CN112358972A

CN112358972A - 一种消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法

Info

Publication number: CN112358972A
Application number: CN202011131351.8A
Authority: CN
Inventors: 周万海; 冯瑞章; 魏琴; 田忠琼; 刘雯雯; 龚云飞; 杨婷
Original assignee: Yibin University
Current assignee: Yibin University
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-02-12

Abstract

本发明公开了一种消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法，属于真菌分离培养技术领域，包括以下步骤：选取成熟的健康油樟，分别采集根、茎、叶，分别对其依次采用水漂洗3‑5次、95％乙醇浸泡1‑2min、4‑5wt％次氯酸钠振荡洗涤4‑5min、95％乙醇浸泡1‑2min和水漂洗5‑6次进行消毒处理；将经上述消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含氯霉素的PDA培养基或含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基或含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基或含氯霉素的MEA培养基中进行培养。本发明的方法对油樟组织表面进行消毒，在保证消毒效果的同时，保护内生真菌不受损伤。

Description

一种消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法

技术领域

本发明属于真菌分离培养技术领域，具体涉及一种消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法。

背景技术

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble)N.Chao)属樟科、樟属，是国家Ⅱ级重点保护植物，也是我国特有的、盛产天然芳香油的经济作物。目前，宜宾油樟种植面积超过50万亩，占全国油樟总资源的75％以上，该区域独特的地理地貌和气候特征，保证和保存了物种的生物遗传独立性。因此，宜宾油樟可能存在与其它地区、其它物种完全不同的潜在内生真菌物种资源。

从植物组织中分离得到内生真菌，是研究其功能以及多样性等性能的基础，大量关于内生真菌的研究都涉及从宿主植物中分离内生真菌。而在分离植物内生真菌的过程中，消毒方法和培养基选择是影响分离效果的关键因素。表面消毒不彻底，会造成宿主附生菌污染，而消毒剂浓度过高或者消毒时间过长，会造成内生真菌损伤严重。同时，内生真菌分离培养时的培养基选择不当，会使得内生真菌不易生长、挑取、辨认。因此，必须设计合理的表面消毒方法、检测表面消毒的效果，建立适宜的培养条件，筛选和优化培养基组成，保证植物内生真菌的分离效果。但迄今为止，国内外均未见针对油樟不同组织表面消毒及其内生真菌分离方法的相关研究报告。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的关于油樟内生真菌研究的空白，以宜宾市高县油樟母本园的油樟为基础研究对象，提供一种能够广泛适用于各地油樟的消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种油樟内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤：

选取成熟健康油樟，分别采集根、茎、叶，分别对其依次采用无菌水漂洗3-5次、95％乙醇浸泡1-2min、4-5wt％次氯酸钠振荡洗涤4-5min、95％乙醇浸泡1-2min和无菌水漂洗5-6次进行消毒处理。

进一步地，S1中对根依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、5wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

进一步地，S1中对茎依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

进一步地，S1中对叶依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤4min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

一种油樟内生真菌的分离培养方法，包括以下步骤：

将经上述消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含氯霉素的PDA培养基或含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基或含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基或含氯霉素的MEA培养基中进行培养。

进一步地，S2中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片。

进一步地，S2中含氯霉素的PDA培养基由PDA培养基中加入0.05-0.15g/L氯霉素得到，氯霉素含量优选为0.1g/L。

进一步地，S2中含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基中油樟叶浸提液的含量为95-100mL/L，氯霉素的含量为0.05-0.15g/L；油樟叶浸提液含量优选为100mL/L，氯霉素含量优选为0.1g/L；其中油樟叶浸提液为水提液，将200g油樟叶切碎为约3*3cm的小块，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸15min，再补充蒸馏水至1L得到。

进一步地，S2中含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基中胡萝卜汁的含量为95-100mL/L，氯霉素的含量为0.05-0.15g/L；胡萝卜汁含量优选为100mL/L，氯霉素含量优选为0.1g/L；其中胡萝卜汁为水煮汁液，将200g胡萝卜切碎为约1*1*1cm的小块，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸15min，补充蒸馏水至1L得到。

进一步地，S2中含氯霉素的MEA培养基由MEA培养基中加入0.05-0.15g/L氯霉素得到，氯霉素含量优选为0.1g/L。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

在分离植物内生真菌的过程中，消毒方法和培养基条件是影响分离效果的关键因素。表面消毒不彻底，会造成宿主表生菌污染，而消毒剂浓度过高或者消毒时间过长，又会造成内生真菌损伤严重。因此要选择合适的表面消毒剂、确定合适的消毒方式并且设定合适的消毒剂浓度以及消毒时间，在保证消毒效果的同时又要保护内生真菌不受损伤。

