胞。终止发酵后或除去细胞后，可以回收本发明多肽，并在期望时通过常规手段对其进行纯化和分离。

D．多肽的用途和加工植物或含纤维素的材料的方法

具有β-葡聚糖酶(或纤维素酶)活性的本发明多肽可以用于处理真菌或植物材料，包括植物浆状物和植物提取物。例如，可以使用它们处理谷物、蔬菜、果实或其提取物。它们可以用于洗涤组合物(液体或固体，如粉末)和/或去污剂组合物中。方便地，可以将本发明多肽与适宜的(固体或液体)载体或稀释剂(包括缓冲液)组合以产生组合物/酶制剂。可以使多肽与载体结合或混合，例如固定在固相载体上。因此，在再一方面，本发明提供包含本发明多肽的组合物。这可以优选在保持葡聚糖酶活性的情况下，采取适于包装、运输和/或储存的形式。组合物包括糊、液体、乳剂、粉末、薄片、颗粒、小球或其它压出物形式。

组合物还可以包含其它成分如一种或多种酶、例如果胶酶，包括(如内切)阿拉伯聚糖酶（arabinanase）和鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、其它纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶和/或木葡聚糖酶。该多肽典型地被稳定地配制为液体或干燥形式。典型地，以任选地包括如稳定缓冲液和/或防腐剂的组合物形式制备该产品。组合物还可以包括其它能够消化植物材料或纤维素的酶，如其它纤维素酶,如(β-D)-葡聚糖酶。对于某些应用，将酶固定在固相基质上或整合在固相支持物颗粒上或之中可能是优选的。组合物还可以包括多种其它降解植物材料的酶，如(其它)纤维素酶和其它果胶酶。

因此，可以在加工植物材料的方法中使用本发明多肽和组合物以降解或修饰植物或真菌材料细胞壁的纤维素成分(如β-D-葡聚糖)。因此，在再一方面，本发明提供降解或修饰植物细胞或纤维素的方法，该方法包括使植物、真菌细胞或纤维素和本发明多肽或组合物接触。

本发明还提供加工植物材料的方法，该方法包括使植物材料和本发明多肽或组合物接触以降解或修饰植物材料中的纤维素。优选地，植物材料是植物浆状物或植物提取物。

具体地，所述降解优选包括切割植物细胞壁的纤维素成分中的β-葡聚糖亚单位。植物材料优选是谷物、蔬菜、果实、或蔬菜或果实的浆状物或提取物。本发明还提供经过加工的植物材料，其可通过植物材料和本发明多肽或植物的接触获得。

本发明还提供降低植物提取物的粘度的方法，该方法包括以对于降解植物提取物中所含纤维素(或β-D-葡聚糖)而言有效的量使用本发明多肽或组合物来接触植物提取物。

植物和含有纤维素的材料包括植物浆状物、植物的部分和植物提取物。在本发明上下文中，来自植物材料的提取物是可以通过提取(机械和/或化学)、加工或通过其它分离技术从植物材料获得的任何物质。所述提取物可以是汁、蜜、基料(base)、或由其制备的浓缩物。该多肽可以在例如(果)汁的制备中用于(例如总的)液化和/或(进一步的)软化。植物材料可以包含或来源于蔬菜，例如胡萝卜、芹菜、洋葱、豆类或豆科植物(如黄豆、大豆、豌豆)，或果类，例如梨果或果实(苹果、梨子、温柏等)、葡萄、西红柿、柑橘类植物(桔子、柠檬、酸橙、橘子)、瓜、李子、樱桃、红醋栗、红浆果、悬钩子、草莓、酸果蔓、凤梨和其它热带水果，树木和其部分(例如松树的花粉)，或谷物(燕麦、大麦、小麦、玉米、水稻)。

因此，可以使用本发明多肽处理植物材料，包括植物浆状物和植物提取物。还可以使用它们处理液体或固体食物或可食用的食物成分。

典型地，将本发明多肽作为上述组合物/酶制剂使用。组合物一般被加入通过例如机械加工如碾碎或研磨植物材料可获得的植物浆状物中。典型地使组合物和植物一起孵育10分钟至5小时，如30分钟至2小时，优选地约1小时。处理温度优选为10至55℃，例如15至25℃，最适约20℃，并且对于每吨待处理的材料，可以使用10至300g、优选30至70g，最佳约50g酶。所用的所有酶或其组合物可以相继地或同时地加入植物浆状物中。根据酶制剂的组成，可以首先浸软(例如成泥)或液化植物材料。使用本发明多肽时，可以改进处理参数，如提取的产量、提取物的粘度和/或提取物的质量。

作为替代方案，或除以上之外，可以将本发明多肽加入挤压或液化植物浆状物后得到的原汁中。在剂量、温度和处理持续时间方面，与处理植物浆状物相似的方式处理此原汁。再有，可以将诸如之前讨论的其它酶包括在内。典型的孵育条件参见前段。一旦将原汁与本发明多肽一起孵育后，可对该汁液进行离心或(超)过滤以产生终产物。

含有本发明多肽的组合物还可以在制备果泥或菜泥的过程中使用。

本发明多肽还可以用于酿造、酿酒、蒸馏、烘焙过程。因此，可以将其用于制备酒精饮料如酒和啤酒，例如以提高酒的过滤性或澄明度。在烘焙过程中，本发明多肽可以改善生面团的结构、改变其粘性或柔性、改善面包块体积和/或面包瓤结构。

本发明多肽可以用于酿造。酿造过程中，包括过度修饰的麦芽的一系列糖化物(mash-bill)中，由于存在高温下释放的β-葡聚糖，会出现过滤问题。麦芽汁过滤速度的减慢将是面临到的一个主要问题。其它问题有终啤酒中的胶体稳定性和浊雾的形成。这些可由相同的糖复合物造成，尤其是在高比重酿造过程中。本发明多肽能够提高例如糖化后的麦芽汁的过滤性。以此方式，可以使在废弃谷粒中留下较少的麦芽汁液，由此可以提高提取物的产量。较为有效的过滤可以增加酿酒厂的效率。因此，一般地，本发明多肽可以用于提高(如最终)啤酒的过滤性或过滤速度。

本发明多肽还可以预防或至少减少啤酒制造过程中薄雾的形成。存在于谷物胚乳壁中的β-葡聚糖会被带入终啤酒中。这可造成薄雾和混浊。本发明多肽可以预防或至少减少由β-葡聚糖水解引起的颗粒聚集。因此，本发明多肽可以用于增加(如终)啤酒的胶体过滤性

本发明多肽由于其葡聚糖酶活性可以用于多种工业领域。这些可以不仅包括酒的生产，还包括生物产甲烷、啤酒制造和烘焙、牙齿保健(例如牙齿或口腔组合物)、织物、衣料的处理或皮革制造、造纸、医疗、茶、纺织品的制备或处理、去污剂或洗涤组合物、以及废物处理。因此，本发明一方面是包含该多肽的食物或食品，如酒精饮料、面包、生面或茶。可以将该多肽配制成适宜其中任何一种用途的组合物。该多肽可以存在于含水组合物(例如热水)中，优选与一种或多种杀真菌剂一起存在，用于处理植物材料(例如球茎)以便尤其是控制寄生昆虫、螨虫和线虫。

由于本发明多肽可以降解葡聚糖，因此可以将其加入食物或食品中(例如通过人食用的方式)。已知可溶性β-D-葡聚糖与降低血清胆固醇和甘油三酯有关，因此本发明多肽可以用于降低人或动物，例如高脂血症个体的血清胆固醇和甘油三酯水平。因此，本发明包括包含本发明多肽和可药用或可兽医用载体的药用组合物和兽医用组合物。故可以使用该多肽制备预防或治疗高脂血症、或高血清胆固醇和甘油三酯水平或由其导致的紊乱的药物。

