CN116121087A - 一种产朊假丝酵母菌的培养与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菌种培养技术领域，尤其涉及一种产朊假丝酵母菌的培养与应用。本发明将产朊假丝酵母菌接种到液体培养基中培养，再接种到固体培养基表面培养，得到产朊假丝酵母菌。与现有技术相比，本发明制备的产朊假丝酵母菌繁殖快，菌种数量多，蛋白含量高。

Description

一种产朊假丝酵母菌的培养与应用

技术领域

本发明涉及菌种培养技术领域，尤其涉及一种产朊假丝酵母菌的培养与应用。

背景技术

产朊假丝酵母菌（Candida utilis）属于真菌门，子囊菌纲，原子囊菌亚纲，内孢霉目，内孢霉科，茁芽酵母亚科，假丝酵母属。又名产朊圆坶或食用圆拟酵母、食用球拟酵母。培养在麦芽琼脂斜面上的菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐或菌丝状。对葡萄糖、蔗糖、棉子糖能发酵；麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖不发酵，不能分解脂肪，能同化及利用硝酸盐。产朊假丝酵母的蛋白质含量和维生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸盐作为氮源，在培养基中不需要加入任何刺激生长的因子，即可生长。特别是它能利用已糖和戊糖，即能利用造纸工业的亚硫酸废液、木材水解液、废糖蜜等，生产人、畜可食用的蛋白质。

产朊假丝酵母是被广泛公认的畜禽动物益生菌，酵母发酵饲料含有丰富的蛋白、小肽及氨基酸，增加饲料的营养价值；产阮假丝酵母菌体所含蛋白质和维生素Ｂ含量均较高，且生长所需营养物质更简单、可利用许多工农业副产物做原料生长繁殖，菌体代谢后常常散发出宜人的香气，可增加动物摄食欲望、提高生产能力。但是在饲料领域，产朊假丝酵母菌的培养受限，繁殖速率慢，蛋白含量低，生产价值有待进一步提高。

发明授权专利CN105385612B公开一株新的产朊假丝酵母菌，含该菌的益生菌剂组合物以及产朊假丝酵母菌和其益生菌剂组合物在棉粕发酵和含氨氮废液处理中的应用。该发明还提供制备发酵饲料益生菌剂组合物的方法。该发明还提供了通过紫外线诱变育种筛选获得高氨氮同化率和高棉酚降解率酵母菌突变株的方法。该发明提供的产朊假丝酵母菌氨氮同化率高，降解棉酚能力强，发酵菌体生物量和蛋白质含量高。采用该菌株处理含氨氮废液可以有效降低氨氮含量，并可形成饲用菌体蛋白；采用含该菌株的益生菌剂及其组合物发酵棉粕，可显著降低棉粕中有毒物棉酚的含量，提高粗蛋白含量和水溶性蛋白含量，并可部分替代豆粕用于饲养动物。但是该发明制备的产朊假丝酵母菌蛋白含量低，培养过程中繁殖慢。

发明专利申请CN115011491A公开了一种产朊假丝酵母菌的培养工艺，包括以下步骤，S1：制备出固体培养基，高压蒸汽灭菌，灭菌完毕后，对需要制成斜面的固体培养基，趁热将试管上部垫于一根玻璃棒上，使培养基斜面长度为试管长度的1/2。该发明中优化条件为培养时间13h、温度30°C、摇床转速为180r/min、碳氮比（葡萄糖和蛋白胨质量比）为3:1时菌体密度最高，即生长效果最好，故该培养工艺基于以上参数，保证了产朊假丝酵母菌的菌群活力和菌种繁衍效率。但是该产朊假丝酵母菌的培养方法依然存在繁殖速度慢，蛋白含量低的问题。

发明内容

有鉴于现有技术中产朊假丝酵母菌蛋白含量低，培养过程中繁殖慢的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种蛋白含量高，繁殖快的产朊假丝酵母菌的培养与应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种产朊假丝酵母菌的培养方法，步骤如下：

步骤1、从产朊假丝酵母菌的菌种中取一环菌体，接种到1~3L液体培养基中，摇匀，培养条件为28~32℃，转速为80~150r/min，培养时间为40~50h，停止培养，使其活菌数量达到10⁵~10⁷个/mL以上，得到菌液；

步骤2、对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，从步骤1制备的菌液接种到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在固体培养基表面均匀涂开；

