CN102040633A

CN102040633A - 利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法

Info

Publication number: CN102040633A
Application number: CN2009102053534A
Authority: CN
Inventors: 吴和生; 林柏丞; 艾利·柏英·斯唐刚
Original assignee: Yuan Ze University
Current assignee: Yuan Ze University
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明公开了一种利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，包含步骤(1)提供几丁质或几丁聚糖来源；(2)将酸溶液加入该几丁质或几丁聚糖来源，形成反应液；(3)将反应液置于微波装置中，以进行水解反应，使几丁质或几丁聚糖水解产生葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺。本发明利用微波炉进行盐酸化反应，能有效缩短反应时间，只须约3～10分钟即能与传统方法达到相同的效果，可大幅缩短制程时间，增加产能，减少葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺的生产成本。

Description

利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法

技术领域

本发明涉及一种生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，特别是指一种利用微波装置作为水解反应热源，以水解几丁质或几丁聚糖而生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法。

背景技术

葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)，或称2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-Glucose)为关节软骨的组成成份之一，可提供关节组织的营养，增加滑液恢复润滑功能，促进退化关节再生，进而有效减轻骨头磨擦产生的痛苦，阻止关节炎症状的恶化。人体可自行合成葡萄糖胺，但随年龄增加，人体内合成葡萄糖胺的速度不及分解葡萄糖胺的速度，于是容易产生体内及关节缺乏葡萄糖胺的现象，并影响关节内细胞的代谢。

葡萄糖胺或其乙酰化衍生物-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)具有：(1)刺激软骨母细胞的新生，促进其新陈代谢，供给骨骼营养，使发炎减少，疼痛消失；(2)保护软骨细胞不受药物、外力的伤害，防止骨关节的退化；(3)增加润滑液量及其黏性，促进关节润滑作用，改善骨关节机能；(4)改善腰酸背痛效果等特性。在欧洲，葡萄糖胺已被广泛用于治疗骨关节炎；人体经食用葡萄糖胺后，可将之快速吸收并运送到体内备组织加以利用。经大鼠急性毒性测试以及微生物变异原性试验证实，葡萄糖胺为一安全无毒的健康食品，及早补充葡萄糖胺更可达到预防关节炎的效果。

由于葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺具有上述多种医疗功能及优点，目前市面上也出现许多以葡萄糖胺为主要成分的保健食品或补充锭，葡萄糖胺制程的研发及改良亦是许多药厂研发的重点之一；由于葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺是组成几丁质与甲壳素的单体，因此在传统工业上，生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法是以酸或酶水解几丁质或几丁聚糖而来；其程序为：将虾壳粉或蟹壳粉浸泡于氯化氢溶液以去除碳酸钙，然后以碱(alkali)煮沸以去除脂肪及蛋白质，得到的产物即为几丁质；随后，将几丁质浸泡于氯化氢溶液直到几丁质溶解为液相，再添加活性碳以去除颜色及重金属，经过浓缩、结晶、以酒精清洗，以及低温真空干燥后，得到的白色结晶粉末即为葡萄糖胺。

然而，在上述制造方法中，不同来源的虾壳粉或蟹壳粉会影响葡萄糖胺的纯度，且若使用受毒物污染的虾蟹来源，也可能会使制得的葡萄糖胺含有毒性；再者，进行虾壳、蟹壳水解作用之前，需费工冲洗该虾壳、蟹壳以避免恶臭；而葡萄糖胺也并非水解虾蟹壳作用中唯一的产物，仍须进行纯化以分离葡萄糖胺与其它副产物。

除了上述利用虾壳粉或蟹壳粉作为几丁质或几丁聚糖来源，以水解方法产生葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺之外，目前亦有使用微生物来生产葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺的方法：利用真菌的细胞壁内会产生几丁质或几丁聚糖的特性，以这些真菌作为几丁质或几丁聚糖的来源，将真菌细胞破碎后取出几丁质或几丁聚糖，并以盐酸进行水解反应进而得到葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺产物。

在上述盐酸水解反应程序中，反应的温度与盐酸的浓度扮演重要的角色；反应时间的长短以及葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺产物的产量，会因盐酸浓度不同与反应温度不同而有所差异；一般而言，反应温度介于60℃到100℃；盐酸浓度介于10～40％(w/w)，反应时间由数十分钟至24小时不等。

Hsieh等人(2007年)于Biotechnology Progress期刊所发表的文献中，揭露的盐酸化反应条件如表1(Hsieh，J.W.，H.S.Wu，Y.H.Wei，and S.S.Wang.2007.Determination and kinetics of producing glucosamine using fungi，Biotechnol.Prog.，23：1009-1016)：

