ES2845632T3

ES2845632T3 - Una producción microbiana selectiva de xilitol a partir de una corriente de azúcar basada en biomasa con un componente de pentosa enriquecido

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Publication number: ES2845632T3
Application number: ES13815582T
Authority: ES
Inventors: Manish Petkar; Shweta Pawar; Arvind Lali
Original assignee: PRIVI BIOTECHNOLOGIES PVT Ltd
Current assignee: PRIVI BIOTECHNOLOGIES PVT Ltd
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2033-08-28
Also published as: EP2890799A2; EP2890799B1; PL2890799T4; US10006059B2; WO2014045297A3; US20150218598A1; PL2890799T3; WO2014045297A2

Abstract

Un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa que comprende: a) el cultivo de una cepa de levadura capaz de convertir xilosa en xilitol en un medio sólido; b) la inoculación de la cepa de levadura obtenida de la etapa (a) en un fermentador de siembra que contiene medio de siembra; y c) el cultivo de la cepa de levadura de la etapa (b) transfiriendo dicha cepa de levadura a un fermentador de producción que tiene medio de producción que contiene xilosa; en donde la fermentación de dicha biomasa que contiene xilosa se lleva a cabo en modo discontinuo seguido de modo continuo, en donde i. dicha fermentación se realiza a una velocidad de agitación más alta durante las 0-24 horas iniciales de fermentación en modo discontinuo y a una velocidad de agitación más baja durante las siguientes 24-72 horas de fermentación discontinua; ii. la velocidad de agitación se mantiene constante durante el modo continuo posterior hasta la cosecha final de la fermentación; y d) en el modo continuo, la cepa de levadura se retira de dicho medio de producción; y el producto de xilitol se retira continuamente de dicho medio de producción a un caudal y se añade continuamente medio de producción fresco al fermentador de producción al mismo caudal, para la producción continua de xilitol.

Description

DESCRIPCIÓN

Una producción microbiana selectiva de xilitol a partir de una corriente de azúcar basada en biomasa con un componente de pentosa enriquecido

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para la producción de xilitol a partir de xilosa (azúcar pentosa) obtenida de una variedad de biomasa, tal como salvado de cereales, astillas de madera, mazorca y tallo de maíz, bagazo y biomasa lignocelulósica. Un aspecto específico de la invención se refiere a un método para la producción de xilitol por fermentación de hidrolizado de biomasa lignocelulósica y al uso de una alta concentración inicial de xilosa para una mayor producción de xilitol en un tiempo de conversión eficazmente más corto.

Antecedentes de la invención

El alcohol pentahídrico xilitol es un alcohol de azúcar, con importante aplicación en la industria alimentaria y de repostería como edulcorante bajo en calorías. Se distribuye ampliamente en la naturaleza en pequeñas cantidades, siendo algunas de las mejores fuentes las frutas, hortalizas, bayas, setas, lechuga, maderas duras y mazorcas de maíz. El cuerpo humano produce de 5-10 gramos de xilitol a partir de una fuente de alimento utilizando rutas de energía establecidas. Aunque ampliamente distribuido en la naturaleza, su presencia en baja concentración hace que no sea económico producir xilitol a escala comercial a partir de fuentes naturales.

El xilitol tiene numerosas ventajas, incluida la misma dulzura que la sacarosa, pero con un tercio menos de calorías y sin regusto desagradable. Después de la adición, su calor de disolución negativo imparte una sensación fresca y refrescante en la boca, haciéndolo un edulcorante popular para caramelos y golosinas. El xilitol es cariostático e incluso una sustancia no cancerígena. El xilitol es el preferido para los pacientes diabéticos, ya que se metaboliza independientemente de la insulina en el cuerpo humano. (J. WEI, Q. YUAN, T. WANG, Le WANG, Front. Chem. Eng. China 2010, 4(1):57-64). Tiene un valor de índice glucémico más bajo de 13 en comparación con la glucosa, con 100. También se ha demostrado que el xilitol tiene propiedades terapéuticas y, según se comunica, crea inmunidad, lucha contra las enfermedades crónicas degenerativas, es antienvejecimiento y no tiene niveles tóxicos conocidos.

La presente invención se refiere a la producción microbiana de xilitol, a partir de xilosa de madera como fracción enriquecida de azúcar pentosa obtenida a partir de biomasa, mediante una cepa de Candida de tipo silvestre inexplorada. Más particularmente, la invención se refiere a un nuevo procedimiento desarrollado utilizando una cepa silvestre de Candida tropicalis para la producción de xilitol con alto rendimiento y productividad. La invención se refiere a un procedimiento que utiliza una cepa de Candida tropicalis de tipo silvestre, en donde el uso de una cepa de tipo silvestre siempre está favorecido sobre una genéticamente modificada desde el punto de vista de la regulación y supera los problemas relacionados con el producto etiquetado según las normas de categoría de alimentos. La presente invención también explora Candida tropicalis (NRRL 12968) en la medida que es capaz de fermentar un azúcar pentosa a una tasa más alta y que se puede lograr utilizando distintas cepas de la misma especie actualmente conocidas en la técnica.