步骤3、培养温度为28~32℃，培养时间为48~96h，得到产朊假丝酵母菌。

优选的，所述步骤2中菌液的接种量为所述固体培养基质量的8~15％。

所述液体培养基采用如下配方配置而成：150~250g/L葡萄糖、40~60g/L牛肉蛋白胨、0.5~1g/L磷酸氢二钾、0.4~0.6g/L七水硫酸镁、0.01~0.05g/L维生素B1、1~5g/L透明质酸、溶剂为水。

所述固体培养基采用如下配方配置而成：2~6wt%葡萄糖、2~3wt%牛肉蛋白胨、0.1~1wt%氯化钠、2~3wt%琼脂、0.1~0.3wt%促进剂、余量为水。

所述促进剂的制备方法如下，以重量份计：

S1、将0.3~0.5份改性甲壳素加入8~12份5~10wt%氢氧化钠水溶液和8~12份2~6wt%尿素水溶液组成的混合溶液中，在-25~-10℃下保持20~30h，然后常温解冻后搅拌20~40min，搅拌速度为100~300rpm，200~400目筛网过滤得到混合溶液；

S2、将8~12份步骤S1制备的混合溶液置于油浴中，在速度为100~300rpm搅拌下滴加0.2~0.6份20~35wt%过氧化氢水溶液，油浴温度控制在40~60℃，反应时间4~8h，加入1~3份8~12wt%硫酸氢钠水溶液终止反应，用0.2~0.8mol/L盐酸调整pH值至中性，400~550目筛网过滤，滤液用切向流超滤系统进行过滤，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，采用无水乙醇洗涤，真空30~50℃干燥8~20h，得到促进剂。

优选的，所述步骤S2中切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为0.8~1.2kDa。

所述改性甲壳素的制备方法如下，以重量份计：

Z1、用水将1~3份鱿鱼骨头清洗后切碎，过50~200目筛，然后加入20~40份3~5wt%氢氧化钠水溶液中60~75℃处理20~40min，用水清洗至中性，重复1~3次；处理后的鱿鱼骨头在室温下用20~30份0.1~0.4mol/L盐酸处理0.5~2h，用水洗涤至中性，在60~85℃的烘箱中干燥10~30h，然后加入到10~30份水中，使用超声均质机分散8~15min，功率为300~500W，超声均质时间为30~60min，得到甲壳素水分散体；

Z2、采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节步骤Z1制备甲壳素水分散体pH至8.0~9.0，加入1~3份盐酸多巴胺，室温磁搅拌20~30h，搅拌速度为300~600rpm，然后以6000~10000rpm离心5~15min，用水洗涤1~3次，得到预处理产物，将预处理产物加入到30~50份水中，机械均质40~60min，均质转速为100~200rpm，加入0.5~1份葡萄糖基甜菊糖苷，机械均质40~80min，均质转速为1000~3000rpm，得到改性甲壳素。

本发明制备的产朊假丝酵母菌在饲料中的应用。

本发明将产朊假丝酵母菌接种到液体培养基中培养，再接种到固体培养基表面培养，得到产朊假丝酵母菌。其中固体培养基采用的促进剂是将改性甲壳素加入氢氧化钠水溶液和尿素水溶液组成的混合溶液中，搅拌过滤，得到混合溶液；将混合溶液搅拌下加入过氧化氢水溶液，油浴反应，加入硫酸氢钠水溶液终止反应，用盐酸调整pH值至中性，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，洗涤干燥，得到促进剂。所述改性甲壳素是用水将鱿鱼骨头清洗后切碎，过筛，在氢氧化钠水溶液中处理，清洗；在室温下用盐酸处理，洗涤干燥，然后加入到水中，超声分散，得到甲壳素水分散体；将甲壳素水分散体加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节pH，加入盐酸多巴胺，搅拌后离心，洗涤，得到预处理产物，将预处理产物加入到水中均质，加入葡萄糖基甜菊糖苷均质，得到改性甲壳素。