本发明多肽还可以表现出抗真菌活性。由于它们能够降解真菌细胞壁，因此可以用于溶解真菌细胞壁，以便裂解这些细胞。这样可以释放细胞内蛋白质。以此方式，该多肽可以用于制备酵母和/或真菌提取物。

E.动物饲料

本发明还涉及包含一种或多种本发明多肽的食品或动物饲料组合物。多肽可以在此饲料中以不同于其天然浓度的浓度存在。优选的量为每kg饲料0.1至100，如0.5至50，优选1至10mg。

本发明还涉及制备动物饲料组合物的方法，该方法包括将本发明多肽加入一种或多种可食用饲料物质或成分中。多肽可以与这些饲料物质或成分分开，单独地或与其它饲料添加剂组合，加入动物饲料组合物中。多肽可以是其中一种饲料物质或成分的一个整体部分。

还可以将本发明多肽加入富含纤维素的动物饲料中以提高植物细胞壁的崩解，由此提高动物对此植物养料的利用。在优选使用预先浸泡的或润湿的食物时，可以将本发明多肽加入饲料或青贮饲料中。有利的是，本发明多肽可以在体内连续降解饲料中的纤维素。尤其是，真菌来源的本发明多肽一般具有较低的最适pH，能够在诸如动物胃这样的酸性环境中释放重要的养料。因此，本发明还考虑包含一种或多种本发明多肽的(如动物)饲料或食品。

本发明多肽还可以用于从大豆中制备奶替代品(或代替物)的过程。这些奶替代物既可以为人也可以为动物食用。在制备这些奶替代物的过程中典型的问题是大豆浆的高粘度，这导致需要对此浆液进行稀释以达到10％至15％干固体的浓度，但这种稀释是不希望有的。可以将含有本发明多肽的酶制剂加入此浆液中，或在此浆液的制备过程中加入，以便允许以较高的浓度(典型地40至50％干固体)进行加工。该酶还可以用于从例如大豆制备开胃物。

组合物还可以包含(尤其是在用于配制动物饲料时)一种或多种离子载体、氧化剂、表明活性剂、瘤胃保护氨基酸(rumen protected aminoacids)、酶增强剂或可以在待饲喂动物的胃肠道中天然产生的酶。

当加入反刍动物或单胃动物(例如家禽或猪)的饲料(包括青贮饲料)中时，该饲料可以包含谷物如大麦、小麦、玉米、黑麦或燕麦，或谷物副产品如小麦麸皮或玉米麸皮，或其它植物材料如大豆和其它豆科植物。这些酶可以显著地提高植物细胞壁的崩解，导致动物更好地利用该植物养料。由此，可以提高生长速度和/或饲料的转化。可以将本发明多肽加入饲料中(直接地或作为添加剂或成分)，或者作为替代可以加入处理过的纤维素(例如葡聚糖)。

用于（外源性）添加β-葡聚糖酶的一个尤其优选的方法是将本发明多肽作为转基因植物材料和/或(如转基因)种子加入。由此，可以通过异源基因表达来合成该多肽，例如可以将编码期望酶的基因克隆在植物表达载体中位于适当植物表达信号(如组织特异性启动子，如种子特异性启动子)的控制之下。随后可以用含有编码该多肽的基因的表达载体转化植物细胞，并选择转化的细胞以再生出全株。可以培养由此获得的转基因植物并收获之，然后可以将含有此异源(对于植物而言)多肽的那些植物部分就此或在进一步加工后包括在其中一种组合物中。在(转基因)植物中(异源)表达酶的一般方法，包括用于酶的种子特异性表达的方法是已知的²³。异源多肽可以包含在转基因植物的种子中，或可以包含在其它植物部分如根、茎、叶、木质部、花、树皮和/或果实中。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。适宜的植物包括谷物如燕麦、大麦、小麦、玉米和水稻。优选地，本发明多核苷酸稳定地整合在植物基因组中。

以转基因植物材料，例如转基因种子的形式添加本发明多肽可能要求对此植物材料进行加工，以便使该酶可以被利用，或至少提高其利用率。该加工技术可以包括各种机械(例如研磨和/或碾碎)技术或热机械处理如挤出或膨胀。

因此，本发明还涉及促进单胃或非瘤胃动物的生长和/或饲料转化的方法，该方法包括用本发明多肽饲喂该动物。适宜的动物包括单胃和/或非瘤胃家畜，如猪(或小猪)、家禽(如家鸡、火鸡)、牛或菜牛、或水生(如海洋)动物(例如鱼)。

用于纤维素降解酶的分析实验

本发明还包括根据本发明的多肽在筛选方法中的用途，以鉴定可以用作能调节β-葡聚糖酶的激动剂或拮抗剂的化合物。一般而言，这些筛选方法可以包括使本发明多肽与测试化合物接触然后测量活性、或将本发明多肽与测试物质一起孵育然后检测对β-葡聚糖酶活性的任何调节。与本发明多肽结合的药剂还可以通过结合分析实验鉴定。

调节物的活性可以通过使表达本发明多肽的细胞与物质在研究下接触，然后通过监测该多肽介导的效果来确定。表达该多肽的细胞可以是体外的，并且优选使用表达重组多肽的细胞在体外进行该分析试验。

本文所述分析试验和底物使得可以鉴定和验证β-葡聚糖酶的活性。然而，也可以使用这些分析试验检测其它纤维素降解酶，无论其是否具有β-葡聚糖酶活性。用于此分析试验的底物可以包含β-葡聚糖。

本发明另一方面涉及用于鉴定或检测能够降解纤维素的多肽的分析方法。该活性可以是葡聚糖酶(例如β-葡聚糖酶)或纤维素酶或木葡聚糖酶。该分析方法可以包括：

(a)提供前段描述的底物作为候选化合物(通常是肽)的底物；和

(b)使该底物和候选化合物接触，并检测是否产生了任何碳水化合物。

可以测量这些碳水化合物的量。如果必要的话，然后可以将其与缺少候选化合物的对照试验中产生的碳水化合物的量作比较。

上述分析方法可以用于鉴定β-葡聚糖酶活性的调节物。

本发明一方面的优选特征和性质加以必要的变更可以适用于另一方面。

现参考如下实施例描述本发明，这些实施例仅旨在用于举例说明而非进行限制。

实施例

一般方法

标准分子克隆技术如DNA分离、凝胶电泳、核酸的限制性酶修饰、Southern分析、大肠杆菌转化、菌落转移和滤膜杂交等，均使用标准技术1，2进行。合成的寡脱氧核苷酸从ISOGEN Bioscience(Maarssen,TheNetherlands)获得。DNA序列分析在Applied Biosystems 373A DNA测序仪上根据供应商说明书进行。

DNA标记和杂交按照ECL^TM直接核酸标记和检测系统(AmershamLIFE SCIENCE,Little Chalfont,英国)或根据标准放射性标记技术¹进行。

实施例1：从T.emersonii分离RNA并合成cDNA

在诱导纤维素酶的条件下培养T.emersonii菌株CBS 393.64。在几个时间点上使用Miracloth过滤包通过过滤收获菌丝体和培养物上清液。用软化水彻底洗涤菌丝体并在纸巾之间挤压以除去多余的水。将所选时间点(基于对培养物上清液中纤维素酶的测量)收获的菌丝体立即冰冻在液氮中，使用研钵和槌将其研成细碎粉末。将所获粉末转移至无菌50ml管中并称重：对于每1至1.2g研碎的菌丝体，加入10ml TRIzol试剂(Gibco/BRL)(每管最多25ml)。立即剧烈混合(涡旋，1min)使菌丝体粉末溶解，之后室温下孵育5分钟，中间不时混合一下。加入0.2(最初的TRIzol)体积的氯仿(因此对于最初使用的每10ml TRIzol为2ml)，涡旋并置于室温10分钟。随后，4℃，6000g离心混合物30分钟。将顶端水相转移至新管中并加入0.5(最初的TRIzol)体积的异丙醇(因此对于最初使用的每10ml TRIzol为5ml)以沉淀总RNA。室温沉淀10分钟后，通过6000g离心30分钟回收RNA。除去上清液后，用一倍体积的70％乙醇洗涤RNA沉淀。除去乙醇后，空气干燥RNA沉淀。然后将干燥的RNA沉淀溶解在3ml GTS(100mM Tris-Cl,pH 7.5,4M硫氰酸胍，0.5%十二烷基肌氨酸钠)缓冲液中。使用10μl RNA溶液确定核酸的质量和浓度。

