CN108485989B - 一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，属于微生物技术领域。本发明的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)已于2018年02月05号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15385。本发明提供了一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，通过此方法修复重金属镉污染土壤具有经济高效、不造成二次污染、美化景观等的优势。

Description

一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法
技术领域
本发明涉及一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
近现代以来，随着工业和农业的迅速发展，重金属也被越来越广泛地使用，随之而来的污染问题也越发凸显。土壤作为重金属污染物最大的容纳场所，使得土壤重金属污染成为全球性的环境问题之一。因此，土壤重金属污染，尤其是农田土壤重金属污染急需防治与修复。
土壤中镉的来源主要是铅镉矿的开采和冶炼，以及电镀行业工业“三废”的排放。目前，中国耕地受镉、镉等重金属污染的面积约占耕地总面积的1/5。土壤中镉过量会导致土壤退化，影响植物生长，造成作物减产，镉被植物富集后会通过食物链最终在人体内积累，危害人类健康，引起人类呕吐、腹泻、厌食等消化道症状，并引发人类贫血等其他症状。
因此，土壤质量是农产品安全生产的第一道防线，做好土壤中重金属污染的防治与修复工作具有重要的意义。然而，土壤中的重金属污染具有潜伏性、不可逆性、长期性以及广泛性，且不能通过生物降解去除，只能发生位置迁移和各种形态之间相互转化。
目前，对于重金属污染土壤的修复方法主要包括物理法、化学法和生物法三种。传统的物理化学修复方法通过各种物理过程或向土壤中添加改良剂、抑制剂等实现土壤中重金属的去除或者钝化，包括客土法、土壤淋洗、电动修复、电热修复、稳定化/固化等，这些技术不仅成本较高、破坏土壤结构，容易引起土壤肥力下降，还有可能导致二次污染。
近年来，研究较多的生物修复技术因其投资少、成本低、对土壤环境扰动小、不引起二次污染等特点而备受关注，其中利用植物吸收重金属被认为是解决土壤重金属污染的理想方法之一，龙葵就是其中一种超积累植物，能够吸收、富集和转移重金属镉，是一种具有良好修复能力的植物资源。
但是，目前已发现的可用于土壤生物修复的植物受到地理条件、气候条件的限制，通常生物量较小、生长缓慢，因而大大影响了它们修复重金属污染土壤的潜力。
发明内容
本发明提供了一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，通过此方法修复重金属镉污染土壤具有经济高效、不造成二次污染、美化景观等的优势。本发明通过在镉污染土壤中种植龙葵，并在其根部接种可用于修复镉污染土壤的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)，使得重金属镉在龙葵中富集，等到龙葵成熟之后，将龙葵整体移走，从而实现去除土壤中的重金属镉污染物的目的。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种用于修复镉污染土壤的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)，所述聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)于2018年02月05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.15385。
本发明提供了上述用于修复镉污染土壤的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)在治理镉污染方面的应用。
本发明提供了一种利用聚多曲霉菌修复镉污染土壤的方法，包含如下步骤：
步骤1：在镉污染土壤中种植龙葵；
步骤2：在龙葵根系接种耐镉微生物；
步骤3：在一批龙葵生长成熟后重复步骤1、2的操作，直至土壤中的镉含量低于0.2mg/kg；
所述耐镉微生物为聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)；所述聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii) 于2018年02月05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15385。
在本发明的一种实施方式中，将所述龙葵种植在镉污染土壤中，控制土壤含水率保持在 55-65％。
在本发明的一种实施方式中，将所述龙葵种植在镉污染土壤中，种植方式为露天栽培。
在本发明的一种实施方式中，所述接种为在龙葵根系接种密度不低于1×106CFU/g的聚多曲霉菌。
在本发明的一种实施方式中，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为 1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
在本发明的一种实施方式中，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为 1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述喷洒菌悬液为将菌悬液喷洒到龙葵表面。
