CN108004285A - 一种用于生产葡萄糖胺的培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种用于生产葡萄糖胺的培养基，包含：25‑500g/L糖蜜(molasses)、0.01‑100g/L大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25‑100g/L玉米浆(Corn Steep Liquor)、0.1‑2g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1‑0.5g/L硝酸铝(Al(NO3)3)，以及1‑5mL/L甲醇(Methanol)。本发明并关于一种生产葡萄糖胺的方法，包含：提供一产生葡萄糖胺的微生物，以及将所述微生物置于上述培养基中进行酦酵培养。

Description

一种用于生产葡萄糖胺的培养基及其应用
技术领域
本发明关于一种用于生产葡萄糖胺的培养基，特别是一种使用糖蜜作为碳源，以及使用大豆水解物作为氮源，以降低生产成本，提高葡萄糖胺产率的培养基及其应用。
背景技术
在医学上，葡萄糖胺己被大量用于治疗骨关节炎，能够有效作用于软骨组织治疗风湿性关节炎，其次葡萄糖胺对白血病癌细胞具有抑制作用，还有消炎护肝的功效。葡萄糖胺在食品保健领域也有着广泛的应用，在一些欧美国家葡萄糖胺被视为天然无害的食品及保健品配方而得到大量推广。
生产葡萄糖胺的方法主要有3种：酸水解法、酵素分解法及微生物酦酵法。传统制备葡萄糖胺主要是利用化学法或酵素法裂解几丁聚醣而得，传统的化学法一般是以强酸(盐酸、硝酸)对几丁质或几丁聚醣进行水解，而水解时间与温度及制成率有关，然而高浓度的强酸使用，容易引起废液处理的问题。
以酵素法来生成几丁寡醣比较少废液处理的问题，具有较高的选择性，目前常用的酵素有几丁质酵素(chitinase)、几丁聚醣酵素(chitosanase)这两种，但是这两种酵素价格高，原料(几丁质或几丁聚醣)不溶于中性的水中，因此水解速率非常低，再加上利用酵素法来生成几丁寡醣的成本高、成份稳定度低、需要较长的反应时间才能获得较高的产率，所以仍然无法商业化。
在目前工业上生产葡萄糖胺仍是使用虾蟹壳于盐酸溶液中进行水解，但不同来源的虾蟹壳是否会影响葡萄糖胺的纯度，以及当被污染的虾蟹壳其制造出的葡萄糖胺是否不具有毒性，况且水解反应前须将虾蟹壳进行前处理冲洗以免发臭，为了减少前处理繁琐的步骤以及在临床应用过程中会引起过敏体质患者的过敏反应，为减少人体服用后的过敏副作用后遗症考量，选择利用微生物生产方式代替传统的化学法。
微生物酦酵法是以微生物在生物反应器发酵培养而得葡萄糖胺。微生物发酵过程并不太会受到反应器的限制，所以微生物酦酵法生产葡萄糖胺得到了越来越多研究者的关注。相较于酸水解法与酵素分解法，微生物酦酵法生产葡萄糖胺具有消除了地域季节对原料来源的限制、产品无鱼腥味、无重金属污染、生产周期短、供应强度高、对环境污染较小、不产生过敏反应。以微生物酦酵法生产葡萄糖胺可改良工业上以化学法生产葡萄糖胺的諸多缺失，然而以微生物法进行葡萄糖胺之产量无法大幅提升，且培养基成本无法降低。因此，开发低生产成本的培养基以进行微生物酦酵法生产葡萄糖胺，是必要且刻不容缓的事。
发明内容
本发明于第一部份提供一种用于生产葡萄糖胺的培养基，包含：25-500g/L糖蜜(molasses)、0.01-100g/L大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100g/L玉米浆(Corn Steep Liquor)、0.1-2g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1-0.5g/L硝酸铝(Al(NO3)3)，以及1-5mL/L甲醇(Methanol)。
在某些具体实施例中，所述糖蜜为预处理过的糖蜜，预处理的方法为糖蜜原液与水以0.5∶1至5∶1体积比混和，静置分层后，分离上层糖蜜溶液为预处理过的糖蜜。在某些具体实施例中，糖蜜原液与水混合的比例较佳为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1，或5∶1。
在某些实施例中，糖蜜的浓度为25-500g/L。在某些具体实施例中，糖蜜的浓度较佳为25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，或500g/L。
在某些实施例中，大豆水解物的浓度为0.01-100g/L。在某些具体实施例中，大豆水解物的浓度较佳为0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100g/L。
在某些实施例中，玉米浆的浓度为0.25-100g/L。在某些具体实施例中，玉米浆的浓度较佳为0.25、0.50、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100g/L。
在某些具体实施例中，MgSO4·7H2O的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或2g/L。
在某些具体实施例中，Al(NO3)3的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4，或0.5g/L。
在某些具体实施例中，甲醇的浓度为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或5mL/L。
