CN102199228A - 一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶t2菌株产生几丁质酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及蝇蛆甲壳素在诱导深绿木霉T2菌株产生几丁质酶中的应用，属于生物技术领域。其中蝇蛆甲壳素的制备工艺主要是将传统的盐酸除钙工艺改为EDTA除钙，减少了废酸排放的环境污染，避免了浓酸对甲壳素分子链的破坏，获得了高品质的甲壳素产品；在蝇蛆壳聚糖的制备工艺中，将高温浓碱回流4h的传统工艺改为氢氧化钠-戊醇反应体系，并采用微波加热处理两次，提高了碱液利用率，极大的缩短了反应时间，节约了能源消耗，获得了含水量低，脱乙酰度较高的白色粉末状壳聚糖产品。本发明的蝇蛆甲壳素还可以作为碳源，诱导深绿木霉T2菌株产生几丁质酶，其诱导效果显著。

Description

一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用。

背景技术

甲壳素(Chitin)又名几丁质、甲壳质、壳多糖、聚乙酰氨基葡萄糖等，化学名为1，4-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β-1，4键结合而成的直链多聚物(C₁₆H₂₆O₁₀N₂)n。广泛存在于甲壳纲动物虾、蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌(酵母，霉菌)、藻类及植物的细胞壁中。壳聚糖(Chitosan)则是甲壳素脱去C₂乙酰基的产物，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、聚葡萄糖胺等，化学名为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-B-D-葡萄糖。

目前国内甲壳素和壳聚糖的生产主要集中在沿海城市，大多以虾、蟹壳为原料，以蝇蛆为原料获取甲壳素和壳聚糖的甚少。由于来源不同，蝇蛆甲壳素和壳聚糖的获取在工艺条件上与虾、蟹壳同类物质的获取是有差异的，而目前提取蝇蛆甲壳素和壳聚糖所用方法几乎是完全的套用以虾、蟹壳为原料的提取工艺。这种以浓酸浓碱制备甲壳素和壳聚糖的方法，不仅成本高、能耗大、产品品质差，而且会造成严重的环境污染。

木霉菌(Trichoderma spp.)是最有开发利用潜力因而最受关注的一类植物病害生物防治微生物，产生几丁质酶是其主要生防作用机制之一。木霉分泌产生的一系列细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要的作用，其中以几丁质酶尤为重要。目前以对哈茨木霉几丁质酶研究最为深入。据报道木霉几丁质酶在非诱导条件下表达量很少，而在诱导条件下大量产生，其中内切几丁质酶产生较多，并表现出极高的抑菌活性。关于不同营养条件对哈茨木霉、哈茨木霉TM菌株、哈茨木霉P1菌株几丁质酶产生的诱导效果国内外已有报道，而且诱导产生的几丁质酶粗提物对多种病原真菌均有显著的拮抗活性。有关利用蝇蛆甲壳素(几丁质)和蝇蛆壳聚糖(脱乙酰几丁质多糖)对深绿木霉T2菌株产生几丁质酶影响的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺，解决了以浓酸浓碱制备甲壳素和壳聚糖的传统工艺中存在的成本高、能耗大、产品品质差，而且会造成严重的环境污染的缺点。

本发明的另一个目的是提出一种蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用。

实现上述目的的技术方案如下：

一种蝇蛆甲壳素的制备工艺，以蝇蛆为原料制成粉体，经除钙、除蛋白质、氧化及还原处理后制得甲壳素，所述除钙过程采用EDTA除钙法。

进一步地，蝇蛆甲壳素的制备工艺，具体包括如下步骤：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡20～30h，除去钙质，后过滤除去EDTA，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用8～12％NaOH水溶液，沸水浴1.5～3h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，且期间至少更换4次碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.3～0.8％KMnO₄水溶液浸渍氧化20～60min，水洗除尽KMnO₄后，再用0.5～1.5％草酸水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

采用上述制备工艺制得的蝇蛆甲壳素为原料来制备壳聚糖，其制备工艺包括如下步骤：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与35～45％的NaOH-戊醇溶液混合均匀，置于700～900W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次2～3min，中途过滤更换NaOH-戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于4～6％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用8～12％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。

本发明还提供了蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用，以蝇蛆甲壳素为碳源，最佳产酶时间为120h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)在蝇蛆甲壳素的制备工艺中，将传统的盐酸除钙工艺改为EDTA除钙，减少了废酸排放的环境污染，避免了浓酸对甲壳素分子链的破坏，获得了高品质的甲壳素产品。

