JP6690085B2 - リグノセルロース系材料の酵素加水分解および糖類発酵のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、リグノセルロース系材料の酵素加水分解および糖類発酵のための方法に関する。
本明細書で原材料とも称される、リグノセルロース系植物材料は、糖類の形態の再生可能なエネルギー源であり、例えば糖類またはバイオエタノールのようなバイオ燃料などの有価製品に変換され得る。この過程において、麦藁、トウモロコシ茎葉、もみ殻などの原材料中に存在する、(リグノまたはヘミ)セルロースは、(ヘミ)セルロース分解酵素によって、還元糖に変換され、これは次に任意選択的に、酵母、細菌、および真菌などの微生物によって、エタノールなどの有価製品に変換される。
したがって本発明の目的は、加水分解ステップが、改善された条件において実施される方法を提供することである。本発明の別の目的は、工程時間が短縮された加水分解を伴う方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、酵素用量が低下されてもよく、同時に、有用な加水分解産物の生成量が同一レベルに保たれ、または増大することすらある、方法を提供することである。別の目的は、加水分解の工程条件が最適化された、加水分解を伴う方法を提供することである。本発明のなおもさらなる目的は、同一酵素用量を使用して、有用な加水分解産物の生成量が増大される、加水分解を伴う方法を提供することである。これらの目的の1つまたは複数が、本発明によって達成される。
a)リグノセルロース系材料を任意選択的に前処理するステップと;
b)任意選択的に前処理されたリグノセルロース系材料を任意選択的に洗浄するステップと;
c)少なくとも2種のセルラーゼを含む酵素組成物を使用して、任意選択的に洗浄されおよび/または任意選択的に前処理されたリグノセルロース系材料を酵素加水分解するステップであって、酵素組成物が少なくともGH61を含むステップと;
d)ここで、7.5mg未満の酵素組成物/gグルカン(乾物およびタンパク質としての酵素基準)、または3.0mg未満の酵素組成物/g原材料(乾物およびタンパク質としての酵素基準)が使用され;
e)糖生成物を任意選択的に回収するステップと
を含み、
前処理の後および酵素加水分解の前および/または最中に、酸素がリグノセルロース系材料に添加される、方法を提供する。
a)リグノセルロース系材料を任意選択的に前処理するステップと;
b)任意選択的に前処理されたリグノセルロース系材料を任意選択的に洗浄するステップと;
c)少なくとも2種のセルラーゼを含む酵素組成物を使用して、任意選択的に洗浄されおよび/または任意選択的に前処理されたリグノセルロース系材料を酵素加水分解するステップであって、酵素組成物が少なくともGH61を含むステップと;
d)加水分解されたリグノセルロース系材料を発酵させて、発酵産物を生成するステップと;
e)ここで、7.5mg未満の酵素組成物/gグルカン(乾物およびタンパク質としての酵素基準)、または3.0mg未満の酵素組成物/g原材料(乾物およびタンパク質としての酵素基準)が使用され;
f)発酵産物を任意選択的に回収するステップと
を含み、
前処理の後および酵素加水分解の前および/または最中に、酸素がリグノセルロース系材料に添加される、方法を提供する。
a)酸素が酵素加水分解時間の後半に添加される場合に、12〜50%、好ましくは20〜40%であり;
b)酸素が酵素加水分解時間の前半に添加される場合に、総酵素加水分解時間の2〜30%、好ましくは4〜25%、より好ましくは5〜20%であり;または
c)またはaとbの組み合わせである。
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通じて「含む(comprise)」および「含む(include)」と言う語、および「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」などのバリエーションは、包括的に解釈される。すなわち、これらの語は、文脈が許せば、特に列挙されないその他の構成要素または整数の可能な包含を伝えることが意図される。冠詞「a」および「an」は、冠詞の1つまたは2つ以上(すなわち1つまたは少なくとも1つ)の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として、「要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味してもよい。