本发明于第二部份提供一种生产葡萄糖胺的方法，包含：
提供一产生葡萄糖胺的微生物；以及
将所述微生物置于含有糖蜜的培养基中进行酦酵培养；且
其中所述含有糖蜜的培养基包含：25-500g/L糖蜜、0.01-100g/L大豆水解物或0.25-100g/L玉米浆、0.1-2g/L MgSO4·7H2O、0.1-0.5g/L Al(NO3)3，以及1-5mL/L甲醇。
在某些具体实施例中，所述产生葡萄糖胺的微生物包含但不限于，伞枝犁头霉菌(Absidia coerulea)、喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii)，以及印度毛霉菌(Mucorindicus)。
在某些具体实施例中，所述糖蜜为预处理过的糖蜜，预处理的方法为糖蜜原液与水以0.5∶1至5∶1的体积比混和，静置分层后，分离上层糖蜜溶液为预处理过的糖蜜。在某些具体实施例中，糖蜜原液与水混合的比例较佳为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1，或5∶1。
在某些实施例中，糖蜜的浓度为25-500g/L。在某些具体实施例中，糖蜜的浓度较佳为25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，或500g/L。
在某些实施例中，大豆水解物的浓度为0.01-100g/L。在某些具体实施例中，大豆水解物的浓度较佳为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100g/L。
在某些实施例中，玉米浆的浓度为0.25-100g/L。在某些具体实施例中，玉米浆的浓度较佳为0.25、0.50、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100g/L。
在某些具体实施例中，MgSO4·7H2O的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9，或2g/L。
在某些具体实施例中，Al(NO3)3的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4，或0.5g/L。
在某些具体实施例中，甲醇的浓度为1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或5mL/L。
在某些具体实施例中，所述酦酵培养的温度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49，或50℃。
在某些具体实施例中，所述酦酵培养环境的酸碱值为pH 4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，或9。
在某些具体实施例中，所述酦酵培养的转速为200、225、250、275、300、325、350、375，或400rpm。
在某些具体实施例中，所述酦酵培养的时间为48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230，或240小时。
于本发明中所使用之单数形式「一」、及「所述」包含复数形式，除非文中另有清楚指明者。因此，例如，当提及「一样本」时，包含复数个所述等样本及对所述领域具有通常技艺者所知之同等物。
本文所使用的「约」、「大约」或「近乎」一词实质上代表所述之数值或范围位于20％以内，较佳为于10％以内，以及更佳者为于5％以内。于本文所提供之数字化的量为近似值，意旨若术语「约」、「大约」或「近乎」没有被使用时亦可被推得。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同浓度糖蜜的培养基进行摇瓶培养后，所产出的生物量、葡萄糖胺浓度，以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
图2：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同浓度硝酸铝的培养基进行摇瓶培养后，所产出的生物量、葡萄糖胺浓度，以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
图3：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同浓度甲醇的培养基进行摇瓶培养后，所产出的生物量、葡萄糖胺浓度，以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
图4：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以不同培养基组成进行摇瓶培养后，所产出的生物量、葡萄糖胺浓度，以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
图5：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以不同转速进行酦酵槽培养后，所产出的生物量以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
图6：为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742)以含有不同氮源的培养基组成进行摇瓶培养后，所产出的生物量、葡萄糖胺浓度，以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量。
