CN101701192B - 一种烟草秸秆降解真菌及其菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草秸秆降解真菌及其菌剂，属于废弃物资源利用技术领域。从猪粪堆肥中筛选得到一种能降解烟草秸秆的高温真菌，该菌株P-1在CMC-刚果红培养基上可产生水解圈，可以烟草秸秆为唯一碳源生长。该菌株接种于液体培养基，接种量1％，45℃条件下摇床培养5天(装液量1/5，170r/min)，过滤出菌丝体获得孢子悬液。试验表明，烟秆接种孢子悬液后，45℃条件下培养7天，烟秆失重率为40.5％，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为50.6％、47.4％和35.2％。本发明是利用微生物发酵方法降解废弃烟草秸秆使其转化为有机肥料，变废为宝、保护环境，具有广阔的应用前景。

Description

一种烟草秸秆降解真菌及其菌剂

一、技术领域

本发明涉及一种烟草秸秆降解真菌及其菌剂，属于农业集约化生产技术，专用于降解废弃烟草秸秆生产有机肥料，实现有机废弃物的资源化利用。

二、背景技术

我国是世界烟草栽培面积最多的国家，每年烟叶产量约为450-500万吨，与此同时产生了大量的废弃烟秆。烟草秸秆中有机物含量约为90％-95％，矿物质含量为5％-10％；其中氮含量0.5-1.2％，磷含量0.1％-0.25％，钾含量0.8％-1.8％。烟草生产带来巨大经济效益的同时，也产生了大量的农业废弃物烟草秸秆。因此，烟秆是一种十分宝贵的农业资源，合理利用这种资源是农业可持续发展的一项重要任务。然而，烟草秸秆中含有大量的木质素、纤维素和尼古丁，因此普通菌株难以分解，不能就地还田处理，也不适用于造纸和作饲料。于是，绝大部分烟草秸秆都作为废弃物被丢弃或被焚烧，不同程度地污染了当地的生活、生产环境，也造成了资源的浪费。

大量的研究表明，高温堆肥是目前有机废弃物无害化处理和资源化利用最安全有效的途径之一。利用微生物降解可以将废弃烟秆制成优良的有机堆肥。此外，烟秆中含有较高含量的烟碱，使得堆腐后的有机肥具有一定的抗病和生防作用，同时也可以作为植物生长的调节剂，还具有减少肥料中铵态氮流失的作用。

在高温堆肥过程中，加快升温速度、缩短堆肥腐熟时间是商品有机肥产生经济效益的关键。烟秆中含有大量较难被生物降解的木质纤维素，因此木质纤维素的降解是限制烟秆堆肥腐熟的主要因素。而木质纤维素主要在高温阶段被分解利用。由于温度的影响，高温阶段的微生物种群受到很大的抑制，表现为种类单一，数量减少，极大地限制了木质纤维素物质的快速降解。通过接种纤维素降解菌菌剂，特别是高温菌菌株，可以加速堆体升温，加快堆肥底物中木质纤维类物质的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期。在高温堆肥过程中，真菌产生的胞外纤维素分解酶活性远远高于细菌产生的纤维素分解酶活性。若能筛选到相应的功能菌株，将其用于废弃烟秆的降解和肥料生产，将会有很好的应用前景。

三、发明内容

1.技术问题

本发明的目的在于筛选一种能够分解烟草秸秆的高温微生物，使其能高效降解烟秆，并利用其生产有机肥，确保可持续农业的顺利发展。

2.技术方案

一种能降解烟草秸秆的高温真菌，该菌株P-1属于灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3304。初期菌落表面浅色、平坦，呈细小颗粒状，随着时间推移颗粒逐渐变密，颜色逐渐变为深绿色，并产生大量的分生孢子。分生孢子梗顶端膨大呈球形，表面以放射状生出小梗，圆形的分生孢子串生于小梗顶端。

烟草秸秆降解菌P-1能在CMC-刚过红培养基上生长并产生透明的水解圈。CMC-刚果红培养基配方为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5g，(NH₄)₂SO₄2g，KH₂PO₄1g，MgSO₄ 7H₂O 0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min。

烟草秸秆降解菌P-1孢子悬液(菌剂)的制备方法为：

1)烟秆粉培养基配方为：干燥粉碎后的烟草秸秆粉末5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min。

2)液体培养基的配制：烘干粉碎后的烟草秸秆粉末(粉碎后过30目筛，含水量1％以下)5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂ 0.1g，蛋白胨0.1g，酵母膏0.1g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min；

3)将上述菌株P-1接种至烟秆粉固体培养基上，45℃条件下培养3-4d，取直径0.8cm的菌饼1块接种于上述液体培养基中，装液量1/5，转速170r/min，45℃条件下振荡培养5d，培养物经无菌纱布过滤后即为孢子悬液菌剂。用血球计数板计数后可浓缩或用无菌水稀释以达到使用浓度，一般为10⁶个/ml。

