CN112007947A - 罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途。能够修复铅污染土壤或水体。能溶解难溶性磷或溶磷，将铅转化为稳定的磷氯铅矿。

Description

罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途。

背景技术

随着经济社会的快速发展，在给人们生活带来极大方便的同时，也对环境带来了很大的污染。近年来，土壤重金属污染愈发严重。根据我国环境环境保护部及国土资源部2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》，约有1/5左右的土壤在不同程度上受到重金属的污染，每年造成的粮食损失达到上千万吨，同时对人类的健康造成严重的危害。近年来，我国多地发生了多起铅中毒事件，特别是一系列儿童血液中铅含量超标事件的集中发生引起了人们的极大关注。土壤中的铅主要通过大气沉降、污水灌溉、施用污泥、农药、化肥等途径进入土壤，最后通过食物链进入人体。铅进入人体后，会破坏神经系统、消化系统、生殖系统，并影响造血功能；儿童处于大脑发育期，神经系统更为敏感，因此铅对儿童的危害更大，影响儿童的智力和体格发育。

目前土壤中铅污染的修复方法主要分为物理方法、化学方法和生物方法。物理修复方法主要包括客土法、换土法和深耕翻土法。化学修复法主要包括土壤固化稳定化、化学淋洗和电动修复等。生物修复主要包括植物修复和微生物修复。物理和化学修复方法修复效率高、速度快，但是工程量大、成本高、易造成二次污染。与它们相比，生物修复成本更低、不易造成二次污染，但是植物修复的修复周期长，不利于达到快速修复的目的。而微生物生长快速、修复周期短、对环境扰动小、对环境干扰小，在土壤和水体重金属修复领域具有更好的发展前景。所以，筛选出对重金属耐性强，且对重金属稳定效果好的菌株至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途。

为实现上述目的，罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和/或具有重金属耐性的用途。

进一步，所述重金属为铅。

进一步，所述重金属污染环境是指重金属污染土壤或重金属污染水体。

进一步，所述用途是指溶解难溶性磷或溶磷的用途。

进一步，所述用途是指将不溶性或难溶性的磷溶解的用途。

进一步，所述不溶性或者难溶性的磷是指磷酸三钙，羟基磷灰石，磷酸铁中的至少一种。

进一步，所述用途是指将铅转化为稳定的磷氯铅矿的用途。

进一步，所述重金属耐性是指罗氏假单胞菌能在600mg/L的Pb²⁺溶液中生长。

为了克服现有重金属污染修复技术存在的工程量大、成本高、易造成二次污染和修复周期长等问题，本发明提供了罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和重金属耐性的用途。所述菌株可以在简单的操作条件下，不产生二次污染并快速的将环境中移动性强的铅(Pb²⁺)转化为稳定的磷氯铅矿(Pb₅(PO₄)₃Cl，Ksp＝1×10^-84)，从而达到修复铅污染的目的，具有广阔的应用前景。

罗氏假单胞菌具有较高的重金属耐性，可以在600mg/L的Pb²⁺溶液中生长；该菌株具备可以高效的将难溶性的磷溶解，9天内，最高可溶解703mg/L的P；将该菌株接种到含有难溶性磷和含铅环境中，可以将难溶性磷溶解，并将生物有效性高的铅(Pb²⁺)转化为非常稳定的磷氯铅矿(Pb₅(PO₄)₃Cl，Ksp＝1×10^-84)，从而达到铅污染修复的目的。

罗氏假单胞菌对重金属铅具有耐性，可以溶解难溶性磷，并固定铅的功能。将其应用于铅污染修复过程中，具有易培养，成本低廉，修复周期短，修复效果好且不产生二次污染的优点，在重金属铅污染修复领域具有较大的应用潜力。

“溶磷”和“溶解难溶性磷”是指在罗氏假单胞菌的作用下，将不溶性或者难溶性的磷，例如磷酸三钙，羟基磷灰石，磷酸铁等溶解，从而将其中的H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-等可溶性的磷酸根释放出来。在本发明中，仅以羟基磷灰石为例，表明罗氏假单胞菌的溶磷能力。

本发明提供了上述罗氏假单胞菌在修复铅污染环境中的应用。具体的，将上述罗氏假单胞菌加入到铅污染环境中，以达到铅污染修复的目的。修复过程中，可根据铅污染环境中铅的含量，选择向铅污染环境中添加或不添加磷源，如羟基磷灰石。优选的，添加羟基磷灰石更有利铅污染环境的修复，其中所述的铅污染环境包括土壤或水体。

本发明对于罗氏假单胞菌和羟基磷灰石加入铅污染环境的方式不做限制，只要加入罗氏假单胞菌和羟基磷灰石到铅污染环境中，就可以发挥作用，并将移动性强的铅(Pb²⁺)转化为非常稳定的磷氯铅矿(Pb₅(PO₄)₃Cl)，从而达到修复铅污染环境的目的即可。

发明对加入所述罗氏假单胞菌，以及羟基磷灰石的含量不做限制，可以根据铅污染环境中铅的含量高低来决定，例如，在铅污染环境中铅含量比较高的情况下，可以提高罗氏假单胞菌以及羟基磷灰石的加入量；而在铅污染环境中铅含量比较低的情况下，可以减少所述罗氏假单胞菌以及羟基磷灰石的加入量。