具体实施方式
实施例一糖蜜的前处理对真菌生长的影响
糖蜜原液为甘蔗制造实糖的加工过程副产物，一般为棕黑色之浓稠液体，含有丰富的营养物质，但可能因为加工过程中锅炉设备老旧的问题，因此成品当中通常富含金属离子，过高的金属离子可能会影响真菌的生长，进而影响葡萄糖胺的产量。因此，本实施例比较进行前处理的糖蜜与未进行前处理的糖蜜原液，对真菌生长的影响。
一、糖蜜的前处理
将糖蜜与水以1∶1的比例混和，不断搅拌直到完全溶解，再置于4℃下静置保存，静置24小时之后，便可发现糖蜜有分层的现象，上层为黑棕色的液体，下层为棕色之泥状物，体积比例约为9∶1，收集上层液体置于4℃下保存。
二、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方式如下：先将试验菌株以M300Sb5AlMeA固态培养基[300mL/L(相当于约163g/L)前处理过的糖蜜(treated molasses)、5mL/L(相当于约2.81g/L)大豆水解物(soy bean hydrolysate)、0.1g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1g/L硝酸铝(Al(NO3)3)、1mL/L甲醇(Methanol)，以及20g/L琼脂(Agar)]于30℃下，以三区划线培养进行一次活化7天，再将形成单一菌落的试验菌株置入内含150mL己灭菌的M300Sb5AlMe液态培养基(300mL/L treated molasses、5mL/L soy bean hydrolysate、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3，1mL/L Methanol)的250mL摇瓶，进行二次活化，以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下培养5天。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到含有150mL的M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L未处理过的糖蜜原液或前处理过的糖蜜(molasses stock or treatedmolasses)、5mL/L soy bean hydrolysate、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3，以及1mL/L Methanol，pH 7]的250mL摇瓶中，以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养。此时培养基中使用的糖蜜分为两种，一为未处理过的糖蜜原液(molasses stock)，一为前处理过的糖蜜(treated molasses)。试验结果显示，使用未处理过的糖蜜原液进行酦酵培养，真菌无法生长；而使用前处理过的糖蜜进行发酵培养，真菌生长良好。
三、糖蜜成分分析
将未处理过的糖蜜原液与前处理过的糖蜜进行营养成分分析[委托台美检验科技有限公司(台北，台湾)进行]，结果如表一所示。由表一成分分析结果可知，本发明的前处理步骤可以有效降低糖蜜中金属离子的含量，以解决过多的金属离子影响真菌生长的问题，且前处理过的糖蜜所含的适量金属离子可以帮助真菌生长，有利于葡萄糖胺的生产。本发明其他实施例所用的糖蜜皆指前处理过的糖蜜。
表一糖蜜原液与前处理过的糖蜜的成分分析表
实施例二不同的糖蜜浓度对真菌生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M200Sb5AlMe液态培养基[200mL/L molasses(相当于约110.8g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；以及
(2)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]。
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
酦酵培养5天后收集菌液，经抽气过滤后得菌块，将菌块取样以60℃烘干，称得干菌重(biomass)后，取1g干菌并加入10mL 6N HCl于85℃震荡水槽中水浴反应6小时，得到含葡萄糖胺之液体。待所述液体冷却后加入10mL超纯水，以10N的NaOH将反应液中和至pH 7，再以抽气过滤收集液体，取0.2mL至试管中，加入0.2mL二硝基苯乙腈(3，5-Dinitrobenzonitrile acetonitrile)溶液作为内部标准品，再加入0.6mL 40mol/m31-萘基异硫氰酸酯吡啶(1-naphthyl isothiocyanate pyridine)溶液，于50℃之震荡水槽中水浴反应1小时，反应后取5μL进行葡萄糖胺鉴定分析。
以高效液相层析技术(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行葡萄糖胺鉴定分析，HPLC分析条件如下：
HPLC pump：Shimadzu LC-20A
侦测器：Shimadzu Model SPD-10A UV-VIS index detector
管柱：Merck STAR Rp-18endcapped(5μm)，250x 4mmI.D.