从鱿鱼骨中提取的甲壳素由平行排列成束的聚合物链形成，与常规甲壳素相比，分子间相互作用较弱，具有更高的纯度和较少的重金属。这些使得甲壳素是一种更活泼的材料，适合生物医学应用和真菌培养。本发明中甲壳素分别采用NaOH和HCl脱蛋白和脱矿进行纯化。由于盐酸多巴胺的添加削弱了甲壳素之间的氢键和静电斥力，经盐酸多巴胺改性后的甲壳素结构致密，表面光滑。葡萄糖基甜菊糖苷是一种低分子化合物，具有良好的水溶性和生物活性，在甲壳素上包覆盐酸多巴胺并加入葡萄糖基甜菊糖苷后，细胞活力明显提高，这是因为盐酸多巴胺通过对亲核基团的良好界面结合亲和力，在增强对产朊假丝酵母菌的亲和力和促进粘附方面发挥了重要作用。同时，由于葡萄糖基甜菊糖苷的生物学特性，可以促进产朊假丝酵母菌的增殖和粘附，刺激生长因子的产生。然后改性甲壳素首先在氢氧化钠和尿素的水溶液中冷冻，部分改性甲壳素分子可以有序排列，然后解冻形成透明的改性甲壳素溶液，在冷冻和解冻过程中乙酰基被部分去除。加入过氧化氢能避免在溶液中形成胶状物质，改性甲壳素与过氧化氢在碱性溶液中氧化解聚可得到水溶性产物，这种解聚是由过氧化氢分解形成的羟基自由基(HO·)引起的。羟基自由基从改性甲壳素的氨基上抽离氢原子，形成氨基自由基(-NH)，这些自由基的进一步重排导致糖苷键的裂解。改性甲壳素的脱乙酰和解聚是同时实现的，这主要是由于在碱性条件下过氧化氢分解形成HO·和HOO·的作用，羟基自由基导致甲壳素解聚，而强亲核性HOO·则导致酰胺键断裂。高度去乙酰化促进剂能诱导分泌蛋白生长因子，刺激产朊假丝酵母菌增殖和产朊假丝酵母菌中蛋白质含量的增加。

本申请还公开了制备的产朊假丝酵母菌的应用，产朊假丝酵母菌在饲料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明将产朊假丝酵母菌接种到液体培养基中培养，再接种到固体培养基表面培养，得到产朊假丝酵母菌；此方法制备的产朊假丝酵母菌数量多，蛋白含量高。

具体实施方式

主要物质来源：

产朊假丝酵母菌：拉丁名称：Candida utilis，菌株编号：CICC 32211。

透明质酸：广州佰宇生物科技有限公司，货号：2020。

葡萄糖基甜菊糖苷：山东亚亨生物科技有限公司，货号：180。

鱿鱼骨头：广州黄沙水产交易市场购买。

三羟甲基氨基甲烷缓冲液：山东嘉颖化工科技有限公司，货号：AL534574901686。

实施例1

一种产朊假丝酵母菌的培养方法，步骤如下：

步骤1、从产朊假丝酵母菌的菌种中取一环菌体，接种到2L液体培养基中，摇匀，培养条件为30℃，转速为120r/min，培养时间为48h，停止培养，使其活菌数量达到10⁶/mL以上，得到菌液；

步骤2、对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，将步骤1制备的菌液接种到固体培养基表面，菌液的接种量为所述固体培养基质量的12％，然后用涂布棒将接种的菌液在固体培养基表面均匀涂开；

步骤3、培养温度为30℃，培养时间为72h，得到产朊假丝酵母菌。

所述液体培养基采用如下配方配置而成：200g/L葡萄糖、50g/L牛肉蛋白胨、0.7g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.03g/L维生素B1、3g/L透明质酸、溶剂为水。

所述固体培养基采用如下配方配置而成：4wt%葡萄糖、2.5wt%牛肉蛋白胨、0.5wt%氯化钠、2.5wt%琼脂、0.2wt%促进剂、余量为水。

所述促进剂的制备方法如下：

S1、将0.4kg改性甲壳素加入10kg 8wt%氢氧化钠水溶液和10kg 4wt%尿素水溶液组成的混合溶液中，在-20℃下保持24h，然后常温解冻后搅拌30min，搅拌速度为200rpm，300目筛网过滤得到混合溶液；

S2、将10kg步骤S1制备的混合溶液置于油浴中，在速度为200rpm搅拌下滴加0.4kg30wt%过氧化氢水溶液，油浴温度控制在50℃反应时间6h，加入2kg 10wt%硫酸氢钠水溶液终止反应，用0.5mol/L盐酸调整pH值至中性，500目筛网过滤，滤液用切向流超滤系统进行过滤，切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为1kDa，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，采用无水乙醇洗涤，真空40℃干燥12h，得到促进剂。

