CN102994487A - 酸性脲酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酸性脲酶的生产方法，属于酶制剂技术领域。本发明要解决的技术问题是提供一种生产酸性脲酶的方法。本发明的酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤：利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No.6577发酵，提取，得到脲酶制剂。本发明方法所需设备简单，操作方便，可工业化大生产酸性脲酶。

Description

酸性脲酶的生产方法

技术领域

本发明涉及酸性脲酶的生产方法，属于酶制剂技术领域。 

背景技术

脲酶（Urease，urea amidohydrolase，EC 3．5．），又称尿素氨基水解酶，存在于大多数细菌、曲霉和高等植物里。它是一种酰胺酶、能使有机物质分子中酶键水解。其作用极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。有部分微生物产生的酸性脲酶(acid urease)不同于植物中提取的中性、偏碱性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性环境，在pH4.0～5.5的体系中仍具有活性^[1]。 

在国外，乳酸杆菌已经被用于生产脲酶酶制剂，有效地减少葡萄酒中尿素含量^[2-6]。在国内，脲酶已经被用于降低黄酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，目前所用的酶制剂均从国外进口^[7]。例如，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司购买日本生产的酒用酸性脲酶去除黄酒中的尿素，该酸性脲酶在绍兴黄酒中作用时间48h左右，可有效除去黄酒中约80%的尿素^[8]。 

随着国内对酸性酒用脲酶的需求量不断增加，迫切需要解决酒用脲酶在国内生产能力不足的现状，因此酒用脲酶的研究对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等方面均有深远的意义。目前，江南大学分离获得肠出血性大肠埃希氏菌，利用该菌株生产出纯度较高的酒用脲酶制剂，然后将酶制剂添加到黄酒中，24h后尿素去除率为70％以上^[9]。 

由于酒用酸性脲酶被作为食品添加剂直接添加到葡萄酒或者黄酒中，而目前报道的产脲酶菌株都是细菌，普遍从动物粪便（鸟粪、鼠粪、牛羊粪便），农田土壤，污泥等中分离获得 ^[9]，并且需要一系列复杂的酶纯化提取工艺才能获得高纯度的酶制剂，从而极大的增加了生产成本，也增加了大规模生产的难度。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供酸性脲酶的生产方法。 

本发明的技术方案是酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤：利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No.6577发酵，提取，得到脲酶制剂。 

进一步的，所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于30~35℃、150~250rpm、溶氧（PO₂）100%条件下发酵5~7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为10⁵~10⁶个/mL，孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的1~2‰。 

所述的PO₂是发酵罐好氧培养时候的一个参数，即发酵罐在运行时，温度、搅拌速度、pH的实际值达到稳定状态，且通入空气使溶氧值不再变化时，将溶氧值校准为100%。校准 好后在进行接种。 

优选的，于35℃，150rpm，培养时间为7天。 

进一步的，所述的麦芽汁培养基的制备方法如下：取大麦芽粉碎，加3~5倍（优选4倍）于麦芽质量的55~60℃的水，在55~60℃下保温3~4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5～7波美（⁰BX）（波美是糖度的单位，本发明中可用蒸馏水调糖度），115℃下灭菌20分钟备用。 

进一步的，所述的提取指在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。 

优选的，收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝。 

优选的，粉碎菌丝过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。 

本发明还提供了所述酸性脲酶的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。 

本发明方法利用高产脲酶的聚多曲霉生产酸性脲酶。该菌株产脲酶活性可达到49.7U。本发明根据聚多曲霉的特性，对发酵条件以及提取工艺进行了研究优化，使得本发明的生产方法工艺简单、投入少，可规模化大生产。本发明方法为酸性脲酶的生产提供了新的选择。 

本发明的聚多曲霉（Aspergillus sydowii）JNC-U5于2012年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.6577，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。 

附图说明

图1pH对脲酶活性的影响 

图2尿素去除率测定 

具体实施方式

本发明的技术方案是酸性脲酶的生产方法，包括如下步骤：利用聚多曲霉Aspergillus sydowii JNC-U5 CGMCC No.6577发酵，提取，得到脲酶制剂。 

进一步的，所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于30~35℃、150~250rpm、溶氧（PO₂）100%条件下发酵5~7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为10⁵~10⁶个/mL，孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的1~2‰。 