(2)在蝇蛆壳聚糖的制备工艺中，将高温浓碱回流4h的传统工艺改为氢氧化钠-戊醇反应体系，并采用微波加热处理两次，提高了碱液利用率，极大的缩短了反应时间，节约了能源消耗。获得了含水量低，脱乙酰度较高的白色粉末状壳聚糖产品。

(3)本发明的蝇蛆甲壳素、壳聚糖的优化制备工艺及蝇蛆甲壳素在诱导深绿木霉T2菌株产生几丁质酶中的应用，可以通过下述试验得到进一步的说明。

1材料方法

1.1蝇蛆甲壳素和壳聚糖优化后的制备工艺流程：

1.2蝇蛆甲壳素和壳聚糖提取

甲壳素提取：将干蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用。称取清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡24h，除去钙质，过滤除去EDTA(回收性再用)。蛆皮用水洗至中性，再用10％NaOH水溶液，沸水浴2h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，并每隔半小时更换碱液。加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品。然后用0.5％KMnO₄水溶液浸渍氧化30min，水洗除尽KMn_O4后，再用1％草酸(H₂C₂O₄)水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应约40min，待产物变白为止。水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

壳聚糖的提取：称取精制的蝇蛆甲壳素与40％的NaOH正戊醇溶液混合均匀，呈糊状物。置于800W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次3min，中途过滤更换戊醇-氢氧化钠混合液一次。反应结束后，用热水洗涤至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于5％醋酸(CH₂COOH)溶液中，过滤除去不溶物，再用10％NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色的与淀粉十分相似的壳聚糖粉末。

1.3蝇蛆甲壳素、壳聚糖产品品质测定

(1)蝇蛆甲壳素灰分测定

将瓷坩埚用25％盐酸溶液煮沸10min，放入500～600℃马福炉中灼烧30min，待炉温降到200℃以下时取出坩埚，置于干燥器中，冷却30min，称重，准确到0.001g。

精确称取样品2g置于坩埚内，在300℃下灼烧2h，使其完全炭化，再将马福炉温度升至600℃灼烧2h，使全部变为灰白。关闭电源，待冷却到200℃时取出置于干燥器中冷却30min后称重，再置于马福炉中灼烧1h。如此反复，直至前后重复不超过0.2mg为止。记录试验数据。按下式计算蝇蛆甲壳素灰分含量。

式中M₁为坩埚+样品重量；M₂为坩埚+灰分重量；M₃为灼烧至恒重时坩埚重量

(2)蝇蛆壳聚糖脱乙酰度及水分含量测定

脱乙酰度测定：准确称取500mg壳聚糖样品，置于250ml锥形瓶中，加入0.3mol/L HCl标准溶液20ml，振荡溶解(20～25℃)1h后，滴加0.1％甲基橙指示剂2～4滴，然后，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定过量的盐酸，当溶液颜色由红变橙时，即为滴定终点，按下式计算蝇蛆壳聚糖脱乙酰度。

${\mathrm{NH}}_2\%=\frac{N_1{V}_1-N_2{V}_2}{2}\×0.016\×100\%$

式中N₁为HCl摩尔浓度；V₁为HCl的加入量；N₂为NaOH摩尔浓度；V₂为NaOH的加入量；W为干燥样品质量；0.016为与1ml的0.3mol/L的HCl相当的胺基量。

水分含量测定：将称量瓶在100℃恒温干燥箱内干燥1h，取出后放于干燥器中冷却30min，用分析天平准确称重。随后，在称量瓶中加入2g样品(精确到0.1mg)，置于恒温干燥箱中，在105℃下干燥2h，取出称重，反复干燥至恒重为止，按下式计算蝇蛆壳聚糖水分含量。

式中M₁为样品干燥前重量；M₂为样品干燥后重量；M₃为称量瓶加样品重量；M₄为称量瓶重量

1.4胶体几丁质A和胶态几丁质B的制备

胶体几丁质A(用于酶活性诱导)：称取2g蝇蛆甲壳素，加入少许蒸馏水研磨，溶解在35m l浓盐酸中，4℃放置24h，滤纸过滤到100mL无离子水中，用稀氢氧化钠溶液中和，加无离子水补足到200mL，4℃下保存备用。