所述改性甲壳素的制备方法如下：

Z1、用水将2kg鱿鱼骨头清洗后切碎，过100目筛，然后加入30kg 4wt%氢氧化钠水溶液中70℃处理30min，用水清洗至中性，重复3次；处理后的鱿鱼骨头在室温下用25kg0.24mol/L盐酸处理1h，用水洗涤至中性，在80℃的烘箱中干燥24h，然后加入到20kg水中，使用超声均质机分散12min，功率为350W，超声均质时间为50min，得到甲壳素水分散体；

Z2、采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节步骤Z1制备甲壳素水分散体pH至8.5，加入2kg盐酸多巴胺，室温磁搅拌24h，搅拌速度为500rpm，然后以8000rpm离心10min，用水洗涤3次，得到预处理产物，将预处理产物加入到40kg水中，机械均质50min，均质转速为150rpm，加入0.8kg葡萄糖基甜菊糖苷，机械均质60min，均质转速为2000rpm，得到改性甲壳素。

实施例2

一种产朊假丝酵母菌的培养方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性甲壳素的制备方法不一致。

所述改性甲壳素的制备方法如下：

Z1、用水将2kg鱿鱼骨头清洗后切碎，过100目筛，然后加入30kg 4wt%氢氧化钠水溶液中70℃处理30min，用水清洗至中性，重复3次；处理后的鱿鱼骨头在室温下用25kg0.24mol/L盐酸处理1h，用水洗涤至中性，在80℃的烘箱中干燥24h，然后加入到20kg水中，使用超声均质机分散12min，功率为350W，超声均质时间为50min，得到甲壳素水分散体；

Z2、采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节步骤Z1制备甲壳素水分散体pH至8.5，室温磁搅拌24h，搅拌速度为500rpm，然后以8000rpm离心10min，用水洗涤3次，得到预处理产物，将预处理产物加入到40kg水中，机械均质50min，均质转速为150rpm，加入0.8kg葡萄糖基甜菊糖苷，机械均质60min，均质转速为2000rpm，得到改性甲壳素。

所述液体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述固体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述促进剂的制备方法与实施例1相同。

实施例3

一种产朊假丝酵母菌的培养方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述改性甲壳素的制备方法不一致。

所述改性甲壳素的制备方法如下：

Z1、用水将2kg鱿鱼骨头清洗后切碎，过100目筛，然后加入30kg 4wt%氢氧化钠水溶液中70℃处理30min，用水清洗至中性，重复3次；处理后的鱿鱼骨头在室温下用25kg0.24mol/L盐酸处理1h，用水洗涤至中性，在80℃的烘箱中干燥24h，然后加入到20kg水中，使用超声均质机分散12min，功率为350W，超声均质时间为50min，得到甲壳素水分散体；

Z2、采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节步骤Z1制备甲壳素水分散体pH至8.5，加入2kg盐酸多巴胺，室温磁搅拌24h，搅拌速度为500rpm，然后以8000rpm离心10min，用水洗涤3次，得到预处理产物，将预处理产物加入到40kg水中，机械均质50min，均质转速为150rpm，得到改性甲壳素。

所述液体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述固体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述促进剂的制备方法与实施例1相同。

实施例4

一种产朊假丝酵母菌的培养方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述促进剂的制备方法不一致。

所述促进剂的制备方法如下：

S1、将0.4kg改性甲壳素加入10kg 8wt%氢氧化钠水溶液和10kg 4wt%尿素水溶液组成的混合溶液中，在-20℃下保持24h，然后常温解冻后搅拌30min，搅拌速度为200rpm，300目筛网过滤得到混合溶液；

S2、将10kg步骤S1制备的混合溶液置于油浴中，油浴温度控制在50℃持续6h，加入2kg 10wt%硫酸氢钠水溶液，用0.5mol/L盐酸调整pH值至中性，500目筛网过滤，滤液用切向流超滤系统进行过滤，切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为1kDa，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，采用无水乙醇洗涤，真空40℃干燥12h，得到促进剂。

所述液体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述固体培养基的制备方法与实施例1相同。

所述改性甲壳素的制备方法与实施例1相同。

对比例1

一种产朊假丝酵母菌的培养方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述固体培养基的制备方法中促进剂采用等量的甲壳素代替。

所述液体培养基的制备方法与实施例1相同。

对比例2

一种产朊假丝酵母菌的培养方法与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述固体培养基的制备方法中不添加促进剂。