表1Hsieh等揭露的盐酸化反应条件

Cao等人则于美国专利公开号US.Patent Pub.No.：US 2008/0188649 A1中揭露的盐酸化反应条件如表2：

表2Cao等揭露的盐酸化反应条件

Gandhi等人则于美国专利号US.PatentNo.：US 6,486,307 B1中揭露的盐酸化反应条件如表3：

表3Gandhi等揭露的盐酸化反应条件

Deng等人则于美国专利公开号US.PatentPub.No.：US 2004/0091976 A1中揭露，几丁质盐酸化反应速率与反应温度、溶液中葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺浓度，以及盐酸溶液浓度有关；成功的反应条件包含60～100℃的反应温度，反应时间则因反应温度与盐酸浓度的不同而异，高浓度盐酸与高反应温度的反应时间为10分钟，低浓度盐酸与低反应温度的反时间则为3小时至24小时不等。

由上述各现有技术可得知，现有生产葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺的酸化水解反应所需时间由数十分钟至24小时不等；众所周知地，在工业化大量生产过程中，生产程序的反应时间若是越长，所需的人员工时越多，产能越低，将不利于降低生产成本。

由此可见，上述现有生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法仍有诸多缺失，实非良好的设计，而亟待加以改良。

发明内容

目前工业上生产葡萄糖胺仍以几丁质或几丁聚糖去做盐酸化进行水解，但生产过程相当耗时且浪费能源，须等待盐酸化反应完成才能进行下一步骤；基于此原因，本发明的目的即在于提供一种利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法；该方法是一种相当省时且节省能源的盐酸化过程，能将数小时的盐酸化反应缩减至3分钟内完成，进而节省能源并减少生产成本。

为了达成上述发明目的，本发明发明人利用微波的电磁能当做热能，以有效迅速地促进化学反应。微波技术能帮助工程师明显地缩短成本费用、加速反应速率、增加产量等。因此，在本发明中利用微波技术来使真菌的生物质(biomass)进行水解反应，以生产葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺，在酸性环境下，减少酸化反应时间，并且节省能源与生产成本。

可达到上述发明目的的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，包含下列步骤：

步骤1：提供几丁质或几丁聚糖来源；

步骤2：将酸溶液加入该几丁质或几丁聚糖来源，形成反应液；

步骤3：将反应液置于微波装置中加热，以进行水解反应，使几丁质或几丁聚糖水解产生葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺；

其中所述几丁质或几丁聚糖来源为可产生几丁质或几丁聚糖的微生物；该微生物为Rhizopus oligosorus BCRC 31996、Monascus purpures BCRC 31499、Monascus pilosus BCRC31527或Aspergillus sp.BCRC 31742；于一较佳实施例中，该微生物为黄曲菌Aspergillus sp.BCRC31742。

其中所述酸溶液为盐酸溶液或硫酸溶液；于一较佳实施例中，该该酸溶液为盐酸溶液。其中该盐酸溶液的浓度为2N至6N；于一较佳实施例中，该盐酸溶液的浓度为6N。

其中所述微波装置的功率为700watt至2100watt；于一较佳实施例中，该微波装置的功率为1120watt至1400watt；于一更佳实施例中，该微波装置的功率为1400watt。

其中该步骤3的加热时间为90秒至270秒；于一较佳实施例中，该加热时间为180秒至270秒；于一更佳实施例中，当盐酸溶液的浓度为6N时，该加热时间为180秒。

本发明所提供的一种利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：

1.本发明与传统盐酸化最大不同在于，传统盐酸化过程是须在高温(60℃～100℃)烘箱进行数小时(一般约4～24小时)；而本发明摒除烘箱，改利用微波炉进行盐酸化反应，能有效缩短反应时间，只须约3～10分钟即能与传统方法达到相同的效果。

2.本发明所提供的盐酸化反应方法，操作简单、步骤少、时间短(3～10分钟即可完成)，若将此过程应用在葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺工业化大规模生产，将可减少生产过程中加热能源成本的开销，也可大幅缩短制程时间，增加产能，减少葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺的生产成本。

附图说明

图1为本发明以盐酸水解反应生产葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺试验流程图；

图2为以传统烘箱作为热源装置，对加入不同浓度HCl溶液的样本加热(100℃)进行水解反应，水解不同时间所产生的葡萄糖胺含量的分析；(O)6N HCl，

4N HCl，(□)2N HCl；

图3为以微波炉作为热源装置，对加入不同浓度HCl溶液的样本加热(100％功率，1400watt)进行水解反应，加热不同时间所产生的葡萄糖胺含量的分析；(O)6N HCl，4N HCl，(□)2N HCl；