本发明提供了上述利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法在治理镉污染方面的应用。
有益效果：
(1)本发明提供的这种聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)对镉具有高耐受性，Cd2+对该菌的最小抑制浓度(MIC)为1500mg/L；
(2)使用本发明提供的这种方法修复镉污染土壤，可显著促进土壤中难溶态镉的溶解，增加土壤中有效态镉含量，将本发明的菌接种于龙葵根系后，可使得土壤中有效态镉浓度增加3.3％-18.1％；
(3)使用本发明提供的这种方法修复镉污染土壤，可显著增加龙葵对土壤中重金属镉的富集与吸收，提高龙葵对镉的提取效果，使得龙葵中地上部镉浓度提高8.2％-17.6％，地下部镉浓度提高19.3％-24％，龙葵总镉吸收量增加28.4％-29.5％；
(4)本发明提供的这种修复镉污染土壤的方法具有实践性强、高效安全、不破坏土壤结构和性质、不引起二次污染，美化环境等优点，应用前景广泛。
生物材料保藏
一种聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)，分类命名为：聚多曲霉，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.15385，保藏日期为：2018年02月05日。
附图说明
图1本发明菌株对碳酸镉的溶解性。
图2不同镉浓度下本发明菌株对土壤中有效态镉含量的影响。
图3接种本发明菌株对龙葵地上部镉吸收量的影响。
图4接种本发明菌株对龙葵地下部镉吸收量的影响。
图5接种本发明菌株对龙葵总镉吸收量的影响。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。
本发明菌株对碳酸镉的溶解性检测：
以菌悬液的形式接种到LB液体培养基(胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g，去离子水1000mL)中，培养基中加入500mg/L的碳酸镉，每个浓度设置3个盆栽，在28℃摇床中振荡培养60h，每隔12h测定溶液pH，然后取10mL样品在12000r/min下离心10min，用火焰原子吸收分光光度计测定上清液中Cd的含量。
土壤中有效态镉含量的检测方法：
盆栽植株取样后，挖取原根际周围的土壤样品，风干后过60目尼龙筛，按土液比1:10 的比例加入0.1mol/LHCl提取剂，利用火焰原子吸收分光光度计测定土壤中的有效态镉含量。
龙葵镉吸收量的检测方法：
每盆植物进行混合取样，沿土面剪下，分为地上和地下两部分，蒸馏水洗净并用吸水纸吸干，然后放置于105℃烘箱内杀青0.5h，65℃烘至恒重，将烘干后各部分样品粉碎，各取 0.2g样品，加入硝酸和高氯酸(4:1，v:v)混合酸，进行微波消解，采用火焰原子吸收分光光度计测定地上和地下部分的Cd浓度。
龙葵总镉吸收量的检测方法：
植物各部分镉含量乘以植物各部分干重再相加即可以得到总镉吸收量。
下述实施例中的菌株，均为从污染土壤中筛选得到的聚多曲霉菌(Aspergillussydowii)，此聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)已于2018年02月05号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15385。
实施例
具体实施步骤如下：
(1)在土壤中分别加入0、0.0856、0.1713、0.3425g的CdCl2固体粉末，加水搅拌混匀，使土壤金属Cd浓度分别为0、28、56、112mg/kg，每个浓度设置3个盆栽，最后取平均值，模拟Cd污染土壤；
(2)土壤稳定后于121℃高温灭菌20min，冷却后进行装盆，每盆均装入Cd污染土壤1.5kg，每个浓度设置6盆分别作为接菌组和对照组，共24盆；
(3)分别在接菌组和对照组采用直播方式播种龙葵种子，每盆播种8颗种子，种子发芽后1周，进行间苗，每盆保留长势良好的5株幼苗；
(4)接菌组盆栽需播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒5mL浓度为1-4×108CFU/mL的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)菌悬液，对照组盆栽每次均加入等量无菌水；
(5)植株生长期间，保持自然通风，有足够的光照，每天早晚进行浇水，保证土壤湿润，控制土壤含水率保持在55-65％，龙葵成熟后收割植物。
本发明菌株对碳酸镉的溶解性检测结果如下：
本发明菌株对碳酸镉的溶解性可见图1。如图2所示：在12、24、36、48、60h的培养时间下，接种的培养基中水溶性Cd含量比未接菌组分别增加6.3％、21.3％、32.1％、41.0％、43.0％；同时，接种本发明菌株的培养基中pH逐渐降低，由最初pH7.4降低到pH6.1，然而未接菌组的培养基中pH值变化不大。说明本发明菌株不但具有高Cd耐受性，而且还对碳酸镉具有溶解性，这也为后边在土壤里溶解难溶态金属奠定了基础。
土壤中有效态镉含量的检测结果如下：
不同土壤镉浓度下，接种本发明的聚多曲霉菌对土壤有效态镉含量的影响可见图2。如图2所示：在28、56和112mg/kg金属浓度下，接菌组的土壤有效态镉浓度比对照组分别增加了18.1％，17.8％，3.3％。
土壤中的金属元素以不同的化学形态存在，不同化学形态的金属元素只有转化成有效态才能被植物所富集。有效态金属含量可以评价污染土壤的环境风险、生物有效性和毒性，因此研究金属有效态可以了解土壤污染状况。本发明的聚多曲霉菌联合龙葵在土壤中能够溶解难溶态镉，提高土壤有效态Cd含量。