La importancia del xilitol y su aplicación en distintas industrias requieren métodos para la máxima producción de este alcohol de azúcar de manera eficaz. Como el xilitol está presente en bajas concentraciones en hortalizas o frutas, su extracción a partir de estas fuentes no es económica. Por lo tanto, el xilitol puede producirse mediante la reducción directa del azúcar xilosa en presencia de agentes reductores adecuados utilizando dos métodos principales: reducción directa mediante un método químico sintético y mediante una vía microbiana natural.

Comercialmente, el xilitol se produce mediante reducción química de la xilosa, una fracción de hidrolizado de hemicelulosa presente en maderas, paja de arroz, mijo, etc. Un ejemplo de este procedimiento se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 4008285, en la que la producción de xilitol a escala comercial se lleva a cabo mediante hidrólisis ácida de materias primas que contienen pentosano, tales como madera, mazorcas de maíz, paja, salvado y cáscaras de semillas de algodón. La hidrólisis del xilitol generalmente se lleva a cabo utilizando catalizador de níquel Raney (NÍZAI2O3) a alta temperatura (80-140 °C) y presión (hasta 50 atm). Una limitación del procedimiento químico es la dificultad de separación y purificación de xilosa o xilitol a partir de hidrolizados que contienen otros azúcares poliméricos derivados de fracciones de hemicelulosa (Jeffries T. W., Kurtzman C. P., Enzyme Microbial Technology, nov. de 1994, Vol. 16, Número 11: 922-932). Se precisan técnicas de separación de múltiples etapas, incluida la filtración mecánica y la cromatografía, para obtener xilitol puro. Estos procedimientos afectan de forma adversa al costo de producción para un rendimiento en el intervalo del 50-60 %. Adicionalmente, tales procedimientos implican riesgos asociados a la alta temperatura y la alta presión. La eliminación de desechos debido al uso de un ácido o álcali es otra preocupación importante asociada con la producción química de xilitol. (E. Winkelhausen y S. Kuzmanova, Journal of fermentation and bioengineering, 1998, Vol. 86, n.° 1, 1-14). Estos factores hacen que los métodos químicos para la producción rutinaria de xilitol sean difíciles, costosos e ineficaces.

Recientemente, se explora en la bibliografía una producción microbiana de xilitol que ofrece un procesamiento aguas abajo rentable que puede reducir el coste de fabricación (Rivas B. et al., Enzyme Microb. Technol., 2003, 31:431-438). Dicho procedimiento reduciría la necesidad de xilosa purificada, produciendo un producto de alta pureza, fácil de separar y adaptable a una amplia variedad de fuentes de materia prima de distintas ubicaciones geográficas.

La mayoría de los métodos de la técnica anterior comunicados en la bibliografía muestran la aplicación de levaduras como catalizador bioquímico para la producción de xilitol, debido a que se considera que son los mejores productores de xilitol entre los microorganismos. El cribado de más de 30 cepas de levadura reveló que la levadura del género Candida, tal como C. guilliermondii VTT-C-71006, C. tropicalis At Cc 1369 y C. tropicalis a Tc C 9968, son los mejores productores de xilitol (Ojamo, H., Tesis de Doctorado de la Universidad Tecnológica de Helsinki, Espoo, Finlandia, 1994).

Uno de tales métodos descritos en la técnica anterior, utilizando la levadura fermentadora de xilosa Candida tropicalis ATCC 13803, utiliza una concentración inicial de xilosa del 15 % (documento WO2009116066). El método comunicado divulga la fermentación de xilosa en solución acuosa con el 50 % de conversión de azúcar y el 50 % de rendimiento en 196 h. Se ha comunicado un trabajo similar utilizando Candida tropicalis ATCC 13803, en donde la concentración inicial de Xilosa comunicada fue del 10 %, lo que está en el margen inferior en comparación con la comunicación anterior (Patente N.° KR100259470).

Otro método comunicado en la técnica anterior utilizó Candida tropicalis ATCC 9968, el cual ha utilizado una concentración inicial más alta de xilosa, del 5 %-30 %, que los procedimientos comunicados anteriormente (documento WO09008193). La patente n.° KR100199819 describe el uso de Candida tropicalis KFCC 10960 con una concentración inicial de xilosa del 5-12 %. Uno de los métodos de la técnica anterior comunicó 173 g/l de producción de xilitol a partir de 200 g/l de concentración inicial de xilosa en 120 horas de fermentación, utilizando una cepa de levadura aislada de forma local del género Candida (T. Ikeuchi, M. Azuma, J. Kato, H. Ooshima, Biomass and Bioenergy, 1999, 16, 333 339).