进行Northern分析³并进一步纯化分离的RNA^1,3。对于mRNA的分离，使用PHARMACIA纯化试剂盒(Cat no.27-9258-02)的改进程序³(使用重力流动而非离心)。对于cDNA的合成，使用STRATAGENEcDNA合成试剂盒根据厂商说明书进行，但针对使用pGBFIN载体进行了许多优化，其中的主要改变见前述³。

通过TCA沉淀以及随后通过电泳在碱性琼脂糖凝胶中电泳进行分析³，估计合成的cDNA量。

实施例2：从T.emersonii的mRNA制备cDNA文库

将实施例1获得的cDNA库平端化，与接头连接并作限制性酶消化³

将此cDNA克隆在表达载体pGBFIN-11(对于该载体的构建见WO-99/32617)需要cDNA在5’末端存在一个EcoRI位点并在3’末端存在一个XhoI位点。因此，对所用的第一链引发寡核苷酸和接头序列(Pharmacia)进行选择以满足为该表达载体设定的先决条件。

获得的cDNA通过SEPHAROSE CL-2B基质作大小分级分离，通过非变性凝胶电泳分析所获各个库的大小³。选择分别通过0.5kb和1.0kb截断值获得的两个cDNA库用于在pGBFIN-11中构建cDNA库。对于pGBFIN-11，制备完全双消化(EcoRI-XhoI)的pGBFIN-11载体库（背景连接<1%）。将所选cDNA库连接至pGBFIN-11载体中，转化大肠杆菌XL 10-Gold细菌细胞以产生两个初步的cDNA文库。所述两个库的转化频率均大于1.0×10⁶。从两个大肠杆菌cDNA文库的一小部分，随机选择菌落并分离质粒DNA。对该质粒DNA的分析证实两个cDNA文库均具有90至95％的插入百分数。

此外，对一部分文库进行菌落转移，接着用T.emeresonii gpdA基因(编码甘油醛3-磷酸脱氢酶)与产生的滤膜杂交。接着，分离质粒DNA并通过限制性分析试剂盒验证所有的质粒均含有正确方向的单个插入片段。对这些含有T.emersonii gpdA的质粒中的cDNA 5’末端进行测序，证实>85%的是全长。

实施例3：用表达文库转化黑曲霉

从前述大肠杆菌cDNA文库中分离DNA。37℃用NotI消化总质粒DNA 4小时以除去来源于大肠杆菌的质粒序列。纯化后，将DNA溶解在无菌软化水中。

每个转化使用1.5×10⁷ B 3.0×10⁷原生质体和10μg质粒DNA，进行了多个黑曲霉DS2978转化³。通过在乙酰胺作为唯一N源的培养基上的生长，选择存在amdS选择标记的转化体。由于amdS选择标记和cDNA表达盒存在于此一体性片段上，因此在乙酰胺上的生长就指示了cDNA表达盒的存在。

30℃下大约7至10天孵育后，纯化10,000个转化体：利用机器人(FlexysJcolony自动采集器)将黑曲霉转化体从转化平板转移至96孔MTP母板(MP)，板的每个孔中含有150μl固化的选择培养基(SM)(每1000ml：0.52g KCl,1.52g K₂HPO₄,0.52g MgSO₄,20g葡萄糖,1g乙酰胺,0.1M MES缓冲液,15g琼脂,1ml痕量元素溶液[痕量元素溶液(每1升含有):2.2g ZnSO₄/7H₂O,1.1g H₃BO₃,0.5g FeSO₄/7H₂O,0.17gCoCl₂/6H₂O,0.16g CuSO₄/5H₂O,0.15g NaMoO₄/2H₂O,5.0g EDTA,pH6.5]pH 5.5)。转化体于34℃生长在SM上5天。由此产生的MP组被用于1)接种MTP用于培养和随后的酶检测，和2)制备此cDNA文库的备份板(BP)，储存在－80℃。

实施例4：分析T.emersonii表达文库

使用生长5天的MP作为复制模板，将复制物铺在新鲜的选择培养基(SM)板上，该培养基每升含有：0.52g KCl,1.52g K₂HPO₄,0.52gMgSO₄,20g葡萄糖,1g乙酰胺,0.1M MES缓冲液,15g琼脂,1ml痕量元素溶液[痕量元素溶液(每1升含有):2.2g ZnSO₄/7H₂O,1.1g H₃BO₃,0.5g FeSO₄/7H₂O,0.17g CoCl₂/6H₂O,0.16g CuSO₄/5H₂O,0.15gNaMoO₄/2H₂O,5.0g EDTA,pH 6.5]pH 5.5。

接种后，将平板在34℃孵育48小时。随后用含有羧甲基纤维素(CMC)的顶端琼脂(5g琼脂糖，0.5g CMC(Sigma ref C4888)，在1000ml 50mM磷酸缓冲液pH 7中制备的)将这些平板覆盖。在顶端琼脂固化后，将平板置于65℃下4小时。为了观察活性，用Congo红溶液(1000ml磷酸缓冲液pH 7中10g Congo红)染色平板15分钟。丢弃染色液，用1M NaCl(1升蒸馏水中58.44g)洗涤平板。重复此后一步骤两次。在红色背景上阳性克隆表现为形成浅的透明晕。

将来自此第一轮筛选的阳性纤维素酶克隆（congo红筛选后表现为透明晕）再次接种在新鲜SM培养基上，并在34℃培养5天。然后将由此获得的模板复制在含有0.075%(w/v)AZCL纤维素(Megazyme产品目录I-AZCEL)的选择培养基上。SM平板按先前方法(34℃培养，随后通过含有纤维素的覆盖物和Congo红染色进行筛选)处理并进行评分，而SM-AZCEL-纤维素平板在34℃孵育48小时，然后进一步在65℃孵育8小时。在高温孵育前后对SM-AZCL-纤维素平板评分。阳性纤维素酶克隆导致扩散的蓝色晕。

最后，鉴定到20个阳性纤维素酶克隆。将按木聚糖酶平板分析方法鉴定到的产生纤维素酶的曲霉菌转化体，在摇瓶发酵³中培养。发酵5天后取培养基样品，按之后描述的方法分析纤维素酶活性。

实施例5：阳性转化体的遗传分析

将鉴定的阳性(再次证实的)转化体培养在液体培养基上，收获菌丝体并通过用于从丝状真菌分离DNA的Puregene分离系统(Biozym B.V.)分离总(染色体)DNA。DNA的分离和纯化按照供应商的操作指南进行，但其中稍作修改：重复蛋白质沉淀步骤3和4。

使用染色体DNA作为模板，在PCR反应中应用引物12207(SEQ IDNO:8)和11937(SEQ ID NO:7)扩增整合在染色体DNA中的表达盒内存在的插入片段。