胶态几丁质B(用于酶活性测定)：称取1g蝇蛆甲壳素，加入4mL丙酮研磨至糊状，其间可适量加入丙酮，充分研细。在10℃下边研磨边缓缓加入浓盐酸40mL，几分钟后，用玻璃棉过滤，然后将滤液缓缓加入到剧烈搅拌的50％乙醇中(至少是滤液的5倍以上)，使胶状几丁质沉淀析出。倾去上清液，收集胶状几丁质，用蒸馏水冲洗几次后使pH为7，置透析袋透析过夜，4℃下避光保存备用。

1.5蝇蛆甲壳素、壳聚糖对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响

1.5.1不同营养条件培养基的制备

PDA培养基(g/L)、PDB液体培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖18g，水1000ml。

SCMS营养液(mg/L)：KH₂PO₄680mg，K₂HPO₄870mg，KCl 200mg，NH₄NO₃1g，MgSO₄ 7H₂O 200mg，CaCl₂ 200mg，FeSO₄2mg，ZnSO₄7H₂O 2mg，Mn₂SO₄H₂O 2mg，蔗糖5g，蒸馏水定容至1000ml，用盐酸调pH值至6.5。

蝇蛆甲壳素培养基(mg/L)：在SCMS营养液中加入胶态几丁质A 200mL(含有蝇蛆甲壳素成分2g)。

壳聚糖培养基(mg/L)：在SCMS营养液基础上加入1％蝇蛆壳聚糖溶液100mL。

1.5.2孢子悬浮液的配制

挑取PDA平板上培养3d的深绿木霉T2菌株孢子，采用血球计数板倍量稀释法进行孢子量的计数，用无菌水调配成1×10¹⁰个/mL的孢子悬浮液。

1.5.3不同营养条件对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响

将配制好的PDB、SCMS营养液、蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基培养基分别装入150mL三角瓶，每瓶60mL高压蒸汽灭菌，冷却后于超净工作台上用移液枪吸取1mL深绿木霉孢子悬浮液接种到装有不同培养基的三角瓶中，在28℃、150r/min的恒温摇床上培养9d，从第2d开始每天取30mL制备几丁质酶粗提液，30mL培养液4℃下5000r/min离心10min，取上清液。在上清液中缓慢加入磨碎的分析纯硫酸铵晶体15g，玻璃棒搅拌。室温静置过夜，取沉淀。加5mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，若出现浑浊，再离心，(4℃，8000r/min，10min)取上清液，用0.2μm微孔滤膜过滤除分生孢子即得几丁质酶粗提液，标记并在4℃下保存备用。

1.5.4深绿木霉T2菌株几丁质酶活性测定

1.5.4.1-乙酰氨基葡萄糖量与吸光度标准曲线：参照李华的方法。

1.5.4.2几丁质酶活性测定

将胶状几丁质B溶液1.5mL(含4mg几丁质)、0.1mol/L的乙酸缓冲液(pH4.5)0.5mL分别加入编号的4组试管中，再加入分别加入四种培养条件下几丁质酶粗提液0.4mL，37℃下反应3h后，1000r/min离心2mim，取1.5ml上清液，加入0.1ml的3％脱盐蜗牛酶和0.15ml的1mol/L磷酸缓冲液(pH7.1)，37℃反应1h，以进一步水解内切几丁质酶、几丁二糖酶所产生的几丁质片段。并以同样处理的包括底物和酶(加热失活)的反应液为标准对照。紫外分光光度计测定420nm处的光密度值(OD)，根据标准曲线求得产生的N-乙酰氨基葡萄糖量。以每小时分解胶体几丁质产生1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位(U)。

1.6不同营养条件下诱导培养的深绿木霉对4种病原菌抑制作用

采用平板对峙法测定经蝇蛆甲壳素培养基、壳聚糖培养基培养的深绿木霉T2对草坪草根腐病菌瓜果腐霉〔Pythium.aphaniderma tum(Edson)Fitzpatrick〕、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucvmerinum)、百合根腐病菌(Fusarium.oxysporum)的抑菌效果，待供试菌长好后，用直径6mm的打孔器取菌饼，将以上两种培养基培养的深绿木霉T2和供试病原菌同时置于PDA培养基的两边，置于25℃条件下培养，以PDA培养基培养的深绿木霉T2和供试菌的对峙培养为对照，每处理重复3次。对峙培养72小时后，记录菌落半径并观察抑菌作用，统计拮抗系数。

拮抗系数分级标准为：I深绿木霉菌丝占据平皿100％，H深绿木霉菌丝占据平皿＞5/6，III深绿木霉菌丝占据平皿＜5/6，＞2/3，IV深绿木霉菌丝占据平皿＜2/3，＞1/2，V深绿木霉菌丝占据平皿＜1/2，＞1/3，VI病原菌菌丝占据平皿100％。

