CN105670955B

CN105670955B - 一种苍白杆菌mgj11及利用其固定土壤重金属镉的方法

Info

Publication number: CN105670955B
Application number: CN201510662761.8A
Authority: CN
Inventors: 余秀梅; 李杨昕; 李艳梅; 康夏; 陈强; 辜运富; 陈翠平; 谢雨歆; 崔永亮
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2035-10-14
Also published as: CN105670955A

Abstract

本发明涉及微生物及环境治理技术领域，具体公开了一种苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)MGJ11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月16日，保藏编号为CGMCC No.11385。本发明还公开了利用所述苍白杆菌MGJ11固定土壤重金属镉的方法，具体为将所述苍白杆菌施入植物根际，或利用所述苍白杆菌菌粉拌种后进行种植，使接种的微生物浓度不小于10⁹菌细胞/植株。

Description

一种苍白杆菌MGJ11及利用其固定土壤重金属镉的方法

技术领域

本发明涉及微生物及环境治理技术领域，具体地说，涉及一种苍白杆菌MGJ11及利用其固定土壤重金属镉的方法

背景技术

农田污灌、固体废弃物施用、化肥农药的大量使用以及矿山开采与冶炼等人类活动，导致土壤受重金属污染越来越严重。其中镉(Cd)污染尤为明显(江春玉等，一株铅镉抗性菌株WS34的生物学特性及其对植物修复铅搞污染土壤的强化作用[J].环境科学学报2008,28(10).1961-1968)。镉是对植物和人体毒性较大的重金属元素之一。长期接触一定剂量的镉会造成肾脏损害，进而导致骨质疏松和软化，严重的能导致癌症病发。由于镉的污染面积广，进入土壤后主要累积于土壤表层，很少向下迁移，并且具有较高的生物有效性(刘俊，等，镉胁迫下大豆生长发育的生理生态特征[J].生态学报，2010(2):333-340.)，因此易被农作物吸收富集。不仅影响植物的生长和发育，造成产量的下降，还能通过生物链的扩散，转移到农产品中，最终进入食物链，危及人体健康(Ding P，Zhuang P，Li Z，etal.Accumulation and detoxification of cadmium by larvae of Prodenialitura(Lepidoptera:Noctuidae)feeding on Cd-enriched amaranth leaves[J].Chemosphere，2013，91(1):28-34.)。

近年来我国镉污染事件层出不穷，例如，2009年8月的湖南浏阳镉污染；2011年9月的云南曲靖镉污染；2012年1月的广西龙江镉污染。(余德彪等，中国镉资源现状分析及可持续发展建议[J].中国矿业，2015，4:002.)。我国有关农田土壤镉污染的调查工作是20世纪70年代中期开始的，但至今没有人能够给出一个全面明确的结论。1980年中国农业环境报告显示，我国农田土壤镉污染面积为9333hm²，随后有人提出镉污染面积为13333hm²(崔力拓等，我国农田土壤镉污染现状及防治对策[J].现代农业科技，2006(11S):184-185.)，最近又有新的资料显示，我国农田土壤镉污染面积已超过20×10⁴hm²，每年生产镉含量超标的农产品达14.6×10⁸kg。在我国，有些镉污染地区已经出现了镉污染所致慢性早期健康危害的个体，甚至出现了疑似“痛痛病”的患者(柳絮等，我国土壤镉污染及其修复研究[J].山东农业科学，2008(6):94-97.)。镉与土壤环境密切相关，因此，减轻植物富集重金属镉对其造成的危害，改善农业生态环境亟不可待。