根据已知程序的改良版本⁴，其中随后用5mg/ml GlucanexJ(NovoNordisk)代替NOVOzyme处理所获菌丝体，对转化体直接进行PCR。

PCR反应含有eLONGase^TM B缓冲液(Life Technologies,荷兰),dNTP(各200μM)，1μl eLONGase^TM酶混合物，1-5μl模板，和每种寡核苷酸各10-30pmol，总体积50μl。对于每批购买物，通过实验确定寡核苷酸的最佳量。平均而言，使用10至30pmol。反应使用如下循环条件进行：1×(2min)94℃,35×(1min 94℃,1min 55℃,6min 72℃),1×(7min72℃)。将样品加载到琼脂糖凝胶上以便分析PCR产物。

由此获得的PCR产物亚克隆至大肠杆菌pcr2.1克隆载体(Invitrogen,根据供应商的说明书)，获得质粒pGBCEA-1。

对亚克隆的PCR产物测序。所得的编码区核苷酸序列描述在SEQ IDNO:1中，推导的蛋白质氨基酸序列描述在SEQ ID NO:2中。此蛋白质被命名为CEA。

实施例6：使用Hamilton粘度测量机器(Viscorobot)通过粘度测定法筛选cDNA表达文库

粘度测量

毛细粘度计是最为常用于测量粘性液体的粘度计类型。一般地，使目的液体在已经的压力差下流过毛细管。然后通常通过记录指定体积的液体通过刻度标记所花费的时间，测量流动速度。其它类型的毛细粘度计迫使液体以预先确定的流速通过毛细管，并测量由此产生的横跨毛细管的压力降，以确定液体的粘度。可以利用对聚合物粘性溶液的有控制的酶解来确定酶活性。倘若已知液体粘度和浓度之间的数量关系，则可以估计出动力学参数如Michaelis-Menten常数。

I．检测系统

(a)Hamilton粘度测量机器的配置

Hamilton吸量器(Hamilton Workstation Microlab 2200,Hamilton公司,Reno,USA)受称作Eclipse的软件程序(Hamilton公司)控制。该软件使得用户可以在Hamilton工作平台内指挥探测臂至某一确定位置。并开发了标准粘度测定Eclipse程序。该程序作用于96孔MTP，其中可以对每个孔进行独立访问。使用注射器通过针孔在Eclipse指定的位置吸入或分配样品液。吸入和分配速度(sec/ml)以及吸入和分配体积(μl)均按意愿指定。通过对搁物架进行定义，可以以有效而省时的方式访问多个试剂容器。指挥Eclipse用系统液体清洗管子，以避免将样品液从一个吸量步骤携带至下一步骤。10sec/ml(有时15sec/ml)的吸入速率对于通过观察峰高度区分大多数粘度是适合的。通常吸入和分配200至250μl的样品液。

(b)Hamilton的配置

样品液的吸入在装水的整个管子中造成压力降。压力降的大小取决于吸入(或柱塞运动)速度以及样品液的粘度。针尖处产生最大的压力降，这是由于此处的半径最小(约0.3mm)。样品液的吸入引起压力改变，此压力改变从T连接处被传递到压力换能器。换能器(Depex B.V.,de Bilt,荷兰)将压力减少的大小转化成电流。此电流由数据采集器以每秒一次的方式读取，并随后以数字形式存储在数据采集器的内存中。与数据采集器连接的计算机可以(通过Delogger软件)将数据采集器的内存下载为文件。接着，这些文件可以被普通电子制表程序(如Microsoft Excel)读取并分析。由于压力随时间进行测量，因此可以通过就时间(秒)对压力减少的大小(mV)作图，观察最终的输出。在将T连接处转移至针头右后位置处时，压力信号对吸入体积的依赖较小。

(c)标准曲线的制备使得可以确定任何液体的粘度

根据Poisseuille法则，测量到的压力降应与粘度直接成比例，因为

P = (mV) F = \frac{Q 8 η 1}{π r^{4}} = η \frac{1}{k}

其中

使用该公式，可以建立毫伏压力减少输出值与未知粘度样品液的关系。这是通过吸入指定的恒定体积的各种浓度标准液体(通常为甘油，因为它覆盖了一个宽范围的粘度并且其行为方式符合Newtonian方式)来实现的。由此产生的压力减少通过未知因子F与mV输出值相关。由于各种浓度甘油的绝对粘度是已知的，因此绘制多种已知浓度甘油的mV减压输出量相对相同甘油浓度的已知绝对粘度的图谱，产生通过原点的直线（因为P=(mV)*F=η/k）。

(d)用于全范围扫描(Full–Scale Screening)的Eclipse程序

单个测量循环由以10sec/ml吸入速度吸入250μl样品和上清液底物混合物组成。在吸入样品液之前，吸入40μl空气以将系统和样品液分隔开。一旦完成样品液的吸入后，对290μl样品和空气进行分配。该测量循环重复6次，之后为一个5ml的洗涤步骤以便清洗管子。

II．分析方法的发展

(e)为了进行筛选建立最佳的果胶和木聚糖底物混合物

一次使用一种以上的粘性底物有几个优点。这样可以同时筛选几种类型的酶，从而节约大量的精力和时间，并需要较少的底物。除了燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖外，我们决定使用果胶作为第二种底物。1％果胶和7%燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖的1:1溶液似乎最适宜进行筛选。由于按比例计算文库中存在极为少的阳性克隆，因此大多数峰具有约435mV的高度。对于阳性木聚糖酶样品，所有的或大多数的木聚糖被降解以致仅留下0.5%的果胶。因此，阳性木聚糖酶克隆产生280mV的峰高。对于果胶降解克隆，峰高为220mV。

(f)确定使用Hamilton粘度测量机器进行检测所必需的最小木聚糖酶活性

由于单个MTP孔容纳至多360μl，因此使用极为小量的底物和上清液进行筛选。而且，上清液加入越多，底物稀释越大，且初始粘度就降低得越多。将250μl 6％燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖分配至MTP孔中。制备参照木聚糖酶(塔宾曲霉木聚糖酶，活性685,400EXU/g,其中1EXU=4.53摩尔还原糖/min/g)的系列稀释物，向底物中加入各30μl的稀释物。50℃孵育24小时后，测量每个样品的粘度。最低可检测的酶浓度相应于53.6ng/ml或0.0367EXU/ml。因此，向300μl底物中加入20μl上清液将能够检测到极低的酶活性。

(g)设置筛选过程以鉴定热稳定酶

为了从文库中仅挑选出热稳定酶以及为了避免宿主黑曲霉的酶活性干扰，热处理带有含热稳定候选酶的克隆的平板。使用空宿主菌株、表达热敏性酶的宿主菌株和表达热稳定酶的菌株验证此系统。在菌株生长和酶产生后，将MTP平板置于72℃加热30分钟。随后向300μl 6%燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖中加入20μl上清液。连同阴性对照(加入20μl水)一起，将含有样品的平板用粘胶带密封，并在烘箱中60℃孵育。高温可以增加所有热稳定酶的活性，但破坏背景宿主黑曲霉酶的干扰活性以及文库表达的非热稳定酶的活性。孵育20小时后，对于热敏性木聚糖酶克隆没有发现显著的峰高降低，说明宿主的木聚糖酶活性完全被失活。此外，还将黑曲霉的热敏性木聚糖xynB的克隆包括在内作为对照。在此情况下，未能检测到任何残余活性，而另一方面包括在内作为对照的耐热性木聚糖酶仍具有活性。72℃热失活30分钟以及24小时或较少的样品孵育时间使得我们可以特异地检测热稳定T.emersonii木聚糖酶。