所述的PO₂是发酵罐好氧培养时候的一个参数，即发酵罐在运行时，温度、搅拌速度、pH的实际值达到稳定状态，且通入空气使溶氧值不再变化时，将溶氧值校准为100%。校准好后在进行接种。 

优选的，于35℃，150rpm，培养时间为7天。 

进一步的，所述的麦芽汁培养基的制备方法如下：取大麦芽粉碎，加3~5倍于麦芽质量的55~60℃的水，在55~60℃下保温3~4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5～7⁰BX， 115℃下灭菌20分钟备用。 

进一步的，所述的提取指在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。 

优选的，收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝，以去除发酵液中的培养基成分。 

优选的，粉碎菌丝过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。 

本发明方法操作简单，产量高，可用于生产酸性脲酶。 

本发明还提供了所述酸性脲酶的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。 

实施例1菌株筛选 

1、菌株的初筛 

材料：四川剑南春（集团）有限责任公司使用的酒曲 

培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖18g，0.4%酚酞溶液3mL，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂20.0，蒸馏水1000mL。除酚酞外，溶解上述各种成分，并调pH为6.8-6.9，然后加入酚酞指示剂。分装三角瓶，121℃灭菌15min，待培养基冷至50-55℃时，加入预先过滤灭菌的20%尿素水溶液，使其在培养基中在最终浓度为2%，摇匀后备用。 

实验方法：无菌条件下取10克酒曲于装有90mL无菌水并放有玻珠的25mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10^-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入30℃培养箱培养2~5天，按菌落周围是否变红进行初筛（结果见表1）。因为脲酶分解尿素产生氨使培养基呈碱性；酚酞遇碱变红，颜色的深浅初步表示了菌株产脲酶能力的大小。挑选菌落周围变红的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察发现主要为霉菌和细菌。 

表1初筛得到菌株的变红时间及颜色深浅 

菌株编号	变红时间(天)	红色深浅	菌株编号	变红时间(天)	红色深浅
						JNC-U1	2	较深	JNC-U12	4	浅
JNC-U2	2	较深	JNC-U13	4	浅
						JNC-U3	2	浅	JNC-U14	4	较深
JNC-U4	2	浅	JNC-U15	4	浅
						JNC-U5	2	深	JNC-U16	4	浅
JNC-U6	2	较深	JNC-U17	5	较深
						JNC-U7	3	较深	JNC-U18	5	较深
JNC-U8	3	较深	JNC-U19	5	浅
						JNC-U9	3	浅	JNC-U20	5	浅
JNC-U10	3	浅	JNC-U21	5	浅
						JNC-U11	3	较深

2、菌株的复筛 

将初筛的菌株经过多次转接后发现，绝大多数菌株产脲酶的能力逐渐丧失。经过多代筛选，我们最终选出一株产脲酶能力稳定的菌株JNC-U5，根据形态初步鉴定为霉菌。将该菌株 接种到5~7波美的麦芽汁培养基中，在30~35℃条件下，150~200rpm，发酵培养6~8天。然后将过滤，并用无菌水洗掉多次洗涤，最后在40℃条件下烘干，打磨成粉即得脲酶酶制剂，4℃冷藏保存备用。 

菌丝脲酶活性测定参照大豆制品脲酶活性测定方法（GB/T 8622-1988）。酶活性定义：30℃，pH7.0条件下，每分钟每克酶制剂分解尿素产生氨的毫克数表示酶得活性U。测定结果表明该酶制剂脲酶活性为49.7U。 

实施例2JNC-U5菌株的鉴定 

1、18S rDNA序列分析 

（1）DNA提取 

收集菌体，溶于5mL提取缓冲液（100mMTris·Cl，100mM EDTA-Na₂，200mM NaCl，2%CTAB，pH8.0）中，37℃振荡45min。加入0.75mL 20%SDS，65℃水浴1h。12,000rpm，离心10min，收集上清。上清用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，加入终浓度0.3mol的NaAC（pH5.2）及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1h。4℃，12,000rpm，离心20min，收集沉淀，用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50μL TE（10mm Tris-Hcl，1mmNa₂EDTA）中，即得总DNA。 

