CN115678810B

CN115678810B - 用于防治烟草霉烂病的复合菌剂、发酵方法及其施用方法

Info

Publication number: CN115678810B
Application number: CN202211449111.1A
Authority: CN
Inventors: 卢灿华; 夏振远; 苏家恩; 蔡永占; 张光海; 王庆; 陈志会; 盖晓彤; 李军营; 马俊红; 陈颐; 姜宁; 晋艳
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2042-11-18
Also published as: CN115678810A

Abstract

本申请公开了一种用于防治烟草霉烂病的复合菌剂、发酵方法及其施用方法，至少包括：生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS‑1；生防菌BA08为枯草芽孢杆菌的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M 2020549；生防菌BA20为枯草芽孢杆菌的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M 2020548；生防菌BSRS‑1为桑肠杆菌的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M2020550。该复合菌剂稳定性好，不仅是烘烤期烟草霉烂病的高效生防菌，而且对雪茄烟发酵过程中的霉变病也有较好防效。说明本申请提供的复合菌剂能对烟草霉烂病发挥较好的防治效果。

Description

用于防治烟草霉烂病的复合菌剂、发酵方法及其施用方法

技术领域

本申请涉及微生物应用技术领域，特别是一种用于防治烟草霉烂病的复合菌剂、发酵方法及其施用方法。

背景技术

近年来，烘烤期烟草霉烂已成为我国南方部分烟区烘烤环节烟叶损失的重要原因之一。烟叶烘烤变黄期内，由于温湿度适宜，烟叶含水量高，死体营养型微生物容易滋生，是烟叶发生霉烂的主要时期。

引起烟叶腐烂的微生物种类较多，主要有青霉属、曲霉属、根霉属、毛霉属真菌，以及芽孢杆菌、乳杆菌和果胶杆菌属细菌等。近期课题组研究发现云南省大理州烟草霉烂病为由少根根霉(Rhizopus arrhizus)引起的真菌性病害(卢灿华,苏家恩,盖晓彤,等.烤烟霉变病原菌鉴定及其生防菌筛选[J].中国烟草科学,2022,43(2):45-51.)，可以为害烟叶叶柄、叶肉组织，以叶基霉烂型为主，发病率达30％以上，损失在20％左右。因此，烟草霉烂病对烟叶生产的危害十分严重。此外，雪茄烟在晾制和发酵过程中也普遍存在霉烂现象，亟需进行科技攻关，突破采后烟叶调制和发酵期烟叶的关键技术瓶颈。

烟草霉烂病的防治方法有化学药剂、设备改进和生物防治等方法。其中，生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性病毒株等优点，受到广泛的青睐。

目前，用于防治霉烂病的微生物报道较少，其中以单菌株的报道为主，例如贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z002(CN112322536A)、05-1205(CN112375700A)和GY1(CN112391315A)，胶质芽孢杆菌(B.mucilaginosus)YN2011(CN110384247A)；而复合生防菌则仅有组合微生物菌剂(CN110250209A)的报道。CN110250209A中公开了一种具有防治烟草霉烂病功能的微生物菌剂，微生物菌剂包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌25～30份，解淀粉芽孢杆菌40～50份，胶质芽孢杆菌20～35份，吐温-20为0.05～0.15份、氮酮0.005～0.015份。该复合微生物菌剂经验证具有防治烟草霉烂病的功能，通过生长优势在烟叶叶柄形成竞争占位，同时其代谢产物能够抑制有害真菌，从而抑制病原菌的生长。

虽然CN110250209A中公开的复合菌剂虽然在烟草烘烤霉烂病中的防效可以达到95～100％，但该复合菌剂对于由少根根霉引发的烘烤霉烂病以及雪茄烟霉变病的防治效果并不明确，而且该复合菌剂所用复合菌种类属于现有已知功能菌株组合，未对其他未知菌株进行进一步的探索。

