CN104262507B - 一种超声波协同cda酶制备龙虾壳壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，以烹饪前、后虾壳为原料，经洗涤、干燥、粉碎预处理后，采用EDTA提取其中甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖。与传统强酸强碱方法相比，本发明工艺简单，总制备时间短，仅需8-12h，EDTA可100%回收重复使用，不使用强酸、强碱，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高达92-95%、黏度高达95-105mPa·s。所制备产品呈现白色粉末状，性质稳定，可用于食品、医药、生物、化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及壳聚糖制备领域，具体涉及一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法。
背景技术
淡水小龙虾（RedSwampCrayfish），学名克氏原螯虾，原产于美国中南部，现已成为我国特别是华东地区淡水养殖虾类的主要种类之一。甲壳素(C8H13NO5)n是天然存在的N-乙酰葡萄糖胺多糖，小龙虾壳中甲壳素含量丰富，常用酸碱法提取龙虾壳甲壳素，环境污染大。
壳聚糖（Chitosan），是由甲壳素经脱乙酰基而得，化学名聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是天然多糖中唯一的碱性多糖，广泛用于纺织、医药、造纸、化妆品、食品工业、和生物技术等领域。目前工业上常用的壳聚糖制备方法均离不开强碱的脱乙酰基作用，且产品性质不稳定、能耗高、环境污染大，制备时间长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，采用EDTA提取龙虾壳甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖，整个过程不使用强酸、强碱，EDTA可100%回收重复使用，成本低、能耗少，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高，性质稳定，制备时间短。
本发明通过以下技术方案实现：
一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，包括以下步骤：
（1）虾壳预处理：对于未经烹饪的新鲜虾壳洗净、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；或者对于烹饪后的虾壳清理后洗净，经无水乙醚和无水乙醇依次洗涤，用蒸馏水洗净后过滤、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；
（2）甲壳素提取：按料液比1g：24～30ml称取虾壳粉加入质量浓度为18-20%EDTA溶液，EDTA溶液pH值为13，置于超声波清洗器中搅拌反应45-60min，超声频率为60KHz、功率为180W-240W，反应后过滤并以蒸馏水洗涤滤渣，收集滤渣烘干，再用过氧化氢溶液浸泡脱色，洗净烘干后的白色粉末为甲壳素；
（3）壳聚糖制备：按料液比1g：20ml称取甲壳素粉加入蒸馏水，100℃恒温水浴1-2h后，置于超声频率25KHz，功率400-500W超声波清洗器中，处理40-60min后，按体积比加入7%-10%的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴50℃恒温酶解2.5-3.5h，酶反应结束后，以100℃水浴下连续热灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，离心，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干得壳聚糖。
本发明进一步改进方案是，所述步骤（1）中虾壳60℃烘干，粉碎过20目筛。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（1）中无水乙醚洗涤和无水乙醇洗涤各5次。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（2）中收集滤渣50℃烘干，再用质量浓度10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡2h脱色。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（2）中以蒸馏水洗涤滤渣，提取滤液，用盐酸调节滤液pH=1，使EDTA以酸的形式沉淀回收。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（3）中称取的甲壳素粉过80目筛。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（3）中酶反应期间以质量浓度为0.1mol/l的NaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（3）中所述离心条件是指9000rpm离心10min。
本发明更进一步改进方案是，所述步骤（3）中CDA粗酶液酶活200U/mL左右（以每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位）。
本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：
本发明采用EDTA提取龙虾壳甲壳素，再以超声波协同CDA酶脱乙酰基，制备壳聚糖，利用超声波“空化作用”，使甲壳素紧密的结晶体疏松，改善甲壳素脱乙酰基酶（ChitinDeacetylation，简称CDA）与甲壳素分子之间的结合作用，同时利用CDA酶的高效催化性和专一性，大大缩短脱乙酰基时间，提高产品脱乙酰度和黏度。与传统强酸、强碱法制备壳聚糖相比，整套制备工艺，不使用强酸、强碱，EDTA可100%回收重复使用，成本低、能耗少，对环境无任何污染，产品脱乙酰度高，性质稳定，产品脱乙酰度高达92-95%、黏度高达95-105mPa·s，制备时间在8-12h，与传统的时间在48h以上相比，大幅缩短制备时间。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：烹饪前新鲜小虾头壳壳聚糖制备：将新鲜淡水小龙虾头壳洗净，置于60℃烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛。称取一定量烹饪前小龙虾头壳粉末于烧杯中，按料液比为1g:30ml的量，加入pH=13的20%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为240W的超声波清洗器中，搅拌反应60min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50℃烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾头壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比1g:20ml加入蒸馏水，100℃水浴中加热预处理2h后，置于超声频率为25KHz，功率为500W的超声波清洗器中，超声波预处理60min后，按体积比加入10%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50℃下恒温酶解3.5h，期间以0.1mol/LNaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100℃水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心10min，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾头壳壳聚糖,壳聚糖脱乙酰度92.38%、黏度95mPa·s。