（2）扩增18S rDNA 

以总DNA为模板，真菌通用引物18SF（SEQ ID No.2：CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA）和18SR（SEQ ID No.3：CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT）分别为正向引物和反向引物扩增18S rDNA。扩增反应体系为50μL：10×Buffer 5μL，dNTP 1μL，Taq酶0.5μL（2U），正反向引物各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O 40.5μL。扩增反应条件：94℃4min预变性；94℃0.5min，55℃1min，72℃0.5min，30个循环；72℃延伸7min。 

（3）18S rDNA序列分析 

将扩增的18S rDNA片段送上海生工测序，通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序进行比较获得同源性分析结果（见表2）。 

扩增片段测序结果如SEQ ID No.1所示： 

GGCATCGGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTCCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCGCGGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGCGCCAGTCCGAAGGCCTCACCGAGTCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGGCCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCGGACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAA GATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTCGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACGCCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCGTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCACCCACAGCCAGTGAAGGCCATGGGATTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATAAIACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTCCCGAAGTCGGGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGAIAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAGATTGCTTATACTTAGACATGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCATATGACTACTGGCAGGATCAACCAGGTTGGA 

表2扩增片段的同源性比对分析 

相似菌株	同源性
		Aspergillus sp（曲霉）	99%
Aspergillus sydowii(聚多曲霉)	95%

2、Biolog微生物鉴定仪鉴定

经18S rDNA序列分析，发现复筛得到的菌株与曲霉属的同源性为99%，初步鉴定该菌株为曲霉属的真菌；与聚多曲霉的同源性为95%，暂时无法确定其种。为了进一步的确定该曲霉的种，本发明人决定采用美国Biolog全自动微生物鉴定仪（BIOLOG Microstation^TM）鉴定（见表3）。 

将待鉴定菌株接种至Biolog推荐的培养基2%ME培养基（ME培养基为微生物通用培养基）上，26℃培养，培养时间为7天。 

校正浊度仪，利用FF接种液调整100%（“FF接种液”是鉴定仪专用的，购买自美国biolog公司，货号：CA94545），然后用FF的标准比浊管显示浊度，应为75%T左右。进行读数校正时最好不要随意转动接种液的玻璃管，因管壁的透光度不均匀，转动会发生变化，空白校正时在什么位置，接种时尽量也放在同样的位置。制备孢子悬液时，首先将灭菌的棉棒在接种液浸一下，然后在平板表面滚动粘取孢子，上下反复涂抹接种液上部干燥的管壁上，使孢子分散，然后利用接种液冲下做成均一孢子悬液；将孢子悬液浓度控制在标准浓度为75%T左右。 

将菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中。按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中。盖好微孔板的盖子，弹出枪头。将微孔板直接放入26℃培养箱中培养1~4天。在相应时间内读板。经鉴定（表3），筛选得到产脲酶菌株为聚多曲霉。因此，结合分子测序和Biolog微生物鉴定仪鉴定结果，确定菌株JNC-U5为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。 

表3Biolog微生物鉴定仪鉴定结果 

英文名	参考中文名
		Aspergillus sydowii	聚多曲霉

实施例3JNC-U5菌株产酶条件的筛选 

1、聚多曲霉产酶条件的优化 

选取温度、发酵天数、接种量、搅拌速度（发酵罐转速）四因素三水平设计正交实验， 

实验结果表4所示。 

其中孢悬液的配制如下：将菌株接种到ME培养基上活化，在30℃光照培养10天左右，待其产孢后，用无菌水洗下孢子，配置成浓度约为10⁶个/mL的孢子悬液。然后将孢悬液按照占麦芽汁培养基体积的0.5‰、1‰和2‰的量加入到培养基中。 

表4不同条件对产脲酶的影响 

正交实验结果表明，温度和发酵时间对菌株产脲酶影响较大，接种量和搅拌速度对产脲酶影响相对较小。产酶的较适宜条件为：温度25~35℃，培养时间5~7天，接种量1~2‰，搅拌速度150~250rpm；优选35℃，培养时间7天，接种量1~2‰，搅拌速度150rpm。 