近年来，土壤酸化加剧使得一些粮食作物吸收镉的量增多，如：“镉大米”，植物富集较多的镉将通过食物链传递到人体，影响人类身体健康。因此，在农田生产系统中，植物修复镉污染土壤或有效利用镉含量稍多农田栽种农作物的关键点在于减少植物对镉的吸收和富集以及通过促生作用增强植物耐逆性。环境友好型的生物修复因其成本低廉、对环境无二次污染因而受到了越来越多的关注(Prapagdee B，Chanprasert M，MongkolsukS.Bioaugmentation with cadmium-resistant plant growth-promoting rhizobacteriato assist cadmium phytoextraction by Helianthus annuus[J].Chemosphere，2013，92(6):659-666.)。在耕地面积短缺的情况下，土地污染与浪费问题相对严重，许多含有重金属的农地仍然担负着生产农副产品的重任，且由于土壤酸化导致土壤中有效镉的增多，这使得农作物极有可能在土壤Cd浓度偏高的情况下富集较多的镉。

因此，选择能促进植物在镉污染土壤中生长、耐受重金属镉能力较强且具有较高利用价值的生物修复方式，不仅是建立高效稳定修复方法的关键要素，也是土地资源合理利用的有效途径。微生物固定就是其中一种有效治理土壤重金属污染的生物修复技术。主要利用植物根系、土壤微生物将土壤中重金属转变成有效性较低的形态，从而降低重金属在土壤中的移动性和生物可利用性，减少其对植物的毒性(常学秀，施晓东，王焕校.利用生物固定土壤重金属的机理及在农产品安全中的应用[J].生态学杂志，2003，22:88-93)。微生物固定由于显效时间快、利用率高，对土壤重金属污染防治和保障农产品安全具有重要意义。

近年来，生物修复方法对镉污染土壤进行修复的相关研究已有报道，但只集中于研究其对镉的富集作用，对于生物固定重金属镉的研究还较少，特别是如何利用微生物增强粮食作物耐受镉污染能力的研究鲜有报道。根际细菌是一些大量聚集在根系周围生长繁殖的微生物，能将有机物转变为无机物，为植物提供有效的氮磷养料；同时，微生物还能分泌维生素、生长刺激素等，促进植物生长。反过来，植物根系分泌物也能为细菌的生长提供所需糖类物质。植物从这些相互作用中获得了更多的营养，也获得了某些对逆境的忍耐能力(Gamalero E，Lingua G，Berta G，et al.Beneficial role of plant growthpromoting bacteria and arbuscularmycorrhizal fungi on plant responses toheavy metal stress.Can J Microbiol，2009，55(5):501-514.)。有证据表明其中一些根际细菌可以提高宿主植物的抗逆性，尤其是对重金属(Ajungla T，Sharma GD，DkharMS.Heavy metal toxicity on dehydrogenase activity on rhizospheric soil ofectomycorrhizal pine seedlings in field condition.J Environ Biol，2003，24(4):461-463.)。在根际细菌中，植物根际促生细菌(PGPR)是一类能够显著促进植物生长的细菌，由于能分泌一种植物生长激素3-吲哚乙酸(IAA)，在植物体内合成并能调控植物生长发育，比如细胞分裂和伸长以及新器官的分化和形成(

E，Evangelou M W，Robinson BH，et al.Effects of indole-3-acetic acid(IAA)on sunflower growth and heavymetal uptake in combination with ethylene diamine disuccinic acid(EDDS)[J].Chemosphere，2010，80(8):901-907.)，对植物的生长发育和生理生化有着重要影响(周建民，党志，陈能场，等.3-吲哚乙酸协同螯合剂强化植物提取重金属的研究[J].环境科学，2007，28(9):2085-2088)。因此充分利用PGPR对植物的促进作用以及对重金属的固定作用，既能减轻重金属对于植物的迫害，并能在逆境下促进植物生长，使得植物产量提高，具有巨大的应用前景。目前，尚无将PGPR中的苍白杆菌应用于植物根部来修复镉污染土壤的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种苍白杆菌MGJ11及利用其固定土壤重金属镉的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种苍白杆菌，经鉴定为苍白杆菌属(Ochrobacterium sp.)，编号MGJ11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2015年9月16日，保藏编号为CGMCC No.11385。