Uno de tales métodos descritos en la técnica anterior, que utiliza la levadura fermentadora de xilosa Candida tropicalis ATCC 750 (equivalente a NRRL 12968) produce menos del 50 % de xilitol a partir de la mezcla de xilosa obtenida del hidrolizado de biomasa (Thomas P. West, World J. Microbiol. Biotechnol, 2009, 25:913-916). La invención comunica un rendimiento de producto máximo de 0,43 (gramos de xilitol/gramo de xilosa) en 120 horas de fermentación.

Uno de tales métodos descritos en la técnica anterior, que utiliza la levadura fermentadora de xilosa Candida tropicalis ATCC 7349, comunica una concentración de xilosa muy baja en el caldo de fermentación, con menor rendimiento de xilitol. La concentración inicial de xilosa utilizada en el procedimiento de la técnica anterior fue de 30 g/litro y produce menos del 40 % de xilitol a partir de la mezcla de xilosa obtenida de la hidrólisis de biomasa. (SAROTE S, MICHAEL S, MANFRED R, Journal of Fermentation and Bioengeering, 1995, Vol. 80, N.° 6, 565-570).

A pesar cantidad significativa de trabajo de la técnica anterior, el desarrollo de un procedimiento de producción microbiana factible desde el punto de vista comercial ha sido difícil de alcanzar por varias razones. Los métodos de la técnica anterior comunicados en la bibliografía tenían uno o más inconvenientes distintos, tales como una menor concentración inicial de sustrato, una deficiente conversión y rendimiento molar/gramo, y una productividad global del procedimiento que no alcanza los niveles necesarios para un procedimiento comercial. Por lo tanto, la presente invención describe un procedimiento nuevo, rentable y de alto rendimiento, en donde puede utilizarse una concentración más alta de xilosa para la producción comercial de xilitol, con una mejor economía.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para la producción de xilitol a partir de xilosa obtenida de una diversidad de biomasa, en donde se obtiene un rendimiento de xilitol de 0,7 g/g de xilosa. El cultivo utilizado para la bioconversión es Candida tropicalis NRRL-12968, obtenido del Northen Regional Research Center (en lo sucesivo, NRRL). La concentración inicial de xilosa utilizada para la reacción de bioconversión está en el intervalo del 20-35 % y la glucosa en el intervalo del 0,5-1,5 %. Con una concentración inicial de xilosa tan alta, el tiempo de bioconversión necesario para la producción de xilitol no supera las 72 horas con una productividad eficaz de 1,91 g de xilitol/hora/litro de caldo de fermentación. La presente invención se actualiza para dar como resultado una tecnología más inventiva y novedosa para un alto rendimiento y una mejor economía. La tecnología inventada implica el modo 'discontinuo seguido del continuo', en donde el tiempo de residencia de 46-64 horas y la tasa de dilución de 0,015-0,025/lit. dan una productividad óptima de 2,5 g/lit./hora de Xilitol.

Uno de los aspectos de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la fermentación microbiana de xilosa a xilitol utilizando Candida tropicalis, en donde el procedimiento comprende: el cultivo de la cepa de levadura y a continuación la transferencia a un fermentador de producción que tiene medio de producción que contiene xilosa. El procedimiento se lleva a cabo utilizando el modo discontinuo seguido del modo continuo, en donde el tiempo de residencia de 46-64 horas y la tasa de dilución de 0,015-0,025/lit. dan una productividad óptima de 2,5 g/lit./hora de Xilitol.

La presente invención proporciona un procedimiento para un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa, en donde el procedimiento comprende: el cultivo de una cepa de levadura capaz de convertir xilosa en xilitol en un medio sólido; la inoculación de la cepa de levadura obtenida en la etapa anterior en un fermentador de siembra que contiene medio de siembra; el cultivo de la cepa de levadura transfiriendo dicha cepa de levadura a un fermentador de producción que tiene medio de producción que contiene xilosa; en donde la fermentación de dicha biomasa que contiene xilosa se lleva a cabo en modo discontinuo seguido de modo continuo, en donde

i. dicha fermentación se realiza a una velocidad de agitación más alta durante las 0-24 horas iniciales de fermentación en modo discontinuo y a una velocidad de agitación más baja durante las siguientes 24-72 horas de fermentación discontinua;

ii. la velocidad de agitación se mantiene constante durante el modo continuo posterior hasta la cosecha final de la fermentación; y

en el modo continuo, la cepa de levadura se retira de dicho medio de producción; y el producto de xilitol se retira continuamente de dicho medio de producción a un caudal y se añade continuamente medio de producción fresco al fermentador de producción al mismo caudal, para la producción continua de xilitol.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando una cepa de Candida tropicalis, en donde dicho procedimiento utiliza una cepa inexplorada del NRRL con un alto nivel de tolerancia a xilosa y una mayor capacidad de producción de xilitol. La cepa de levadura fermentadora de xilosa utilizada en este método es Candida tropicalis, obtenida del banco de cultivos del NRRL con número de referencia 12968. Las cepas equivalentes depositadas en otro banco de cepas con distinto número de referencia, tal como ATCC 750, 7349, comunicadas en la técnica anterior, tenían los inconvenientes de un consumo muy bajo de xilosa hasta del 3% con una producción muy baja de xilitol que no superaba el 40 %.