本明細書では、安定酵素組成物は、30時間の加水分解反応時間後に、好ましくはその初期活性の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の活性を30時間の加水分解反応時間後に保つ酵素組成物を意味する。好ましくは酵素組成物は、加水分解反応時間の40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500時間後に、活性を保つ。
GH61、エンドグルカナーゼ(EG)、およびエキソセロビオヒドロラーゼ(CBH)は、セロオリゴ糖(セロビオースを主生成物とする)などの生成物への不溶性セルロースの加水分解を触媒する一方で、β−グルコシダーゼ(BG)は、主にセロビオースおよびセロトリオースであるオリゴ糖をグルコースに変換する。
本明細書において、リグノセルロース系材料としては、あらゆるリグノセルロースおよび/またはヘミセルロース系材料が挙げられる。本発明で原材料として使用するのに適するリグノセルロース系材料としては、例えば農業バイオマス、商業的有機物、建築および解体廃材、都市固形廃棄物、古紙および庭ごみなどのバージンバイオマスおよび/または非バージンバイオマスなどのバイオマスが挙げられる。バイオマスの一般形態としては、樹木、灌木および牧草、小麦、麦藁、サトウキビバガス、スイッチグラス、ススキ、トウモロコシ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ穂軸、キャノーラ茎、大豆茎、サトウモロコシ、穀粒からの繊維を含むトウモロコシ穀粒、「ふすままたは繊維」と称されることが多い、トウモロコシ、小麦、および大麦などの穀物製粉(湿式磨砕および乾式製粉を含む)からの製品および副産物、ならびに都市固形廃棄物、古紙、および庭ごみが挙げられる。バイオマスはまた、草質材料、農業残渣、林業残渣、都市固形廃棄物、古紙、およびパルプおよび製紙工場残渣でもあり得るが、これに限定されるものではない。「農業バイオマス」としては、枝、低木、トウ、トウモロコシおよびトウモロコシ苞葉、エネルギー作物、森林、果実、花卉、穀物、牧草、草本作物、葉、樹皮、針状葉、丸太、根、若木、短期輪作木質作物、灌木、スイッチ草本、樹木、野菜、果、ブドウの木、甜菜パルプ、小麦ミドリング粉、オート麦外皮、および硬質および軟質木材(有害物質のある木材は含まない)が挙げられる。さらに、農業バイオマスとしては、特に林業木材廃棄物をはじめとする、農業および林業活動をはじめとする農業プロセスから生じる有機廃棄物材料が挙げられる。農業バイオマスは、前述のいずれか単独、またはそのあらゆる組み合わせまたは混合物であってもよい。
原材料は、酵素加水分解のための基質へのアクセスしやすさを高め、および/またはヘミセルロースを加水分解し、および/またはヘミセルロースおよび/またはセルロースおよび/またはリグニンを可溶化するために、任意選択的に、加熱、機械および/または化学修飾、またはこのような方法の任意の組み合わせによって、当該技術分野で公知のあらゆる方法で前処理してもよい。一実施形態では、前処理は、蒸気爆発、熱水処理または希酸または希塩基処理によって、リグノセルロースを処理することで実施される。
任意選択的に、本発明による方法は、洗浄ステップを含む。任意の洗浄ステップを使用して、発酵ステップの阻害物質として作用することもある水溶性化合物を除去してもよい。洗浄ステップは、既知の様式で実施してもよい。
本発明の方法で使用される酵素組成物は、例えばトウモロコシ茎葉または麦藁などのリグノセルロース分解性材料を極めて効果的に加水分解し得て、それは次に、エタノール、バイオガス、ブタノール、乳酸、プラスチック、有機酸、溶媒、動物飼料補給剤、薬剤、ビタミン、アミノ酸、酵素または化学原料などの有用な生成物にさらに変換される。さらに例えばバイオガス生産中間体としての乳酸などの加水分解に続く工程からの中間生成物は、その他の材料の基礎的要素として使用し得る。本発明は、エタノール生産によって例示されるが、これは限定でなく例証としてのみ実施され、別の言及される有用な生成物も等しく良好に生成され得る。
