CN102994398A - 高产脲酶的聚多曲霉及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高产脲酶的聚多曲霉（Aspergillus sydowii）及其用途，属于微生物领域。本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株高产脲酶的聚多曲霉菌株Aspergillus sydowiiJNC-U5。本发明的聚多曲霉菌株已于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6577。本发明提供聚多曲霉产脲酶可以达到49.7U，可用于高纯度脲酶的生产。

Description

高产脲酶的聚多曲霉及其用途

技术领域

本发明涉及高产脲酶的聚多曲霉及其用途，属于微生物领域。 

背景技术

脲酶(Urease，urea amidohydrolase，EC 3．5．)，又称尿素氨基水解酶，存在于大多数细菌、曲霉和高等植物里。它是一种酰胺酶、能使有机物质分子中酶键的水解。其作用极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸^[1]。 

在国外，乳酸杆菌已经被用于生产脲酶酶制剂，能有效地减少葡萄酒中尿素含量^[2-6]。在国内，脲酶已经被用于降低黄酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，目前所用的酶制剂均从国外进口^[7]。而在白酒行业中，这方面的研究几乎是空白。因此酒用脲酶的研究对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等方面均有深远的意义。 

目前，江南大学分离获得的肠出血性大肠埃希氏菌，产脲酶活性为0.58U^[8]。浙江大学分离的高产酸性脲酶菌株肺炎克雷伯氏菌，产脲酶活性达到17.17U^[9]。这些产脲酶菌株的属于细菌类，是从动物粪便（鸟粪、鼠粪、牛羊粪便）、农田土壤、污泥等中分离获得^[8]。 

现有研究结果表明，海洋来源的聚多曲霉（Aspergillus sydowii）PFW-13能够产生抗肿瘤活性次级代谢产物^[10]；胡利勇报道了A.sydowii LC-562有较强的产纤维素酶活性^[1]。至今未报道聚多曲霉有高产脲酶的能力。 

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株高产脲酶的聚多曲霉菌株Aspergillus sydowii JNC-U5，该菌株已于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6577，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

进一步的，所述聚多曲霉的18S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在生产脲酶中的用途。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在酿酒中的用途。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在黄酒生产中的用途。 

本发明的菌株是从四川剑南春（集团）有限责任公司的酒曲中分离获得。该菌株为聚多曲霉，特征如下： 

（1）菌落特征 

菌落在ME培养基上辐射生长，有辐射形沟纹，28℃培养7天直径约22-30mm；颜色呈灰绿色，周围有白色的晕圈；菌落反面呈淡褐或暗褐色。 

（2）分生孢子及分生孢子梗特征 

分生孢子头球形，小分生孢子头，呈疏松柱形或散乱；分生孢子梗直接生于基质或生于气生菌丝，分生孢子为球形或近球形，孢子表面有小刺。 

（3）培养条件 

培养基：5~7波美麦芽汁；温度：30~35℃；液态发酵：150~200rpm，6~8天。 

本发明的有益效果在于：本发明首次发现一株产脲酶的聚多曲霉。该菌株产脲酶活性可达到49.7U，为脲酶的生产提供了宝贵的菌株资源。本发明的聚多曲霉是从酒曲中分离出来的，所产的脲酶可用于提高酒曲中脲酶的活性，有效降低曲药中尿素的含量，提高白酒的安全质量。同时，本发明聚多曲霉也为生产酒用脲酶制剂提供了新的选择，具有极大的应用和推广价值。 

本发明提供的聚多曲霉（Aspergillus sydowii）JNC-U5，于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6577，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

附图说明

图1本发明菌株的菌落形态 

图2本发明菌株的分生孢子及分生孢子梗的形态 

图3本发明菌株分生孢子的超微结构 

图4本发明菌株的分生孢子梗的超微结构 

具体实施方式

本发明的聚多曲霉（Aspergillus sydowii）JNC-U5于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6577，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

进一步的，所述聚多曲霉的18S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在生产脲酶中的用途。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在酿酒中的用途。 

本发明还提供了所述的聚多曲霉在黄酒生产中的用途。 

本发明的菌株是从四川剑南春（集团）有限责任公司的酒曲中分离获得。 

本发明的聚多曲霉产脲酶能力可以达到49.7U，是一株高产脲酶的新菌株，可用于脲酶的生产。本发明的聚多曲霉是从酒曲中分离出来的，所产的脲酶可用于提高酒曲中脲酶的活性，有效降低曲药中尿素的含量，提高白酒的安全质量。因此，本发明的聚多曲霉菌株可用于酿酒生产，特别是黄酒生产。同时，本发明的聚多曲霉也为生产酒用脲酶制剂提供了宝贵 的菌种资源，具有极大的应用和推广价值。 