所用烘干粉碎后的烟草秸秆粉末指的是粉碎后过30目筛，含水量1％以下。上述孢子悬液菌剂可用于降解烟草秸秆。

3.有益效果

本发明提供了一种能高效分解烟草秸秆的高温真菌，该菌株P-1可在CMC-刚果红平板上生长并产生透明的水解圈，可在以烟秆为唯一碳源的烟秆粉平板上生长。将孢子悬液接种于烟草秸秆进行固体发酵后，烟秆失重率为40.5％，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为50.6％、47.4％和35.2％；而对照组的烟秆失重率为27.7％，纤维素、半纤维素和木质素降解率分别为31.4％、27.8％和20.7％(表1)。

烟草秸秆降解菌P-1可将废弃烟草秸秆发酵分解后制成有机肥料，不仅可以变废为宝、保护环境，还可以促进可持续发展，具有广阔的应用前景。

四、具体实施方式

1)高效菌株的分离：该降解菌是从江苏常熟地区生产的猪粪堆肥中筛选到的。将样品进行梯度稀释，然后将菌悬液涂布到CMC-刚果红平板上，45℃培养筛选降解菌。

上述CMC-刚果红培养基配方为：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄7H₂O 0.5g，刚果红0.2g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min。

挑选在CMC-刚果红平板上产生透明圈较大的菌株，再分别接种到烟秆粉培养基上，选择生长较快的菌株，最终得到能高效降解烟草秸秆的高温真菌P-1。该菌菌落初期表面浅色、平坦，呈细小颗粒状，随着时间推移颗粒逐渐变密，颜色逐渐变为深绿色，并产生大量分生孢子。分生孢子梗顶端膨大呈球形，表面以放射状生出小梗，圆形的分生孢子串生于小梗顶端。鉴定为灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)。

该菌株能在以烟草秸秆为唯一碳源的烟秆粉培养基上生长。烟秆粉培养基配方为：烘干粉碎后的烟草秸秆粉末(粉碎后过30目筛，含水量1％以下)5g，(NH₄)₂SO₄2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 7H₂O 0.5g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min

2)烟草秸秆降解菌P-1孢子悬液菌剂的制备：

接种降解菌P-1在烟秆粉培养基平板上培养3-4d，挑取直径0.8cm的菌饼1块接种至液体培养基中，45℃条件下振荡培养5d(装液量1/5、转速170r/min)，培养物用无菌纱布过滤后用血球计数板计数，用无菌水将孢子悬液调整至10⁶个/ml。

液体培养基配方为：烘干粉碎后的烟草秸秆粉末(粉碎后过30目筛，含水量1％以下)，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂0.1g，蛋白胨0.1g，酵母膏0.1g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min。

3)烟草秸秆降解：

采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对烟草秸秆的降解效果。每个150ml三角瓶分装烘干的、剪碎至1cm宽、2-3cm长的烟秆5g，(NH₄)₂SO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，每瓶加5mM pH 7.0的磷酸缓冲液(PBS)15ml。各瓶接种0.25ml 10⁶个/ml浓度的孢子悬液，以接种等量无菌水作为对照，混匀后置于45℃恒温培养。定期观察烟秆的形态变化，7天后，洗去烟秆上的菌丝，测定其失重率以及纤维素、半纤维素和木质素的降解率。

纤维素、半纤维素和木质素的测定方法：

纤维素：将烟秆粉碎后过30目筛，称取0.2g烟秆粉末于烧杯中，将烧杯置冷水浴中，加入60％H₂SO₄ 60ml，并消化30min，然后将消化好的纤维素溶液转入100ml容量瓶，并用60％ H₂SO₄定容至刻度，摇匀后用布氏漏斗过滤至另一烧杯中。取滤液5ml，放入100ml容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，取2ml于具塞试管中，加入0.5ml 2％蒽酮试剂，并沿管壁加5ml浓H₂SO₄，塞上塞子，摇匀，静置10min，然后在620nm波长下测定吸光度。根据纤维素含量标准曲线计算样品中的纤维素含量。

半纤维素：将烟秆粉碎后过30目筛，称取0.1g烟秆粉末于烧杯中，加入10ml质量分数80％硝酸钙溶液，置电炉上加热，小火煮沸5min。冷却后离心；将沉淀用热水冲洗3次，然后向沉淀中加10ml浓度为2mol/L的盐酸，盖上玻盖，混匀，置沸水浴中，不时搅拌下沸腾45min；冷却后离心，将上清液移入100ml容量瓶中；向容量瓶中加1滴酚酞，用NaOH中和至显玫瑰色，稀释至刻度，随后将其过滤至烧杯中，弃去最初滤出的几滴滤液。用DNS法测定溶液中的还原糖，即取2ml滤液于试管中并加入1.5ml DNS试剂，于沸水浴中5min，冷却，在540nm波长下测定吸光度，并对照葡萄糖标准曲线计算样品的半纤维素含量。