III．使用Hamilton粘度测量机器筛选cDNA表达文库

(h)cDNA表达文库的复制和文库的表达

一个复制循环包括在选择培养基(SM)(每升含有：0.52g KCl,1.52gK₂HPO₄,0.52g MgSO₄,20g葡萄糖,1g乙酰胺,0.1M MES缓冲液,15g琼脂,1ml痕量元素溶液[痕量元素溶液(每升):2.2g ZnSO₄/7H₂O,1.1gH₃BO₃,0.5g FeSO₄/7H₂O,0.17g CoCl₂/6H₂O,0.16g CuSO₄/5H₂O,0.15gNaMoO₄/2H₂O,5.0g EDTA,pH 6.5]pH 5.5)和液体生长培养基(GM)(每升含有：70g葡萄糖,25g酪蛋白水解酶,12.5g酵母提取物,1g KH₂PO₄，0.5g K₂SO₄,2g MgSO₄,0.03g ZnCl₂，0.02g CaCl₂,0.01g MnSO₄，0.3gFeSO₄,pH 5.6)中的两次接种。文库储存在标准的MTP中，其中形成孢子的重组黑曲霉菌落在每个孔中在SM上10％甘油存在下生长。储存期间，这些平板(母板,MP)保持在冰冻状态(－80℃)。在复制MP之前，将其在无菌通风橱中解冻一小时以避免微生物污染。MP的复制使用PBAFlexys菌落复制器进行。生长5天的母板用作复制板，将复制物接种在装有液体生长培养基(GM)的96孔MTP中。将新鲜接种的SM琼脂板置于32℃孵箱中，随后在每孔加入150μl 10％甘油后储存在－80℃。GM生产平板在水饱和的Tomtec Quadrastor摇床96000(32℃)中孵育。2至3天后平板显示出生长的菌丝体。孵育GM平板6天。

(i)完成生长后对上清液取样

生长6天后，提取剩余的GM液体生长培养基(含有细胞外表达产物)并将其转移至新鲜的MTP中。使用4道Tecan吸量器将上清液转移至新鲜的MTP中。回收的上清液平均量在120和140μl之间。将这些上清液平板冰冻并随后用于测定木聚糖酶活性。

(j)用于全范围筛选的制备物

将来自表达文库的上清液平板解冻并置于72℃密闭水浴中35至40分钟。在一次性MTP格式的支架中使用12道吸量器和商业预制吸量头(由Eppendorf提供)，将20μl的每一上清液转移至含有底物混合物的MTP中，此MTP在加入上清液之前已加热至60℃。底物混合物由1％果胶(见以下(k))和7％燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖(见以下(l))的1:1混合物组成，最终pH为4.12。在分析的MTP中每孔装有310ml底物。直接在分配上清液后通过吸量头在样品孔中搅动混合上清液和底物混合物。随后将平板置于60℃烘箱中孵育18至24小时。孵育后，使MTP冷却并使用Hamilton粘度测量机器(Hamilton公司，Reno,USA)就粘度的降低进行筛选。

(k)1％果胶pH4.1的制备

将0.2M Na₂HPO₄溶液加入250ml 0.1M柠檬酸溶液中直到pH达到5.5，由此制备柠檬酸-磷酸缓冲液(Mc Ilvaine缓冲液)。用蒸馏水将其补至1升，如果必要的话重新调节pH。60℃下将0.5g高度甲基化的果胶(Ruban Brun型)缓慢加至含有50ml上述McIlvaine缓冲液和25ml蒸馏水的烧瓶中制备0.5%果胶溶液。剧烈搅拌以保证果胶充分溶解。将此补充至100ml，并再次检查pH。此处所用果胶降低了溶液的pH，因此在这些条件下溶液的pH为5.1。如果果胶溶液浑浊不清，则使用15g离心此溶液15分钟以去除未溶解的颗粒。

(l)7％碱处理的燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖pH 4.1的制备

在150ml烧杯中将20ml 2M NaOH加热至60℃。在另一烧杯中在20ml水中加入7g燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖(来自Sigma公司)，以便形成淡棕色面团状团块。如有必要，加入更多的水，但总共不超过30ml。使用钢匙，将此水-燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖团块缓慢加入热NaOH溶液中。需要有力的搅拌装置使木聚糖溶解在此氢氧化物溶液中，由此保持温度恒定在60℃。一旦所有的木聚糖溶解后，溶液转变为暗棕色并类似于一种极为粘稠的清澈糖浆。然后加入剩余的水以致加入50ml的总体积。使溶液冷却并加入4N HCl直到达到期望的pH(通常pH 4.1-4.2)。将此溶液补足至100ml，如果必要重新调节pH。10℃下20,000g离心15分钟，产生清澈的微黄色上清液(其粘度取决于加入的燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖的最初量)。

(m)文库筛选

对克隆在黑曲霉中的Talaromyces emersonii文库的筛选得到相应于测试的119个MTP的119副图。每副图显示了表示为96个峰的96个孔的粘度，这些峰为每个孔的mV减压测量值。分析这些图以寻找指示粘度降低的低峰。比平均峰高低的峰被选出来重新测试。一些平板几乎没有产生变化，以致选择推测的阳性克隆进行重新测试是容易的。其它平板显示了极大量的变化，因此常常有5或6个以上的克隆被选择进行重新测试。为了获得阳性对照，孵育后向一块随机平板的固体位置加入10μl内切木聚糖酶。从这些阳性对照，我们发现如果有木聚糖酶活性，则可以预期240至280mV的峰高。

测试的踝节菌文库平板中还含有5个被验证的热稳定木聚糖酶克隆，这些克隆是在使用染料检测分析前被发现的，其中所述分析的基于与不溶性聚合物底物化学连接的染料的溶解。毫无例外地，这5个克隆已在最初的筛选循环中使用粘度测定法被单独地发现。已知克隆的所有峰的水平均比剩余的峰低得多(250mV)。整体而言，排除含有早先发现的木聚糖酶克隆的那些培养孔，选择了118个培养孔用于再次测试。

(n)118个推测克隆的再次测试

根据全范围筛选所用原则，基于粘度测定法进行再次测试。然而，此次利用较大的分析体积，这是因为可以在热稳定酶活性和无规律的低峰之间造成更为明显的区别。在两个大的MTP(2ml/孔)中加入1.2ml 9%燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖。向每排头两个孔中加入50μl水(阴性对照)。向每排的最后一个孔中加入50μl参照内切木聚糖酶溶液以作为阳性对照。每排第3至11孔用于再次测试推测的木聚糖酶克隆(加入50μl上清液)。混合并在60℃孵育24小时后，使用专订设计的Eclipse程序(吸入体积：800μl，吸入速度:10sec/ml)测量粘度。

鉴定到几个阳性克隆，因为其峰与阳性对照的峰确切地位于同一水平，说明木聚糖完全降解。总共在粘度法筛选的再次测试中鉴定到13个推测菌株。通过对染色体DNA进行PCR扩增，直接将cDNA插入片段克隆在pCR2.1载体中。使用pwo聚合酶和引物组2(11937/12207,SEQ IDNO：7和8)，从12个文库菌株获得16个cDNA插入片段。cDNA插入片段在pCR2.1载体中的方向通过对位于载体中和cDNA 3’端的XhoI进行消化来确定。对cDNA插入片段的5’端进行DNA序列分析。

对可能的果胶降解酶的再次测试以类似于测试木聚糖酶的方式进行，但使用1%果胶替代9%燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖。仅10个再次测试的可能克隆在最初的筛选循环中产生极低峰，但在木聚糖酶的再次测试中未表现出任何活性。一个克隆可重复地产生果胶降解酶。测量到的200mV压力值相应于纯水的粘度。由于所用果胶未完全甲基化，因此它可能被热稳定多聚半乳糖醛酸酶、果胶酸盐裂解酶或果胶裂解酶降解。

(o)粘度法筛选(viscoscreen)的优点

三个关键的因素促进了开发粘度测定筛选方法以鉴定热稳定酶。首先，使天然宿主木聚糖酶活性热失活的可能性使得可以极大地加快适当反应条件的发展。其次是如下事实，在测试具有已知热敏性酶的克隆时热失活破坏了所有活性，以致仅挑选出更具有热稳定性的酶。第三，升高的温度增加了酶活性以致使得筛选变得甚至更为灵敏。在燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖(Sigma)上，鉴定了11个能够显著降低粘度的克隆，而在果胶上鉴定了一个确定的果胶降解克隆。此外，早先鉴定的5个热稳定木聚糖酶克隆也独立地被再次发现。