2、聚多曲霉产酶培养基筛选 

产脲酶培养基^[11]1^#：蛋白胨1%（w/v），葡萄糖1.8%（w/v），氯化钠0.5%（w/v），磷酸二氢钾0.2%（w/v）；高压灭菌后加入过滤灭菌的尿素溶液，使最终浓度为2%（w/v）； 

产脲酶培养基^[12]2^#：葡萄糖2%（w/v），酵母浸膏1%（w/v），酵母粉（不含氨基酸）1%（w/v），柠檬酸盐0.5%（w/v），Na₂HPO₄1.5%（w/v），NiSO₄·6H₂O（w/v）0.0032%（w/v），用酒石酸调pH至3.0，高压灭菌后加入过滤灭菌的尿素溶液使最终浓度为0.02%（w/v）； 

产脲酶培养基3^#：酵母浸膏1%（w/v），Na₂HPO₄1.5%（w/v），用1波美麦芽汁定容至1L（其中“波美”是糖度的单位），用柠檬酸调pH至3.0，高压灭菌后加入过滤灭菌的尿素溶液使最终浓度为0.02%（w/v）； 

产脲酶培养基4^#：葡萄糖1%（w/v），Na₂HPO₄1.5%（w/v），用柠檬酸调pH至3.0，高压灭菌后加入过滤灭菌的尿素溶液使最终浓度为0.02%（w/v）； 

产脲酶培养基5^#：5~7波美的麦芽汁培养基。

麦芽汁制备:取大麦芽粉碎，加4倍于麦芽量的60℃的水，在55~60℃下保温糖化，不断搅拌，经3~4h后，用纱布过滤，除去残渣，煮沸后再重复用滤纸或脱脂棉过滤一次，即得澄清的麦芽汁，用蒸馏水将麦芽汁浓度调整到5～7⁰BX。分装三角瓶中于115℃下灭菌20分钟备用。 

实验方法： 

将菌株接种到ME培养基上活化，在30℃光照培养10天左右，待其产孢后，用无菌水洗下孢子，配置成浓度约为10⁶个/mL的孢子悬液。然后将孢子悬液按照每瓶2mL的接种量接种到上述五种产脲酶培养基中（200mL/500mL三角瓶）。在35℃条件下，180rpm，发酵培养6天。用滤纸过滤收集菌丝，并用无菌水多次洗涤，低温冷冻干燥菌丝，4℃冷藏保存备用。同时，收集过滤液体，亦4℃冷藏保存备用。 

将干燥的菌丝磨成粉状，参照邱业先等^[10]的方法测定脲酶活性，取0.1g菌丝，置于100mL容量瓶中，加2mL甲苯处理15min，加入10%尿素10mL和20mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液，混合均匀。将容量瓶置37℃培养24h，用38℃蒸馏水稀释至刻度，振荡并过滤。取滤液0.5mL，加入4mL苯酚钠（1.35mol/L）溶液，并加入3mL次氯酸钠（0.9%）溶液，仔细混匀显色20min，最后用蒸馏水定容至50mL。用Varian Cary 50 BiO型分光光度计，在578nm处测光吸收值。 根据标准曲线求出氨态氮含量。零空白不加入样品，其他操作与样品实验相同。对每一样品设置用水代替基质的对照。酶活：以24小时后1g样品分解尿素形成氨态氮含量（毫克数）表示。 

通过测定发现，该菌株在2^#和5^#培养基中发酵培养，所产脲酶的活性都比较高（表5）。其中5^#培养基为5～7波美的麦芽汁，大麦及麦芽作为酿酒原料被广泛用于酿酒生产，因此，选择麦芽培养基不仅产脲酶活性高，而且不会给酒体带来其它异杂味。另外取5mL各种培养基发酵后的滤液测定脲酶活性，结果均未检出，由此可见该菌株所产脲酶为胞内酶。 

表5不同培养基发酵所产脲酶酶活性 

培养基编号	脲酶活性（mg/g）
		1#	190.4
2#	588.7
		3#	325
4#	115.6
		5#	656.5

实施例4脲酶酶制剂的制备方法 

仪器：Minfors INFORS HT-5L发酵罐，细胞破碎仪Biospec Minnibeadbeater，粉碎机。 

利用发酵罐生产酸性脲酶酶制剂，选用5^#培养基，出的麦芽培养基对脲酶菌株进行发酵，发酵条件：温度，35℃；溶氧PO₂，100%；转速250rpm，pH 3.5，培养6天后，菌丝收集，用滤纸过滤收集菌丝体，用无菌水多次洗涤，然后低温冷冻干燥菌丝，4℃冷藏保存备用。干燥后的菌丝采用不同的方法进行破碎后参照实施例3方法测定脲酶活性，试验重复3次，如下所示： 