DNS试剂的配制方法：6.3g 3，5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

木质素：将烟秆粉碎后过30目筛，称取0.1g烟秆粉末，装入离心管中，加入质量分数1％醋酸10ml，摇匀后离心。将沉淀用质量分数1％醋酸5ml洗一次，然后加3-4ml乙醇和乙醚混合液(体积比1∶1)，浸泡3min，弃去上清液，共浸洗3次。将离心管中的沉淀在沸水浴中蒸干，然后向沉淀中加入质量分数72％的硫酸3ml，用玻棒搅匀，室温下静置16h，使全部纤维素溶解。然后向试管中加入10ml蒸馏水，用玻棒搅匀，置沸水浴中5min，冷却后加5ml蒸馏水和0.5ml质量分数10％的氯化钡溶液，摇匀，离心。沉淀用蒸馏水冲洗2次，再向冲洗过的木质素沉淀中加10ml质量分数10％的硫酸和0.1mol/L重铬酸钾溶液，将试管放入沸水浴中15min，不时搅拌。冷却后将试管中所有物质转入烧杯中作滴定用，并用15-20ml蒸馏水洗涤残余部分。然后向烧杯中加入5ml质量分数20％KI溶液和1ml质量分数0.5％淀粉液，用硫代硫酸钠滴定。另外单独滴定加入了10ml质量分数10％硫酸的0.1mol/L的重铬酸钾溶液10ml作为空白样。木质素含量按下式计算：

X＝K(a-b)/(n×48)

式中，“48”为1mol C₁₁H₁₂O₄相当于硫代硫酸钠的当量数；K为硫代硫酸钠浓度，mol/L；a为空白滴定所耗硫代硫酸钠体积，ml；b为滴定溶液所耗硫代硫酸钠体积，ml；n为烟秆粉质量，g。

结果表明，接种后24h烟秆上开始出现白色菌丝，至48h时已经长出大量的白色菌丝，而对照此时只有少量菌丝。培养48h时菌丝基本长满，而对照组此时仅有少量白色菌丝。随后，布满叶脉表面的菌丝大约可持续3～4天，同时产生大量的孢子。7天后，各处理的烟秆变软、腐烂。接种P-1的烟秆降解率为40.5％，对照的降解率为27.7％(表1)。

接种P-1后秸秆底物纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为50.6％、47.4％和35.2％，而对照组的分解率分别为31.4％、27.8％和20.7％。

从以上数据可以看出接种高温降解菌P-1可以显著加快烟草秸秆的分解和其中成分的转化，加速底物的分解和腐熟。

表1烟草秸秆P-1固体发酵后烟秆、纤维素、半纤维素和木质素的降解率(％)

	烟秆	纤维素	半纤维素	木质素
					对照	27.7±1.63	31.4±1.90	27.8±2.09	20.7±5.28
P-1	40.5±3.95	50.6±2.29	47.4±2.70	35.2±4.76

Claims (5)

1.一种烟草秸秆降解真菌P-1，该菌株属于灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.3304；其生物学特性为，初期菌落表面浅色、平坦，呈细小颗粒状，随着时间推移颗粒逐渐变密，颜色逐渐变为深绿色，并产生大量的分生孢子，分生孢子梗顶端膨大呈球形，表面以放射状生出小梗，圆形的分生孢子串生于小梗顶端。

2.权利要求1所述烟草秸秆降解真菌在降解烟草秸秆方面的应用。

3.用权利要求1所述真菌制备的降解烟草秸秆的菌剂，制备方法如下：

1)烟草秸秆粉固体培养基的配制：烘干粉碎后的烟草秸秆粉末5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min；

2)液体培养基的配制：烘干粉碎后的烟草秸秆粉末5g，(NH₄)₂SO₄ 2g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂ 0.1g，蛋白胨0.1g，酵母膏0.1g，水1000ml，pH自然，121℃高压灭菌20min；

3)将权利要求1所述菌株P-1接种至烟草秸秆粉固体培养基上，45℃条件下培养3-4d，取直径0.8cm的菌饼1块接种于上述液体培养基中，装液量为体积比1/5、转速170r/min，45℃条件下摇床培养5d，培养物经4层无菌纱布过滤后获得孢子悬液菌剂。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其生产方法中所用烘干粉碎后的烟草秸秆粉末为粉碎后过30目筛，含水量质量比1％以下。

5.权利要求3或4所述菌剂在降解烟草秸秆方面的应用。