现有复合菌剂种类单一，功效单一，目前市场需求缺口较大，亟需开发多种复合生防菌剂，满足烟叶烘烤、调制期霉烂病的绿色防控，实现烟草产业高质量发展和绿色转型。

发明内容

本申请提供了一种用于防治烟草霉烂病的复合菌剂、发酵方法及其施用方法，用于解决现有技术中存在的缺乏针对烟草霉烂病的有效复合菌剂的技术问题。

本申请提供了一种用于防治烟草霉烂病的复合菌剂，至少包括：生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1；

生防菌BA08为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)的一个株系，保藏编号为CCTCCNo：M 2022549；

生防菌BA20为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)的一个株系，保藏编号为CCTCCNo：M 2022548；

生防菌BSRS-1为桑肠杆菌(Enterobacter.mori)的一个株系，保藏编号为CCTCCNo：M 2022550。

通过实验优选发现，采用包括上述生防菌剂的复合菌剂喷施烘烤烟叶后，能有效防止调制过程中烟叶因少根根霉引发烟草霉烂病，防效可达88.51％，病情指数最低可达10.05％。

本申请提供复合菌剂中各菌株对烟草霉烂病的防效虽然均不突出，但通过将其复合使用后，能显著提高所得复合菌剂的防效。

优选地，适用烤烟烟叶或雪茄烟叶。例如所适用烤烟烟叶具体为K326。

本申请的另一方面还提供了一种上述复合菌剂的发酵方法，包括以下步骤：

将生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1的种子液混合后，接种于培养液中进行液体发酵，得到复合菌剂发酵液。

本申请提供复合菌剂发酵方法，所用液体发酵为枯草芽孢杆菌常用发酵培养基和培养条件。按此发酵后所得发酵液可用于防治少根根霉引发烟草霉烂病。

优选地，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的2～10倍稀释液。

按此比例稀释后，复合菌剂均能发挥对烟叶霉烂病的防效。

优选地，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的2倍稀释液。按此比例稀释后，所得防效效果最优。防效可达88.51％，病情指数最低可达10.05％。

优选地，当处理烟叶为雪茄烟叶时，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的10倍稀释液。

优选地，生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1的种子液按体积比为0.5～2：0.5～2：1～2。

优选地，生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1的种子液按体积比等比例混合后进行液体发酵。

优选地，液体发酵条件：保持搅拌器转速为120r/min至发酵结束；

发酵通气量：保持15m³/h时保持至发酵结束；

发酵温度：整个发酵过程保持温度在36.5～37.5℃；

发酵时间：运行发酵42h。

优选地，液体发酵培养基，各成分以g/L计为：蔗糖10g/L，骨蛋白胨5g/L，玉米浆干粉5g/L，豆粕粉15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH 7.2。

本申请的另一方面还提供了一种上述复合菌剂的施用方法，包括以下步骤：

向每杆烟叶的叶柄处喷施50～200mL如上述方法发酵所得的复合菌剂发酵液。

优选地，复合菌剂的喷施量为75mL。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的用于防治烟草霉烂病的复合菌剂，该复合菌剂稳定性好，是烘烤期烟草霉烂病的高效生防菌，对烟叶调制过程中由少根根霉引发的霉烂病的相对防效在70％以上。说明本申请提供的复合菌剂能对由少根根霉引发的霉烂病发挥较好的防治效果。

2)本申请所提供的用于防治烟草霉烂病的复合菌剂，以枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)BA08、枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)BA20、桑肠杆菌(Enterobacter.mori)BSRS-1等比例复配后制得的复合菌剂，充分发挥各菌株的协同效果，接种复合菌剂后，其中所含生防菌BA08和BA20定殖后产生拮抗物质控制烟叶表面的少根根霉病毒繁殖，而生防菌BSRS-1通过调节烟叶组织微生物种群破坏少根根霉病毒的生长环境，抑制少根根霉病毒的生长发挥间接作用，从而协同抑制少根根霉病毒在烤烟调制期间在烟叶叶柄部位上定殖。