本発明による方法は、発酵ステップを含む。したがってさらなる態様では、本発明は、ステップ中に、例えばグルコース、L−アラビノースおよび/またはキシロースなどの糖(類)を含む炭素源の発酵のために微生物が使用される、発酵工程を含む。炭素源としては、例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプン、アラビナンなどの、L−アラビノース、キシロースまたはグルコース単位を含む、あらゆる炭水化物オリゴマーまたはポリマーなどが挙げられる。このような炭水化物からのキシロースまたはグルコース単位の放出のために、適切なカルボヒドラーゼ(キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど)が、発酵培地に添加されてもよく、または改変宿主細胞によって産生されてもよい。後者の場合、変性宿主細胞は遺伝子改変されて、このようなカルボヒドラーゼを産生し排出してもよい。グルコースのオリゴまたはポリマー原料を使用する追加的な利点は、例えばカルボヒドラーゼの律速量を使用して、発酵中に遊離グルコースの(より)低い濃度を維持できることである。これは次に、キシロースなどの非グルコース糖代謝および輸送に必要なシステムの抑制を防止する。好ましい方法では、改質宿主細胞は、L−アラビノース(任意選択的にキシロース)およびグルコースの双方を発酵し、好ましくは同時に発酵するが、その場合、好ましくは、グルコース抑制に非感受性の改変宿主細胞を使用して、ジオキシックな増殖を防止する。L−アラビノース供給源、任意選択的に炭素源としてのキシロース(およびグルコース)に加えて、発酵培地は、改質宿主細胞の増殖に必要な適切な成分をさらに含む。酵母または糸状菌などの微生物の増殖のための発酵培地の組成は、当該技術分野で周知である。
−嫌気的工程が可能である;
−酸素制限条件もまた可能である;
−より高いエタノール収率およびエタノール生産速度が得られ得る;
−使用される株はL−アラビノースおよび任意選択的にキシロースを利用できてもよい。
本発明によって、総反応時間(または加水分解ステップおよび発酵ステップを合わせた反応時間)が短縮されてもよい。一実施形態では、総反応時間は、90%のグルコース収率で、300時間以下、200時間以下、150時間以下、140時間以下、130以下、120時間以下、110時間以下、100時間以下、90時間以下、80時間以下、75時間以下、または約72時間である。より低いグルコース収率では、それ相応により短い総時間に達してもよい。
本発明によって生産されてもよい発酵産物としては、アミノ酸、ビタミン、医薬品、動物飼料補給剤、特殊化学薬品、化学物質原材料、プラスチック、溶媒、燃料、またはその他の有機ポリマー、乳酸、および、燃料エタノールをはじめとするエタノール(「エタノール」という用語は、エチルアルコールまたはエチルアルコールと水の混合物を含むと理解される)が挙げられる。
本発明による方法は、任意選択的に発酵産物を回収するステップを含む。発酵産物は、発酵ブロスから、あらゆる既知の様式で分離されてもよい。したがって当業者は、各発酵産物について適切な分離技術を選択できる。例えばエタノールは、例えば従来の方法で、水蒸気蒸留/真空蒸留などの蒸留によって、酵母発酵ブロスから分離されてもよい。
一実施形態では、本発明は、これに限定されないが、エタノール生産において、前処理リグノセルロース系原材料から還元糖を生産するための、ラサムソニア属(Rasamsonia)のセルロース分解酵素などの熱安定性酵素の使用に関する。
安定性酵素の高い安定性のために、活性は時間内に中断しないが、加水分解過程でより少ない還元糖が放出される。加水分解時間を延長することで、酵素用量を低下させて酵素の使用を延長し、同様のレベルの放出還元糖を得ることが可能である。例えば、0.175mL酵素/g原材料乾物は、72時間以内に、前処理原材料からの理論的な最大還元糖のおよそ90%の放出をもたらした。0.075mL酵素/g原材料乾物を使用した場合、120時間以内に、理論的な最大量のおよそ90%の変換が達成される。結果は、酵素活性が安定しているので、加水分解時間を延長することで、酵素用量の低下を補償して、同一量の還元糖を入手し得ることを示す。同じことは、乾物含量が10%を超える前処理原材料の加水分解にも当てはまり、15%の乾物原材料での加水分解時間延長の補償効果が示される。
リグノセルロース系材料をエタノールに変換する通常の工程では、運用コストを低下させるために工程段階は、好ましくは腐敗条件下で実施される。したがって汚染と汚染微生物の増殖が存在して、乳酸、ギ酸、および酢酸の生成、基質に対するエタノール収率損失、毒素生成、および細胞外多糖類などの有害な副作用をもたらし得て、それは生産コストにかなりの影響を及ぼすこともある。高い工程温度および/または短い工程時間は、加水分解および発酵中の汚染リスクを制限する。ラサムソニア属(Rasamsonia)酵素のような熱安定性酵素は、60℃を超える温度でリグノセルロース系原材料を加水分解できる。これらの温度では、望まれない副作用を引き起こす汚染微生物のリスクは、ほぼ皆無である。
