CN109837216B

CN109837216B - 一种快速分离烟草内生真菌的方法

Info

Publication number: CN109837216B
Application number: CN201711202159.1A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 李盼盼; 申国明; 高林; 李青诚; 高加明; 李方明; 余军
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN109837216A

Abstract

本发明提出了一种快速分离烟草内生真菌的方法，包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存等步骤。本发明采用组织分离法，从烟草植株的根、茎、叶中进行内生真菌的分离培养，可以更好地发掘烟草内生真菌的生物多样性；同时，针对烟草材料的组织特点，选择了合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)‑2.5％次氯酸钠(30s)‑75％乙醇(1min)”三步消毒法，可以在最大程度上保证内生真菌分离效果。本发明的特点和意义在于建立了更为完善的烟草内生真菌的分离技术方法，实现对其更加快速及准确的分离；本发明对于烟草内生真菌资源的充分利用、烟草农业生产的健康可持续发展具有重要意义。

Description

一种快速分离烟草内生真菌的方法

技术领域

本发明涉及一种快速分离烟草内生真菌的方法，属于微生物学领域。

背景技术

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织和器官内部或者组织间隙中的一类真菌。其与宿主植物建立了和谐的互利共生关系，是植物体微生态系统的重要组成部分。内生真菌在植物生长发育及在植物生物和非生物胁迫中发挥着重要作用，研究表明内生真菌能促进植物生长、诱导植物产生抗病性、提高植物对重金属的耐性、减轻重金属对植物的不良影响等。植物内生真菌分布广泛、活性多样，已在多种植物中得到研究。此外，近年来的研究表明，生活在植物体这一特殊生态环境中的内生真菌能够与宿主发生协同进化，产生与宿主相同或相似的活性次级代谢产物，包括抑菌、抗肿瘤、促生长因子、抗氧化活性物质等，在医药、农业领域有很大的应用潜力。

烟草内生真菌是与烟草(Nicotinana tabacum)有互利共生关系的生态类群，烟草内生真菌广泛分布于烟草根、茎、叶中，具有丰富的生物多样性，是烟田微生物群落的重要成员。烟草内生真菌不仅能促进烟草生长，增强抗病虫能力，提高烟草品质和抗逆性(抗病虫害、抗重金属和抗干旱胁迫)，还具有降低烟草亚硝胺含量，改善烟叶品质的积极作用。因此，烟草内生真菌的研究及开发对阐明烟草内生真菌的种类、分布特点，提高烟叶品质具有重要意义。

目前对烟草内生真菌研究较少，仅有一个专利涉及烟草内生真菌的分离和鉴定(一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，公开号：CN105018351A)。其涉及的分离技术手段包括：烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化和保存。其所阐述的烟草内生真菌的分离方法只适用于从烟草叶片中分离培养烟草内生真菌，不能很好地揭示烟草内生真菌在不同部位(根、茎、叶)的分布规律及种群结构；其表面消毒采用75％的乙醇浸泡2～3min，此消毒方法几乎适用于所有植物，而无法对烟草组织易霉变、稚嫩的特点进行针对性地分离。同时，上述消毒过程中消毒液有可能渗透到组织内，从而杀死组织里的一些内生真菌；或者消毒不彻底，导致表面附生真菌被分离，不能反映烟草内生真菌的真实群落结构。

发明内容

基于上述问题，本发明目的在于提供一种采用组织分离法，选择合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法，在最大程度上保证内生真菌分离效果的快速分离烟草内生真菌的方法。

针对以上问题，提供了如下技术方案：一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存，具体步骤如下：

(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶；

(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡25～35s后，再放入75％乙醇中浸泡1～2min，最后用无菌水冲洗多次，完成表面消毒；

(3)检验步骤(2)中的消毒是否彻底：取最后一次冲洗的无菌水，用涂布法涂布于培养基上，看是否有杂菌长出，若没有杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出则消毒不彻底，需重复消毒；

(4)将步骤(2)中的烟草组织去除边缘，切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养；

(5)将步骤(4)中的烟草组织与培养基放入培养箱，28℃恒温培养；

(6)观察步骤(5)中烟草内生真菌生长状态，若切口处有菌丝长出，用灭菌的接种环挑取菌丝，在新的PDA培养基上划线稀释，直至获得纯培养；

(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40％甘油水溶液中，-80℃保存菌种。

本发明进一步设置为：所述步骤(1)中先用自来水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶，除去表面泥土，再用无菌水充分冲洗。

本发明进一步设置为：所述步骤(2)中经过步骤(1)处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡30s后，再放入75％乙醇中浸泡1min，最后用无菌水冲洗三次。

本发明进一步设置为：所述步骤(4)中PDA培养基的组成为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，青霉素2g/L。