附图说明

图1为本申请实施例3中各优先生防菌及CK处理的平板对峙法实验实物照片，其中a)为BA08号生防菌实验结果图；b)为BA20号生防菌实验结果图；c)为BSRS-1号生防菌实验结果图；d)为CK实验结果图；

图2为本申请实施例中基于生防菌BA08、BA20及其近缘种基因组序列构建系统发育树示意图；

图3为本申请实施例中基于生防菌BSRS-1及其近缘种基因组序列构建的系统发育树；

保藏信息：

生防菌BA08为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)的一个株系，已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2022549。

菌株BA20为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)的一个株系，命名为BA20。已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2022548。

菌株BSRS-1为桑肠杆菌(Enterobacter.mori)的一个株系，命名为BSRS-1。已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2022550。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本申请中未详述的且并不用于解决本申请技术问题的技术手段，均按本领域公知常识进行设置，且多种公知常识设置方式均可实现。

实施例

以下实施例中所用物料和设备，如无特殊说明均为商业渠道获取。

实施例1生防菌筛选

虎红培养基，成分以g/L计为：蛋白胨5.0，葡萄糖10.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，孟加拉红0.03，氯霉素0.1，琼脂16。培养基的pH为7.5。

NA培养基，成分以g/L计为：蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂16，pH 7.0。

LB液体培养基，成分以g/L计为：胰蛋白胨5.0，酵母粉2.0，氯化钠5.0，pH 7.1。

烤烟霉变病病原菌少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)DL8具体性状及其培养要求参见“卢灿华,苏家恩,盖晓彤,等.烤烟霉变病原菌鉴定及其生防菌筛选[J].中国烟草科学,2022,43(2):45-51.”一文记载的DL8。

生防菌培养：用NA培养基(蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂16g，加水至1000mL，调节pH 7.0)，活化从云南省玉溪市红塔区高仓街道龙树村红壤中分离获得的候选生防菌，待长出单菌落后将菌株接种到100mL LB液体培养基中，在28℃、180r/min下摇培36～48h。

病原菌孢子悬浮液制备：用虎红培养基活化少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)DL8，25℃下培养68～72h，取10皿少根根霉菌于500mL灭菌水中，用玻璃棒搅拌直至灭菌水变成黑色，然后用单层纱布过滤，制成病原菌孢子悬浮液；

烟样准备：取新鲜烟叶叶柄，长10～15cm，用无菌水洗净、晾干，用无菌刀片在每个叶柄的基部切一个斜面制造伤口；用75％酒精消毒接种盘，晾干后在盘底放入一次性培养皿，皿口向下，然后铺上4张擦手纸，加入70mL灭菌水，将纸浸湿；将造伤的叶柄置于接种盘内，每盘放置15个叶柄；

接种：先喷雾接种30～50mL病原菌孢子悬浮液，晾干后再接种40～60mL候选生防菌；同时设置仅按前述方法接种病原菌的处理为对照；以及仅按前述方法接种无菌水的处理为空白对照；晾干后用50cm×70cm自封袋密封，置于37℃恒温培养箱内培养72h。

调查与分析：调查各处理的发病等级，并计算病情指数和相对防效。烟叶发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级(具体等级划分标准见表1)，病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)，生防菌相对防效＝100×(对照组病情指数-处理组病情指数)/(对照组病情指数)。

表1烟叶霉烂病病情等级划分

试验结果：对各处理烟叶霉烂病病情进行等级划分后，根据以上公式分别计算得到各生防菌的病情指数、生防菌相对防效，并从108株候选生防菌中筛选出三株对烟草霉烂病的致病菌少根根霉菌具有良好防治效果的生防菌，优选出的生防菌的病情指数、生防菌相对防效结果见表2。