所述菌株分离自攀枝花钒钛磁铁尾矿库边缘的大豆根系，其对镉有较强的耐受性且能分泌植物生长激素3-吲哚乙酸(IAA)。将该细菌接种的植物根际，其能产生植物生长激素IAA来促进植物生长、减少植物对土壤中Cd的富集以缓解镉对植物的胁迫作用，从而固定植物根际土壤中的镉，增强植物的耐逆性。

通过含有镉的牛肉膏蛋白胨液体培养基的摇培实验证明，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)对镉的最高耐受浓度为(120mg L^-1)，抑制其产生IAA的极限浓度为(100mg L^-1)。因此，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11表现出较强的促生性和重金属耐受性。

本发明还提供了含有所述苍白杆菌的菌剂。

本发明还提供了含有所述苍白杆菌的菌肥。

本发明进一步提供了所述苍白杆菌在固定土壤重金属镉方面的应用。

本发明还提供了利用所述苍白杆菌固定土壤重金属镉的方法，具体为：将所述苍白杆菌施入植物根际，或利用所述苍白杆菌菌粉拌种后进行种植，使接种的微生物浓度不小于10⁹菌细胞/植株。

进一步地，所述菌粉拌种包括以下步骤：取当年采集的成熟、饱满的植物种子，将菌粉加适量水调成菌浆粘附于种子表面，随拌随播，忌干燥和阳光直晒，超过48h应重新拌种。植物幼苗移栽后，要适时补充水分。

进一步地，将苍白杆菌施入植物根际可通过菌剂灌根或菌肥穴施的方式。

作为优选，通过菌剂灌根的方式将苍白杆菌施入植物根际。

进一步地，所述菌肥穴施包括以下步骤：将菌肥以底肥穴施施入土壤中，然后播种或移栽幼苗。或将菌剂与有机肥充分混合均匀后，以底肥穴施施入土壤中，然后播种或移栽幼苗。

进一步地，所述菌剂灌根包括以下步骤：待植物种植萌发后形成幼苗或直接移栽幼苗时，用水将苍白杆菌菌剂稀释，以灌根方式施于植物根系。

所述菌剂的培养方法为将菌种接种到色氨酸牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3gL^-1,蛋白胨10gL^-1,NaCl 5gL^-1,色氨酸0.5gL^-1,pH 7.0-7.2)在28℃条件下，保证充足的氧气，摇培5天后得到。

在本发明的具体实施方式中，选用大豆为例，施以根际促生菌来固定其根部土壤重金属镉，减少大豆对镉的吸收，来改善目前大豆易受镉影响的状况，增强大豆抗逆性，提高镉污染土地利用率，充分发挥大豆的经济价值。但本发明所述方法与应用并不限应用于此种植物。

本发明的有益效果在于：

本发明以促进植物生长以提高植物耐逆性并减少植物对重金属镉富集量为目的，从攀枝花钒钛磁铁尾矿库附近的大豆根系分离纯化获得产IAA量多且对镉耐受性较强的土著根际促生菌——苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)，并以大豆为例将该菌接种在含镉土壤中的大豆根系周围，结果证明苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)分泌出的植物生长激素IAA促进植物生长，减少植物对镉的吸收，减少镉对植株的危害，增强植株抗逆性。

本发明建立了一种稳定、高效、应用前景好且有应用价值的微生物固定重金属镉的方法，即利用苍白杆菌(Ochrobactrum sp.MGJ11)作为菌剂、菌肥和拌种的方式施入植物根际以固定植物根部土壤镉的修复方法，主要应用于工矿区以及土壤酸化导致有效镉增多农田系统。本发明施用的菌剂还具有显著的促生效果，将其接种的植物根际，能有效促进植物生长，减少植物对镉的富集，增强植物耐逆性，充分体现出了集促生和固定土壤Cd两种功能于一身的优势菌肥。这种方法应用于土壤酸化导致有效镉增多农田系统中，将有效地帮助植物降低农产品镉含量以提升农产品品质和产量；这种方法应用于工矿区的含镉土壤且能够帮助植物生长于非常恶劣的土壤环境中，将会改善工矿区生态环境、减少土地资源的浪费。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1含有苍白杆菌MGJ11的菌剂