实施例2：烹饪前新鲜小龙虾尾壳壳聚糖制备：将新鲜淡水小龙虾尾壳（去除头壳后剩余部分）洗净，置于60℃烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛，称取一定量烹饪前小龙虾尾壳粉末于烧杯中，按料液比为1g:24ml的量，加入pH=13的18%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为180W的超声波清洗器中，搅拌反应45min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50℃烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾尾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比1g:20ml加入蒸馏水，100℃水浴中加热预处理1h后，置于超声频率为25KHz，功率为400W的超声波清洗器中，超声波预处理40min后，按体积比加入7%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50℃下恒温酶解2.5h，期间以0.1mol/LNaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100℃水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心10min，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾尾壳壳聚糖,壳聚糖脱乙酰度93.75%、黏度98mPa·s。
实施例3：烹饪前新鲜小龙虾壳壳聚糖制备：将新鲜淡水小龙虾壳（包括头壳、尾壳）洗净，置于60℃烘箱中烘干，使用粉碎机粉碎至过20目筛，称取一定量烹饪前小龙虾壳粉末于烧杯中，按料液比为1g:28ml的量，加入pH=13的19%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为220W的超声波清洗器中，搅拌反应55min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50℃烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按料液比1g:20ml加入蒸馏水，100℃水浴中加热预处理1.5h后，置于超声频率为25KHz，功率为450W的超声波清洗器中，超声波预处理50min后，按体积比加入9%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50℃下恒温酶解3h，期间以0.1mol/LNaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100℃水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心10min，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得小龙虾壳聚糖,壳聚糖脱乙酰度94.54%、黏度101mPa·s。
实施例4：烹饪后小龙虾壳壳聚糖制备：将烹饪后小龙虾壳洗净，以无水乙醚中洗涤5次，再以无水乙醇抽提5次，用蒸馏水洗净后过滤，滤渣于60℃烘箱中烘干，粉碎机粉碎至过20目筛。称取一定量烹饪后小龙虾壳粉末于烧杯中，按料液比为1g:26ml的量，加入pH=13的18%的EDTA溶液，置于超声频率为60KHz，功率为200W的超声波清洗器中，搅拌反应50min，过滤并以蒸馏水洗涤滤渣。收集上述滤渣，于50℃烘干，再以10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡，脱色2h，洗净烘干后的白色粉末即为甲壳素。将此小龙虾壳甲壳素粉碎至过80目筛，置于烧杯中，按g/ml料液比1:20加入蒸馏水，100℃水浴中加热预处理1.5h后，置于超声频率为25KHz，功率为480W的超声波清洗器中，超声波预处理55min后，按体积比加入8%的酶活约200U/mL的CDA粗酶液，磁力搅拌水浴于50℃下恒温酶解2.5h，期间以0.1mol/LNaOH调节pH=7.5，以使酶活性最高，酶反应结束后，以100℃水浴下连续灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，9000rpm离心10min，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干，即得壳聚糖,壳聚糖脱乙酰度95.12%、黏度105mPa·s。
Claims (8)
1.一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）虾壳预处理：对于未经烹饪的新鲜虾壳洗净、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；或者对于烹饪后的虾壳清理后洗净，经无水乙醚和无水乙醇依次洗涤，用蒸馏水洗净后过滤、烘干、粉碎、置于干燥器中备用；
（2）甲壳素提取：按料液比1g：24～30ml称取虾壳粉加入质量浓度为18-20%EDTA溶液，EDTA溶液pH值为13，置于超声波清洗器中搅拌反应45-60min，超声频率为60KHz、功率为180W-240W，反应后过滤并以蒸馏水洗涤滤渣，收集滤渣烘干，再用过氧化氢溶液浸泡脱色，洗净烘干后的白色粉末为甲壳素；
（3）壳聚糖制备：按料液比1g：20ml称取甲壳素粉加入蒸馏水，100℃恒温水浴1-2h后，置于超声频率25KHz，功率400-500W超声波清洗器中，处理40-60min后，按体积比加入7%-10%的CDA粗酶液，CDA粗酶液酶活200U/mL左右，磁力搅拌水浴50℃恒温酶解2.5-3.5h，酶反应结束后，以100℃水浴下连续热灭活15min终止酶反应，迅速冷却至室温，离心，蒸馏水反复洗涤至中性，沉淀物烘干得壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（1）中虾壳60℃烘干，粉碎过20目筛。
3.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述无水乙醚洗涤和无水乙醇洗涤各5次。
4.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中收集滤渣50℃烘干，再用质量浓度10%的过氧化氢溶液在35℃水浴中浸泡2h脱色。
5.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（2）中以蒸馏水洗涤滤渣，提取滤液，用盐酸调节滤液pH=1，使EDTA以酸的形式沉淀回收。
6.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中称取的甲壳素粉过80目筛。
7.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶反应期间以质量浓度为0.1mol/L的NaOH调节pH=7.5。
8.根据权利要求1所述的一种超声波协同CDA酶制备龙虾壳壳聚糖的方法，其特征在于：所述步骤（3）中所述离心条件是指9000rpm离心10min。
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