表2候选生防菌对烟草霉烂病的防效

处理	病情指数	相对防效(％)
			BA08	46.03	49.12
BA20	71.43	21.06
			BSRS-1	58.73	35.09
CK	90.48	0.00

在对照病情指数为90.48时，生防菌BA08、BA20和BSRS-1对少根根霉菌有一定防效，分别为49.12％、21.06％、35.09％(表2)。

实施例2复合菌剂对烟草霉烂病的防效评价

实施例2与实施例1的区别为：

生防菌培养：用NA培养基活化菌株BA08、BA20、BSRS-1，待长出单菌落后，挑取单菌落置于LB液体培养基28℃、180r/min过夜培养制成种子液，将菌株BA08、BA20、BSRS-1分别按等比例两两组合或三株菌组合，以1/100(v/v)接种于100mL LB液体培养基中，28℃、180r/min摇培48h，获得复合菌剂。

试验结果：生防菌BA08、BA20和BSRS-1两两组配或三株菌共培养获得的复合菌剂在防治少根根霉菌引起的烟草霉烂病的效果如表3所示，差异较大。

表3复合菌剂对烟草霉烂病的防效

处理	病情指数	相对防效(％)
			BA08+BA20	28.57	56.10
BA08+BSRS-1	19.05	70.73
			BA20+BSRS-1	41.27	36.59
BA08+BA20+BSRS-1	14.29	78.05
			CK	65.08	0.00

两两组合中，BA08+BSRS-1防效最佳(70.73％)，BA08+BA20次之(56.10％)。三株菌等比例接种后共发酵获得的复合菌剂防效高达78.05％，是较为理想的生防菌组合(表3)。

实施例3生防菌对少根根霉菌的抑制试验

实施例3与实施例1的区别为：

实验采用平板对峙法，用直径0.8cm的打孔器将少根根霉菌菌丝块贴接于筛选培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.2)平皿中心，在距菌饼中心3.5cm的两侧对称划线接种各生防菌BA08、BA20和BSRS-1，以只接少根根霉菌菌丝块的处理为对照。

28℃恒温培养，待对照长菌丝长至全皿的2/3～4/5时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理进行6次重复。各处理实物照片如图1所示。

试验结果：从表4可见，生防菌BA08和BA20均对少根根霉菌具有较强的抑菌作用，而生防菌BSRS-1对少根根霉菌无拮抗作用(图1)。

表4生防菌对少根根霉菌的拮抗作用

根据表4和图1所得结果，推断生防菌BA08和BA20可能通过产生拮抗物质控制病害，而生防菌BSRS-1可能通过调节组织微生物种群起着间接作用。

实施例4复合菌剂对烟叶烘烤期霉烂病的防治评价

实施例4与实施例1的区别为：

1、种子液培养：分别挑取一环生防菌接种于含有500mL种子培养液(蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏3.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0)的500mL离心管内，置于28℃恒温摇床培养15h。

2、发酵：将三株生防菌的种子液等比例混合后转接至含有150L发酵培养基中发酵(蔗糖10g/L，骨蛋白胨5g/L，玉米浆干粉5g/L，豆粕粉15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH 7.2)。

发酵工艺参数如下：

(1)灭菌：空消条件为：0.15MPa，123℃，1h；实消条件为：0.15MPa，123℃，35min；

(2)接种：灭菌完成培养液温度下降至37℃时开始接种，接种比例为菌种/培养液1:100(v/v)；

(3)发酵控制：转速:保持120r/min至发酵结束；通气量：保持15m³/h时保持至发酵结束；整个过程保持罐压在0.05Mpa；因设备原因允许通气量在短时间内浮动。温度：整个发酵过程保持温度在37℃，上下可浮动0.5℃。发酵时间：运行发酵42h。