移动相：Water/Acetonitrile(85/15)
流速：1.1mL/min
UV侦测波长：230nm。
再依葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比，代入以葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比之葡萄糖胺盐酸盐检量线，以内插法求得葡萄糖胺的克數，换算出葡萄糖胺浓度(Glucosamine Concentration，g葡萄糖胺/L)以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量(Glucosamine Content，g葡萄糖胺/g干菌重)。结果如图1所示，在本实施例中，当糖蜜的浓度增加时，真菌的生物量会大幅的成长，且每克干菌重所含的葡萄糖胺含量也增加，因此每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度也会增加。
实施例三不同的硝酸铝浓度对真菌生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M300Sb5Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(2)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(3)M300Sb5Al2Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.2g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(4)M300Sb5Al4Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.4g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(5)M300Sb5Al5Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；以及
(6)M300Sb5Al10Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、1g/LAl(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度结果如图2所示。
在本实施例中，微量的硝酸铝可以有效地增加每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度，但是随着硝酸铝浓度的增加，真菌的生物量受到了负面的影响而减少，进而影响到每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度。因此，考量到葡萄糖胺的产量，培养基中的硝酸铝浓度以0.1-0.5g/L为宜，而以0.1g/L为最佳，此时每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度最高。
实施例四不同的甲醇浓度对真菌生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M300Sb5Al液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、0mL/L Methanol，pH 7]；
(2)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(3)M300Sb5AlMe2液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、2mL/L Methanol，pH 7]；
(4)M300Sb5AlMe5液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、5mL/L Methanol，pH 7]；
(5)M300Sb5AlMe10液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、10mL/L Methanol，pH 7]；
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度结果如图3所示。
在本实施例中，微量的甲醇可以有效地增加每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度，但是随着甲醇浓度的增加，真菌的生物量受到了负面的影响而减少，进而影响到每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度。因此，考量到葡萄糖胺的产量，培养基中可添加的甲醇浓度以1-5mL/L为宜，甲醇浓度高达10mL/L(1％)时，会抑制真菌的生长，葡萄糖胺浓度显著下降。
实施例五不同的培养基组合对真菌生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowiiBCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M300Sb5液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O，pH 7]；
(2)M300Sb5Al液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3，pH 7]；
(3)M300Sb5Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、1mL/LMethanol，pH 7]；
(4)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度结果如图4所示。
在本实施例的比较中，以M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/LMgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol]培养的真菌的生物量最多，且其每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度最高。
实施例六不同的培养基对真菌在摇瓶中生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株分别为伞枝犁头霉菌(Absidia coerulea BCRC32931，新竹，台湾)、喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)，以及印度毛霉菌(Mucor indicus BCRC32158，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(2)GP液态培养基[33.9g/L葡萄糖(Glucose)、40.6g/L真菌蛋白胨(Mycological-peptone)、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.1g/L氯化钙(CaCl2)]；
(3)WF液态培养基[33.9g/L白细砂糖(White fine-granulated sugar)、40.6g/LMycological-peptone、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L KH2PO4、0.1g/L CaCl2]；
(4)YPG液态培养基[20g/L Glucose、10g/L Mycological-peptone、1g/L酵母萃取物(Yeast extract)、1g/L硫酸铵[(NH4)2SO4]、1g/L氯化钠(NaCl)、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L CaCl2)；
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量、每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度，以及对于酦酵培养之碳源换算求得其产率(Yield)，并与工作天數换算求得生产率(Productivity)，结果如表二所示。
如表二所示，本实施例所使用的三种培养基中，以M300Sb5AlMe培养基生产的葡萄糖胺生产成本最低，且对试验的三个菌种皆适用，可以在最低的成本下，生产出相同产量的葡萄糖胺。另外，本实施例所使用的三种菌株中，以喜多氏曲霉(Aspergillussydowii.BCRC 31742)在M300Sb5AlMe培养基中培养，可生产成本最低的葡萄糖胺(358.6NTD/kg-葡萄糖胺)。
