CN114570761B - 利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法。本发明通过将处于对数生长期的瓜里科州假单胞菌菌液接种至铀污染土壤中，在好氧条件下，该菌可以溶解土壤中的缓释磷，并将磷酸根富集在菌细胞周围，吸引土壤中的铀酰离子，并诱导形成生物惰性的磷酸铀酰类矿物沉淀，阻断土壤可交换态铀(主要指铀酰离子)向作物的迁移行为，从而达到土壤铀污染修复与安全利用的目的。本方法具有原位修复工艺简单、操作方便、成本低、效果快、无二次污染、不破坏土壤结构、农作物不减产等优点，适用于中低浓度铀污染的农田土壤修复场地。

Description

利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法
技术领域
本发明涉及一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿过程修复农田表层土壤铀污染的方法，属于土壤重金属污染修复技术领域。
背景技术
铀矿或富铀煤炭开采和冶炼过程会产生大量含铀废水、废渣，污染周边土壤，影响作物生长和粮食安全，危害人类健康。
目前，已经有许多铀污染土壤的修复方法，包括物理修复、化学修复和生物修复。物理方法主要有客土法、土壤淋洗等，这类方法成本普遍较高，适用于修复高浓度、小面积的铀污染土壤，对于地区性的、面积广而浓度低的铀污染土壤修复不具有经济性。化学修复主要是向污染土壤中加入钝化剂提升土壤自身的吸附和沉淀作用，从而降低土壤中铀的生物可利用性，减少污染物迁移，一定程度上可以改变土壤铀污染问题，但化学钝化剂存在破坏土壤理化性质、修复效果持久性差等问题。微生物修复土壤铀污染的方法主要包括生物吸附和生物成矿。生物吸附对铀的吸附钝化有不错的效果，但是环境中大量存在的其他阳离子会竞争吸附位点，而且细胞凋亡或分散后吸附的铀会被重新释放，难以真正应用到铀污染场地。而生物成矿具有修复效率高、成本低、操作简单等特点，已被应用于铀污染的场地修复。其中，铀的生物还原成矿方法仅适用于厌氧环境，在有氧或存在硝酸盐的环境中，铀难以被生物还原成低价铀的矿物(如沥青铀矿)。
综上所述，大面积而低浓度有氧表层土壤中的铀污染需要寻求一种经济、高效且稳定的修复方法。本发明提出了一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿过程修复土壤铀的方法，可低成本、高效率地修复表层土壤铀污染。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿过程修复土壤铀污染的方法。
为了实现上述发明目的，本发明所用的具体技术方案如下：
一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，该方法以经过耐铀驯化的瓜里科州假单胞菌(Pseudomonas guariconensis)菌液作为修复菌剂，以磷酸钙(Ca3(PO4)2)作为缓释磷源，将修复菌剂和缓释磷源均匀施加到待修复土壤中并保持土壤处于好氧环境，使修复菌剂通过生物成矿过程利用缓释磷源生成磷酸根并吸附土壤中的铀酰离子，从而形成生物惰性的磷酸铀酰类矿物沉淀，完成土壤铀污染的好氧修复。
作为优选，所述瓜里科州假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018653。
作为优选，所述瓜里科州假单胞菌的耐铀驯化方法如下：
在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5mL/dm2浓度为5～20mg U/L的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述瓜里科州假单胞菌的菌液，在30～35℃条件下好氧培养3～5天，挑取具有溶磷圈的菌落接种于LB培养基中，在30～35℃和150rpm条件下进行液体培养1天，获得中间菌液；在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5mL/dm2浓度为50～100mg U/L的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述中间菌液，继续在30～35℃条件下好氧培养3～5天，挑取具有溶磷圈的菌落接种于LB培养基中，在30～35℃和150rpm条件下进行液体培养1天，最终获得耐铀驯化后的瓜里科州假单胞菌菌液。
作为优选，所述修复菌剂和缓释磷源通过喷洒或旋耕方式施加到待修复土壤中。
作为优选，所述待修复土壤为深度0～20cm的农田表层土壤。
作为优选，所述缓释磷源的施用量为1～20g/kg，所述修复菌剂的施用量为5～50mL/kg且菌液浓度为OD600＝0.6～1.2。
进一步的，所述经过耐铀驯化的瓜里科州假单胞菌菌液采用处于对数生长期的菌液配制而成。
作为优选，所述待修复土壤所处的修复温度为20～35℃，土壤pH为6～8，土壤含水率维持在15～25％。
作为优选，所述待修复土壤通过洒水维持其土壤含水量。