3、试验在云南省大理州大理市湾桥镇进行，烟草品种为K326。

4、试验在烟叶编制成杆后，以人工接种病原菌方式进行，每杆接种75mL病原菌孢子悬浮液。

5、试验采用复合菌剂发酵液的2、5、10倍稀释液，向每杆烟喷施75mL复合菌剂发酵液于叶柄处，并以清水喷施叶柄的处理为对照，每处理20杆烟，设置重复3次，求取各重复的平均值。

6、烟叶按正常调制程序烘烤9d，调制完毕后按实施例1中方法调查各处理的发病等级。

实验结果见表5。

表5复合菌剂对烤烟霉烂病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			复合菌剂2倍稀释液	10.05	88.51
复合菌剂5倍稀释液	20.15	76.97
			复合菌剂10倍稀释液	40.23	54.02
CK	87.50	-

试验结果：由表5可知，不同稀释浓度的复合菌剂对烘烤期烟草霉烂病均有防效。在对照病情指数为87.50时，复合菌剂稀释10、5、2倍的病情指数分别为40.23、20.15、10.05，对应防效为54.02％、76.97％和88.51％。上述结果说明复合菌剂在稀释2～5倍时具有较好防治效果。

实施例5复合生防菌对雪茄烟叶霉变的防效评价

实施例5与实施例4的区别为：

1、试验在玉溪元江进行。

2、试验参试烟叶为晾制后的雪茄烟叶。

3、试验配施复合菌剂10倍稀释液。

所得结果如表6所示。

表6复合生防菌对雪茄烟叶霉变的防效

	处理后霉烟占比(％)	相对防效(％)
			处理	38.00	57.78
对照	90.00	-

试验结果：由表6可知，对照雪茄烟叶霉烟比为90％，而经复合菌剂处理的雪茄烟叶霉烟比仅为38％，相对防效为57.78％，具有明显的防治效果。上述结果说明，由生防菌BA08、BA20和BSRS-1组成的复合菌剂可有效控制雪茄烟叶霉变。

实施例6生防菌鉴定与保藏

1、生防菌鉴定

对上述实验获得的生防菌菌株BA08、BA20、BSRS-1，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。

化合物代谢采用Gen III板鉴定。

分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。

阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

鉴定结果记录如下：

(1)形态特征：

生防菌BA08和BA20形态特征相似，于28℃培养，在显微镜下，芽孢中生或端生，椭圆形，不膨大，芽孢比菌体小，存在于菌体中。抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。菌体平均大小为0.60～0.90μm×1.8～2.6μm，革兰氏染色为阳性。

菌株BSRS-1于28℃培养，在显微镜下，椭圆形，能运动，周生鞭毛。菌体平均大小为0.30～0.90μm×1.0～2.0μm，革兰氏染色为阴性。

(2)培养特征：

生防菌BA08和BA20于28℃在NA平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，扁平中心无凸起，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。上述形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断生防菌BA08和BA20为芽孢杆菌。

生防菌BSRS-1：于28℃在NA平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳白色，透明状，圆形，边缘整齐，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，扁平中心无凸起，边缘整齐，表面光滑。

(3)稳定性特征：

生防菌BA08和BA20可在含有0～8％ NaCl，pH 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，最适宜生长温度为28～35℃，最适宜pH值为7.0～7.2。

生防菌BSRS-1可在含有0～5％ NaCl，pH 4.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为15～40℃，最适宜生长温度为28℃，最适宜pH值为7.0。