由攀枝花钒钛磁铁尾矿库边缘的大豆根系分离得到菌种，发现其对镉有较强的耐受性且能分泌植物生长激素3-吲哚乙酸(IAA)。将该细菌接种的植物根际，其能产生植物生长激素IAA来促进植物生长、减少植物对土壤中Cd的富集以缓解镉对植物的胁迫作用，从而固定植物根际土壤中的镉，增强植物的耐逆性。

该菌种经鉴定为苍白杆菌属(Ochrobacterium sp.)，编号MGJ11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2015年9月16日，保藏编号为CGMCC No.11385。

将该菌种接种到色氨酸牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3gL^-1,蛋白胨10gL^-1,NaCl 5gL^-1,色氨酸0.5gL^-1,pH 7.0-7.2)在28℃条件下，保证充足的氧气，摇培5天后得到。

其微生物浓度约为10⁹菌细胞/mL。

实施例2微生物固定土壤重金属镉及室内测试效果

将实施例1所述的菌剂稀释500倍。

以添加了重金属镉的蛭石为为土壤基质进行温室盆栽实验，将大豆栽种于含镉土壤中，将稀释后的菌剂喷洒到大豆幼苗根系周围土壤中，使微生物浓度为10⁹～10¹⁰菌细胞/植株，并以不接苍白杆菌(MGJ11)的大豆幼苗作为阴性对照，整个培养过程中补充含氮的营养液(KNO³,KH₂PO₄ 0.2gL^-1，KCl 0.5gL^-1，CaSO₄·2H₂O 0.2gL^-1，CaCO₃ 2gL^-1，MgSO₄·7H₂O0.2g，Fe·EDTA，H₃BO₃ 1mg L^-1，ZnSO₄·7H₂O1mg L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.5mg L^-1，MnCl₂·4H₂O0.5mg L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg L^-1)，每个处理三个重复(即种植三株)。温室培养条件为白天16小时(25℃)，夜晚8小时(17℃)，湿度为90％。38天后，收集大豆植株，并通过测定、分析不同处理大豆的生长指标和根的镉元素含量来评估其固定重金属镉的能力和在重金属镉胁迫下的生长情况，结果见表1。

表1大豆的生长指标

由表1可知，苍白杆菌(MGJ11)在不同浓度镉的胁迫下均能促进大豆生长。不含镉的土壤条件下，接种苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)的大豆茎长比未接种的对照CK增加了30.79％，根长增加了30.10％。因此，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)产生的植物生长激素IAA能有效促进大豆茎与根的伸长。在土壤镉浓度为20-100mg kg^-1的条件下，接种苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)的大豆与对照CK相比，茎长增量范围为0.63％-52.69％，镉浓度为40mg kg^-1时茎增量达到最大；根长增量范围为29.44％-161.43％，镉浓度为20mg kg^-1时根增量达到最大值。由此可见，在具有重金属镉的胁迫条件下，接种苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)能明显促进大豆根与茎的生长；尤其是在镉浓度较低条件下，其对大豆茎的促生长效果最佳，而对根的促进生长作用在所有试验浓度下都好。因此，接种具有产吲哚乙酸功能的苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)能明显促进大豆的生长，抵御重金属镉的迫害。同时，不论作物是否受到重金属的胁迫，都能有效发挥其促生功能。

从大豆生物量可以看出，在镉胁迫下接种苍白杆菌(MGJ11)能实现生物量的促进作用，但不同镉浓度下促进作用各不相同。大豆生物量增量范围为6.42～87.15％，尤其在土壤镉浓度为20mg kg^-1时，大豆生物量增量达到了87.15％。而土壤镉浓度为60mg kg^-1时，接种大豆的生物量略低于未接种大豆，原因可能是重金属浓度的增加会在一定程度上影响苍白杆菌(MGJ11)的促生效果，但接种该菌与未接种情况相比，仍旧可以更好地促进大豆根和茎的伸长。因此，在无镉和有镉土壤中，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)能够促进大豆生物量的积累，增加产量。