A partir de ahí, la cepa de tipo silvestre comunicada en la presente invención se explora en cuanto al consumo inicial de xilosa y se descubre que tolera una concentración de xilosa tan alta como de 350 g/l o del 35 % de concentración de xilosa, lo que es mucho mejor que las cepas comunicadas en la técnica anterior.

El método comunicado en la presente invención utiliza una concentración optimizada de xilosa al 20-35 % en el fermentador de producción, lo que es crítico para el crecimiento de las levaduras comunicado. El aumento de la concentración inicial de xilosa da como resultado un aumento de la captación de xilosa y, por lo tanto, de la formación de xilitol (Sirisansaneeyakul S, Staniszewski M, Rizzi M, J. Ferment. Bioeng, 1995, 80, 565-570). La alta concentración de xilosa induce la formación de xilitol, favoreciendo el xilitol a expensas de la producción de etanol. Al mismo tiempo, para una alta productividad, es importante que la cantidad de xilosa convertida en xilitol y la cantidad de xilitol disponible para el metabolismo posterior deben estar bien equilibradas. ("Eleonora W, Samual A, Slobodanka K, Bulletin of the Chemists and Technologists of Macedonia, Vol. 22, N.° 1, pág. 47-54, 2003). Esto puede proporcionar una forma equilibrada de generar los cofactores necesarios a través de las distintas etapas de la vía metabólica.

La cepa utilizada para la presente invención se obtiene de la colección de cultivo abierta del NRRL con el n.° de referencia 12968. La presente invención comunica un método nuevo para la producción de xilitol empleando la cepa NRRL12968 utilizada, en el que el método comunicado es económico y comercialmente viable. La presente invención comunica un método nuevo, en donde la cepa, un equivalente de ATCC 750 comunicada en la técnica anterior, se puede utilizar a una alta concentración de xilosa con una producción selectiva de xilitol, en que la tolerancia global de la cepa ha aumentado a un nivel comercialmente aceptable. La concentración inicial de xilosa utilizada en el presente estudio está en el intervalo del 20-35 %, preferentemente del 25 %. La invención comunicada describe un método nuevo de alto rendimiento que produce 0,65-0,7 gramos de xilitol/gramo de xilosa a un caudal de aire de 0,2 volúmenes por volumen de medio por minuto (en lo sucesivo en el presente documento denominado vvm) en un plazo de 48-72 horas de tiempo de bioconversión.

El método comunicado en la invención utiliza 0,2 vvm de caudal de aire constante. La aireación desempeña un papel importante en el método comunicado para la conversión de xilosa en xilitol. El alto grado de aireación estimula el crecimiento celular debido a una vía de oxidación adicional y la entrada en el ciclo de Krebs para la producción de energía que para el xilitol. Esto va en detrimento de la acumulación de xilitol en el caldo de fermentación. (Walther T, Hensirisak P, Agblevor F.A., Bioresource Technology. 2001, 76(3): 213-220J. De otra manera, en condiciones limitadas de oxígeno, la formación de biomasa fue baja, disminuyendo de este modo la producción de xilitol en el caldo.

La invención comunicada describe un enfoque nuevo y un método eficaz para equilibrar la demanda de oxígeno de las células de levadura para la producción de biomasa frente al xilitol. Se comunica que la tasa de transferencia de oxígeno (OTR, forma siglada de oxygen transferrate) de la fase gaseosa a la fase líquida y, además, de la fase líquida a la membrana celular, es impulsada por la velocidad del agitador. Dado que la alta velocidad de agitación presenta una mayor OTR en comparación con la baja agitación y muestra un crecimiento celular exponencial debido a una mayor disponibilidad de oxígeno a nivel celular. Por lo tanto, en la presente invención se desarrolla una nueva estrategia de agitación en dos fases para obtener la máxima producción de xilitol con una formación significativa de biomasa.

