CN1955282A - 一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法及应用 - Google Patents

一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法及应用 Download PDF

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一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明涉及利用肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C12发酵生产收集菌体，用溶菌酶和液氮研磨的方法将菌体细胞破碎，通过乙醇分级沉淀，获得酒用酸性脲酶制品；本发明还涉及这种酒用酸性脲酶的应用，在黄酒中加入该酒用酸性脲酶24h后尿素去除率能达70％以上。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较理想的去除酒中尿素的方法。

Description

一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法及应用
技术领域
一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法及应用，具体地说是利用肠杆菌发酵生产收集菌体，用溶菌酶和液氮研磨的方法将菌体细胞破碎，通过乙醇分级沉淀，获得酒用酸性脲酶制品，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。
背景技术
1985年证实了酒精饮料中的氨基甲酸乙酯具有致癌作用后，引起世界卫生组织和各国的高度重视。1985年12月，加拿大政府率先颁布了各类酒中氨基甲酸乙酯的限量标准。之后，美国葡萄酒工业协会、日本等国也先后制定了酒中氨基甲酸乙酯的限量标准。
国内外对酒中氨基甲酸乙酯的研究表明，酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途径为尿素途径，我国黄酒及日本清酒中90％以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的反应：
而酒中尿素的主要来源为：
(1)由微生物代谢产生，即由精氨酸代谢产生的尿素。
(2)原辅材料和酿造过程的培养液成分中所含的尿素。
在研究了影响氨基甲酸乙酯形成的因素后发现，尿素浓度、乙醇浓度等是最主要的因素。各国学者们对降低酒中氨基甲酸乙酯的方法进行了深入的研究，通过去除或降低酒中的尿素含量，以达到控制氨基甲酸乙酯含量的目的。研究的主要方向为：
1.选育低产尿素的酵母菌；
2.适当控制发酵条件；
3.酒中添加适量的酒用酸性脲酶。
相比之下，向酒中添加酒用酸性脲酶最为简便、实用，也是目前较常用的方法，这种方法具有显著的优点：
1.不改变原酿造酒的工艺条件，不影响正常生产。
2.不改变原酒的风味特性。这是由于添加量小，而且脲酶经煎酒后失活。
3.降低酒中氨基甲酸乙酯的程度高，可达90％。
我国是世界上年产酒量最大的国家，有着十分悠久的酿酒历史，不仅产量大，而且品种多，许多产品在国际上享有较高的声誉。我国的绍兴黄酒在日本及东南亚拥有广泛的市场，但在1987年，日本有关部门提出绍兴黄酒中氨基甲酸乙酯含量超标(大于100μg/L)，近年来，又在绍兴黄酒出口贸易上遇到了氨基甲酸乙酯的问题，为了降低酒中氨基甲酸乙酯的含量，绍兴黄酒集团至今仍需从日本进口酒用酸性脲酶。因此，为了人民的身体健康，也为了能更多的出口创汇，研究和生产我国自己的酒用酸性脲酶已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是筛选一株能产适合酒用的酸性脲酶的微生物，通过细胞破碎，用乙醇分级沉淀等生化分离手段，最终获得较纯的酒用酸性脲酶，整个工艺流程收率为45％，酶的比活为138u/mg，最适温度为75℃，温度稳定范围75℃以下，最适pH5.5，稳定pH范围4.0～6.5。将该酶加入黄酒中，通过去除尿素，避免氨基甲酸乙酯的产生，起后修饰作用。
本发明的技术方案：将肠杆菌接入含有糖的发酵培养基中，同时添加氮源及营养物质，以盐酸调节发酵培养基pH，发酵获得菌体，用溶菌酶和液氮研磨的方法将菌体细胞破碎，用乙醇分级沉淀，获得胞内酶酒用酸性脲酶。工艺为：
A通过肠杆菌发酵，收集菌体：
(1)出发菌株：采用肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C12。该菌株已在《浙江农业大学学报》22(5)：493～498，1996公开。
(2)发酵培养基组成：糖10g/L，氮源16g/L，营养物质10g/L，NaCl5g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，尿素3g/L，MnSO40.1g/L，NiSO40.1g/L，用盐酸调pH5.0～5.5，所述及的营养物质为豆饼水解液和/或玉米浆。
(3)发酵条件：接种量6％，初始pH5.0～5.5，30～34℃恒温静置培养28h。
(4)收集菌体：将发酵液以8000r/min、4℃离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次。
B用溶菌酶和液氮研磨进行细胞破碎：
(1)溶菌酶处理：将菌体按质量体积比1∶5溶于高渗缓冲液SMM中，溶菌酶的加入量为0.6mg/mL，30℃水浴处理13h。以8000r/min、4℃离心10min后，用pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶离心收集的沉淀，以8000r/min、4℃离心10min后，收集上清液。
(2)液氮研磨：溶菌酶处理后收集上清液后，将余下的沉淀加入适量液氮，快速研磨，待液氮挥发后，再次加入适量液氮进行研磨，反复三次，用pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶研磨后的菌体，以8000r/min、4℃离心10min后，收集上清液。
C用乙醇分级沉淀
(1)合并B中收集的上清液加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为30％进行醇沉，以5000r/min、4℃离心(I)10min后，弃沉淀，取上清液。
(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为50％进行醇沉，以5000r/min、4℃离心(II)10min后，取沉淀，弃上清。
(3)沉淀加少量pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，以10000r/min、4℃离心(III)10min后，弃沉淀，取上清，即为酸性脲酶酶液。
D酸性脲酶在黄酒中的应用
酸性脲酶按0.05u/mL的加量在30℃以下加入黄酒中，24h尿素去除率达到70％以上。
酶活定义：在常压、37℃、pH4.5的条件下，每min分解尿素产生1μmol铵离子的酶量为1个酶活单位。
黄酒中的尿素测定方法应用二乙酰-肟的方法，在波长为527nm的条件下，以超纯水作为空白，测定尿素标准溶液的OD值，与以OD值相对应的浓度作图，绘制标准曲线。在相同条件下测定黄酒的OD值，再通过回归方程计算其含量。
本发明的有益效果：发酵生产酒用酸性脲酶可以扩大，提取方法容易扩大生产，该酸性脲酶能在酒中稳定发挥作用，尿素去除率高，在黄酒中，加入酒用酸性脲酶后尿素去除率能达到70％以上。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，是目前较理想的去除酒中尿素的方法。
附图说明
图1酒用酸性脲酶制备工艺示意图。
具体实施方式
实施例1
将肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C12斜面接入种子液，扩大培养后，再按接种量6％接入20L发酵培养基中，发酵培养基组成如说明书所述。初始pH5.0～5.5，30～34℃静置培养28h，把发酵液在8000r/min下4℃离心10min收集到菌体80g，用2L去离子水洗涤两次后，在400mlSMM高渗缓冲液中复溶，加入溶菌酶240mg，30℃水浴处理13h。8000r/min条件下4℃离心10min，用400mLpH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶离心收集的沉淀，8000r/min条件下4℃离心10min后，收集上清液。余下的沉淀，加入适量液氮，快速研磨，待液氮挥发后，再次加入适量液氮进行研磨，反复三次，用400mLpH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶研磨后的菌体，8000r/min下4℃离心10min后，收集上清液。将两次收集的800mL上清合并，加入342.7mL-20℃乙醇沉淀，5000r/min条件下4℃离心10min后，再取上清加入457.3mL-20℃乙醇进行醇沉，5000r/min条件下4℃离心10min后，取沉淀，沉淀加80mLpH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，10000r/min条件下4℃离心10min后，得到上清约80mL，即为浓缩的酸性脲酶粗酶液，冷冻干燥后得2g酶粉。在100mL黄酒中加入0.69mg酶粉，24h后尿素含量从35.2mg/L降到10.3mg/L测定尿素去除率为70.6％。