实施例1菌株筛选 

1、菌株的初筛 

材料：四川剑南春（集团）有限责任公司使用的酒曲 

培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖18g，0.4%酚酞溶液3mL，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂20.0，蒸馏水1000mL。除酚酞外，溶解上述各种成分，并调pH为6.8~6.9，然后加入酚酞指示剂。分装三角瓶，121℃灭菌15min，待培养基冷至50-55℃时，加入预先过滤灭菌的20%尿素水溶液，使其在培养基中在最终浓度为2%，摇匀后备用。 

实验方法：无菌条件下取10克酒曲于装有90mL无菌水并放有玻珠的25mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10^-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入30℃培养箱培养2~5天，按菌落周围是否变红进行初筛，结果见表1。因为脲酶分解尿素产生氨使培养基呈碱性；酚酞遇碱变红，颜色的深浅初步表示了菌株产脲酶能力的大小。挑选菌落周围变红的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察发现主要为霉菌和细菌。 

表1初筛得到菌株的变红时间及颜色深浅 

菌株编号	变红时间（天）	红色深浅	菌株编号	变红时间（天）	红色深浅
						JNC-U1	2	较深	JNC-U12	4	浅
JNC-U2	2	较深	JNC-U13	4	浅
						JNC-U3	2	浅	JNC-U14	4	较深
JNC-U4	2	浅	JNC-U15	4	浅
						JNC-U5	2	深	JNC-U16	4	浅
JNC-U6	2	较深	JNC-U17	5	较深
						JNC-U7	3	较深	JNC-U18	5	较深
JNC-U8	3	较深	JNC-U19	5	浅
						JNC-U9	3	浅	JNC-U20	5	浅
JNC-U10	3	浅	JNC-U21	5	浅
						JNC-U11	3	较深

2、菌株的复筛 

将初筛的菌株经过多次转接后发现，绝大多数菌株产脲酶的能力逐渐丧失。经过多代筛选，最终选出一株产脲酶能力稳定的菌株JNC-U5，根据形态初步鉴定为霉菌。该菌株将用于后续的鉴定。将该菌株接种到5~7波美的麦芽汁培养基中，在30~35℃条件下，150~200rpm，发酵培养6~8天。然后将过滤，并用无菌水洗掉多次洗涤，最后在40℃条件下烘干，打磨成粉即得脲酶酶制剂，4℃冷藏保存备用。 

菌丝脲酶活性测定参照大豆制品脲酶活性测定方法（GB/T 8622-1988）。酶活性定义：30℃，pH7.0条件下，每分钟每克酶制剂分解尿素产生氨的毫克数表示酶得活性U。测定结果 表明由菌株JNC-U5制备的酶制剂脲酶活性为49.7U。 

实施例2JNC-U5菌株的鉴定 

1、18S rDNA序列分析 

（1）DNA提取 

收集菌体，溶于5mL提取缓冲液（100mMTris·Cl，100mM EDTA-Na₂，200mM NaCl，2%CTAB，pH8.0）中，37℃振荡45min。加入0.75mL 20%SDS，65℃水浴1h。12,000rpm，离心10min，收集上清。上清用等体积的酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1）抽提2次，加入终浓度0.3M的NaAC（pH5.2）及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1h。4℃，12,000rpm，离心20min，收集沉淀，用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50μL TE（10mmTris-HCl，1mm Na₂EDTA）中，即得总DNA。 

（2）扩增18S rDNA 

以总DNA为模板，真菌通用引物18SF（SEQ ID No.2：CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA）和18SR（SEQ ID No.3：CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT）分别为正向引物和反向引物扩增18S rDNA。扩增反应体系为50μL：10×Buffer 5μL，dNTP 1μL，Taq酶0.5μL（2U），正反向引物各1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 40.5μL。扩增反应条件：94℃ 4min预变性；94℃ 0.5min，55℃ 1min，72℃ 0.5min，30个循环；72℃延伸7min。 

（3）18S rDNA序列分析 

将扩增的18S rDNA片段送上海生工测序，通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序进行比较获得同源性分析结果（见表2）。 