作为优选，待修复土壤中施加修复菌剂和缓释磷源后，进行好氧修复的时长为7～14天。
相对于现有技术而言，本发明的主要优点如下：
(1)本发明将瓜里科州假单胞菌用于表层农田土壤铀污染的原位修复，与物理或化学方法相比，可大幅降低修复成本，并减少土壤结构破坏、农作物减产等副作用。
(2)本发明将土壤中生物易利用的铀酰离子解析后沉淀，并在瓜里科州假单胞菌的诱导下，形成生物惰性的磷酸铀酰类矿物，该矿物在土壤环境中非常稳定，其矿物晶格中的铀自然条件下不会再次释放，解决常规生物修复方法存在的重金属易二次释放、修复效果长效性差等问题。
(3)本发明提供的瓜里科州假单胞菌具有将土壤缓释磷(如磷酸钙等)转化为有效磷的能力，提高土壤磷肥利用率，具有增加作物产量的辅助作用。
具体实施方式
以下具体实施例用来进一步解释说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明的发明构思是通过将处于对数生长期的瓜里科州假单胞菌菌液接种至铀污染土壤中，在好氧条件下，该菌可以溶解土壤中的缓释磷，并将磷酸根富集在菌细胞周围，吸引土壤中的铀酰离子，并诱导形成生物惰性的磷酸铀酰类矿物沉淀，阻断土壤可交换态铀(主要指铀酰离子)向作物的迁移行为，从而达到土壤铀污染修复与安全利用的目的。下面通过具体实施例来展示本发明所能达到的技术效果。
本发明下述实施例所用的瓜里科州假单胞菌Pseudomonas guariconensis菌种保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018653，菌株名称：Pseudomonasguariconensis PP-d4，保藏日期：2018年9月25日，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。下述实施例中其余的试剂均可采用市售分析纯及以上的商业产品。
实施例
本实施例采用小白菜盆栽试验以验证瓜里科州假单胞菌生物成矿过程修复铀污染土壤的修复效果，具体如下：
(1)铀污染土壤的获取，具体如下：
采集某菜地表层土壤(0～20cm)，过2mm筛子，去除塑料、砾石、植物根等杂质。取上述土壤1.0kg，加入250mL 30mg U/L的硝酸铀酰溶液，并拌均匀。在通风阴凉处放置一个月进行老化稳定化，获得铀污染土壤。上述铀污染土壤中总U含量为25.04mg/kg，其中可交换态U占比为21.15％，土壤pH为7.5。
(2)瓜里科州假单胞菌的耐铀驯化，具体如下：
在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5mL/dm2低浓度(5mg U/L)的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述瓜里科州假单胞菌的菌液，在32℃条件下好氧培养5天，挑取具有明显溶磷圈(固体培养基中磷酸钙溶解后形成的透明圆圈)的菌落接种于LB培养基中，在32℃和150rpm条件下进行液体培养1天，获得中间菌液；在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5mL/dm2高浓度(100mg U/L)的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述中间菌液，继续在32℃条件下好氧培养5天，挑取具有明显溶磷圈的菌落接种于LB(Luria-Bertani)培养基中，在32℃和150rpm条件下进行液体培养1天，最终获得耐铀驯化后的瓜里科州假单胞菌菌液。
上述NBRIP固体培养基的配方为：1L去离子水，2.5g氯化钾，3g氯化钠，6g六水合氯化镁，20g琼脂粉。
上述LB液体培养基的配方为：1L去离子水，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠。
(3)菌株富集培养，具体如下：
将耐铀驯化后的瓜里科州假单胞菌菌液接种至新的LB培养基(配方与上一步中相同)中，在温度32℃和搅拌速率150rpm条件下，恒温摇床中培养10～15小时，获得处于生长对数期的菌液，最后通过生理盐水稀释上述菌液OD600为1.0，用于进行后续土壤修复。
(4)土壤修复，具体如下：
取两份步骤(1)获得的铀污染土壤，每份400g。其中一份作为实验组的铀污染土壤，实验组铀污染土壤中添加2g Ca3(PO4)2作为外加缓释磷源，并通过均匀喷洒方式接种20mL步骤(3)获得的菌液。另一份作为对照组的铀污染土壤，对照组铀污染土壤中添加2gCa3(PO4)2作为外加缓释磷源，并通过均匀喷洒方式加入20mL去离子水，不接种菌液。将上述两组土壤均放置于25℃条件下，土壤与大气接触保持好氧状态，静置修复14天，期间通过洒水维持土壤含水率为20％。
结果显示，修复14天后，对照组土壤中可交换态U含量从7.03mg/kg下降至4.90mg/kg，降低率为30.3％，可交换态U的占比从21.15％下降至17.13％，降低了4.02％。修复14天后，实验组土壤中可交换态U含量从7.03mg/kg下降至2.66mg/kg，降低率为62.2％，可交换态U占比从21.15％下降降低率为10.05％，降低了11.10％。
