CN106832054A - 一种壳聚糖的提取和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖的提取和制备方法，以橡胶木犀金龟为原料，经原料处理、脱无机盐、脱除蛋白质、脱色和脱乙酰基步骤，其中脱乙酰基过程中先在28wt%的氢氧化钠溶液中进行微波处理，随后再用甲壳素脱乙酰酶进行反应，最后冷冻干燥制得壳聚糖。本发明以农业害虫橡胶木犀金龟为原料，不仅能减少虫害，而且也为橡胶木犀金龟开辟新的应用资源；而且采用微波法与酶解法相结合，避免了使用高浓度碱液造成的污染及浪费，通过微波先脱去部分乙酰基，同时使得化学键以及取代位点活化，随后在甲壳素脱乙酰酶作用下发生发应，大大提高了脱乙酰度，脱乙酰度高达95.6~97.3%，获得了良好品质的壳聚糖。

Description

一种壳聚糖的提取和制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种壳聚糖的提取和制备方法。
背景技术
壳聚糖（chitosan），又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质（chitin）经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。壳聚糖已经在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。目前，壳聚糖的生产原料主要来源是虾蟹壳，先从中提取甲壳素，再脱乙酰得到壳聚糖。然而，虾蟹壳中甲壳素含量少、 无机盐含量高（大于30％），提取成本高，并不利于推广应用。
橡胶木犀金龟，属鞘翅目犀金龟科。食性杂，成虫以吸食树汁为主，食用果实较少。幼虫食用腐殖土和朽木，是分解者，并不食用植物根系。国外分布在东南亚及南亚各国，国内分布在南方的广东、广西、海南、福建、云南等省（自治区）。橡胶木犀金龟的生长发育分为卵期、幼虫期、蛹期和成虫期，幼虫期又分为3个不同龄期。橡胶木犀金龟数目繁多，繁殖率高，其幼虫为害期长达5-6个月，因此，将橡胶木犀金龟作为甲壳素来源不仅能减少虫害，而且也为橡胶木犀金龟开辟新的应用资源。
目前壳聚糖的制备方法主要有热碱降解法、酶解法、水合肼法和微波法。热碱降解法由于需使用浓碱（40%以上）且温度一般都在100℃以上，在这样的条件下，浓碱液在促乙酰基水解的同时，也能使大分子主链的糖苷键水解断裂，相对分子质量降低，产品粘度相应变小。传统的微波法存在使用氢氧化钠浓度过高且微波加热时间过长的缺点。传统的酶解法由于脱乙酰酶来源不易，要达到较高的脱乙酰度所需的酶量大，限制了其广泛的应用。水合肼法一般只适合于实验室制备高脱乙酰度的壳聚糖，难以工业生产，一是由于水合肼太贵，致使生产成本高；二是水合肼有较大的毒性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种壳聚糖的提取和制备方法。本发明以农业害虫橡胶木犀金龟为原料，采用微波法与酶解法相结合，避免了使用高浓度碱液造成的污染及浪费，通过微波先脱去部分乙酰基，同时使得化学键以及取代位点活化，随后在甲壳素脱乙酰酶作用下发生发应，大大提高了脱乙酰度，脱乙酰度高达95.6~97.3%，获得了良好品质的壳聚糖。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种壳聚糖的提取和制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟幼虫、橡胶木犀金龟蛹和橡胶木犀金龟成虫中的一种或几种，用水洗干净后进行冷冻干燥，粉碎并过20~40目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15，35~40℃下搅拌6~8小时，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为7.5~8.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度50~60℃下反应6~8h，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖。
步骤（2）、（3）以及（5）中所述的离心转速均为5500~6000r/min。
步骤（1）和步骤（5）中所述冷冻干燥的温度为-40~-30℃，干燥时间为12~18h。
本发明在脱乙酰基的过程中，先在28wt%的氢氧化钠溶液中对甲壳素进行微波处理，使得甲壳素在电磁场中由于介质损耗而引起体积加热，极性分子在磁波场中取向随电场方向改变而改变，导致分子发生旋转、振动或摆动而形成位移电流，这种扭转效应与磨擦作用产生大量的热，使反应物分子运动加剧，大大增加了反应物分子之间的碰撞频率，在极短时间内达到比传统加热法更高的活化状态，从而大幅度缩短碱处理时间。而且甲壳素分子链在反应过程中的降解程度明显下降。在以往所用的微波法中，所用的碱液浓度都在40wt%以上，本发明所用氢氧化钠溶液的浓度为28wt%，即避免了使用高浓度碱液，在微波处理后，首先脱去部分的乙酰基（40%~50%），并且由于微波的作用使得甲壳素中与乙酰基相连接的化学键发生活化，也使得甲壳素脱乙酰酶作用的取代位点发生活化，随后在甲壳素脱乙酰酶的作用下进一步发生脱乙酰反应，使得脱乙酰度大大提高。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明以农业害虫橡胶木犀金龟为原料，不仅能减少虫害，而且也为橡胶木犀金龟开辟新的应用资源；
（2）本发明的脱乙酰基过程采用微波法与酶解法相结合，避免了使用高浓度碱液造成的污染及浪费，通过微波先脱去部分乙酰基，同时使得化学键以及取代位点活化，随后在甲壳素脱乙酰酶作用下发生发应，大大提高了脱乙酰度，脱乙酰度高达95.6~97.3%，获得了良好品质的壳聚糖；
（3）本发明避免了甲壳素大分子主链的糖苷键水解断裂，所得到的壳聚糖的粘度为335~357mPa•S；
（4）本发明的制备条件温和，工艺过程产生的废液少，对环境污染小，适合推广使用。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种壳聚糖的提取和制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取3龄期橡胶木犀金龟幼虫，用水洗干净后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-40℃，干燥时间为12h，粉碎并过20目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15，35℃下搅拌8小时，随后离心分离20min，离心转速为5500r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离20min，离心转速为5500r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离20min，离心转速为5500r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为7.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度50℃下反应8h，随后离心分离20min，离心转速为5500r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖，冷冻干燥的温度为-40℃，干燥时间为12h。