Claims (5)

1、一种用肠杆菌发酵生产酒用酸性脲酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将肠杆菌接入含有糖的发酵培养基中，同时添加氮源及营养物质，以盐酸调节发酵培养基pH，发酵获得菌体；用溶菌酶和液氮研磨的方法进行细胞破碎；用乙醇分级沉淀，获得其胞内酶酒用酸性脲酶；其工艺为：
A通过肠杆菌发酵，收集菌体：
(1)出发菌株：采用肠杆菌(Enterobacter sp.)9043C12；
(2)发酵培养基组成：糖10g/L，氮源16g/L，营养物质10g/L，NaCl 5g/L，乙酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，尿素3g/L，MnSO40.1g/L，NiSO40.1g/L，用盐酸调pH5.0～5.5，所述的营养物质为豆饼水解液和/或玉米浆；
(3)发酵条件：接种量6％，初始pH5.0～5.5，30～34℃恒温静置培养28h；
(4)收集菌体：将发酵液以8000r/min、4℃离心10min后，弃上清，将菌体用去离子水洗涤两次；
B用溶菌酶和液氮研磨进行细胞破碎：
(1)溶菌酶处理：将菌体按质量体积比1∶5溶于高渗缓冲液SMM中，溶菌酶的加入量为0.6mg/mL，30℃水浴处理13h，以8000r/min、4℃离心10min后，用pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶离心收集的沉淀，以8000r/min、4℃离心10min后，收集上清液；
(2)液氮研磨：溶菌酶处理后收集上清液后，将余下的沉淀加入适量液氮，快速研磨，待液氮挥发后，再次加入适量液氮进行研磨，反复三次，用pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复溶研磨后收集的沉淀，以8000r/min、4℃离心10min后，收集上清液；
C用乙醇分级沉淀：
(1)合并B中收集的上清液，加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为30％进行醇沉，以5000r/min、4℃离心(I)10min后，弃沉淀，取上清液；
(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇终浓度为50％进行醇沉，以5000r/min、4℃离心(II)10min后，取沉淀，弃上清；
(3)沉淀加少量pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，以10000r/min、4℃离心(III)10min后，弃沉淀，取上清，即为酸性脲酶液。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的盐酸为30％浓度的HCl。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖为葡萄糖。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的氮源为豆饼水解液、玉米浆、尿素、硫酸铵中的一种或多种。
5、用权利要求1方法制备的酒用酸性脲酶的应用，其特征在于酸性脲酶按0.05u/mL的加量在30℃以下加入黄酒中，24h后尿素去除率达到70％以上。
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