(4)化合物代谢特征：

生防菌BA08能利用乙酰乙酸、水苏糖、L-精氨酸、肌苷、肌醇、D-天冬氨酸、D-松二糖、D-葡糖醛酸、果胶、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡糖、蔗糖、蜜三糖,棉子糖、蜜二糖、D-甘露糖、丙酮酸甲酯、D-甘露醇、D-麦芽糖、L-半乳糖醛酸内酯、葡糖醛酰胺、D-纤维二糖、D-海藻糖、D-果糖-6-磷酸、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、L-组胺、D-果糖、L-丝氨酸、L-鼠李糖、龙胆二糖、D-半乳糖醛酸、柠檬酸、D-葡糖酸、粘酸、甲酸、糊精、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、糖质酸、L-乳酸、L-丙氨酸、甘油、L-苹果酸，不能利用D-丝氨酸、D-阿拉伯醇、奎宁酸、p-羟基-苯乙酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、N-乙酰-D-半乳糖胺、丙酸、D-苹果酸、α-酮-丁酸、明胶、β-羟基-D,L丁酸、3-甲酰葡糖、N-乙酰神经氨酸、α-羟基-丁酸、α-D-乳糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、γ-氨基-丁酸、α-酮-戊二酸、L-焦谷氨酸、D-果糖、D-乳酸甲酯、L-果糖、溴-丁二酸、D-半乳糖、D-葡糖-6-磷酸、吐温40、乙酸、D-山梨醇；能在含有四唑蓝、溴酸钠、四唑紫、1％ NaCl、4％ NaCl、8％NaCl、pH 5、pH 6、氨曲南、氯化锂、丁酸钠、萘啶酮酸、1％乳酸钠、亚碲酸钾、的条件下生长，不能在含有D-丝氨酸、硫酸四癸钠、万古霉素、梭链孢酸、盐酸胍、醋竹桃霉素、林肯霉素,洁霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV的条件下生长。

生防菌BA20能利用α-D-葡糖、肌苷、D-天冬氨酸、D-松二糖、肌醇、D-葡糖醛酸、N-乙酰-D-葡糖胺、蜜三糖,棉子糖、D-甘露醇、果胶、蜜二糖、D-麦芽糖、D-纤维二糖、D-甘露糖、D-海藻糖、L-半乳糖醛酸内酯、D-水杨苷、β-甲酰-D-葡糖苷、D-果糖、丙酮酸甲酯、龙胆二糖、D-葡糖酸、葡糖醛酰胺、L-组胺、D-果糖-6-磷酸、水苏糖、乙酰乙酸、L-鼠李糖、L-精氨酸、L-丝氨酸、蔗糖、粘酸；粘液酸、D-半乳糖醛酸、柠檬酸、糊精、糖质酸、甲酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-乳酸、甘油、L-丙氨酸、L-苹果酸，不能利用D-丝氨酸、p-羟基-苯乙酸、D-阿拉伯醇、丙酸、奎宁酸、β-羟基-D,L丁酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-苹果酸、明胶、α-酮-丁酸、α-D-乳糖、α-羟基-丁酸、3-甲酰葡糖、N-乙酰神经氨酸、α-酮-戊二酸、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、γ-氨基-丁酸、L-焦谷氨酸、D-半乳糖、D-果糖、L-果糖、D-乳酸甲酯、溴-丁二酸、吐温40、D-葡糖-6-磷酸、乙酸、D-山梨醇；能在含有溴酸钠、四唑紫、四唑蓝、1％NaCl、4％NaCl、8％NaCl、氨曲南、pH 5、pH 6、丁酸钠、氯化锂、萘啶酮酸、亚碲酸钾、1％乳酸钠的条件下生长，不能在D-丝氨酸、硫酸四癸钠、利福霉素SV、梭链孢酸、万古霉素、林肯霉素,洁霉素、二甲胺四环素、醋竹桃霉素、盐酸胍、含有的条件下生长。