予備熱処理後の最初のステップは、前処理原材料を酵素活性が最適である温度に冷却することである。大規模では、これは典型的に、(冷却)水を添加することで実施され、これは温度を低下させるのに加えて、乾物含量を低下させる。ラサムソニア属(Rasamsonia)の酵素のような魔法瓶安定性酵素を使用することで、(i)加水分解中のより高い温度が可能であるため、前処理原材料に必要な冷却がより少なく、(ii)添加水がより少なく、加水分解および発酵中の乾物含量が増大し、したがってエタノール工場のエタノール生成能力(容量あたり時間単位あたりの生産量)が増大するという事実によって、コスト削減が達成され得る。また、ラサムソニア属(Rasamsonia)の酵素のような本発明による熱安定性酵素を使用して、非熱安定性酵素を用いた工程で使用される水よりも温度がより高い冷却水を使用することで、コスト削減を達成してもよい。
ひとたびほぼ全てのセルロースが変換されると、遊離される還元糖はわずかなので、加水分解終了時に、酵素活性は低いようである。しかし僭越なことに主に基質への酵素吸収のために、存在する酵素活性量の減少はわずかである。加水分解後に、遠心分離、濾過、デカンテーションなどの固液分離を適用することで、溶液中の例えば70%などの60%以上の酵素活性を回復させて、次の加水分解において、新たな前処理リグノセルロース系原材料を加水分解するために再利用し得る。
上述したような加水分解後の酵素再利用を含む工程は、発酵後のエタノール産生微生物の再利用と、酵素生産発酵における基質としての、およびエタノール産生微生物の培地としての(精製および/または濃縮または希釈)還元糖含有濾液の使用と、組み合わせ得る。
ラサムソニア属(Rasamsonia)からの酵素などの酵素の熱安定性は、加水分解、発酵、および真空蒸留後における、薄い蒸留廃液中の残留セルロース分解活性を引き起こす。酵素の全活性は、3回の連続工程段階中に低下する。したがって真空蒸留後に得られる薄い蒸留廃液は、前処理麦藁をエタノールに変換する、新たに開始される加水分解−発酵−蒸留工程サイクルのための酵素源として再利用し得る。薄い蒸留廃液は、濃縮または(非)希釈形態および/または精製および追加的な酵素補給あり、またはなしのいずれかで使用し得る。
最適工程では、新規工程サイクルにおけるその再利用前に、薄い蒸留廃液に、先の工程サイクルの3回の連続工程段階中に失われた活性に等しい、一定量の酵素が補給される。このようにして過量の酵素が回避され、したがって最も効率的な酵素の使用が得られる。
加水分解中に混合することで、酵素はより頻繁に基質に接触するようになり、これはより効率的な触媒活性の使用をもたらす。混合が酵素に対して悪影響を及ぼさない限り、これはより低い酵素使用量をもたらし、したがってコストを低下させる。ラサムソニア属(Rasamsonia)からの熱安定性酵素のような安定性酵素は、頑強であり、徹底的なスラリー混合における状況である、(局所的に)高い剪断および温度の状況に抵抗し得る。したがって混合システムにおけるその使用は有益であり、用量低下したがってコスト低下をもたらす。
[実験情報]
[株]
ラサムソニア・エメルソニイ(Rasamsonia emersonii)(サーモミセス・エメルソニイ(Thermomyces emersonii))株は、1964年12月に受入番号CBS393.64で、CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES,Uppsalalaan 8,P.O.Box 85167,NL−3508 AD Utrecht,The Netherlandsに寄託された。
Schell,D.J.,Applied Biochemistry and Biotechnology(2003),vol.105−108,pp 69−85に記載されるようにして、希釈酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)を得た。パイロット規模の前処理反応器を使用して、190℃、1分間の滞留時間、および液相中の1.45%(w/w)の有効H2SO4酸濃度の定常状態条件で稼働させた。
[1.総タンパク質]
[TCAビウレット]