(5)小白菜盆栽试验，具体如下：
在经过上述步骤(4)修复14天后的土壤中，以大田作物施肥量的2倍施入氮肥+钾肥组成的底肥(以氮磷含量计，包含N：0.15g/kg，K：0.12g/kg)，其中所用氮肥为(NH4)2SO4，钾肥为K2SO4，不再额外施加磷肥。将小白菜种子用去离子水浸泡2小时，选择饱满种子，采用种子直播方式分别播种到两组土壤表层约1cm深处，每组土壤大约播种25粒种子。种子长出绿芽后控制日间光照12小时(8:00-20:00)、温度25℃、湿度80％，栽培30天。对照组和实验组均进行相同的栽培操作。
结果显示：对照组中小白菜根部U积累量为1.03mg/kg(鲜重)，实验组中小白菜根部U积累量为0.84mg/kg(鲜重)，降低了18.45％。对照组中小白菜叶子部分U积累量为0.16mg/kg(鲜重)，实验组中小白菜叶子部分U积累量为0.12mg/kg(鲜重)，降低了25.00％。无论是根部还是叶子部分，实验组中小白菜U含量低于《食品中放射性物质限制浓度标准(GB14882-1994)》中对蔬菜水果中天然铀的限制值1.5mg/kg。
需要注意的是，上述实施例中，铀污染土壤是通过采集表层土壤后进行异位修复的，假如需要对农田表层土壤进行原位修复，则可以将修复菌剂和缓释磷源通过旋耕方式施加到土壤中，以便于进行好氧修复。在该修复过程中，具体的修复菌剂和缓释磷源用量以及其他的控制参数可以根据实际进行优化，上述实施例仅给出了一种较佳选择。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1. 一种利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，以经过耐铀驯化的瓜里科州假单胞菌（Pseudomonas guariconensis）菌液作为修复菌剂，以磷酸钙（Ca3(PO4)2）作为缓释磷源，将修复菌剂和缓释磷源均匀施加到待修复土壤中并保持土壤处于好氧环境，使修复菌剂通过生物成矿过程利用缓释磷源生成磷酸根并吸附土壤中的铀酰离子，从而形成生物惰性的磷酸铀酰类矿物沉淀，完成土壤铀污染的好氧修复；
所述瓜里科州假单胞菌的耐铀驯化方法如下：
在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5 mL/dm2 浓度为5~20 mg U/L的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述瓜里科州假单胞菌的菌液，在30~35℃条件下好氧培养3~5天，挑取具有溶磷圈的菌落接种于LB培养基中，在30~35℃和150 rpm条件下进行液体培养1天，获得中间菌液；在灭菌NBRIP固体培养基表面滴加0.5 mL/dm2 浓度为50~100 mg U/L的硝酸铀酰溶液，涂布干燥后，再在固体培养基上接种并划线稀释所述中间菌液，继续在30~35℃条件下好氧培养3~5天，挑取具有溶磷圈的菌落接种于LB培养基中，在30~35℃和150 rpm条件下进行液体培养1天，最终获得耐铀驯化后的瓜里科州假单胞菌菌液。
2. 根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述瓜里科州假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No: M2018653。
3.根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述修复菌剂和缓释磷源通过喷洒或旋耕方式施加到待修复土壤中。
4. 根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤为深度0~20 cm的农田表层土壤。
5. 根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述缓释磷源的施用量为1~20 g/kg，所述修复菌剂的施用量为5~50 mL/kg且菌液浓度为OD600=0.6~1.2。
6.根据权利要求5所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述经过耐铀驯化的瓜里科州假单胞菌菌液采用处于对数生长期的菌液配制而成。
7.根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤所处的修复温度为20~35℃，土壤pH为6~8，土壤含水率维持在15~25%。
8.根据权利要求7所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤通过洒水维持其土壤含水量。
9.根据权利要求1所述的利用瓜里科州假单胞菌生物成矿修复土壤铀污染的方法，其特征在于，待修复土壤中施加修复菌剂和缓释磷源后，进行好氧修复的时长为7~14天。
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