菌株BSRS-1能利用的碳源有D-苹果酸、糊精、D-乳酸甲酯、甲酸、L-焦谷氨酸、果胶、葡糖醛酰胺、α-D-乳糖、龙胆二糖、D-松二糖、L-精氨酸、溴-丁二酸、D-山梨醇、丙酮酸甲酯、乙酸、α-D-葡糖、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-果糖-6-磷酸、水苏糖、蜜二糖、D-甘露糖、蜜三糖、D-果糖、p-羟基-苯乙酸、D-半乳糖、D-甘露醇、β-甲酰-D-葡糖苷、L-谷氨酸、L-半乳糖醛酸内酯、L-鼠李糖、甘油、D-水杨苷、D-纤维二糖、蔗糖、D-葡糖-6-磷酸、肌苷、氨基乙酰-L-脯氨酸、柠檬酸、肌醇、D-半乳糖醛酸、D-葡糖醛酸、粘酸、L-苹果酸、糖质酸、D-葡糖酸、D-丝氨酸、L-乳酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-组胺、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺，不能利用的碳源包括丙酸、α-酮-丁酸、D-天冬氨酸、D-阿拉伯醇、α-羟基-丁酸、奎宁酸、明胶、γ-氨基-丁酸、α-酮-戊二酸、吐温40、乙酰乙酸、3-甲酰葡糖、D-果糖、L-果糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、β-羟基-D,L丁酸；生防菌BSRS-1能在含有氨曲南、氯化锂、D-丝氨酸、1％ NaCl、4％ NaCl、8％ NaCl、醋竹桃霉素、梭链孢酸、pH 5、pH 6、丁酸钠、盐酸胍、萘啶酮酸、硫酸四癸钠、林肯霉素,洁霉素、1％乳酸钠、万古霉素、利福霉素SV、四唑蓝、四唑紫、的条件下生长，不能在含有亚碲酸钾、二甲胺四环素、溴酸钠的条件下生长。

(5)生防菌属水平鉴定：

将生防菌的16S rDNA序列与Ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)收录的序列比对，结果表明生防菌BA08与B.tequilensis KCTC 13622^T、B.cabrialesiiTE3^T、B.inaquosorum KCTC13429^T相似度最高(均为99.86％)，与B.subtilis NCIB 3610^T和B.rugosus SPB7^T的相似度次之，均为99.80％。生防菌BA20与B.tequilensis KCTC13622^T、B.cabrialesii TE3^T、B.inaquosorum KCTC 13429^T相似度最高(均为99.93％)，与B.subtilis NCIB 3610^T和B.rugosus SPB7^T的相似度次之，均为99.86％。生防菌BSRS-1与E.asburiae JCM 6051^T、E.cancerogenus ATCC 33241^T、E.huaxiensis 090008^T相似度最高，分别为99.59、99.52和99.49％。上述结果说明BA08和BA20为芽孢菌属细菌，而BSRS-1为肠杆菌属细菌。

(6)生防菌种的鉴定：

将基因组测序获得的序列提交至Type Strain Genome Server(https://tygs.dsmz.de/)，分析生防菌与已知种的相似性。

结果表明，生防菌BA08与BA20的分子DNA杂交值(dDDH)为100，说明两株菌遗传相似度较高。两株生防菌与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ATCC 6051^T和NCIB 3610的dDDH4值均高于种的划分阈值70％，两株菌与芽孢杆菌属内其他细菌的dDDH4低于70％，说明生防菌BA08和BA20属于枯草芽孢杆菌内的2个株系(具体结果参见表7)。

表7生防菌BA08与BA20及近缘参考菌株的dDDH值相似性比较

参考菌株	dDDH0/％	dDDH4/％	dDDH6/％
				B.subtilis BA20	100.0	100.0	100.0
B.subtilis ATCC 6051^T	93.0	89.3	94.6
				B.subtilis NCIB 3610	91.5	89.1	93.5
B.stercoris D7XPN1^T	91.5	62.2	88.8
				B.spizizenii TU-B-10^T	85.8	50.6	80.6
B.inaquosorum KCTC 13429^T	84.1	50.0	79.0
				B.rugosus SPB7^T	79.9	48.6	75.0
B.cabrialesii TE3^T	89.4	47.5	82.5
				B.tequilensis NCTC13306^T	67.3	45.3	63.6
B.vallismortis DV1-F-3^T	64.9	42.5	60.6
				B.mojavensis KCTC 3706^T	83.0	32.5	69.2
B.velezensis NRRL B-41580^T	32.8	20.4	28.4