2结论

2.1蝇蛆甲壳素和壳聚糖优化后的提取工艺流程与传统方法的比较

蝇蛆甲壳素提取中用EDTA代替盐酸：虽然成本较盐酸高，但容易回收，可重复使用，总体成本并不增加，而且还解决了使用盐酸后废酸处理、环境污染及设备损耗等问题。

蝇蛆甲壳素制备中脱乙酰过程在醇相溶液中进行，并将回流加热装置改为微波炉加热。

醇相溶液的优势：甲壳素脱乙酰反应实质上是酰胺的水解过程，是OH-作为亲核试剂进攻甲壳素中乙酰氨基，并将其水解为氨基的过程。因此，OH-亲核性越强，越有利于脱乙酰反应的进行。在水及低级醇类等极性溶剂中，亲核试剂OH-被溶剂化了，大大降低了OH-的亲核活性。而采用极性弱、沸点较高的正戊醇，可使反应中OH-的亲核性远强于在水溶液或其他低级醇类溶液，促进反应的正向进行。

醇相反应体系加热最高可升温至139℃，可极大的促进脱乙酰反应的进行。一方面反应需要一定的活化能，所以温度升高有利于反应的进行，另一方面，温度低时NaOH不溶于戊醇，反应属固-固-液反应体系，高温增加了NaOH在戊醇中的溶解度，增大了反应物的接触面积，提高了反应发生的速率。

微波加热的优势：壳聚糖生产的传统工艺是在大量浓碱溶液中沸腾反应，或在较低温度下反应数十小时之久，才能得到脱乙酰度较高的产品。因此，减少碱用量，降低反应温度，缩短反应时间，是减少原料消耗和能耗，降低壳聚糖生产成本的关键。

采用了NaOH-戊醇反应体系，以半干法微波方式制备壳聚糖，可获得脱乙酰度为95.5％的高质量壳聚糖产品，且碱用量下降10％左右，反应时间可由4h缩短为6min。

2.2蝇蛆甲壳素、壳聚糖产品品质

利用蝇蛆提取甲壳素提取率为75％；经测定制备的蝇蛆甲壳素灰分含量为17.3％；制备的蝇蛆壳聚糖脱乙酰度为95.5％，含水量为8.36％。

2.3N-乙酰氨基葡萄糖量与吸光度标准曲线

表1为在420nm处测定的不同浓度N-乙酰氨基葡萄糖的吸光值，同时，如图1所示，以0.85减去吸光值的差值为纵坐标，以N-乙酰氨基葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线，并对出该曲线进行拟合，发现其呈现对数增长关系。根据以上曲线拟合的方程可求得不同糖量对应的吸光度的关系，关系式为：

y＝0.3651ln(x)+0.0029

表1不同浓度N-乙酰氨基葡萄糖量吸光值

2.4蝇蛆甲壳素、壳聚糖对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响

2.4.1四种培养基对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响

通过四种不同营养条件的培养基对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生影响试验，结果表明蝇蛆甲壳素培养基中深绿木霉T2菌株几丁质酶活性明显高于其他三种培养基的，经方差分析发现，蝇蛆甲壳素培养基中几丁质酶活性与PDB培养基中几丁质酶活性之间存在极显著差异，其它两种培养基的酶活性介于二者之间，表明蝇蛆甲壳素具有诱导深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的作用(表2)。

表2四种培养基对深绿木霉T2菌株几丁质酶活性的影响

注：大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上的显著性。

2.4.2四种培养基不同培养时间对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响

培养时间是影响深绿木霉几丁质酶产量的一个重要因素，不同营养条件下培养5d(第120h测定)的酶活性均出现高峰值，其中蝇蛆甲壳素培养基的酶活性最高为1.8340U/mL，对照培养基(PDB培养基)的酶活性最低，为1.0967U/mL，而壳聚糖培养基和SCMS营养液的酶活值介于二者之间，并且相差不大，随后酶活值下降，在第7d四种不同培养基深绿木霉几丁质酶活值出现另一峰值，但均低于第5d的酶活值，同时蝇蛆甲壳素培养基的酶活性与其他三种培养基的酶活值相差不大；方差分析结果表明四种培养条件下深绿木霉几丁质酶在第5d的酶活值均较其他培养天数的达极显著差异。由此可以断定深绿木霉产几丁质酶的最佳培养时间应为120h(表3)。