实施例2
一种壳聚糖的提取和制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟成虫，用水洗干净后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-35℃，干燥时间为15h，粉碎并过40目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15，40℃下搅拌6小时，随后离心分离18min，离心转速为5800r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离18min，离心转速为5800r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离18min，离心转速为5800r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为8.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度60℃下反应6h，随后离心分离18min，离心转速为5800r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖，冷冻干燥的温度为-35℃，干燥时间为15h。
实施例3
一种壳聚糖的提取和制备方法，具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟蛹和橡胶木犀金龟成虫（蛹和成虫质量比为1:1），用水洗干净后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-30℃，干燥时间为18h，粉碎并过30目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15，38℃下搅拌7小时，随后离心分离15min，离心转速为6000r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离15min，离心转速为6000r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离15min，离心转速为6000r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为8.0，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度55℃下反应7h，随后离心分离18min，离心转速为6000r/min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖，冷冻干燥的温度为-30℃，干燥时间为18h。
性能测试
测试标准：
1. 壳聚糖脱乙酰度的测定：采用简单的滴定分析方法测定壳聚糖的脱乙酰度。称取制备的壳聚糖（mg），加入v 1 mL 0.1mol/L HCl溶液，溶解后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定过量的HCl溶液，消耗NaOH的体积v 2，根据下面的公式计算出壳聚糖脱乙酰度。
式中，c 1为HCl标准溶液的浓度，v 1为加入HCl的体积，c 2为NaOH标准溶液的浓度，v 2为加入NaOH的体积，m 为壳聚糖的质量，M （-NH2） 为-NH2的质量摩尔浓度，W （-NH2） 为-NH2的质量百分数。
2. 壳聚糖粘度的测定：将制备得到的壳聚糖置于NDJ-5S型粘度计下检测，称取制备的壳聚糖，粘度计转速为60RPm，测定其粘度。
对本发明实施例1~3制得的壳聚糖的脱乙酰度、粘度进行测定，并取松墨天牛、叩头虫、暗黑鳃金龟、黑水虻和黄粉虫的成虫，按照本发明实施例2的方法提取和制备壳聚糖作为对照1，并连同市售壳聚糖作为对照2，检测结果如表1所示：
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种壳聚糖的提取和制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）原料处理：取橡胶木犀金龟幼虫、橡胶木犀金龟蛹和橡胶木犀金龟成虫中的一种或几种，用水洗干净后进行冷冻干燥，粉碎并过20~40目筛得虫粉，备用；
（2）脱除无机盐：将步骤（1）得到的虫粉加入到1mol/L的盐酸溶液中，固液比为1:15，35~40℃下搅拌6~8小时，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；
（3）脱除蛋白质：将步骤（2）所得物料加入到8wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:10，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为750W，处理时间3min后，冷却至室温浸泡2h，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，得到甲壳素；
（4）脱色：将步骤（3）所得甲壳素加入高锰酸钾进行脱色处理，随后将脱色后的固体用蒸馏水洗涤至中性；
（5）脱乙酰基：将步骤（4）所得物料加入到28wt%的氢氧化钠溶液中，固液比为1:18，充分搅拌后，进行微波处理，微波功率为1350W，处理时间5min后取出，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性；随后将所得物料分散到50mM Tris-HCl的缓冲液中，固液比为1:50，调节溶液pH为7.5~8.5，随后再加入占溶液总质量0.2wt%的甲壳素脱乙酰酶，在温度50~60℃下反应6~8h，随后离心分离15~20min，将所得固体用蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥制得壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖的提取和制备方法，其特征在于：步骤（2）、（3）以及（5）中所述的离心转速均为5500~6000r/min。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖的提取和制备方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（5）中所述冷冻干燥的温度为-40~-30℃，干燥时间为12~18h。
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