La presente invención describe una condición de agitación variable a una tasa de aireación constante, donde en las primeras 24 horas se favorece el crecimiento celular manteniendo una mayor tasa de agitación de 500 rpm. La última fase se mantiene a 400 rpm para inducir la acumulación de xilitol sobre la biomasa. El nuevo enfoque comunicado en la presente invención ayuda a equilibrar la demanda de oxígeno para inducir la acumulación de xilitol junto con el crecimiento celular requerido. La nueva estrategia de agitación en dos fases requiere la necesidad de un procedimiento 'discontinuo seguido de continuo', en donde la fase I utilizada tiene un papel importante para llevar a las células a su fase altamente productiva, y la fase II posterior facilita la fermentación continua altamente productiva al mantener las células en su forma activa.

El procedimiento descrito en la presente invención se efectúa en modo discontinuo durante 65-75 horas iniciales de fermentación y más tarde se efectúa en modo continuo con una productividad 1,34 veces mayor que en el modo discontinuo solo. El tiempo de residencia óptimo para el modo discontinuo es de 65 horas, mientras que el del modo continuo es de 52 horas. La tasa de dilución óptima a la que se efectúa el sistema de purga continua de células es de 0,02/hora.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando Candida tropicalis (NRRL 12968), en una medida que sea capaz de fermentar el azúcar pentosa a mayor tasa y que se pueda lograr utilizando distintas cepas de la misma especie. Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para la biotransformación de xilosa a xilitol con un procedimiento rentable y de alto rendimiento, en donde puede utilizarse una concentración más alta de xilosa para la producción comercial de xilitol, con una mejor economía.

Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando Candida tropicalis con una mayor concentración inicial de sustrato, mejor conversión y rendimiento molar/gramo, y aumentar la productividad global del procedimiento para alcanzar los niveles necesarios para un procedimiento comercial.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para la producción de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa con un procesamiento aguas abajo rentable que pueda reducir el coste de fabricación.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para proporcionar un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilitol con una condición de reacción suave y ambientalmente benigna.

Una de las realizaciones de la presente invención proporciona un procedimiento para la fermentación microbiana de biomasa que contiene xilosa a xilitol, en donde dicho procedimiento comprende el cultivo de una cepa de levadura capaz de convertir xilosa en xilitol en un medio sólido; la inoculación de la cepa de levadura obtenida en la etapa anterior en un fermentador de siembra que contiene medio de siembra; el cultivo de la cepa de levadura de la etapa anterior transfiriendo dicha cepa de levadura a un fermentador de producción que tiene un medio de producción que contiene xilosa; en donde la fermentación de dicha biomasa que contiene xilosa se lleva a cabo en modo discontinuo seguido de modo continuo, en donde

En otra realización de la presente invención, se proporciona la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando una cepa de levadura, en donde dicha cepa de levadura puede ser Candida tropicalis, que tiene el N.° de referencia NRRL 12968.

En otra realización más de la presente invención se proporciona un procedimiento para la bioconversión de xilosa en xilitol utilizando una cepa de levadura, en donde la concentración de xilosa utilizada puede estar en el intervalo del 20 35 % (p/v), preferentemente al 25 % (p/v), y la conversión de 250 g/l de xilosa en 175 g/l de xilitol puede ser en no más de 72 horas.

En otra realización de la invención se proporciona un procedimiento para la fermentación microbiana de biomasa que contiene xilosa a xilitol, en donde la composición del medio de siembra puede ser glucosa al 1% (p/v), Extracto de levadura al 0,3 % (p/v), extracto de malta al 0,3 % (p/v), peptona al 0,5 % (p/v).

En una de las realizaciones más preferidas de la presente invención, el crecimiento del cultivo de siembra se lleva a cabo en un matraz Erlenmeyer en una relación de volumen de 5 y autoclavado durante 20 minutos en condiciones convencionales, y después del autoclavado, los medios se inoculan con una cantidad optimizada de suspensión celular de Candida tropicalis.

En otra realización más de la presente invención, el inóculo de cultivo de siembra se puede hacer crecer a 30 °C y 275 rpm durante 18 horas con una densidad óptica de los medios de cultivo de siembra a las 18 horas de incubación, con una dilución de 20X, que puede alcanzar 0,6-0,7 unidades de DO.

En otra realización de la presente invención, el protocolo optimizado para preparar la suspensión celular puede formularse manteniendo las células de Candida tropicalis en agar MYGP a 4 °C, suspendiendo en agua destilada estéril para preparar una suspensión densa, añadiendo la suspensión celular a un medio de siembra autoclavado a una dilución precalculada para lograr una DO final de 0,1 a 0,2 unidades de DO a 640 nm.

En otra realización de la presente invención, el medio sólido utilizado para el crecimiento celular puede ser una placa de agar MYGP, que se compone de extracto de levadura 3 g/l, extracto de malta 3 g/l, bactopeptona 5 g/l, glucosa 10 g/l y agar 22 g/l.