本方法は、妨害物質を除去するためのトリクロロ酢酸(TCA)を使用したタンパク質沈殿の組み合わせであり、比色分析ビウレット反応によるタンパク質濃度の判定を可能にした。ビウレット反応では、銅(II)イオンが銅(I)に還元され、それはアルカリ溶液中で、ペプチド結合中の窒素および炭素と錯体を形成する。紫色は、タンパク質の存在を示唆する。色の強さ、ひいては546nmにおける吸光は、ランベルト・ベールの法則に従って、タンパク質濃度に正比例する。BSA(ウシ血清アルブミン)を使用して標準化を実施し、タンパク質含有量は、BSA当量/Lとしてgタンパク質で、またはBSA当量/Lとしてmgタンパク質で表された。既知濃度のサンプル濃度に対してOD546をプロットすることで、当該技術分野で公知の標準的計算プロトコルを使用してタンパク質含有量を計算し、検量線から作成された方程式を使用した、未知サンプルの濃度の計算がそれに続いた。
[サンプル前処理SDS−PAGE]
サンプルの推定タンパク質濃度に基づいて、以下のサンプル調製を実施した。10μLのサンプルに、40μLのミリQ水および50μLのTCA(20%)をに添加して、サンプルを5倍(約1mg/ml)に希釈して、タンパク質を沈殿させた。氷上で1時間後に、サンプルを遠心分離した(10分間、14000rpm)。ペレットを500μLのアセトンで洗浄し、遠心分離(10分間、14000rpm)した。ペレットを下述するように処理した。
ペレットを65μLのミリQ水、25μLのNuPAGE(商標)LDSサンプル緩衝液(4×)Invitrogen、および10μLのNuPAGE(商標)サンプル還元剤(10×)Invitrogenに溶解した。変性ステップ前に、65:25:10の比率のMilliQ;NuPAGE(商標)LDSサンプル緩衝液および10μLのNuPAGE(商標)サンプル還元の混合物を使用して、サンプルを5倍に希釈した。混合後、サンプルをサーモミキサー内で10分間70℃で培養した。サンプル溶液を4〜12%のBis−トリスゲル(NuPAGE(商標)BisTris、Invitrogen)に塗布した。マーカーM12(Invitrogen)のサンプル(10μL)もまた、ゲルに塗布した。XCELL Surelockを使用して、外側緩衝液チャンバー内の600mlの20×希釈SDS緩衝液、および内側緩衝液チャンバー内の0.5mlの抗酸化剤(NuPAGE(商標)Invitrogen)を含有する200mlの20×希釈SDS緩衝液によって、ゲルを200Vで50分間電気泳動した。泳動後、脱ミネラル水でゲルを2回水洗して、ゲルを50%メタノール/7%酢酸溶液で1時間固定し、Sypro Ruby(ゲルあたり50ml)で一晩染色した。ミリQ水でゲルを洗浄した後、Typhoon 9200(610 BP 30、Green(532nm)、PMT 600V、100ミクロン)を使用して、造影した。
Typhoonスキャナを使用して、当該技術分野で公知の標準法を使用して、レーン内のタンパク質バンド間の比率を判定した。サンプルを三重反復試験にかけて、Image quantプログラムを使用して濃淡値を判定した。値は、総タンパク質に対する相対%タンパク質として表され、全てのタンパク質バンドの全濃淡値と比較して、選択されたタンパク質バンドの濃淡値を使用して計算される。
%グルカン変換(%)=(グルコース(g/l)×100%)/(グルカン(DM上の画分)×dm(g/kg)×1.1)
式中、
グルコース(g/l)=加水分解後の上清中のグルコース濃度。
グルカン(dm上の画分)=処理前の基質のグルカン含有量。
dm(g/kg)=加水分解の乾物(例えば20%dm=200g/kg)。
1.1=加水分解中の水取り込みに起因する重量増大。
グルコース=60g/l
グルカン画分=0.40(乾物基準で40%)
dm=200g/kg
グルカン変換例=(60*100)/(0.4×200×1.1)=68%の変換
[セルラーゼ酵素混合物のセルロース分解活性に対する加水分解中の酸素不在効果の評価]
下述の手順に従って、3種の異なる酵素混合物のセルロース分解活性に対する、加水分解中の酸素不在の効果を評価した。酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)原材料を用いて、10w/w%DMの最終濃度で加水分解反応を実施した。この原材料溶液は、濃縮原材料溶液を水で希釈して調製した。その後、pHを4MのNaOH溶液でpH4.5に調節した。原材料からの酸素の除去は、二段階で実施した。最初に、超音波処理槽(Bransonic 5510E−DTH、設定;脱気)内の真空下超音波処理によって、原材料溶液を15分間脱気した。第2のステップでは、3時間にわたる10%DM原材料の500mlの溶液を通過する窒素の継続的散布によって、酸素をさらに除去した。窒素流を水蒸気で飽和させて原材料溶液からの水の蒸発を防止するために、窒素流を原材料溶液を通して散布する前に、水を通して散布した。並行して、酸素含有対照サンプルとして、同様の機構で同一プロトコルに従って、500mlの同一バッチの10w/w%DM aCSに空気を散布した。
