CN110438012A - 一种产花青素的萨氏曲霉h-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产花青素的萨氏曲霉H‑1及其应用，所述的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H‑1进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2019年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019592。该菌株能发酵分离得到花青素，该色素具有抑制肝癌细胞增殖的能力，且对正常肝细胞毒性较低，同时具备抗氧化能力，色素的稳定性好，易于制备，具有推广使用价值。

Description

一种产花青素的萨氏曲霉H-1及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种花青素的萨氏曲霉(Aspergillussydowii)H-1及其应用。

背景技术

天然色素可来源动植物、微生物，相比较于合成色素的缺点，天然色素具有很明显的优势(Martins et al.,2016；Rodriguez-Amaya,2016)：(1)环保、可生物降解；(2)天然色素易于被人们接受，安全性高且健康；(3)食品着色自然，可作为食品添加剂可补给人体所需的营养物质；(4)具有多种良好的生物特性，可用于食品保健领域。与动植物色素相比，真菌天然色素能最大限度地减少批次间产量的差异以及克服动植物因季节、产地造成色素产量下降的问题，而且比植物来源的天然色素更稳定，随着目前全世界对天然色素的趋势正在转向使用环保型和可生物降解的商品色素，对天然色素的需求日益增加(徐春明等,2015；Aguilar et al.,2017)。真菌具有产生多种次级代谢物的巨大潜力，原因在于其代谢产物结构的复杂性、多样性使其成为潜在的发现功能化合物的新来源(Asai et al.,2015)。

色素作为真菌的次级代谢产物，色泽多样，因其具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血脂等功能，同时具有高营养、无毒安全的特性，受到了广泛关注，目前的真菌色素主要分为类胡萝卜素和聚酮化合物两大类，仅有类胡萝卜素和红曲色素批准在工业上使用(Mapari et al.,2010；Gmoser et al.,2017)。红曲色素中几乎有一半含量是黄色素，具有降血脂、抗肿瘤的功能，因其不溶于水，限制了它的应用范围，而红曲红色素为水溶性色素，在食品行业作为添加剂广泛使用，工业上通过化学修饰将不溶于水的黄色素与Na2S反应生成水溶性的黄色素后投入使用(苏金为等,2002；Feng et al.,2012；Chen and Wu,2016)。最近，随着天然色素用于工业应用需求日益增加，消费者专注于高营养的、无毒安全的色素产品，因此亟待寻找能够产天然色素的新菌株(Torres et al.,2016)。

发明内容

本发明提供了一种从腐殖土中分离的真菌，该真菌能在以葡萄糖为碳源的发酵培养中产生水溶性紫色素，并提供了紫色素的有效提取方法，证明为花青素及该紫色素在抗氧化和抗癌症中的作用。

为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种产花青素的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1，该菌株从腐殖土中分离得到，将甘油保种的菌种划线接种于查氏固体培养基上，28℃培养5d，其菌落为棕色致密丝绒状，菌落呈现不同程度褐色，外层为白色，有些许绿色孢子。

将所述的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2019年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019592。

所述的萨氏曲霉H-1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的萨氏曲霉H-1能够在适宜条件下发酵产紫色色素花青素，发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物0.5g/L，KH2PO45g/L，NaCl 1g/L。

发酵条件为：接种量为5％(v/v)，培养温度28℃，摇床转速180r/min，培养时间7d，初始pH6.0。

在本发明的另一方面，还提供了发酵产物花青素的分离提纯方法，包括以下步骤：将色素发酵液多层纱布过滤收集后，采用0.2μm水系滤膜抽滤，55℃旋蒸至原来体积的1/10，终浓度为70％乙醇4℃沉淀过夜，收集上清，冷冻干燥成粉末。

在本发明的另一方面，所述的分离提纯得到的花青素在抗氧化和抗肿瘤方面的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

1)具有抑制肝癌细胞增殖的能力，且对正常肝细胞毒性较低。色素对肝癌细胞HepG2的IC₅₀为1.282mg/mL，对人正常肝细胞HL-7702的IC₅₀分别为5.367mg/mL；

2)具有良好的条件致病菌抗菌特性，对金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌对紫色素最为敏感，MIC均为195.312μg/mL；