1^#：称取0.1g菌丝体于2mL的细胞破碎管中，加入0.3g玻璃珠（0.1mm）和1mL pH6.7柠檬酸缓冲液，利用细胞破碎仪器破碎80s，搅拌转速1500r/min，反复破碎3次。将破碎后的菌丝及液体全部转入50mL的容量瓶，测定其脲酶活性。 

2^#：利用粉碎机粉碎，过80目筛，称取0.1g测定脲酶活性。 

两种不同的处理方式酶活基本相同（表6），但采用粉碎机粉碎操作简单，所以该酸性脲酶酶制剂的制备选用粉碎机直接粉碎即可用于生产，极大的降低了生产成本，更适宜工业化大生产。 

表6不同制备方法脲酶酶活性 

处理方式编号	脲酶活性（mg/g）
		1#	691.6
2#	689.5

实施例5酸性脲酶酶制剂在提高大曲曲药脲酶活性及酿酒发酵过程中的应用 

1、酸性脲酶制剂在酿酒过程中的应用 

（1）不同pH对脲酶活性的影响 

酿酒发酵过程中的pH值一般维持在3.5~4.5之间，因此研究pH对其酶活性的影响对进一步的应用研究有指导意义。 

用乳酸和乳酸钠缓冲液调整不同pH值，然后参照实施例3的方法用不同pH值乳酸和乳酸钠溶液代替柠檬酸缓冲液，测定脲酶制剂在不同pH条件下的脲酶活性。测定结果（图1）表明尽管随着pH值的降低，该酶的活性受到一定的抑制，但是在pH3.5~4.5之间时仍然保持较高的活性。即说明本发明方法制备的酸性脲酶可用于酿酒生产。 

（2）酸性脲酶在酿酒中的应用 

为了进一步研究酸性脲酶在酿酒中的应用，本发明购买市售黄酒实施了尿素去除率实验，黄酒检测分析数据：尿素25mg/L，酒精度为16.2%（v/v），pH4.1。将实施例2中制成的脲酶制剂按照10mg/100mL的量加入上述酒样中，置于25℃条件下反应。每隔24h测定尿素的含量。尿素含量的测定采用二乙酰肟法（国家标准方法GB/T18204.19-2000）。测定结果（图2）表明添加脲酶制剂后24h，尿素去除率可以达到78.5%，此后尿素去除率变化不大，48h后尿素去除率超过80%。 

参考文献 

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Claims (8)

1.酸性脲酶的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：利用聚多曲霉Aspergillus sydowiiJNC-U5 CGMCC No.6577发酵，提取，得到脲酶制剂。

2.根据权利要求1所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：所述的发酵是指将聚多曲霉接种到麦芽汁培养基中，于30~35℃、150~250rpm、溶氧100%发酵5~7天；其中，聚多曲霉的孢悬液浓度为10⁵~10⁶个/mL，孢悬液的体积占麦芽汁培养基体积的1~2‰。

3.根据权利要求2所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：所述的发酵条件如下于35℃，150rpm，培养时间为7天。

4.根据权利要求2或3所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：所述的麦芽汁培养基的制备方法如下：取大麦芽粉碎，加3~5倍于麦芽质量的55~60℃的水，在55~60℃下保温3~4h，过滤，煮沸，过滤，将麦芽汁浓度调整到5～7波美，115℃下灭菌20分钟。

5.根据权利要求1~4任一项所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：所述的提取为在发酵完毕后收集菌丝，干燥菌丝，粉碎菌丝。

6.根据权利要求5所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：收集菌丝时用无菌水洗涤菌丝。

7.根据权利要求5或6所述的酸性脲酶的生产方法，其特征在于：粉碎菌丝后过80目筛，收集菌丝粉末即得到酶制剂。

8.权利要求1~7任一项所述的生产方法在生产酸性脲酶中的用途。

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