[リグノセルロース系原材料の加水分解中におけるセルラーゼ酵素混合物のセルロース分解活性に対する酸素の効果]
リグノセルロース系原材料の加水分解中における酵素混合物のセルロース分解活性に対する酸素の効果が、この実施例で示される。酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)原材料を用いて、20w/w%DMの最終濃度で加水分解反応を実施する。この原材料溶液は、濃縮原材料溶液を水で希釈して調製する。その後、10%(w/w)NH4OH溶液によって、pHをpH4.5に調節する。
1.1Lの20%aCS、pH4.5、温度62℃、撹拌機速度60rpm(これは1m3あたり<0.002mol酸素のDOレベルに相当する)、2.5mg/g dm TEC−210セルラーゼ混合物、培養時間120時間(参考実験)。
2.実験1と同様であるが、加水分解開始時に、溶液に、20%の溶存酸素レベルへの空気散布を開始する(これはDO(溶存酸素)電極を使用した測定で、1m3あたり0.03molの酸素に相当する)。この溶存酸素レベルは、残りの加水分解処理全体を通じて維持される。
3.実験1と同様であるが、72時間目に、溶液に、20%の溶存酸素レベルへの空気散布を開始する(これはDO(溶存酸素)電極を使用した測定で、m3あたり0.03molの酸素に相当する)。この溶存酸素レベルは、残りの加水分解処理全体を通じて維持される。
[パイロット規模におけるリグノセルロース系原材料の酵素加水分解に対する部分的曝気(時間)の効果]
パイロット規模におけるリグノセルロース系原材料加水分解における、酵素混合物または組成物のセルロース分解活性に対する、溶存酸素濃度の効果が、本実施例で示される。酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)原材料を用いて、20w/w%DMの最終濃度で加水分解反応を実施する。濃縮原材料スラリーを水で希釈して、原材料溶液を調製する。25%(w/w)NH4OH溶液によって、pHをpH4.5に調節する。
実験1
0から120時間目の空気混入:150Lの20%pCS、pH4.5、温度62℃、1バールの超過圧力、ヘッドスペース内の10kg/hの気流、3.75mg TCA/g dmのTEC−210セルラーゼ混合物、270リットルパイロット反応器内で120時間の培養時間。DO電極を使用して、反応混合物の溶存酸素濃度(DO)を絶えず測定した。DOは、インペラ速度を調節することで、0.15〜0.22mol/m3のレベルに制御された。
実験2
72から120時間目の空気混入:150Lの20%pCS、pH4.5、温度62℃、2.50mg TCA/g dm TEC−210セルラーゼ混合物の酵素用量、および270リットルパイロット反応器内で120時間の総培養時間。DO電極を使用して、反応混合物の溶存酸素濃度(DO)を絶えず測定した。工程の最初の72時間は、以下の設定を適用した:超過圧力なし、ヘッドスペース内の気流なし、DOは、インペラ速度を調節することで[0.02〜0.05]mol/m3のレベルに制御された。工程の最後の48時間は、以下の設定を適用した:1バールの超過圧力、ヘッドスペース内の10kg/hの気流、DOは、インペラ速度を調節することで、0.15〜0.22mol/m3のレベルに制御された。
[リグノセルロース系原材料の酵素加水分解に対する溶存酸素供給タイミングの効果]
リグノセルロース系原材料酵素加水分解に対する、溶存酸素供給タイミングの効果が、本実施例で示される。酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)原材料を用いて、20w/w%DMの最終濃度で加水分解反応を実施する。濃縮原材料スラリーを水で希釈して、原材料溶液を調製する。25%(w/w)NH4OH溶液によって、pHをpH4.5に調節する。