3)良好的抗氧化的特性，色素清除羟基自由基能力随其浓度增大而增强，对羟自由基抑制率强于超氧阴离子；

4)色素的稳定性好，该色素对光照不敏感、耐高温，在中性及碱性条件下稳定性较好。

附图说明

图1是菌株H-1在查氏培养基上的菌落；

图2是H-1发酵产的紫色素；

图3是真菌H-1β-tubulin序列的系统进化树；

图4是色素水溶液400～800nm扫描光谱图；

图5是不同光照因素处理下的色素残存率；

图6是不同温度因素处理下的色素残存率；

图7是不同pH因素处理下的色素残存率；

图8是不同金属离子因素处理下的色素残存率；

图9是不同浓度色素对细胞的抑制率；

图10是不同浓度色素处理下细胞HepG2形态图；A,B,C,D分别代表浓度为0mg/mL,0.4mg/mL,2mg/mL,10mg/mL。

图11是三种色素清除羟基自由基能力的比较；

图12是三种色素超氧阴离子自由基能力的比较。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株的培养及鉴定

1.1菌株的培养

1)筛选霉菌：称取土样各5g，分别溶于含有30mL无菌生理盐水的锥形瓶中，28℃、180r/min摇瓶30min。收集上清，用无菌水做10倍梯度稀释，稀释度依次为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，取稀释液各100μL涂布于高盐查氏固体培养基上^[115]，每个稀释梯度3个重复，置于28℃培养箱倒置培养3d。

2)筛选产花青素的霉菌：将分离得到的霉菌在查氏固体培养基上采用划线分离纯化，直至单菌落生长，记录名称。将分离到的霉菌接种CMC-Na固体培养基上培养，置于28℃培养箱倒置培养3d后，在每个平板上加入0.1％刚果红溶液5ml，是溶液覆盖整个平板表面。20min后弃平板内刚果红溶液，多次用生理盐水冲洗，洗去多余红色，然后观察并测量菌落及菌落周围透明圈直径(cm)。计算HC值(透明圈直径/菌落直径)，每株菌3个重复，选取HC值较大的霉菌用于发酵产花青素的鉴定。

1.2菌株的鉴定

1)菌株的培养

将甘油保种的菌种划线接种于查氏固体培养基上，28℃培养5d，进行菌落形态鉴定。将发酵培养：将孢子数为1×10⁶个/mL，接种于查氏液体中培养60h后，按5％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，发酵培养基组成为：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物0.5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，NaCl 1g/L，初始pH为6.0。

2)菌株分子鉴定

通过表型分析该色素真菌H-1在查氏固体平板上生长的5d，其菌落为棕色致密丝绒状，菌落呈现不同程度褐色，外层为白色，有些许绿色孢子；生长初期菌落外层为白色，中间为灰绿色，在生长过程中中间的灰绿色逐渐被褐色取代，菌落表面无渗出液，无辐射状沟纹，并且无可溶性色素扩散到培养基质中。孢子呈圆形，分生孢子头呈球形，放射形等，从其形态特征判断为曲霉属(图1)。该真菌发酵7d后发酵液中有紫色素产生，随着发酵时间的延长色素颜色加深(图2)。

β微管蛋白基因鉴定，β-tubulin序列通用引物βtub1(5’-AATTGGTGCCGCTTTCTGG-3’)和βtub2(5’-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3’，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)(Balajee et al.,2005)对产色素真菌基因组进行PCR扩增，真菌H-1的β-tubulin序列片段的大小在350bp左右，将扩增产物连接到载体PMD19质粒(购买自TaKaRa Biotechnology(Dalian)上，转入感受态细胞，挑选具有氨苄抗性的单克隆，提取质粒，双酶切验证成功后，送出测序(成都擎科梓熙生物技术有限公司)。采用MEGA 7.0构建ML系统进化树(Juuti etal.,2005)。

该色素真菌经β-微管蛋白基因序列鉴定如SEQ ID NO.1所示，317bp,GenBank登陆号序列号为MH426599。由系统发育树可看出(图3)，菌株H-1和萨氏曲霉(Aspergillussydowii)FMR14440为一支，支持率为98％，其同源性达到了100％，确定该菌为萨氏曲霉。

将所述的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2019年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019592。

实施例2色素溶解性分析

将色素发酵液8层纱布过滤收集后，采用0.2μm水系滤膜抽滤，55℃旋蒸(上海申胜R201BC旋转蒸发器)至原来体积的1/10，终浓度为70％乙醇4℃沉淀过夜，收集上清，冷冻干燥成粉末。分别取定量的紫色素，定量的一级水，10％～100％乙醇，10％～100％甲醇，正丁醇、三氯乙酸、甘油、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等溶剂中进行溶解(王丽娟等,2014)，观察其在不同溶剂的溶解程度。