En una de las realizaciones más preferidas de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando un cultivo de Candida tropicalis, en donde dicha biomasa puede ser hidrolizado de salvado de cereales que se selecciona del grupo que consiste en arroz y maíz, mazorca de maíz, paja de arroz, paja de trigo, pila de algodón, desechos de semillas oleaginosas, astillas de madera, biomasa lignocelulósica.

En otra realización más de la presente invención, el hidrolizado de salvado de cereales puede utilizarse como fuente principal de carbono.

En otra realización de la presente invención, la fuente de carbono utilizada puede ser hidrolizado de biomasa lignocelulósica que contiene xilosa junto con glucosa.

En otra realización de la presente invención, la fermentación puede realizarse en un medio de producción, en donde la concentración de xilosa está en el intervalo del 20-35 % (p/v), muy preferentemente del 25 % (p/v).

En otra realización más de la presente invención, el cultivo de siembra utilizado se puede hacer crecer durante no más de 18 horas de antigüedad de la inoculación, cuando el cultivo está en fase logarítmica, como se concluye en los estudios de curvas de crecimiento, lo que es un requisito obligatorio para una alta productividad de xilitol.

En otra realización más de la presente invención, la densidad celular óptima equivalente a 0,67 g/l (p/v) de concentración celular obtenida en el fermentador de siembra puede transferirse al fermentador de producción a la concentración optimizada del 3,33 %.

En una de las realizaciones de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa, en donde la composición del medio de producción puede ser xilosa equivalente al 20-35 % (p/v), obtenida a partir de hidrosilato de biomasa, glucosa al 5-15 % (p/v), extracto de levadura al 2,5-7,5 % (p/v), peptona al 5-15 % (p/v) y sales que comprenden KH2PO4 al 0,2-1 %, MgSO4.7H2O al 0,2-1 %, (NH4)2SO4 al 0,2-1 %.

La fermentación se lleva a cabo en modo discontinuo seguido del modo continuo.

En otra realización más de la presente invención, la fermentación microbiana se puede llevar a cabo a una temperatura en el intervalo de 28-32 °C, muy preferentemente a 30 °C, y a un pH en el intervalo de 5-7, muy preferentemente de 5,5 a 6,0.

En otra realización de la presente invención, la fermentación microbiana puede realizarse a una tasa de aireación en el intervalo de 0,1 a 0,5 vvm, muy preferentemente de 0,2 vvm.

En una de las realizaciones más preferidas de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de xilosa, en donde la fermentación puede realizarse a una velocidad de agitación de 500 rpm durante las 0-24 horas iniciales de fermentación en modo discontinuo, lo que favorece el crecimiento celular; y de 400 rpm durante las siguientes 24-72 horas de fermentación en modo discontinuo, muy preferentemente 41-72 horas, para la acumulación de xilitol, y adicionalmente se mantiene constante en modo continuo hasta la cosecha final de la fermentación.

En otra realización de la presente invención, la fermentación se puede llevar a cabo durante aproximadamente 60-72 horas para el modo discontinuo, muy preferentemente durante 65 horas, y para el modo continuo después de 65 horas aproximadamente del modo por lotes.

En otra realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando Candida tropicalis, en donde el procedimiento comprende retirar la cepa de levadura del medio de producción y reciclarla para una fermentación continua que da como resultado una producción continua de xilitol.

En otra realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa utilizando una cepa de levadura, en donde la tasa de dilución óptima para el modo continuo del procedimiento puede estar en el intervalo de 0,015-0,025/lit., muy preferentemente de 0,02/lit. En otra realización más de la presente invención, el tiempo de residencia óptimo para la fermentación en modo continuo puede estar en el intervalo de 46-65 horas, muy preferentemente 52 horas.

En otra realización más de la presente invención, la productividad óptima de la fermentación en modo mixto nueva puede estar entre 1,8-2,5 gramos/litro/hora, muy preferentemente es de 1,87 gramos/litro/hora para el modo discontinuo; y de 2,5 gramos/litro/hora para el modo continuo de la fermentación global.

En una realización de la presente invención, la tasa de crecimiento de las células se puede mantener en una fase logarítmica constante mediante la purga continua de las células a una tasa de dilución y un tiempo de residencia de la xilosa optimizados durante el modo continuo, mientras que la concentración de sustrato se mantiene constante durante todo el proceso.

En otra realización de la presente invención, las células pueden purgarse continuamente junto con el caldo, manteniendo su fase logarítmica activa.

En otra realización de la presente invención, el consumo de sustrato xilosa y la formación del producto puede controlarse mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (presión) equipada con una columna de exclusión iónica Biorad Aminex HPX-87H. Por tanto, la densidad celular seca se estima mediante la curva de calibración preparada midiendo la densidad óptica a 640 nm y el peso celular seco.