基于基因组的系统发育树也表明生防菌BA08和BA20与枯草芽孢杆菌的两株菌聚为一支(参见图2)。上述基因组分析结果表明生防菌BA08和BA20均为枯草芽孢杆菌。

分析表明生防菌BSRS-1与桑肠杆菌(Enterobacter.mori)LMG 25706^T的dDDH4值最高，为80.5％。生防菌BSRS-1与肠杆菌属内其他模式种的dDDH4值低于70％(参见表8)。

表8生防菌BSRS-1与肠杆菌属内近缘种的dDDH值比较

基于基因组的系统发育树也表明生防菌BSRS-1与桑肠杆菌(E.mori)LMG 25706^T聚为一支(参见图3)。上述结果说明生防菌BSRS-1为桑肠杆菌(E.mori)的一个株系。

2、生防菌保藏

通过上述鉴定结果，确认生防菌BA08为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个株系，已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2022549。

菌株BA20为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个株系，命名为BA20。已于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2022548。

实施例7

将实施例4中所得稀释2倍的复合菌剂发酵液，与CN110250209A中公开的复合菌剂，按实施例4中使用方法分别喷施于烟叶叶柄处。

实施例8

与实施例4的区别在于：接种时，生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1种子液按体积比为2:2:1接种。

实施例9

与实施例4的区别在于：接种时，生防菌BA08、生防菌BA20、生防菌BSRS-1种子液按体积比为0.5:0.5:2接种。

实施例10

与实施例4的区别在于：喷施复合菌剂发酵液时，按每杆烟叶叶柄处喷施50mL，稀释2倍的发酵液。

实施例11

与实施例4的区别在于：喷施复合菌剂发酵液时，按每杆烟叶叶柄处喷施200mL，稀释2倍的发酵液。

实施例7～10所得防效结果与实施例4类似，在此不累述。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于防治烟草霉烂病的复合菌剂，其特征在于，至少包括：生防菌BA08、生防菌BA20和生防菌BSRS-1；

生防菌BA08为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M 2022549；

生防菌BA20为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M 2022548；

生防菌BSRS-1为桑肠杆菌（Enterobacter mori）的一个株系，保藏编号为CCTCC No：M2022550。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，适用于烤烟烟叶或雪茄烟叶。

3.一种如权利要求1或2所述复合菌剂的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

将生防菌BA08、生防菌BA20和生防菌BSRS-1的种子液混合后，接种于培养液中进行液体发酵，得到复合菌剂发酵液。

4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的2~10倍稀释液。

5.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的2倍稀释液。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，当处理烟叶为雪茄烟叶时，复合菌剂发酵液为液体发酵所得发酵原液的10倍稀释液。

7.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，生防菌BA08、生防菌BA20和生防菌BSRS-1的种子液按体积比为0.5~2：0.5~2：1~2混合。

8.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，生防菌BA08、生防菌BA20和生防菌BSRS-1的种子液按体积比等比例混合后进行液体发酵。

9.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，液体发酵条件：保持搅拌器转速为120r/min至发酵结束；

发酵通气量：保持15 m³/h保持至发酵结束；

发酵温度：整个发酵过程保持温度在36.5~37.5℃；

发酵时间：运行发酵42 h。

10.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，培养液中，各成分以g/L计为：蔗糖10g/L，骨蛋白胨5 g/L，玉米浆干粉5 g/L，豆粕粉15 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH 7.2。

11.一种复合菌剂的施用方法，包括以下步骤：其特征在于，向每杆烟叶的叶柄处喷施50~200 mL如权利要求3~9中任一项所述方法发酵得到的复合菌剂发酵液。

12.根据权利要求11所述的复合菌剂施用方法，其特征在于，向每杆烟叶的叶柄处喷施70~90 mL如权利要求3~9中任一项所述方法发酵所得的复合菌剂发酵液。