首先需要确定表面消毒剂的种类，选用安全无毒以及更易清洗的次氯酸钠作为消毒剂，本发明经过实验处理发现，一定浓度的次氯酸钠与95％乙醇配合使用能够获得较好的的消毒效果。对于油樟组织的表面消毒，选用三步法，即乙醇-次氯酸钠-乙醇，为避免消毒效果不彻底或油樟的茎和叶出现褐化，确定了95％乙醇浸泡1min→5％次氯酸钠震荡洗涤根5min、4％次氯酸钠震荡洗涤茎5min、4％次氯酸钠震荡洗涤叶4min→95％乙醇浸泡1min的消毒方式，并在乙醇浸泡前后采用无菌水进行漂洗，使得本发明的方法能够充分而彻底地对油樟组织的表面进行消毒，防止表面菌类对后续内生真菌分离培养的影响，同时也避免了组织褐化，油樟内部组织受到损伤及其内生真菌被杀灭，影响内生真菌的多样性研究。

在油樟内生真菌分离的过程中，培养基的营养条件是很关键的因素。如果培养基选择不当，可能会使某些内生真菌生长缓慢甚至不生长，或长出的内生真菌不易辨认、挑取和分离等。因此，选用合适的内生真菌分离培养基，对保证油樟内生真菌的分离效果是非常必要的。本发明通过前期对油樟和其内生真菌的相关研究、合理推测及实验验证，最终确定了采用适合培养油樟组织内生真菌生长的培养基，且长出的菌落容易辨认、挑取和分离。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳的实施例提供一种消毒油樟表面并分离培养其内生真菌的方法，具体步骤如下：

S1.选取成熟的健康油樟，分别采集根、茎、叶，对根依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、5wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理，对茎依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理，对叶依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤4min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理；

S2.将经S1消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片，接种到含氯霉素的PDA培养基中，即可；其中，氯霉素的含量为0.1g/L。

实施例2

S2.将经S1消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片，接种到含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基中，即可；其中，氯霉素的含量为0.1g/L，油樟叶浸提液的含量为100mL/L。

实施例3

S2.将经S1消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片，接种到含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基中，即可；其中，氯霉素的含量为0.1g/L，胡萝卜汁的含量为100mL/L。

实施例4

S2.将经S1消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片，接种到含氯霉素的MEA培养基中，即可；其中，氯霉素的含量为0.1g/L。

实验例1

实验方法：对采集的油樟样品(根、茎、叶)都先用95％酒精处理1min，分别用4％和5％的次氯酸钠消毒1min、2min、3min、4min、5min、6min，继而用95％的酒精再处理1min，将消毒后的材料修剪成2～3mm长的小段或0.5*0.5cm的正方形小块，置于PDA培养基上培养一周后观察，每种处理30个平板作为实验组，同时，取每种处理的最后一次漂洗液0.1ml涂布平板，在同一培养环境下培养作为对照组1，消毒后的油樟组织在空白培养基上进行按压后置于同一培养环境下培养作为对照组2，检验消毒是否彻底，同时观察组织是否褐化。

由下表1可知，通过不同时间的表面消毒后，单独使用次氯酸钠或者酒精的处理，较短时间的第5次无菌水冲洗液接种到固体平板，或者用消毒后油樟组织按压固体平板后都有菌落长出，表明表面消毒不彻底；将酒精和次氯酸钠结合消毒，表现出95％的酒精+次氯酸钠的固体平板无菌落生长，表明表面消毒彻底；较长时间的处理虽然无菌落长出，但材料褐化较为严重，因此，综合考虑处理时间和材料褐化程度，需要将95％的酒精和一定浓度的次氯酸钠搭配使用，才能完全达到表面消毒的要求。

表1不同表面消毒剂的消毒效果

注：“+”表示有菌落长出，“-”表示无菌落长出。

不同的植物组织，表面消毒的程序不同，针对油樟根、茎、叶组织，通过不同的消毒方法表面消毒的结果(下表2)显示，95％的酒精+3％次氯酸钠处理在实验规定的时间内均无法达到彻底消毒的目的；95％的酒精+5％次氯酸钠处理中，乙醇-次氯酸钠-乙醇三步法表现出最好的消毒效果。然而，这种方式消毒以后的油樟茎、叶组织出现褐化，可能有消毒强度太大的可能。