在含镉(20-100mg kg^-1)土壤中，大豆能有效存活，且生长情况良好，38天后植物根会富集到一定量的Cd(见表2)，而只有少量的Cd能够从根转移到茎内。在含有不同浓度镉的土壤中大豆根的富集量不同，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)能有效降低大豆根对镉的吸收，其吸收量的减小幅度为14.41～50.94％，尤其在土壤镉浓度为40mg kg^-1时效果最佳。因此，在镉的胁迫下，苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)能有效抑制植物根吸收土壤中的Cd，降低镉在大豆根部的积累量，减轻镉的毒害作用，缓减镉压力。

表2：大豆根的重金属含量

实施例3微生物固定土壤重金属镉及室外测试效果

以含镉工矿区土壤作为原位修复土壤，进行室外修复效果测试；并以大豆为修复植物，但不限制应用于此种植物。

在工矿区挖穴，丢施适量底肥后将大豆直接播种于工矿中覆土，种子浅播深度为距离土表1～2cm，待种子长出土面2～3cm，将菌剂稀释500倍后灌根，浓度为10⁹～10¹⁰菌细胞/株；根据大豆生长状况适时浇水追肥。

38天后，豆苗存活率为90％，生长良好，且明显看出接种苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)的大豆植株长势好于不接种的对照CK。采集大豆根洗净烘干后，测定植株株高、根长、干重以及根部和地上部分金属镉的含量，结果表明：接种苍白杆菌(Ochrobacterium sp.MGJ11)的植株与不接菌的对照CK相比，株高增加28.2％，根长增加32.5％，干重增加23.6％，根的Cd含量减少18.2％。

上述结果表明：用苍白杆菌(Ochrobactrum sp.MGJ11)作为菌剂的方式施入植物根际以固定植物根部土壤中镉离子的方式是一种高效、稳定且应用前景很好的生物修复技术，可应用于工矿区、含镉农田的镉固定中。该种方法的应用不局限于大豆，而可以应用于所有种植于含镉土壤中的植物，为遭受镉污染土壤的生物修复提供技术支持。同时，该方法的应用可提高镉污染土地资源的利用率，减少土地资源浪费，又发挥植物的经济价值，提高农产品品质，对土壤重金属污染的修复、保障农产品安全以及改善工矿区生态环境有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种能有效促进植物生长、减少植物对镉的富集、增强植物耐逆性苍白杆菌，其特征在于，经鉴定为苍白杆菌属(Ochrobacterium sp.)，编号MGJ11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月16日，保藏编号为CGMCC No. 11385。

2.含有权利要求1所述苍白杆菌的菌剂。

3.权利要求1所述的苍白杆菌在固定土壤重金属镉与促进植物生长方面的应用，其特征在于，金属镉在土壤中的浓度为40mg kg^-1。

4.利用权利要求1所述的苍白杆菌固定土壤重金属镉的方法，其特征在于，将所述苍白杆菌施入植物根际，或利用所述苍白杆菌菌粉拌种后进行种植，使接种的微生物浓度不小于10⁹菌细胞/植株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌粉拌种包括以下步骤：取当年采集的成熟、饱满的植物种子，将菌粉加水调成菌浆粘附于种子表面。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过菌剂灌根或菌肥穴施的方式将苍白杆菌施入植物根际。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过菌剂灌根的方式将苍白杆菌施入植物根际。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌肥穴施包括以下步骤：将菌肥以底肥穴施施入土壤中，然后播种或移栽幼苗。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述菌剂灌根包括以下步骤：待植物种植萌发后形成幼苗或直接移栽幼苗时，用水将苍白杆菌菌剂稀释，以灌根方式施于植物根系。