所述液体培养基的制备方法与实施例1相同。

测试例1

菌数测试

取本发明制备的产朊假丝酵母菌1g，倒入离心管，加入20mL蒸馏水，振荡离心约1min后，另取试管加入9mL蒸馏水及1mL离心液混匀，得到混合液，取10μL混合液注入血球计数板凹槽，在光学显微镜下进行观察计数。测菌数(稀释倍数为200，样品量为1g)，计算公式如下：

产朊假丝酵母菌数/1g＝(80个小方格细胞总数/80×400×10⁴×稀释倍数)/样品量

测试结果见表1。

表1：菌数测试结果

试验方案	菌数（个/g）
		实施例1	<![CDATA[1.584×10<sup>9</sup>]]>
实施例2	<![CDATA[6.351×10<sup>8</sup>]]>
		实施例3	<![CDATA[5.376×10<sup>8</sup>]]>
实施例4	<![CDATA[5.316×10<sup>8</sup>]]>
		对比例1	<![CDATA[8.752×10<sup>7</sup>]]>
对比例2	<![CDATA[6.615×10<sup>7</sup>]]>

测试例2

蛋白质含量测试

取1mL本发明制备的产朊假丝酵母菌，加入10mL蒸馏水，测定蛋白质百分含量，20000rpm离心3次，每次3min，干燥至恒重，测定恒重后的质量，得到菌体质量。再利用考马斯亮蓝法测得产朊假丝酵母菌中的蛋白质含量，采用如下公式计算产朊假丝酵母菌中蛋白质百分比含量。

产朊假丝酵母菌中蛋白质百分比含量=（菌液中蛋白质含量/菌体质量）×100%

测试结果见表2。

表2：蛋白质含量测试结果

试验方案	产朊假丝酵母菌中蛋白质百分比含量(%)
		实施例1	46.37
实施例2	38.81
		实施例3	37.93
实施例4	37.72
		对比例1	34.42
对比例2	30.21

从测试例1和2的测试结果可以看出，实施例1的菌数最多，而且产朊假丝酵母菌中蛋白质含量最高，可能原因在于本发明将产朊假丝酵母菌接种到液体培养基中培养，再接种到固体培养基表面培养，得到产朊假丝酵母菌。其中固体培养基采用的促进剂是将改性甲壳素加入氢氧化钠水溶液和尿素水溶液组成的混合溶液中，搅拌过滤，得到混合溶液；将混合溶液搅拌下加入过氧化氢水溶液，油浴反应，加入硫酸氢钠水溶液终止反应，用盐酸调整pH值至中性，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，洗涤干燥，得到促进剂。所述改性甲壳素是用水将鱿鱼骨头清洗后切碎，过筛，在氢氧化钠水溶液中处理，清洗；在室温下用盐酸处理，洗涤干燥，然后加入到水中，超声分散，得到甲壳素水分散体；将甲壳素水分散体加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节pH，加入盐酸多巴胺，搅拌后离心，洗涤，得到预处理产物，将预处理产物加入到水中均质，加入葡萄糖基甜菊糖苷均质，得到改性甲壳素。

从鱿鱼骨中提取的甲壳素由平行排列成束的聚合物链形成，与常规甲壳素相比，分子间相互作用较弱，具有更高的纯度和较少的重金属。这些使得甲壳素是一种更活泼的材料，适合生物医学应用和真菌培养。本发明中甲壳素分别采用NaOH和HCl脱蛋白和脱矿进行纯化。由于盐酸多巴胺的添加削弱了甲壳素之间的氢键和静电斥力，经盐酸多巴胺改性后的甲壳素结构致密，表面光滑。葡萄糖基甜菊糖苷是一种低分子化合物，具有良好的水溶性和生物活性，在甲壳素上包覆盐酸多巴胺并加入葡萄糖基甜菊糖苷后，细胞活力明显提高，这是因为盐酸多巴胺通过对亲核基团的良好界面结合亲和力，在增强对产朊假丝酵母菌的亲和力和促进粘附方面发挥了重要作用。同时，由于葡萄糖基甜菊糖苷的生物学特性，可以促进产朊假丝酵母菌的增殖和粘附，刺激生长因子的产生，所以实施例1的菌数最高。然后改性甲壳素首先在氢氧化钠和尿素的水溶液中冷冻，部分改性甲壳素分子可以有序排列，然后解冻形成透明的改性甲壳素溶液，在冷冻和解冻过程中乙酰基被部分去除。加入过氧化氢能避免在溶液中形成胶状物质，改性甲壳素与过氧化氢在碱性溶液中氧化解聚可得到水溶性产物，这种解聚是由过氧化氢分解形成的羟基自由基(HO·)引起的。羟基自由基从改性甲壳素的氨基上抽离氢原子，形成氨基自由基(-NH)，这些自由基的进一步重排导致糖苷键的裂解。改性甲壳素的脱乙酰和解聚是同时实现的，这主要是由于在碱性条件下过氧化氢分解形成HO·和HOO·的作用，羟基自由基导致甲壳素解聚，而强亲核性HOO·则导致酰胺键断裂。高度去乙酰化促进剂能诱导分泌蛋白生长因子，刺激产朊假丝酵母菌增殖和产朊假丝酵母菌中蛋白质含量的增加。