En otra realización de la presente invención, el rendimiento global del producto puede ser del 65-70 %, más preferentemente del 65 %.

Ventajas:

1) La presente invención proporciona un procedimiento que implica fermentación en modo discontinuo seguido de un modo continuo, lo que es más económico que el procedimiento discontinuo y/o continuo solo.

2) El nuevo enfoque comunicado en la presente invención ayuda a equilibrar la demanda de oxígeno para inducir la acumulación de xilitol junto con el crecimiento celular requerido.

3) La presente invención proporciona una nueva estrategia de agitación en dos fases para obtener la máxima producción de xilitol con una formación significativa de biomasa.

4) La presente invención proporciona un procedimiento para la recuperación y el reciclado de microorganismos que hace que el procedimiento sea rentable y económicamente viable.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención y permitirán que otros expertos en la materia la comprendan más completamente. Se debería entender, sin embargo, que la invención no se limita únicamente a los ejemplos particulares que se proporcionan a continuación.

EJEMPLO 1

Se cultivó Candida tropicalis NRRL 12968 en una placa de agar MYGP que contenía extracto de levadura 3 g/l, extracto de Malta 3 g/l, Bactopeptona 5 g/l, Glucosa 10 g/l y Agar 22 g/l. A continuación, se inoculó la cepa de levadura en un medio de siembra que contenía extracto de levadura 3 g/l, extracto de Malta 3 g/l, Bactopeptona 5 g/l y Glucosa 10 g/l, de pH 6,0. Se inoculó un 3,33 % cultivo de siembra cultivado durante 18 horas en un medio de producción. El medio de producción contiene xilosa equivalente al 20 % (p/v) obtenida de hidrolizado de salvado de maíz, glucosa al 1 % (p/v), extracto de levadura al 0,5 % (p/v), peptona al 1 % (p/v) y sales, KH2PO4 al 0,05 %, MgSO4.7H2O al 0,05 %, (NH4)2SO4 al 0,05 %. El medio se ajustó a un pH de entre 5,5-6,0. La temperatura del fermentador se mantuvo a 30 °C. Se mantuvo en el fermentador una tasa de aireación de 0,2 vvm. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente comprendida por, 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 42 horas. Se continuó la fermentación durante 66 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. Al final de las 66 horas, se añade continuamente medio fresco con xilosa al 20 % a una tasa de dilución de 0,02/hora con un tiempo de residencia eficaz de 52 horas. Al mismo tiempo, se eliminan continuamente las células junto con el producto a un caudal igual al caudal de adición de xilosa. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 175 g/l a partir de 250 g/l de xilosa, al 98 % de conversión.

EJEMPLO 2

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 utilizando hidrolizado de biomasa lignocelulósica como fuente de xilosa. El hidrolizado de biomasa lignocelulósica contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente comprendida por, 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 42 horas. Se continuó la fermentación durante 70 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. Al final de las 70 horas, se añade continuamente medio fresco con xilosa al 20 % a una tasa de dilución de 0,015/hora con un tiempo de residencia eficaz de 64 horas. Al mismo tiempo, se eliminan continuamente las células junto con el producto a un caudal igual al caudal de adición de xilosa. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 130 g/l a partir de 194 g/l de xilosa, al 97 % de conversión.

EJEMPLO 3

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 utilizando hidrolizado de salvado de arroz como fuente de xilosa. El hidrolizado de salvado de arroz contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente comprendida por 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 42 horas. Se continuó la fermentación durante 70 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. Al final de las 70 horas, se añade continuamente medio fresco con xilosa al 20 % a una tasa de dilución de 0,025/hora con un tiempo de residencia eficaz de 47 horas. Al mismo tiempo, se eliminan continuamente las células junto con el producto a un caudal igual al caudal de adición de xilosa. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 130 g/l a partir de 200 g/l de xilosa, al 97 % de conversión.

EJEMPLO DE REFERENCIA 4

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 utilizando xilosa comercial al 20 % y glucosa de cosustrato al 1 %. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente de 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 42 horas. Se continuó la fermentación durante 68 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 142 g/l a partir de 196 g/l de xilosa, al 99 % de conversión.

EJEMPLO 5

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 en condiciones variables de RPM utilizando hidrolizado de mazorca de maíz y con todos los componentes del medio comunicados. El hidrolizado de mazorca de maíz contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente comprendida por 400 rpm durante 0-30 horas, 300 rpm durante 30-48 horas y 250 rpm durante 48-72 horas. Se continuó la fermentación durante 72 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAd Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 117 g/l a partir de 200 g/l de xilosa, al 98 % de conversión. EJEMPLO DE REFERENCIA 6

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 en condiciones fijas de RPM utilizando hidrolizado de salvado de maíz y con todos los componentes del medio comunicados. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación fija de 200 rpm. Se continuó la fermentación durante 166 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 141 g/l a partir de 220 g/l de xilosa, al 97 % de conversión.