图4为以不同功率的微波炉作为热源装置，对加入6N HCl溶液的样本加热进行水解反应，加热不同时间所产生的葡萄糖胺含量的分析；(O)80％功率(1120watt)，

90％功率(1260watt)，(□)100％功率(1400watt)。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明。

实施例1几丁质或几丁聚糖来源的制备

本实施例是以摇瓶发酵培养方式，大量培养会产生几丁质或几丁聚糖的真菌，以这些真菌作为几丁质或几丁聚糖的来源，再将真菌细胞破碎后取出几丁质或几丁聚糖，最后以盐酸进行水解反应进而得到葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺产物。

1.1试验菌株

本实施例是以黄曲菌Aspergillus sp.BCRC31742作为生产真菌生物质的菌株，该菌株购自财团法人食品工业发展研究所(台湾，新竹)。

1.2摇瓶发酵培养

将黄曲菌株Aspergillus sp.BCRC31742先以PDA(Potato Dextrose Agar：200g/L Diced potatoes，20g/L Glucose，15g/L Agar)固态培养基于30℃下培养活化7天，再将单一菌落接种于以灭菌PDB(Potato Dextrose Broth：20g/L Diced potatoes，4g/L Glucose，150ml)液态培养基内，于30℃下以200rpm转速培养7天，进行二次活化；接着进行摇瓶培养，将活化后的菌株接种至已灭菌的GP培养基(glucose peptone medium：25g/L Glucose，20g/L Peptone，0.5g/LKH₂PO₄，0.5g/LMgSO₄·7H₂O，0.1g/L CaCl₂·2H2_O)，于30℃下以200rpm转速培养7天。摇瓶培养后，将所得的真菌发酵物(真菌生物质)以真空过滤方式与培养液分离，并以无菌水清洗数次后，将该真菌放入烘箱烘干后秤重，再将干燥后的真菌生物质以10ml无菌水重新悬浮，接着以均质机将真菌细胞打破后，供实施例2水解反应试验作为几丁质或几丁聚糖来源使用。

实施例2盐酸水解反应试验

盐酸水解反应试验流程如图1所示，以实施例1制备所得的真菌生物质作为几丁质或几丁聚糖来源，加入盐酸后，于不同的反应条件下，进行水解反应，以得到葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺产物，并加入1-萘基异硫氰酸酯嘧啶(1-naphthyl isothiocyanate pyridine，1-NITC)溶液进行衍生化反应，再以高效液相层析技术(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行葡萄糖胺含量测定。

2.1以传统烘箱作为热源试验

各样本以10ml真菌细胞均质液作为试验材料，分别加入10ml 2N、4N、6N不同浓度的盐酸(HCl)溶液，混匀后置于100℃传统烘箱中分别加热反应1、2、3、4、6、8、12、16、20、24小时，再各加入10ml无菌水以终止反应；待溶液冷却至30℃后，以12N氢氧化钠(NaOH)溶液，将反应液中和至pH值为7.0，再以45μm滤膜过滤，取0.1ml过滤后的反应液进行衍生化反应，再以HPLC进行葡萄糖胺含量测定，结果如图2所示。

2.2以微波炉作为热源试验

各样本以10ml真菌细胞均质液作为试验材料，分别加入10ml 2N、4N、6N不同浓度的盐酸(HCl)溶液，混匀后置于微波炉中，以100％功率(1,400watt)分别加热反应90、120、150、180、210、240、270秒，再各加入10ml无菌水以终止反应；待溶液冷却至30℃后，以12N氢氧化钠(NaOH)溶液，将反应液中和至pH值为7.0，再以45μm滤膜过滤，取0.1ml过滤后的反应液进行衍生化反应，再以HPLC进行葡萄糖胺含量测定，结果如图3所示。

2.3不同微波功率试验

各样本以10ml真菌细胞均质液作为试验材料，各加入10ml 6N盐酸(HCl)溶液，混匀后置于微波炉中，分别以80％功率(1120watt)、90％功率(1260watt)、100％功率(1,400watt)加热反应90、120、150、180秒，再各加入10ml无菌水以终止反应；待溶液冷却至30℃后，以12N氢氧化钠(NaOH)溶液，将反应液中和至pH值为7.0，再以45μm滤膜过滤，取0.1ml过滤后的反应液进行衍生化反应，再以HPLC进行葡萄糖胺含量测定，结果如图4所示。