龙葵镉吸收量的检测结果如下：
在不同镉浓度下接种本发明的聚多曲霉菌对龙葵镉吸收量的影响可见图3-4。如图3-4所示：在土壤Cd浓度为28、56mg/kg时，与对照组相比，接菌组的龙葵地上部Cd浓度分别提高8.2％、17.6％，地下部Cd浓度与对照组相比显著提高19.3％、24.0％，在本实验中发现，接种本发明的聚多曲霉菌的龙葵地上部和地下部Cd浓度均有不同程度增加，本发明的聚多曲霉菌可促进土壤难溶态镉的溶解，增加了土壤中有效态Cd浓度，提高了龙葵对镉的吸收富集。
龙葵总镉吸收量的检测结果如下：
接种本发明菌株对龙葵总镉吸收量的影响可见图5。如图5所示：在土壤Cd浓度为28、 56mg/kg时，接种本发明菌株的龙葵总镉吸收量比未接菌组分别提高29.5％、28.4％。说明本发明菌株可以显著提高龙葵对镉的总吸收量，该菌在处理低镉浓度中具有较好的修复效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (21)

1.一种用于修复镉污染土壤的聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)在治理镉污染方面的应用，其特征在于，所述聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)于2018年02月05号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15385。
2.一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤1：在镉污染土壤中种植龙葵；
步骤2：在龙葵根系接种耐镉微生物；
步骤3：在一批龙葵生长成熟后重复步骤1、2的操作，直至土壤中的镉含量低于0.2mg/kg；
所述耐镉微生物为聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)；所述聚多曲霉菌(Aspergillus sydowii)于2018年02月05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15385。
3.如权利要求2所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，将所述龙葵种植在镉污染土壤中，控制土壤含水率保持在55-65％。
4.如权利要求3所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，将所述龙葵种植在镉污染土壤中，种植方式为露天栽培。
5.如权利要求2所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为在龙葵根系接种密度不低于1×106CFU/g的聚多曲霉菌。
6.如权利要求3所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为在龙葵根系接种密度不低于1×106CFU/g的聚多曲霉菌。
7.如权利要求4所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为在龙葵根系接种密度不低于1×106CFU/g的聚多曲霉菌。
8.如权利要求2所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
9.如权利要求3所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
10.如权利要求4所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
11.如权利要求5所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
12.如权利要求6所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
13.如权利要求7所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液。
14.如权利要求2所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
15.如权利要求3所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
16.如权利要求4所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
17.如权利要求5所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
18.如权利要求6所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
19.如权利要求7所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述接种为将聚多曲霉菌菌种制备成浓度为1-4×108CFU/mL的菌悬液，分别在龙葵播种前和出苗后的第2、4、6周喷洒菌悬液5mL。
20.如权利要求8所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述喷洒菌悬液为将菌悬液喷洒到龙葵表面。
21.如权利要求14所述的一种利用聚多曲霉菌联合龙葵修复镉污染土壤的方法，其特征在于，所述喷洒菌悬液为将菌悬液喷洒到龙葵表面。
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