実験1.0から7時間目の空気混入:1Lの20%pCS、pH4.5、温度62℃、1.5mgのTCA/g dm TEC−210セルラーゼ混合物、培養時間120時間。DO電極を使用して、反応混合物の溶存酸素濃度(DO)を絶えず測定した。DOは、加水分解処理の最初の7時間にわたり>0.05mol/m3のレベルに調節された。加水分解時間の7から120時間目には、DOは<0.02mol/m3のレベルに維持された。
実験2.72から120時間目の空気混入:1Lの20%pCS、pH4.5、温度62℃、1.5mgのTCA/g dm TEC−210セルラーゼ混合物、培養時間120時間。DO電極を使用して、反応混合物の溶存酸素濃度(DO)を絶えず測定した。DOは、加水分解処理の最初の72時間にわたり<0.01mol/m3のレベルに調節された。加水分解時間の72から120時間目には、DOは>0.05mol/m3のレベルに維持された。
[低い酵素用量を使用したリグノセルロース系原材料加水分解におけるセルラーゼ酵素組成物のセルロース分解活性に対する酸素の効果]
リグノセルロース系原材料加水分解中に低い酵素用量を使用した、酵素組成物のセルロース分解活性に対する酸素の効果が、本実施例で示される。酸前処理トウモロコシ茎葉(aCS)原材料を用いて、20w/w%DMの最終濃度で加水分解反応を実施する。この原材料溶液は、濃縮原材料溶液を水で希釈して調製する。その後、10%(w/w)NH4OH溶液によって、pHをpH4.5に調節する。適用トウモロコシ茎葉のグルカンの含有量は、37%乾物基準であった。
1.1Lの20%aCS、pH4.5、温度62℃、撹拌機速度60rpm、1グラムの原材料あたり3.5mgのTEC−210セルラーゼ組成物(乾物基準)、閉鎖反応器内で120時間の培養時間(参考実験)。DO電極を使用して、反応混合物の溶存酸素レベルを絶えず測定した。この緩慢な撹拌は、0.005mol/m3の溶存酸素レベルをもたらす。
2.実験1と同様であるが、および酵素用量、1グラムの原材料あたり2.5mgのTEC−210(乾物基準)、および250rpmの撹拌機速度、新鮮空気が絶えず新しく補給される反応混合物上のヘッドスペースを使用する。新鮮空気によるヘッドスペースの補給と組み合わされたより高い撹拌速度は、反応混合物中に0.030mol/m3の溶存酸素レベルをもたらした。
Claims (8)
- リグノセルロース系材料から糖生成物を調製する方法であって、
a)前記リグノセルロース系材料を前処理するステップと;
b)酵素組成物を使用して、前記前処理されたリグノセルロース系材料を酵素加水分解するステップであって、前記酵素組成物が少なくともエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ及びGH61を含み、ここで、1.5mg以上3.0mg未満の酵素組成物/g原材料(乾物およびタンパク質としての酵素基準)が使用され、前記酵素加水分解中に、酸素が前記前処理されたリグノセルロース系材料に添加され、前記酵素加水分解のための反応器が50m3以上の容量を有し、前記酵素加水分解における乾物含量が14〜33重量%であり、前記酵素加水分解中のpHが3.0〜6.4であり、前記酵素加水分解時間が5〜150時間であり、前記酵素加水分解が50℃〜65℃の温度で実施され、前記酵素加水分解が前記リグノセルロース系材料中の利用可能糖の70%以上が放出されるまで実施される、ステップと
を含む、方法。 - 糖生成物を回収するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素加水分解されたリグノセルロース系材料を発酵させて、発酵産物を生成する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記発酵産物が、エタノールである、請求項3に記載の方法。
- 前記発酵が、少なくとも1種のC5糖を発酵できる酵母を用いて実施される、請求項3または4に記載の方法。
- 前記酸素が、泡の形態で添加される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素組成物が、真菌に由来する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素組成物が、ラサムソニア属(Rasamsonia)酵素を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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