扩增片段测序结果SEQ ID No.1所示，如下： 

GGCATCGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTCCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCGCGGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGCGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGTCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGGCCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCGGACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTCGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACGCCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAA GGCGTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCACCCACAGCCAGTGAAGGCCATGGGATTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTCCCGAAGTCGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAGATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGGATCAACCAGGTTGGA 

表2扩增片段的同源性比对分析 

相似菌株	同源性
		Aspergillus sp（曲霉）	99%
Aspergillus sydowii（聚多曲霉）	95%

2、Biolog微生物鉴定仪鉴定

经18S rDNA序列分析，发现复筛得到的菌株与曲霉属的同源性为99%，初步鉴定该菌株为曲霉属的真菌；与聚多曲霉的同源性为95%，暂时无法确定其种。为了进一步的确定该曲霉的种，本发明人决定采用美国Biolog全自动微生物鉴定仪（BIOLOG Microstation^TM）鉴定（见表3）。 

将待鉴定菌株接种至Biolog推荐的培养基2%ME培养基上，26℃培养，培养时间为7天。 

校正浊度仪，利用FF接种液调整100%，然后用FF的标准比浊管显示浊度，应为75%T左右。进行读数校正时最好不要随意转动接种液的玻璃管，因管壁的透光度不均匀，转动会发生变化，空白校正时在什么位置，接种时尽量也放在同样的位置。制备孢子悬液时，首先将灭菌的棉棒在接种液浸一下，然后在平板表面滚动粘取孢子，上下反复涂抹接种液上部干燥的管壁上，使孢子分散，然后利用接种液冲下做成均一孢子悬液；将孢子悬液浓度控制在标准浓度为75%T左右。 

将菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中。按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中。盖好微孔板的盖子，弹出枪头。将微孔板直接放入26℃培养箱中培养1-4天。每天读板，选取相应的时间。经鉴定（表3），筛选得到产脲酶菌株为聚多曲霉。因此，结合分子和Biolog微生物鉴定仪鉴定结果，确定菌株JNC-U5为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。 

表3Biolog微生物鉴定仪鉴定结果 

英文名	参考中文名
		Aspergillus sydowii	聚多曲霉

实施例3本发明曲霉株的形态特征及碳源利用特性鉴定 

1、菌落形态及菌体显微观察 

将4℃保存的菌株用ME斜面培养基活化3天，然后用接种针挑取斜面的菌落接种到ME平板培养基上，于28℃培养7天，观察菌落形态，于显微镜下观察分生孢子及分省孢子梗的形态（见图2）。用扫描电镜Quanta^TM450FEG观察菌体的超微结构（见图3和图4）。 

该曲霉菌落在ME培养基上呈辐射生长，有辐射形沟纹，28℃培养7天直径约22~30mm；颜色呈灰绿色，周围有白色的晕圈；菌落反面呈淡褐或暗褐色。分生孢子梗直接生于基质或生于气生菌丝，分生孢子为球形或近球形，孢子表面粗糙，有小刺；小分生孢子头呈疏松柱形或散乱。通过查阅文献和比较发现，这些特征与聚多曲霉形态特征基本一致。 

2、碳源利用情况 

碳源利用情况采用Biolog微生物鉴定仪进行测定。采用上述Biolog微生物鉴定仪鉴定时的接种方法，将曲霉的孢子悬液接种到微生物碳源鉴定板中；该鉴定板中含有各种碳源，以鉴定板的第一个小孔作为空白对照。在28℃条件下，培养48小时，然后用Biolog微生物鉴定仪，750nm处测吸光值，得出碳源利用情况见表4。 

表4本发明聚多曲霉菌株的碳源利用情况 

注：“＋”为阳性（阳性即为可以利用该碳源），“－”为阴性。 

参考文献 

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[11]胡利勇.萨氏曲霉Aspergillus sydowiLC-562产纤维素酶的研究.[学位论文].杭州：浙江工业大学,2004。 

Claims (5)

1.高产脲酶的聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5，其保藏号为CGMCC No.6577。

2.根据权利要求1所述的产脲酶聚多曲霉，其特征在于：其18S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1或2所述的聚多曲霉在生产脲酶中的用途。

4.权利要求1或2所述的聚多曲霉在酿酒中的用途。

5.权利要求1或2所述的聚多曲霉在黄酒生产中的用途。

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