本发明的有益效果：与现有技术中只能从烟草叶片中分离培养烟草内生真菌和仅采用75％的乙醇的消毒方法相比，本发明采用组织分离法，将烟草植株的根、茎、叶经严格表面消毒后在常规培养基中进行内生真菌的分离培养，可更好地发掘烟草内生真菌的生物多样性；培养过程中的表面消毒是分离的关键步骤，消毒程序会对分离结果产生影响，不同植株的表面微生物种类存在较大差异，本发明针对烟草材料的组织特点(稚嫩，易生霉等)，经对比优化选择了合适的表面消毒时间和消毒剂，建立了“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法，对灭活烟草表面微生物更具针对性，可以在最大程度上保证内生真菌分离效果，既避免了消毒过程中消毒液渗透到组织内，从而杀死组织里的一些内生真菌，同时也能避免消毒不彻底，导致表面附生真菌被分离，不能反映烟草内生真菌的真实群落结构。

附图说明

图1为本发明实施例中烟草内生真菌分离流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种快速分离烟草内生真菌的方法，具体步骤结合附图1如下：

(1)用自来水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶，除去表面泥土，再用无菌水充分冲洗；

(2)将步骤(1)中处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1～2min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡30s后，再放入75％乙醇中浸泡1min，最后用无菌水冲洗三次，完成表面消毒；

表1：75％乙醇进行烟草表面灭菌最佳时间

处理时间	75％乙醇
		10s	-
30s	-
		1min	+
2min	+
		3min	*

注：-代表有杂菌出现；+代表最佳灭菌条件；*代表内生真菌杀死

从表1可知，烟草组织在75％乙醇中浸泡0～1min之间的时间内有杂菌出现，表示灭菌还不够彻底，当浸泡到3min时，此时烟草组织内的生真菌被杀死，而浸泡1～2min为75％乙醇的最佳灭菌处理时间。

表2：烟草表面灭菌最佳条件

表3：杀菌强度对内生真菌分离影响

杀菌强度	内生真菌长出时间(d)	分离内生真菌数量
			2.5％次氯酸钠，30s	3～5	较多
5.0％次氯酸钠，10s	5～8	较少

从表2可知，烟草组织在1.0％次氯酸钠中浸泡处理中始终有杂菌出现；烟草组织在2.5％次氯酸钠中浸泡20s内也有杂菌，当浸泡到1min时内生真菌杀死，最佳浸泡时间为30s；烟草组织在5.0％次氯酸钠中浸泡最佳时间为10s，浸泡20s或更长时间，生真菌被杀死；结合表3可知，烟草组织在2.5％次氯酸钠中浸泡30s时，内生真菌长的时间短且数量多，而在5.0％次氯酸钠中浸泡10s时，内生真菌的长出时间长且数量较少；因此，在2.5％次氯酸钠中浸泡30s为烟草表面灭菌最佳条件之一。

经反复实验证明，在2.5％次氯酸钠中浸泡30s后再重复用75％乙醇消毒1min会取得更好的分离效果。

(4)将步骤(3)中的烟草组织去除边缘，切成0.5×0.5cm小块插入PDA培养基中培养，所述PDA培养基的组成为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，青霉素2g/L；

(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40％甘油水溶液中，-80℃保存菌种。-80℃为超低温冻存，可保存更长时间。

本技术方法适用于从烟草植株的根、茎、叶中进行内生真菌的分离，可以最大限度的挖掘烟草内生真菌资源，揭示烟草内生真菌的分布规律及种群结构。不同植株的表面微生物种类存在较大差异，本方案中采用“75％乙醇(1min)-2.5％次氯酸钠(30s)-75％乙醇(1min)”三步消毒法，对灭活烟草表面微生物更具针对性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，上述假设的这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括对烟株组织表面的三步消毒、切片培养、内生真菌菌株的分离纯化和保存，具体步骤如下：

(1)用无菌水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶；

(7)观察步骤(6)中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，然后将纯化菌株的菌丝用接种环挑入灭菌的40％甘油水溶液中，-80℃保存菌种；

所述步骤(2)中经过步骤(1)处理后的烟草组织先在75％乙醇中浸泡1min，然后放入2.5％次氯酸钠中浸泡30s后，再放入75％乙醇中浸泡1min，最后用无菌水冲洗三次。

2.根据权利要求1所述的一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：所述步骤(1)中先用自来水充分冲洗健康烟株的根、茎、叶，除去表面泥土，再用无菌水充分冲洗。

3.根据权利要求1所述的一种快速分离烟草内生真菌的方法，其特征在于：所述步骤(4)中PDA培养基的组成为：马铃薯粉200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，青霉素2g/L。