将色素样品溶于不同溶剂，结果发现该色素极易溶于水，其次溶于80％以下的乙醇、甲醇，不溶于正丁醇、三氯乙酸、甘油、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等有机溶剂。水溶性色素可用于饮料、食品、药品等多种工业领域，在食品添加剂方面有巨大的应用潜力。

实施例3色素特征性波长检测及色素稳定性的测定

制备色素水溶液，在可见光区400～800nm处扫描测得其特征性吸收峰值(ThermoMultiskan GO全波长酶标仪)。配制0.5％的粗色素水溶液，将其分别置于LED白光、紫外光、黑暗条件下处理4～24h。上述浓度色素溶液(以最佳光照条件为前提)，分别在温度为4℃、25℃、40℃、55℃、70℃、85℃、100℃条件下处理4h。pH处理条件为pH 1～14，处理24h。用Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Li⁺、Pb⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺配制浓度为0.01mol/L金属盐溶液，将其与等体积色素水溶液混匀，4℃避光处理24h，12000r/min离心2min，取上清测吸光度值，计算色素残存率。A0为未处理之前色素吸光度值，A为色素经不同条件处理之后的吸光度值。

色素残存率(％)＝(A/A0)×100％。

色素水溶液在可见光区400～800nm处扫描测得其在520nm处有最大吸收峰值(图4)。

色素在不同理化因素处理条件下，在不同光条件下处理24h，色素残存率为98.5％，黑暗条件下为95.4％，LED白光下色素残存率为84.8％，光稳定性表现为：紫外光>黑暗>-白光(图5)。随着温度升高，色素出现不同程度的损失，4℃色素残存率为99.5％，在100℃处理色素4h，色素残存率为86.8％；pH>6处理24h，色素残存率在90％以上，而pH<5色素损失严重，最高含量仅为22.7％，说明该色素在碱性环境中稳定，酸性条件下不稳定(图6；图7)。当加入不同金属离子处理后，Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Li⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Co²⁺能与色素反应会有沉淀产生，色素损失严重。相比于其他金属离子如K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺和水溶液，色素在NaCl(Na+)溶液中保存效果最好，基本无损失，达到99.9％(图8)。因此，色素可在黑暗、低温(4℃)、中性或偏碱性的NaCl溶液中保存，或者干燥后黑暗低温保存。

实施例4色素对细胞增殖影响的测定

采用CCK-8法进行测定(试剂盒购买自赛默飞)。选用人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞HL-7702(分别购买自中国科学院细胞库,华西研究院)进行细胞实验，采用紫色素浓度依次为：0.0032mg/mL、0.016mg/mL、0.08mg/mL、0.4mg/mL、2mg/mL、10mg/mL。待细胞长至对数生长期，用DMEM稀释后使细胞密度为1×10⁴个/mL。然后按每孔200μL细胞悬液接种于96孔板中，约18h后，加入以上实验色素浓度，每个浓度六个复孔，处理72h，同时设置空白对照组(不加细胞悬浮液,加等体积DMEM代替)和阴性对照组(不加色素,加等体积DMEM代替)。药物作用时间结束后，用移液枪吸取孔板中的液体，每孔加入含10％CCK-8的DMEM培养基10μL(每孔中均不含气泡)，放置于37℃培养箱中孵育2h，酶标仪450nm检测吸光度值，并记录不同浓度下的细胞形态变化。

细胞抑制率(％)＝(对照组–实验组)/(对照组–空白组)×100％。

色素对细胞增殖抑制率测定结果表明(图9)，在浓度为0.4～10mg/mL色素样品对细胞有明显的增殖抑制作用。随着色素浓度增加，抑制人肝癌细胞株HepG2与人正常肝细胞HL-7702增殖越明显，具有浓度-剂量依赖特性。采用T检验进行统计学分析，当色素浓度为0.4mg/mL和0.8mg/mL时，与正常肝细胞HL-7702组比较，低浓度色素对肝癌细胞HepG2增殖作用更明显，抑制差异有统计学意义(p<0.05)。色素对肝癌细胞HepG2的IC50为1.282mg/mL，对人正常肝细胞HL-7702的IC50分别为5.367mg/mL。但当浓度升高到10mg/mL，对正常肝细胞与肝癌细胞均具有较强的细胞毒性，其细胞增殖抑制率达到了80％以上。该特性与天然色素花色苷类类似。