实施例7：表征来自黑曲霉转化体的第一Talaromyces emersonii热稳定

β-葡聚糖酶(CEA)

活性测定和定义

纤维素酶PAHBAH单位(CPU)定义

一个单位的纤维素酶活性定义为使用葡萄糖标定曲线,60℃和pH5.0下在5％羧基甲基纤维素(CMC)底物浓度时每分钟释放1μmol产生的还原糖所需的酶量。

根据CPU方法的酶活性通过使用4-羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)检测还原糖来测定。该分析方法基于M.Powell,J.C.,Killip,M.,Small,C.W.(1973)J.Lab.Clin.Med.82,649-655，并稍作修改。对PAHBAH试剂按如下作修改：0.05M柠檬酸三钠，0.1M Na₂SO₃，0.02M CaCl₂，0.5MNaOH和0.1M对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)。最终的pH为12。在碱性溶液中含有PAHBAH的此试剂储存在室温，应在一天内使用。葡萄糖用作参照还原糖(标定曲线)。对于该分析的标定曲线，葡萄糖的终浓度在0至300mM之间。通过将100μl酶溶液和400μl在0.1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)中的5%CMC混合，测定CPU活性。加有底物(CMC)的Eppendorf管预先在60℃孵育5分钟。通过加入酶溶液起始反应。15分钟后，加入1.0ml PAHBAH试剂终止反应。在100℃加入Eppendorf管5分钟，然后在冰上冷却。以适当的速度(在Beckman Microfuge E中全速离心1分钟)离心样品以甩下所有固体物质。420nm测量吸光度。通过加入100μl0.1M乙酸缓冲液代替酶溶液，制备空白对照。

β-葡聚糖酶单位(BGU)定义

β-葡聚糖酶单位是在0.5%大麦β-葡聚糖底物浓度时，40℃和pH 3.5下每分钟释放0.258μmol还原糖(按葡萄糖当量测量的)所需的活性。

因此除了以上确定纤维素酶(CPU)活性外，还进行更为特异的分析以检测β-葡聚糖酶活性。该分析的原则是加入一定量酶后，中等粘度的大麦β-葡聚糖溶液(Megazyme,澳大利亚,2/11Ponderosa Parade,Warriewood NSW 2101)的粘度降低速度。将中等粘度的大麦β-葡聚糖(Megazyme，澳大利亚)溶解在0.425M柠檬酸钠缓冲液pH 3.5中至6.25mg/ml浓度。底物在40℃孵育10分钟。随后加入小量酶(范围在0.005－0.062单位/ml)，允许反应进行。在60分钟反应时间时，相对于与具有已知酶活性的标准内切葡聚糖一起孵育的参照样品，测量样品粘度。标准的绝对活性是使用Fe-III六氰化物和4.76mg/ml大麦β-葡聚糖作为起始底物浓度，通过还原糖法测定的。

内切木聚糖酶单位(EXU)定义

木聚糖酶活性单位(EXU)定义为在测试条件下每分钟释放4.53μmol还原糖(按木糖当量测定的)的酶量(endoI，来自黑曲霉的内切-1,4-β-木聚糖酶,参见EP-A-0,463,706(Gist-brocades B.V.))。所述测试条件包括：5mg/ml在100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)中的小麦面粉阿拉伯木聚糖(Megazyme,澳大利亚,2/11 Ponderosa Parade,Warriewood NSW 2101)，温度40℃，反应时间60分钟。通过加入1M NaOH终止反应。样品与Fe-III-六氰化物在沸水中孵育15分钟后，在420nm比色进行检测。所述六氰化铁试剂通过将1.17g KFe(CN)和19.5g无水碳酸钠溶解在1升水中制成。

除了上述木聚糖活性的绝对测定外，还使用相对方法，该方法依据加入一定量酶后小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme,澳大利亚,2/11Ponderosa Parade,Warriewood NSW 2101)溶液的粘度降低。将小麦阿拉伯木聚糖溶解在0.425M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)中至8.3mg/ml浓度。底物在55℃孵育10分钟。随后，加入小量酶（范围在0.01至0.05单位/ml），使反应得以进行。60分钟的反应时间后，相对于与具有已知EXU活性的黑曲霉内切木聚糖酶标准(EP-A-0,463,706)一起孵育的参照物，确定样品的粘度。通过使用上述Fe-III-六氰化物以还原糖法测量标准的绝对EXU活性。使用Haake落球粘度装置手工测定粘度。

纤维素酶单位(CXU)定义

β-葡聚糖酶活性(BGU)单位定义为试验条件下一小时内水解大量糖苷键当量产生0.5mg葡萄糖的纤维素酶量。所述试验条件包括：9mg/ml在5mM乙酸钠缓冲液(pH=4.6)中的羧甲基纤维素，温度37℃。释放的葡萄糖使用DNS试剂通过还原糖法测定。

除了上述纤维素酶活性的绝对测定外，还使用相对方法，该方法的依据是加入一定量酶后羧甲基纤维素溶液的粘度降低。将羧甲基纤维素溶解在5mM柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.6)中至一定浓度，该浓度取决于此批的粘度。底物在37℃孵育10分钟。随后，加入小量酶，使反应得以进行。60分钟的反应时间后，相对于与具有已知CXU活性的标准一起孵育的参照物，确定样品的粘度。

不同pH下的活性

通过离心除去生长的菌丝体后，按实施例3所述在摇瓶中通过适当的黑曲霉转化体制备T.emersonii β-葡聚糖酶。滤液用于本实验。在不同的pH值下在60℃的固定温度测量滤液的活性。根据CPU方法测量活性。与使用5.0的固定pH不同，使用适当pH的柠檬酸缓冲液稀释CMC底物以便实现pH测量。实验重复两次，结果显示在下表1。发现酶的最适pH在pH 4.5和5.0之间，大约pH 4.8。

表1：60℃下pH概况（profile）

不同温度下的活性

然后在不同温度测量此β-葡聚糖酶的活性。根据CPU方法在pH4.0测量活性。与在60℃的固定温度下孵育不同，在不同的温度下进行此孵育。实验进行两次，结果显示在下表2。发现最适温度在80℃和85℃之间。T_opt似乎为大约84℃(但它也可能是82℃、83℃或85℃，这取决于如何画线以及如何将线条置于数据点之间)。

表2：pH4下的温度概况

相对于其它酶的活性

此外还使用BGU方法测量β-葡聚糖酶在30至60℃下的活性，并与作为参照物的购买的具有纤维素酶和葡聚糖酶活性的无T.reesei细胞培养物进行比较。无T.reesei细胞培养物由不同酶的混合物组成，其中有一种或多种β-葡聚糖酶，但这些活性并未进行过表征。为了对本发明T.emersonii β-葡聚糖酶和T.reesei纤维素酶/葡聚糖酶的活性进行比较，40℃给予大约相等活性的酶。将40℃T.emersonii β-葡聚糖酶A的活性设置为1，并由此相对于此来表示其它活性。结果显示在下表3。

表3：与T.reesei酶比较的相对活性

在高于40℃的温度下，与T.emersonii β-葡聚糖酶相比，T.reesei纤维素酶/葡聚糖酶活性趋于稳定。40℃以上，这些活性便不同，CEA活性更高。而且，尽管在升高的温度下相对活性更高，但中等温度下相对于T.reesei混合物而言活性持平。这说明此β-葡聚糖酶在宽的温度范围内都是具有活性的。