表3不同培养时间对深绿木霉T2菌株几丁质酶活性影响

注：大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平上的显著性。

2.5不同营养条件下培养的深绿木霉对4种病原菌抑制作用

对峙培养72小时后，不同营养条件下诱导培养的深绿木霉T2菌株对草坪草根腐病菌瓜果腐霉〔Pythium.aphaniderma tum(Edson)Fitzpatrick〕、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucvmerinum)、百合根腐病菌(Fusarium.oxysporum)的生长均有抑制作用，其中甲壳素培养基培养的深绿木霉T2菌株对四种病原菌菌丝的生长抑制作用最为明显，除对黑星菌的拮抗系数为II外，其余均为I；而壳聚糖培养基培养的深绿木霉T2菌株对四种病原菌菌丝的生长抑制作用相差不大，除了对灰霉菌的拮抗系数为III外，其余均为均为II，详见表4。

表4不同营养条件下深绿木霉T2对3种病原菌的抑制效果

附图说明

图1为不同浓度N-乙酰氨基葡萄糖光密度图。

具体实施方式

实施例1

本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺，按如下步骤进行制备：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用(0.3mol/L)饱和EDTA溶液浸泡24h，除去钙质，后过滤除去EDTA(回收性再用)，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用10％NaOH水溶液，沸水浴2h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，并每隔半小时更换碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.5％KMnO₄水溶液浸渍氧化30min，水洗除尽KMnO₄后，再用1％草酸(H₂C₂O₄)水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

实施例2

本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺，按如下步骤进行制备：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡20h，除去钙质，后过滤除去EDTA(回收性再用)，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用8％NaOH水溶液，沸水浴1.5h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，并每隔半小时更换碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.3％KMnO₄水溶液浸渍氧化60min，水洗除尽KMnO₄后，再用0.5％草酸(H₂C₂O₄)水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

实施例3

本实施例为蝇蛆甲壳素的制备工艺，按如下步骤进行制备：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡30h，除去钙质，后过滤除去EDTA(回收性再用)，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用12％NaOH水溶液，沸水浴3h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，并每隔半小时更换碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.8％KMnO₄水溶液浸渍氧化20min，水洗除尽KMnO₄后，再用1.5％草酸(H₂C₂O₄)水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

实施例4

本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺，按如下步骤进行：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与40％的NaOH-正戊醇溶液混合均匀，置于800W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次3min，中途过滤更换NaOH-正戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于5％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用10％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。

实施例5

本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺，按如下步骤进行：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与35％的NaOH-正戊醇溶液混合均匀，置于700W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次2min，中途过滤更换NaOH-正戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于4％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用8％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。

实施例6

本实施例为蝇蛆壳聚糖的制备工艺，按如下步骤进行：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与35％的NaOH-正戊醇溶液混合均匀，置于900W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次2min，中途过滤更换NaOH-正戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于6％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用12％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。

实施例7

本实施例为蝇蛆甲壳素和蝇蛆壳聚糖对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生的影响。

(1)制备PDB、SCMS营养液、蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基：

PDA培养基(g/L)、PDB液体培养基(g/L)：马铃薯200g，葡萄糖18g，水1000ml。

SCMS营养液(mg/L)：KH₂PO₄680mg，K₂HPO₄870mg，KCl 200mg，NH₄NO₃1g，MgSO₄7H₂O 200mg，CaCl₂200mg，FeSO₄2mg，ZnSO₄7H₂O 2mg，Mn₂SO₄H₂O 2mg，蔗糖5g，蒸馏水定容至1000ml，用盐酸调pH值至6.5。

蝇蛆甲壳素培养基(mg/L)：在SCMS营养液中加入胶态几丁质A 200mL(含有蝇蛆甲壳素成分2g)。

壳聚糖培养基(mg/L)：在SCMS营养液基础上加入1％蝇蛆壳聚糖溶液100mL。

(2)几丁质酶粗提液：

将步骤(1)中配制好的蝇蛆甲壳素培养基和蝇蛆壳聚糖培养基分别装入150mL三角瓶，每瓶60mL高压蒸汽灭菌，冷却后于超净工作台上用移液枪吸取1mL深绿木霉孢子悬浮液接种到装有不同培养基的三角瓶中，在28℃、150r/min的恒温摇床上培养9d，从第2d开始每天取30mL制备几丁质酶粗提液，30mL培养液4℃下5000r/min离心10min，取上清液。在上清液中缓慢加入磨碎的分析纯硫酸铵晶体15g，玻璃棒搅拌。室温静置过夜，取沉淀。加5mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，若出现浑浊，再离心，(4℃，8000r/min，10min)取上清液，用0.2μm微孔滤膜过滤除分生孢子即得几丁质酶粗提液，标记并在4℃下保存备用。