表二各菌株以不同的培养基经摇瓶培养所产出之葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺含量、产率和生产率的比较
实施例七不同的转速对真菌在酦酵槽中生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株300mL菌液进行搅拌式酦酵槽试验，将菌液接种至含有3L M300Sb5AlMe液体培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]的酦酵槽中，于30℃下，转速分别为200、300、400rpm进行酦酵培养，以外加管线通入空气，进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量以及每克干菌重所含的葡萄糖胺含量结果如图5所示。
在本实施例中得知，在转速为300rpm时，真菌的生物量最高，且每克干菌重所含的葡萄糖胺含量也最高，葡萄糖胺的生产效率最好。反观在转速为200rpm时，由于转速过慢通气不佳使得真菌生产趋于缓慢，而当转速为400rpm时，则因转速太快，不停地将菌块打散，让真菌无法快速生长。
实施例八不同的培养基对真菌在酦酵槽中生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株300mL菌液进行搅拌式酦酵槽试验，将菌液接种到分别各含有3L的以下培养基之一的酦酵槽中：
(1)M300Sb5AlMe液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/L soy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L Al(NO3)3、1mL/L Methanol，pH 7]；
(2)GP液态培养基(33.9g/L Glucose、40.6g/L Mycological-peptone、0.5g/LMgSO4·7H2O、0.5g/L KH2PO4、0.1g/L CaCl2)；
(3)WF液态培养基(20g/L Glucose、10g/L Mycologicai-peptone、1g/L Yeastextract、1g/L(NH4)2SO4、1g/L NaCl、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L CaCl2)；
于30℃下、转速为300rpm进行酦酵培养，以外加管线通入空气，进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量、每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度，以及对于酦酵培养之碳源换算求得其产率，并与工作天數换算求得生产率，结果如表三所示。
如表三所示，本实施例所使用的三种培养基中，以M300Sb5AlMe培养基生产的葡萄糖胺生产成本最低，可以花费不到其他二种培养基的生产成本的1％而生产相同产量的葡萄糖胺；因此，本发明所提供的含有糖蜜的培养基适合应用于大量制造葡萄糖胺，以降低生产成本。
表三以不同的培养基经酦酵槽培养所产出之葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺含量、产率和生产率的比较
实施例九不同的氮源对真菌生长的影响
一、真菌酦酵试验
在本实施例中，试验菌株亦为喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii BCRC 31742，新竹，台湾)。首先对试验菌株进行二次活化培养，方法同实施例一所述。
接着，取二次活化后的试验菌株15mL菌液，接种到分别各含有150mL的以下培养基之一的摇瓶中：
(1)M300Sb5液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O，pH 7]；
(2)M300Sb5Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、5mL/Lsoy bean hydrolysate(相当于约2.81g/L大豆水解物)、0.1g/L MgSO4·7H2O、1mL/LMethanol，pH 7]；
(3)M300C20Me液态培养基[300mL/L molasses(相当于约163g/L molasses)、20mL/L玉米浆(相当于约7.6g/L)、1mL/L Methanol，pH 7]；
并以恒温培养箱在30℃、200rpm转速下进行酦酵培养5天，接着进行葡萄糖胺鉴定分析。
在本实施例中，使用二种不同的氮源，一种为大豆水解物，另一种为玉米浆，二者的成份分析如表四所示。
表四大豆水解物以及玉米浆的成份分析表
二、葡萄糖胺鉴定分析
菌液的处理以及HPLC分析方法、条件皆同实施例二所述，测得的生物量、每克干菌重所含的葡萄糖胺含量，以及每公升培养基所生产的葡萄糖胺浓度结果如图6所示。
在本实施例中，将氮源替换为玉米浆时，虽然生物量较低，但是每克干菌重所含的葡萄糖胺含量较M300Sb5液态培养基培养的真菌的含量高；而且将氮源替换为玉米浆时，可降低生产成本，甚至较以大豆水解物作为氮源的培养基的生产成本还要低，显示玉米浆也是理想的氮源。
表五喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii)以不同的培养基经摇瓶培养所产出之葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺含量、产率和生产率的比较
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (9)

1.一种用于生产葡萄糖胺的培养基，其特征在于包括：
25-500g/L糖蜜(molasses)；
0.01-100g/L大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100g/L玉米浆(Corn SteepLiquor)；
0.1-2g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)；
0.1-0.5g/L硝酸铝(Al(NO3)3)；以及
1-5mL/L甲醇(Methanol)。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述糖蜜为预处理过的糖蜜，预处理的方法为糖蜜原液与水以0.5:1至5:1的体积比混和，静置分层后，分离上层糖蜜溶液为预处理过的糖蜜。
3.一种生产葡萄糖胺的方法，其特征在于包括：
提供一产生葡萄糖胺的微生物；以及
将所述微生物置于含有糖蜜的培养基中进行酦酵培养；且
其中所述含有糖蜜的培养基包含：25-500g/L糖蜜(molasses)、0.01-100g/L大豆水解物(soy bean hydrolysate)或0.25-100g/L玉米浆(Corn Steep Liquor)、0.1-2g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1-0.5g/L硝酸铝(Al(NO3)3)，以及1-5mL/L甲醇(Methanol)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述产生葡萄糖胺的微生物选自下列所组成之群组：伞枝犁头霉菌(Absidia coerulea)、喜多氏曲霉(Aspergillus sydowii)，以及印度毛霉菌(Mucor indicus)。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述糖蜜为预处理过的糖蜜，预处理的方法为糖蜜原液与水以0.5:1至5:1的体积比混和，静置分层后，分离上层糖蜜溶液为预处理过的糖蜜。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酦酵培养的温度为25–50℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酦酵培养环境的酸碱值为pH4-9。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酦酵培养的转速为200–400rpm。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酦酵培养的时间为48–240小时。
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