2.4衍生化反应

将上述2.1、2.2、2.3试验，于不同条件下进行水解反应后得到的反应液进行衍生化反应，取各反应液0.1ml，加入0.3ml 40mol/m³1-NITC溶液，于50℃下以100rpm转速反应1小时，以形成葡萄糖胺盐酸盐衍生物，反应后加入0.1ml HPLC内部标准品[0.1％(wt)3，5-二硝基苯甲腈(3，5-dinitrobenzonitrile)溶于乙腈(acetonitrile)溶液中]，过滤后取10μL进行葡萄糖胺含量测定。

2.5以高效液相层析技术(HPLC)进行葡萄糖胺含量测定

以高效液相层析技术(HPLC)进行葡萄糖胺含量测定，HPLC分析条件如下：

HPLC pump：Shimadzu LC-10AS

管柱：

100RP-18(5μm，4mm i.d.×250mm)

管柱温度：40℃

移动相：水/乙腈(87/13)，水与乙腈皆为HPLC等级

流速：1.3ml/min

侦测器：Uv-Vis侦测器SPD-10A，0.0100AUFS(Simadzu，日本)

压力：130～150N

UV侦测波长：230nm

UV侦测时间：40分钟

再依葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比，代入以葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比的葡萄糖胺盐酸盐检量线，以内插法求得葡萄糖胺的克数，换算出葡萄糖胺成分含量(GluN Content)；2.1、2.2、2.3各试验测出的葡萄糖胺成分含量分别如图2、3、4所示。

由图2结果可知，以传统烘箱作为热源时，添加6N HCl溶液的样本在加热4小时后，样本中葡萄糖胺的含量最高(0.22克/克干重细胞)；加入4N HCl溶液的样本则在加热24小时后，样本中葡萄糖胺的含量达到最高(0.22克/克干重细胞)；而加入2N HCl溶液的样本也是在加热24小时后，样本中葡萄糖胺的含量达到最高(0.14克/克干重细胞)。

而由图3结果可知，以100％功率(1400watt)微波炉作为热源时，添加6N HCl溶液的样本在加热180秒(3分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量最高(0.22克/克干重细胞)；加入4N HCl溶液的样本则在加热270秒(4.5分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量达到最高(约0.10克/克干重细胞)；而加入2N HCl溶液的样本也是在加热270秒(4.5分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量达到最高(0.06克/克干重细胞)。

另外，如图4所示，以6N HCl溶液进行水解反应，而以不同功率的微波炉作为热源时，以80％功率(1120watt)微波加热反应180秒(3分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量最高(约0.18克/克干重细胞)；同样的，以90％功率(1260watt)微波加热反应180秒(3分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量最高(约0.19克/克干重细胞)；而以100％功率(1400watt)微波加热反应180秒(3分钟)后，样本中葡萄糖胺的含量最高(约0.22克/克干重细胞)。

由本实施例试验结果可知，本发明所提供以微波技术生产葡萄糖胺的方法，可以将盐酸水解反应的时间由数小时缩短至3分钟。传统盐酸化方法与本发明盐酸化法的比较如下所示，由此可以明显得知在本发明中，运用微波技术来进行盐酸化反应，能有效缩短时间，并且降低能源消耗成本。

表4传统盐酸化方法与本发明盐酸化法的比较

上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims

1.一种利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，包含以下步骤：

步骤1：提供几丁质或几丁聚糖来源；

步骤2：将酸溶液加入所述几丁质或几丁聚糖来源，形成反应液；

其特征在于：还包括：

步骤3：将反应液置于微波装置中加热，以进行水解反应，使几丁质或几丁聚糖水解产生葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺。

2.如权利要求1所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述几丁质或几丁聚糖来源为产生几丁质或几丁聚糖的微生物。

3.如权利要求2所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述微生物为Rhizopus oligosorus BCRC 31996、Monascus purpures BCRC 31499、Monascus pilosus BCRC 31527或Aspergillus sp.BCRC 31742。

4.如权利要求1所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述酸溶液为盐酸溶液或硫酸溶液。

5.如权利要求4所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述盐酸溶液的浓度为2N至6N。

6.如权利要求1所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述微波装置的功率为700瓦特至2100瓦特。

7.如权利要求1所述的利用微波技术生产葡萄糖胺及乙酰葡萄糖胺的方法，其特征在于：所述步骤3的加热时间为90秒至270秒。