EJEMPLO DE REFERENCIA 7

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 con un 2 % de inóculo utilizando hidrolizado de salvado de maíz como fuente de xilosa. El hidrolizado de salvado de maíz contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente de 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 24 horas. Se continuó la fermentación durante 48 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 61 g/l a partir de 205 g/l de xilosa, al 52 % de conversión.

EJEMPLO DE REFERENCIA 8

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 con un 10 % de inóculo utilizando hidrolizado de salvado de maíz como fuente de xilosa. El hidrolizado de salvado de maíz contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente de 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 42 horas. Se continuó la fermentación durante 66 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 97 g/l a partir de 187 g/l de xilosa, al 72 % de conversión.

EJEMPLO DE REFERENCIA 9

Se repite el protocolo descrito en el Ejemplo 1 con un equivalente de xilosa al 30 % utilizando salvado de maíz como fuente de xilosa. El hidrolizado de salvado de maíz contiene xilosa como azúcar pentosa principal junto con glucosa, que se utiliza como una fuente de carbono en la fermentación. Otros componentes de los medios, como el extracto de levadura, la bactopeptona y las sales, se añaden como fuente adicional de nutrientes. El pH del hidrolizado se ajustó entre 5,5 y 6. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C, a 0,2 vvm de caudal de aire constante. Se aplicó al fermentador la velocidad de agitación en gradiente de 500 rpm durante las 24 horas iniciales seguido de 400 rpm durante las siguientes 142 horas. Se continuó la fermentación durante 166 horas y se controló el consumo de sustrato y la formación de productos. El análisis se realizó mediante HPLC equipada con columna de exclusión iónica BIORAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) y utilizando detector RID (forma siglada de refractive index detector, detector de índice de refracción. La concentración celular se controló mediante el método de turbidometría a 640 nm en un espectrofotómetro. El xilitol obtenido fue de 191 g/l a partir de 298 g/l de xilosa, al 97 % de conversión.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la producción microbiana de xilitol a partir de biomasa que contiene xilosa que comprende: a) el cultivo de una cepa de levadura capaz de convertir xilosa en xilitol en un medio sólido;

b) la inoculación de la cepa de levadura obtenida de la etapa (a) en un fermentador de siembra que contiene medio de siembra; y

c) el cultivo de la cepa de levadura de la etapa (b) transfiriendo dicha cepa de levadura a un fermentador de producción que tiene medio de producción que contiene xilosa; en donde la fermentación de dicha biomasa que contiene xilosa se lleva a cabo en modo discontinuo seguido de modo continuo, en donde

d) en el modo continuo, la cepa de levadura se retira de dicho medio de producción; y el producto de xilitol se retira continuamente de dicho medio de producción a un caudal y se añade continuamente medio de producción fresco al fermentador de producción al mismo caudal, para la producción continua de xilitol.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde la biomasa se selecciona de un grupo que comprende salvado de cereales, arroz, maíz, mazorca de maíz, paja de arroz, paja de trigo, pila de algodón, desechos de semillas oleaginosas, astillas de madera, bagazo, biomasa lignocelulósica o hidrolizados de los mismos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la biomasa es biomasa lignocelulósica enriquecida en polímero de azúcar pentosa, hidrolizados de pentosa y/o fracción enriquecida de hemicelulosa procedente de desechos de la industria papelera y/o xilosa comercial.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se lleva a cabo en un medio de producción, en donde la concentración de xilosa está en el intervalo del 20-35 % (p/v), muy preferentemente del 25 % (p/v).

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha cepa de levadura es Candida tropicalis.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha cepa de levadura es Candida tropicalis que tiene el N.° de referencia NRRL 12968.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde la cepa de levadura se cultiva a 30 °C y 275 rpm durante 18 horas.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 28-32 °C, muy preferentemente a 30 °C.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 5,0 a 7, muy preferentemente de 5,5 a 6,0.

10. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se realiza a una tasa de aireación en el intervalo de 0,1 a 0,5 vvm, muy preferentemente de 0,2 vvm.

11. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se realiza a una velocidad de agitación de

i. 500 rpm durante las 0-24 horas iniciales de fermentación en modo discontinuo;

ii. 400 rpm durante las siguientes 41-72 horas de fermentación en modo discontinuo; y se mantiene constante en modo continuo hasta la cosecha final de la fermentación.

12. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se lleva a cabo durante 60-72 horas para el modo discontinuo, muy preferentemente durante 65 horas.

13. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha fermentación se efectúa en modo continuo después de 65 horas de modo discontinuo.

14. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde el tiempo de residencia óptimo para la fermentación en modo continuo está en el intervalo de 46-65 horas, muy preferentemente 52 horas.