纯化和比活性

从滤液开始纯化T.emersonii β-葡聚糖酶。使用PD10柱将大约25ml无细胞培养物脱盐，并置于10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)平衡的resourceQ 6ml阴离子交换柱上。使用10至300mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)的线性梯度进行洗脱。(线性梯度A至B；流速：6ml/min；运行时间:54min；检测波长:280nm,254nm,214nm)。收集活性部分(20ml)，使用Microsep浓缩器浓缩(3.5ml 10K)，并用0.1M磷酸钠缓冲液(pH 5.0)洗涤两次。此部分的纯度通过HPL-SEC(大小排阻层析)和SDS-PAGE分析。

比活性测定

280nm下计算的β-葡聚糖酶摩尔消光系数为81550M^-1.cm^-1。纯化酶的蛋白浓度来源于E280测定，使用对于1mg/ml为2.33的E280^1cm比吸光度。纯化样品的比活性按BGU(底物：大麦β-葡聚糖)测定，为1027BGU/mg。使用CPU方法，比活性为628单位/mg。由于与还原糖法相比根据粘度测定法的活性有大数目的差异，因此推断T.emersonii β-葡聚糖酶表现出显著的内切葡聚糖酶活性。典型的外切葡聚糖酶在还原糖分析中有极为充分的表现，而在粘度测定法中表现极差。

等电点

IEF-PAGE按如下进行。装置是Phast系统(Pharmacia Biotech)、IEF3-9 PhastGel(Pharmacia Biotech)。根据标准Phast系统方法，进行凝胶电泳并染色(考马斯亮兰)。在PhastGel IEF3-9上测定等电点，为3.3。分子量测定

按以下进行SDS-PAGE。装置也是Phast系统(Pharmacia Biotech)；12.5%均一凝胶(Pharmacia Biotech)；SDS-缓冲条(Pharmacia Biotech)。样品处理：一体积(5个样品)缓冲液(500mM Tris-HCl,pH 6.8,10%SDS,0.1%溴酚蓝)与4体积样品混合并煮沸3分钟。根据标准Phast系统方法电泳凝胶并染色(考马斯亮兰)。使用柱：TSK G3000SW(目录号:05103)(TosoHaas)进行HPLC大小排阻层析。方法：洗脱液是：0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0，流速：1ml/min，运行时间:30分钟，监测波长:280nm。酶的脱糖基化：将5μl纯化酶(7mg/ml)与20μl 0.5%SDS及25μl 1%β-巯基乙醇混合。煮沸此混合物4分钟。冷却后，加入1M磷酸钠缓冲液pH7.0中的20μl N-糖苷酶F(500U/ml)和20μl 3%Triton X-100。过夜孵育后用SDS-PAGE分析脱糖基化。

在SDS-PAGE凝胶和HP-SEC上测定分子量为43kDa。脱糖基化后，SDS-PAGE上观察到37kDa的一条直带。

热稳定性

使用T.reesei纤维素酶/葡聚糖酶作为参照物确定T50热稳定性。T50是孵育20分钟后剩余50%活性时的温度。表4显示了来自T.emersonii的纯化β-葡聚糖酶与本实施例中较前使用的T.reesei纤维素酶/葡聚糖酶混合物之间的T50热稳定性差异(初始活性设置为1，酶孵育20分钟，在冷却后使用CPU方法测量活性)。每个实验重复两次，因此表4显示了两次的测量结果。纯化的β-葡聚糖酶的T50热稳定性在93.4℃周围，T.reesei纤维素酶/葡聚糖酶的T50热稳定性在大约64.9℃。

表4：与T.reesei酶比较的热稳定性

实施例8：活性测量

使用燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖作为底物，在摇瓶中使用GM培养基,发酵实施例6粘度法筛选中鉴定的两个文库菌株(初始菌株标记为AD009.21和AD011.31)。此外，还将实施例4和5鉴定的表达β-葡聚糖酶活性的菌株(标记为AD021.B6)(CEA)包括在内。进行了几次测试，结果显示如下。菌株AD009.21和AD011.31令人惊奇地显示出几乎不存在木聚糖酶活性。相反，尽管AD009.21和AD011.31是使用燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖在粘度法筛选中鉴定的，但这些克隆似乎具有纤维素酶活性。尤其是，β-D009.21对大麦β-葡聚糖极为有效。

表5：纤维素酶菌株的摇瓶发酵；

木聚糖酶(EXU/ml)、β-葡聚糖酶(BGU/ml)和纤维素酶(CXU/ml)活性

菌株(和葡聚糖酶名称)	EXU/ml	BGU/ml	CXU/ml
				AD021.B6(CEA)	<10	160	524
AD009.21(CEB)	<10	884	254
				AD011.31(CEC)	<10	<10	7

对于EXU和BGU试验检测极限设置为低于10，而对于CXU试验设置为低于5。

对菌株AD 009.21和AD 011.31(见实施例6前述)的DNA分析显示了两种新的β-葡聚糖酶，称作CEB和CEC。编码区的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3和5，相应的氨基酸序列是SEQ ID NO:4和6。

CEB菌株显示出高β-葡聚糖酶活性。CEA菌株与CEB菌株相比显示了相对高的纤维素酶活性。β-葡聚糖酶活性和纤维素酶活性之间的比例对于CEA和CEB是不同的。CEC菌株显示出纤维素酶活性，但其β-葡聚糖酶或木聚糖酶活性低于这些试验的检测极限。然而，同源性研究强烈地提示有β-葡聚糖酶活性，因此认为这在不同的pH下可能会高得多。

使用一种以上的底物进行筛选是可行的。令人惊奇的是，已证实代替一次使用两种底物，可以在粘度法筛选中使用三种不同的底物。其中一个底物是葡萄糖聚合物杂质，如葡聚糖或纤维素物质。已证明，使用燕麦斯卑尔脱小麦木聚糖、果胶和纤维素样物质导致在一个筛选循环中可鉴定三类酶，即木聚糖酶、果胶酶和纤维素酶。粘度测定分析法比通常的染料检测法具有另一个极大的优势。染料检测方法以和底物化学连接的染料为基础。此类底物中仅几种化合物是可商业获得的。然而，粘度测定法可以使用任何类型的粘性底物，甚至于不需要任何化学预处理的天然粘性底物。此方面是重要的，因为从商业和工业角度来看这样就能够针对其粘度降低(例如果汁)或粘度增加(例如乳品)具有商业重要性的底物来筛选酶活性。

实施例9：Talaromyces emersonii内切葡聚糖酶(CEC)的烘焙性能

在标准烘焙方法中，将3500g小麦面粉(80% Kolibri和20% Ibis小麦面粉的混合物(Meneba,荷兰)，约21℃)、77g压榨(Konings)酵母、70g盐、25ppm抗坏血酸、10ppm真菌α-淀粉酶Fermizyme^TMP₂₀₀（DSM N.V.,Bakery Ingredients,Delft,荷兰）和不同量的内切葡聚糖酶CEC酶(来自4个不同的克隆，由其AD号标识)及2030ml水(8-15℃)在螺旋混合器(Hobart)中混合2分钟(以速度1)然后约6分钟(以速度2)以输入125Wh(瓦小时)能量，制备模烤面包。生面团温度为28℃。由有资格的面包师用手评价此面团的机械加工性。

在混合后直接将面团分为6块，每块875g，圆化并在检验室中34℃和85%RH（相对湿度）下检验35分钟。末了，使面团成形和进行模制，然后在检验室中38℃和87%RH下最后检验75分钟。之后，经过全部检验的面团在电烤炉中210℃烘焙30分钟。冷却至室温后，面包块的体积通过菜籽置换法(rape seed displacement method)确定。在密封的聚乙烯袋中室温储存16至24小时后，由有资格的面包师评价面包瓤的质量。鉴定为表达CEC的四个文库菌株在摇瓶中发酵并在此烘焙试验中进行了测试。结果显示在下表中。