(3)几丁质酶活性测定：

将胶状几丁质B溶液1.5mL(含4mg几丁质)、0.1mol/L的乙酸缓冲液(pH4.5)0.5mL分别加入编号的4组试管中，再分别加入四种培养条件下几丁质酶粗提液0.4mL，37℃下反应3h后，1000r/min离心2mim，取1.5ml上清液，加入0.1ml的3％脱盐蜗牛酶和0.15ml的1mol/L磷酸缓冲液(pH7.1)，37℃反应1h，以进一步水解内切几丁质酶、几丁二糖酶所产生的几丁质片段。并以同样处理的包括底物和酶(加热失活)的反应液为标准对照。紫外分光光度计测定420nm处的光密度值(OD)，根据标准曲线求得产生的N-乙酰氨基葡萄糖量。以每小时分解胶体几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位(U)。

通过四种不同营养条件的培养基对深绿木霉T2菌株几丁质酶产生影响试验，结果表明蝇蛆甲壳素培养基中深绿木霉T2菌株几丁质酶活性明显高于其他三种培养基的，比PDB液体培养基中深绿木霉T2菌株几丁质酶活性高1.13倍，且与其它三种培养基中深绿木霉T2菌株几丁质酶活性之间存在极显著差异。

实施例8

本实施例为不同营养条件下培养的深绿木霉对4种病原菌抑制作用

(1)四种供试病原菌

采用常规PDA平板培养基在25℃恒温箱中培养草坪草根腐病菌瓜果腐霉〔Pythium.aphaniderma tum(Edson)Fitzpatrick〕、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucvmerinum)、百合根腐病菌(Fusarium.oxysporum)4种供试病原菌。

(2)不同营养条件下培养的深绿木霉T2与四种病原菌的对峙培养

待供试菌长好后，用直径6mm的打孔器取菌饼，将以上两种培养基培养的深绿木霉T2和供试病原菌同时置于PDA培养基的两边，置于25℃条件下培养，以PDA培养基培养的深绿木霉T2和供试菌的对峙培养为对照，每处理重复3次。对峙培养72小时后，记录菌落半径并观察抑菌作用，统计拮抗系数。

拮抗系数分级标准为：I深绿木霉菌丝占据平皿100％，II深绿木霉菌丝占据平皿＞5/6，III深绿木霉菌丝占据平皿＜5/6，＞2/3，IV深绿木霉菌丝占据平皿＜2/3，＞1/2，V深绿木霉菌丝占据平皿＜1/2，＞1/3，VI病原菌菌丝占据平皿100％。

(3)不同营养条件下培养的深绿木霉对4种病原菌抑制作用

对峙培养72小时后，不同营养条件下诱导培养的深绿木霉T2菌株对草坪草根腐病菌瓜果腐霉〔Pythium.aphanidermatum(Edson)Fitzpatrick〕、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucvmerinum)、百合根腐病菌(Fusarium.oxysporum)的生长均有抑制作用，其中甲壳素培养基培养的深绿木霉T2菌株对四种病原菌菌丝的生长抑制作用最为明显，除对黑星菌的拮抗系数为II外，其余均为I；而壳聚糖培养基培养的深绿木霉T2菌株对四种病原菌菌丝的生长抑制作用相差不大，除了对灰霉菌的拮抗系数为III外，其余均为均为II。

Claims (4)

1.一种蝇蛆甲壳素的制备工艺，以蝇蛆为原料制成粉体，经除钙、除蛋白质、氧化及还原处理后制得甲壳素，其特征在于，所述除钙过程采用EDTA除钙法。

2.根据权利要求1所述的蝇蛆甲壳素的制备工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡20～30h，除去钙质，后过滤除去EDTA，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用8～12％NaOH水溶液，沸水浴1.5～3h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，且期间至少更换4次碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.3～0.8％KMnO₄水溶液浸渍氧化20～60min，水洗除尽KMnO₄后，再用0.5～1.5％草酸水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

3.一种用权利要求1或2所述的蝇蛆甲壳素制备壳聚糖的工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与35～45％的NaOH-戊醇溶液混合均匀，置于700～900W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次2～3min，中途过滤更换NaOH-戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于4～6％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用8～12％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。

4.一种根据权利要求1所述的蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用。

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