在光镜下(20×)可以看到加入不同浓度色素处理72h后(图10)，萨氏紫色素对细胞的毒性表现为：随着色素浓度增大，细胞HepG2增殖缓慢，细胞内颗粒增多，纤维状细胞变圆回缩；当色素浓度为2mg/mL、10mg/mL时，细胞已不能维持原来形态，出现大面积脱落死亡。该色素对肝癌细胞HepG2的增殖生长具有一定的抑制作用。

实施例5色素抗氧化能力测定

选取已报道具有抗氧化能力的水溶性天然色素紫苏红色素、红曲红色素(徐亚民等,2007；Srianta et al.,2017)(购买自青岛鹏远康华天然产物有限公司)。采用试剂盒测定色素对羟自由基及超氧阴离子自由基清除能力(购买自南京建成生物工程研究所)，所用色素浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。

清除率(％)＝[A0-(A1-A2)/A0]×100％。

上式中：A0为空白对照组的吸光度，以一级水替代色素组溶液；A1为实验色素组吸光度；A2为色素溶液本身的吸光度，以一级水替代反应试剂。

羟自由基·OH与超氧阴离子O2-·是活性氧中最常见的自由基，而·OH是毒性最大、最活泼的自由基，能快速地与活细胞中的任何分子发生反应。采用市售水溶性食品天然色素紫苏红色素、红曲红色素与本实验紫色素比较清除自由基的能力。色素清除羟基自由基能力随其浓度增大而增强，对羟自由基抑制率强于超氧阴离子；当红曲色素浓度低于100μg/mL时，无羟自由基、超氧阴离子清除能力。羟自由基清除能力大小为：紫色素>紫苏红色素>红曲红色素(图11)；超氧阴离子清除能力按大小依次为：紫色素>紫苏红色素>红曲红色素(图12)。

实施例6最低抑菌浓度(MIC)测定

选用条件致病菌株：金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、大肠杆菌(来自四川省食品药品监督局)。将色素用LB液体培养基配制成初始浓度为200mg/mL，用LB培养基按2倍梯度稀释成浓度分为100～0.1953mg/mL的色素溶液，阴性对照组加入100μL的无菌LB培养基，空白对照不加菌液，加100μL的LB培养基。将各株菌菌液浓度配浓度为5×10³cfu/mL，每株菌铺12列6个复孔于96孔板上，各孔加入菌液100μL，按浓度梯度依次加入配置好的色素溶液100μL，实验组和阴性对照组各6个复孔，37℃培养16h(Jones,1986)。

选用常见的条件致病菌进行色素抑菌活性测定。研究结果表明：金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌对紫色素最为敏感，MIC均为195.312μg/mL，对大肠杆菌无抑菌活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种产花青素的萨氏曲霉 H-1 及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 317

<212> DNA

<213> 萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)

<400> 1

tgcgtcgaaa atttcatcca ttgcagatgg tctttgtttt cgtgattttt actaacgact 60

ctataggcag accatctccg gtgagcacgg cctcgatggc tccggtgtgt gagtacagcc 120

cgtccaggac tcgatcaaaa cacgacagaa cacagcccct gatataatac agttacaatg 180

gtacctccga cctccagctc gagcgtatga acgtctactt caacgaggcc agcggcaaca 240

agtacgttcc ccgtgccgtc ctcgtcgatc tcgagcctgg tactatggac gctgtccgtg 300

ccggtccctt cggtcag 317

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattggtgcc gctttctgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agttgtcggg acggaatag 19

Claims (6)

1.一种产花青素的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1，其特征在于，所述的萨氏曲霉H-1进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2019年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019592。

2.根据权利要求1所述的一种产花青素的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1，其特征在于，所述的萨氏曲霉H-1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1所述的萨氏曲霉(Aspergillus sydowii)H-1产花青素的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物0.5g/L，KH2PO4 5 g/L，NaCl 1g/L。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，发酵条件为：接种量按体积分数为5％，培养温度28℃，摇床转速180r/min，培养时间7d，初始pH为6.0。

5.权利要求3所述的花青素的分离提出方法，其特征在于，包括以下步骤：将色素发酵液多层纱布过滤收集后，采用0.2μm水系滤膜抽滤，55℃旋蒸至原来体积的1/10，终浓度为70％乙醇4℃沉淀过夜，收集上清，冷冻干燥成粉末。

6.权利要求5分离提纯得到的花青素在抗氧化和抗肿瘤方面的应用。