Claims (5)

1.一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1、从产朊假丝酵母菌的菌种中取一环菌体，接种到1~3L液体培养基中，摇匀，培养条件为28~32℃，转速为80~150r/min，培养时间为40~50h，停止培养，使其活菌数量达到10⁵~10⁷个/mL以上，得到菌液；

步骤2、对高压蒸汽灭菌处理后的固体培养基进行倒平板操作，从步骤1制备的菌液接种到固体培养基表面，然后用涂布棒将接种的菌液在固体培养基表面均匀涂开；

步骤3、培养温度为28~32℃，培养时间为48~96h，得到产朊假丝酵母菌；

所述固体培养基采用如下配方配置而成：2~6wt%葡萄糖、2~3wt%牛肉蛋白胨、0.1~1wt%氯化钠、2~3wt%琼脂、0.1~0.3wt%促进剂、余量为水；

所述促进剂的制备方法如下，以重量份计：

S1、将0.3~0.5份改性甲壳素加入8~12份5~10wt%氢氧化钠水溶液和8~12份2~6wt%尿素水溶液组成的混合溶液中，在-25~-10℃下保持20~30h，然后常温解冻后搅拌20~40min，搅拌速度为100~300rpm，200~400目筛网过滤得到混合溶液；

S2、将8~12份步骤S1制备的混合溶液置于油浴中，在速度为100~300rpm搅拌下滴加0.2~0.6份20~35wt%过氧化氢水溶液，油浴温度控制在40~60℃，反应时间4~8h，加入1~3份8~12wt%硫酸氢钠水溶液终止反应，用0.2~0.8mol/L盐酸调整pH值至中性，400~550目筛网过滤，滤液用切向流超滤系统进行过滤，过滤后经旋转蒸发浓缩至固体，采用无水乙醇洗涤，真空30~50℃干燥8~20h，得到促进剂；

所述步骤S2中切向流超滤系统的超滤膜截留分子量为0.8~1.2kDa。

2.如权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述步骤2中菌液的接种量为所述固体培养基质量的8~15％。

3.如权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述液体培养基采用如下配方配置而成：150~250g/L葡萄糖、40~60g/L牛肉蛋白胨、0.5~1g/L磷酸氢二钾、0.4~0.6g/L七水硫酸镁、0.01~0.05g/L维生素B1、1~5g/L透明质酸、溶剂为水。

4.如权利要求1所述的一种产朊假丝酵母菌的培养方法，其特征在于，所述改性甲壳素的制备方法如下，以重量份计：

Z1、用水将1~3份鱿鱼骨头清洗后切碎，过50~200目筛，然后加入20~40份3~5wt%氢氧化钠水溶液中60~75℃处理20~40min，用水清洗至中性，重复1~3次；处理后的鱿鱼骨头在室温下用20~30份0.1~0.4mol/L盐酸处理0.5~2h，用水洗涤至中性，在60~85℃的烘箱中干燥10~30h，然后加入到10~30份水中，使用超声均质机分散8~15min，功率为300~500W，超声均质时间为30~60min，得到甲壳素水分散体；

Z2、采用三羟甲基氨基甲烷缓冲液调节步骤Z1制备甲壳素水分散体pH至8.0~9.0，加入1~3份盐酸多巴胺，室温磁搅拌20~30h，搅拌速度为300~600rpm，然后以6000~10000rpm离心5~15min，用水洗涤1~3次，得到预处理产物，将预处理产物加入到30~50份水中，机械均质40~60min，均质转速为100~200rpm，加入0.5~1份葡萄糖基甜菊糖苷，机械均质40~80min，均质转速为1000~3000rpm，得到改性甲壳素。

5.根据权利要求1~4任一项所述方法制备的产朊假丝酵母菌在饲料中的应用。