面团的质量极好。在使用较高剂量的内切葡聚糖酶CEC时，在处理面团过程中有一些粘性。然而，这一点粘性并不影响面团的机械加工性。所有含有内切葡聚糖CEC的面团都极柔软且易于操作。

从这些烘焙结果，我们推断内切葡聚糖酶CEC可以极为有效地提高面包的品质，不论从面包体积还是面包瓤的质量来讲都是如此。尽管面包体积大，但面包瓤的结构仍极为规则和细腻。

实施例10：Talaromyces emersonii酶(CEC)与黑曲霉的内切木聚糖酶在烘焙性能上的比较

在荷兰模制面包的生产过程中比较CEC和目前所用来自黑曲霉的真菌内切葡聚糖酶的烘焙性能。提供的此黑曲霉内切葡聚糖酶为纯的商购形式，即Fermizyme^TM HS₂₀₀₀。

除了使用不同量的内切葡聚糖酶CEC或Fermizyme^TM HS₂₀₀₀外，原样重复实施例9的程序。

从这些结果明显看出，引入内切葡聚糖酶CEC比引入Fermizyme^TMHS₂₀₀₀更大程度地提高了面包体积。而且，当使用CEC而不是Fermizyme^TM HS₂₀₀₀时，使面包体积达到某个确定水平需要较少的内切葡聚糖酶单位/kg面粉。

实施例11

三种葡聚糖酶的某些分子和生化性质比较见下表。

^＊基于糖苷水解酶(CAZy)分类

⁺从氨基酸序列预测的

葡聚糖酶/纤维素酶	家族	3D	亲核/质子供体	机制
					CEA	5	TIM 8	glu/glu	保持
CEN	7	胶状卷	glu/glu	保持
					CEC	45	混合圆桶	asp/asp	转化
	16	胶状卷	glu/glu	保持

CEB、CEC均是表现出EC 3.2.1.4活性的纤维素酶。许多纤维素酶还可以水解大麦葡聚糖中的1,4键，这使得它们对于某些应用尤其有用，例如用于去除饲料中抗营养物因子。由于活性是通过粘度测定法测量的，因此可能该纤维素酶表现出内切活性。然而不能排除也水解1,3键。因此，基于这些观察，尽管EC 3.2.1.73、3.2.1.39和3.2.1.6存在于家族16中，但不能排除这些活性：家族7和16的特征似乎十分相似。

纯粹作为解释，纤维素酶(EC 3.2.1.4)通常能够催化内切水解纤维素中的1,4-D-葡糖苷键。纤维素酶的系统名是1,4-(2,3;1,4)-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)。内切-1,4-D-葡聚糖酶和内切葡聚糖酶D与1,4-(1,3;1,4)-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶同义。纤维素酶也可以水解还含有1,3键的-D-葡聚糖中的1,4键，这使得它们对于某些应用尤其有用，如用于消除饲料中的抗营养物因子。表现出内切葡聚糖酶活性的这些酶一般被称作葡聚糖酶。此外，可以通过地衣酶(1,3-1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.73))和内切-1,3(4)-葡聚糖酶(1,3-(1,3;1,4)-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.6))水解葡聚糖。

下表综述了纤维素酶活性。

参考文献

1.Sambrook等(1989)“Molecular Cloning:A laboratory manual”，第2版,Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,纽约

2.Innis等(1990)“PCR protocols,a guide to methods andapplications”Academic Press,San Diego.

3.WO-A-99/32617

4.van Zeijl,C.等(1998)J.of Biotechnol.59:221-224

5.Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12,387-395页

6.Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300

7.Altschul,S,F等(1990)J Mol Biol 215:403-10

8.Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci,USA89:10915-10919)

9.Karlin和Altschul(1993)Proc,Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787

10.Cunningham和Wells,Science（科学）,244,1081-1085,1989

11.de Vos等(Science,255,306-312,1992)

12.Smith等(J.Mol.Biol.,224,899-904,1992)

13.Wlodaver等(FEBS Lett.,309,59-64,1992)

14.Ford等,Protein Expression and Purification,2,95-107,1991

15.Goosen等,“Transformation and Gene Manipulation inFilamentous Fungi:an overview”见:Handbook of Applied Mycology,第4卷(1992)

16.Romanos等,Yeast 8:423-488(1992)

17.EP-A-0,449,375

18.WO-A-98/04726

19.WO-A-98/30707

20.Alenkso和Clutterbuck,Fungal Genet.Biol 21:373-397(1997)

21.EP-A-0,635,574

22.WO-A-98/46772

23.WO-A-91/14772

Claims

1.分离的多肽，其是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的β-葡聚糖酶。

2.分离的多核苷酸，其是：

(a)编码根据权利要求1的多肽的序列；或

(b)与(a)中定义的序列在全长上互补的序列。

3.分离的多核苷酸，其是：

(a)序列由SEQ ID NO:1的核酸序列组成；

(b)与(a)中定义的序列在全长上互补的序列；或

(c)由于遗传密码的原因而与(a)中定义的序列简并的序列。

4.根据权利要求2的多核苷酸，其是DNA序列。

5.载体，其包含根据权利要求2至4之任一项的多核苷酸。

6.根据权利要求5的载体，其是表达载体，其中根据权利要求4的DNA序列与调节序列可操作地连接。

7.宿主细胞，其包含根据权利要求2至4之任一项的多核苷酸作为异源序列。

8.宿主细胞，其以异源蛋白形式表达根据权利要求1的多肽。

9.用权利要求4的DNA序列或权利要求5的载体转化的宿主细胞。

10.制备根据权利要求1的多肽的方法，该方法包括在利于该多肽表达的条件下培养权利要求7至9之任一项定义的宿主细胞。

11.组合物，其包含权利要求1的多肽。

12.根据权利要求11的组合物，还包含具有纤维素酶、内切阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶或多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽。

13.处理植物材料的方法，该方法包括使植物材料和根据权利要求1的多肽或根据权利要求11或权利要求12的组合物接触。

14.根据权利要求13的方法，其中所述处理包括降解或修饰植物材料中的纤维素。

15.根据权利要求14的方法，其中所述纤维素是β-葡聚糖。

16.根据权利要求14的方法，用于降解或修饰植物细胞壁。

17.根据权利要求13至16之任一项的方法，其中所述处理包括切割所述材料中的β-D-葡聚糖成分的葡萄糖亚单位。

18.根据权利要求13至16之任一项的方法，其中所述材料包括植物、植物浆状物、植物提取物或可食用食品或其成分、或含有植物材料的织物。

19.降低植物材料的粘度的方法，该方法包括使植物材料和根据权利要求1的多肽或根据权利要求11或权利要求12的组合物接触，其中所述多肽或组合物的量以及接触条件为对于降解该材料中所含纤维素有效的量和条件。

20.根据权利要求1的多肽或根据权利要求11或权利要求12的组合物在处理植物材料的方法中的用途。

21.根据权利要求20的用途，其中所述处理包括切割植物材料中的β-D-葡聚糖聚合物。

22.根据权利要求1的多肽或根据权利要求11或权利要求12的组合物在加工植物浆状物、汁或提取物的方法中的用途，该方法包括将所述浆状物、汁或提取物与所述多肽或组合物一起孵育以至少部分地降解纤维素。

23.动物饲料，其包含根据权利要求1的多肽。

24.根据权利要求1的多肽在酿造、蒸馏、生物产甲烷、牙齿保健、皮革处理、造纸、纺织品处理或制造、烘焙或面包制造、洗涤或去污剂处理、球根花卉的处理中或在动物饲料中的用途。

25.食物，其包含根据权利要求1的多肽。

26.根据权利要求25的食物，其是酒精饮料、面包、生面团或茶。