表2不同消毒方式的消毒效果

不同浓度次氯酸钠不同消毒时间对油樟根、茎、叶的表面消毒效果见下表3、表4、表5，其中，分别以“Ⅺ”、“Ⅴ”、“Ⅳ”处理的效果最好：

表3不同浓度次氯酸钠不同处理时间对油樟根的表面消毒效果

表4不同浓度次氯酸钠不同处理时间对油樟茎的表面消毒效果

表5不同浓度次氯酸钠不同处理时间对油樟叶的表面消毒效果

实验组平板生长的内生真菌菌落数较多，同时对照组平板没有菌落生长以及组织未褐化被认为是内生菌分离的最好效果，以此为评判标准。由上，从油樟根、茎、叶的表面消毒效果来看，根、茎、叶的最佳次氯酸钠消毒浓度分别为5％、4％、4％，这可能是因为茎和叶的表面组织要比根的表面组织更嫩一些，所以表面消毒剂的浓度也更低一些，否则容易导致消毒过度，造成表面消毒剂进入植物材料中，从而杀死内生真菌，影响分离效果。同时，由表5、6、7可知，4％次氯酸钠处理根浓度太低，导致消毒不彻底，而5％次氯酸钠处理叶浓度又太高，导致内生真菌损伤严重。实验表明，根、茎、叶消毒效果分别以“Ⅺ”、“Ⅴ”、“Ⅳ”最佳，即“以5％次氯酸钠震荡洗涤5min”处理油樟根效果最佳、“以4％次氯酸钠震荡洗涤5min”处理油樟茎效果最佳、“以4％次氯酸钠震荡洗涤4min”处理油樟叶效果最佳。

实验例2

实验方法：通过消毒后的样品，用无菌剪刀将周围组织裁剪丢弃，选用中部组织将根茎剪成2-3mm的小段，将叶剪切成0.5*0.5cm大小的组织片，接种到8种不同的培养基当中，每种培养基接种10个平板50个样，8种培养基共400个样。在霉菌培养箱中28℃培养，培养一周后，挑取生长出的菌株并用三点法将其进行纯化，观察记录并统计出菌数量，通过对菌株DNA提取、PCR扩增、序列测定及比对，得到内生真菌的具体分类。

观察记录并统计各个培养基上的出菌数量和种类，结果如下表6所示。

表6不同培养基分离油樟内生真菌的效果

从分离的菌种数量和种类来看，马铃薯葡萄糖琼脂培养基、PDA+油樟叶浸提液、PDA+胡萝卜汁、麦芽浸粉琼脂培养基的培养基的内生真菌分离结果比较好，其中马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离效果最佳，分离真菌的数量和种类均最多，另外，这种培养基成本低、来源稳定，为最适合油樟根茎叶内生真菌分离纯化的最佳培养基。此外PDA+油樟叶浸提液、PDA+胡萝卜汁、麦芽浸粉琼脂培养基也具有良好的培养能力，分离的真菌数量比较多，种类比较丰富，可以尝试利用此类培养基对内生真菌的不同季节数量动态变化进行研究，以期得到更多种类的内生真菌。而察氏培养基、马丁培养基和卵磷脂吐温-80营养琼脂培养基效果较差。玉米粉琼脂培养基因具有乳白色的外表，其中还掺杂有白色不透明的小颗粒，不易观察培养基上生长的颜色较浅的菌落形态，所以不适合用于进行真菌多样性研究的相关实验。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种油樟根茎叶表面消毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

选取成熟的健康油樟，分别采集根、茎、叶，分别对其依次采用无菌水漂洗3-5次、95％乙醇浸泡1-2min、4-5wt％次氯酸钠振荡洗涤4-5min、95％乙醇浸泡1-2min和无菌水漂洗5-6次进行消毒处理。

2.根据权利要求1所述的油樟根茎叶表面消毒的方法，其特征在于，对根依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、5wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

3.根据权利要求1所述的油樟根茎叶表面消毒的方法，其特征在于，对茎依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤5min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

4.根据权利要求1所述的油樟根茎叶表面消毒的方法，其特征在于，对叶依次采用无菌水漂洗3次、95％乙醇浸泡1min、4wt％次氯酸钠振荡洗涤4min、95％乙醇浸泡1min和无菌水漂洗5次进行消毒处理。

5.一种油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经权利要求1消毒处理后的材料的周围组织裁剪丢弃，将剩余的中部组织接种到含氯霉素的PDA培养基或含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基或含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基或含氯霉素的MEA培养基中进行培养。

6.根据权利要求5所述的油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，中部组织剪成2-3mm的小段斜口根茎或剪成0.5×0.5cm的小片叶片。

7.根据权利要求5所述的油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含氯霉素的PDA培养基由PDA培养基中加入0.05-0.15g/L氯霉素得到。

8.根据权利要求5所述的油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含氯霉素和油樟叶浸提液的PDA培养基中油樟叶浸提液含量为95-100mL/L，氯霉素的含量为0.05-0.15g/L。

9.根据权利要求5所述的油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含氯霉素和胡萝卜汁的PDA培养基中胡萝卜汁的含量为95-100mL/L，氯霉素的含量为0.05-0.15g/L。

10.根据权利要求5所述的油樟内生真菌的分离培养方法，其特征在于，含氯霉素的MEA培养基由MEA培养基中加入0.05-0.15g/L氯霉素得到。