本发明提供的罗氏假单胞菌经过培养可以获得大量的罗氏假单胞菌的活菌体。本发明对培养方法没有特殊的限制，只要经过培养，可以使所述罗氏假单胞菌大量增殖即可。例如，可以从平板上挑取单菌落或从液体培养液中移取少量体积的菌液，接种于培养基中，并在好氧条件下，在25-30℃的温度下培养24-48小时后，即可得到培养液。其中，所述的培养基并不做限制，例如本领域常规的培养基，例如牛肉膏-蛋白胨培养基(3g牛肉浸膏，10g蛋白胨，5g NaCl，溶解在1L超纯水中，pH调为7.0-7.2)或LB培养基(5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g NaCl，溶解在1L超纯水中，pH调为6.8-7.0)。优选为牛肉膏-蛋白胨培养基。预配置固体培养基，则向培养液中加入15g/L的琼脂粉即可。

附图说明

图1为菌株HP-7的16S rDNA序列Neighbor-Joining系统发育树图。

图2为罗氏假单胞菌在NBRIP固体培养基中的溶磷效果图。

图3为罗氏假单胞菌和自然状态下(无菌对照)在液体培养基中对难溶性磷的溶解能力结果图。

图4为罗氏假单胞菌及自然状态下(无菌对照)培养液pH值的变化结果图。

图5为罗氏假单胞菌在重金属铅胁迫下的溶磷能力结果图。

图6为罗氏假单胞菌将Pb²⁺矿化为Pb₅(PO₄)₃Cl的X射线衍射(XRD)图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明所用培养基的配方如下：

牛肉膏-蛋白胨培养基：3g牛肉浸膏，10g蛋白胨，5g NaCl，溶解在1L超纯水中，pH调为7.0-7.2；

LB培养基：5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g NaCl，溶解在1L超纯水中，pH调为6.8-7.0；

NBRIP培养基：10g葡萄糖，5g Ca₅(PO₄)₃(OH)，5g MgCl₂·6H₂O，0.25g MgSO₄·7H₂O，0.2g KCl，0.1g(NH₄)₂SO₄，稀释到1L，pH调节到7.0。

以上如预配置固体培养基，则向培养液中加入15g/L的琼脂粉即可。

以下实施例所用的菌株：罗氏假单胞菌Pseudomonas rhodesiae，可购买于ATCC700311^TM。

罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae HP-7)则按照如下方法筛选：

原材料：湖南株洲某冶炼厂含铅土壤。在罗氏假单胞菌(HP-7)的分离过程中，使用的是液体富集，平板划线分离的方法。

液相富集，平板划线分离具体操作为：称取10g湖南株洲某冶炼厂含铅土壤加入到装有100ml无菌水的锥形瓶中。将锥形瓶放置在25-30℃，140rpm的摇床中震荡1h。随后在超净台中，无菌条件下从含有土壤悬液的锥形瓶中移取10ml上部土壤悬液，加入100ml含有100mg/L Pb²⁺的牛肉膏-蛋白胨液体培养基中，此培养液在25-30℃，140rpm的摇床培养5天后，移取1ml菌液转移到含有100mg/L Pb²⁺的新鲜培养液(牛肉膏-蛋白胨液体培养基)中，再培养5天。如此转接3次后，开始平板划线分离。平板上的菌落生长3天后，使用接种环挑取单菌落到20mM的磷酸盐缓冲液中，使用磷酸盐将菌液梯度稀释10^-5～10^-3后，使用接种环在含有50，100，150，200mg/L Pb²⁺的牛肉膏-蛋白胨固体培养基上划线，在25-30℃下培养2-3天后，使用接种环挑取单菌落，梯度稀释后，继续平板划线，如此5-6次，得到纯菌。将得到的纯菌保存在-80℃冰箱。

将从牛肉膏-蛋白胨固体培养基上分离出的耐铅纯菌活化后，通过16S rDNA测序进行菌种鉴定，获得的序列在NCBI上进行比对，使用MEGA软件计算序列的相似性，并使用邻位相连算法(Neighbor-Joining)构建系统发育树(见图1)，发现与罗氏假单胞菌的同源性最高，将此菌株命名为罗氏假单胞菌(HP-7)。对HP-7菌进行生理生化鉴定的项目包括：明胶、氧化酶、精氨酸双水解酶、硫化氢、双氧水、硝酸盐还原实验等(表1)。

表1菌株HP-7的生理生化指标表

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

取活化后的罗氏假单胞菌(HP-7)菌液10ul以点接的方式接种在NBRIP固体培养基上，在25-30℃下培养3-4天，观察菌落形貌和透明的溶磷圈。结果如图2所示。从图2中可以看出，在NBRIP固体培养基上生长的HP-7的菌落颜色为浅灰色，菌落中间平整且光滑，菌落边缘向上凸起。菌落周围出现明显的透明状光环，为溶解圈。菌落直径为3mm，透明的溶磷圈直径为13mm。这表明HP-7具有溶磷能力。

实施例1罗氏假单胞菌对难溶性磷的溶解能力试验

菌株：罗氏假单胞菌Pseudomonas rhodesiae可购买于ATCC 700311^TM。

将罗氏假单胞菌从-80℃冰箱中取出活化，接种在牛肉膏-蛋白胨液体培养基中，在25-30℃，140rpm的摇床中培养24小时后，以1％的接种量接入新鲜的牛肉膏-蛋白胨液体培养基中，在相同培养条件下培养24小时后，在无菌条件下将培养液离心，倒去上清，使用0.9％的NaCl洗涤菌体3次，重悬在0.9％的NaCl溶液中，得到罗氏假单胞菌菌液，保存在4℃中待用。使用0.9％NaCl洗涤的目的是洗去牛肉膏-蛋白胨培养基中的复杂成分，从而减少对后续溶磷实验结果的干扰。在实际铅污染修复过程中，则不需要这个洗涤步骤。

本实例用来说明罗氏假单胞菌对难溶性磷的溶解能力。

将上述得到的罗氏假单胞菌菌液以1％的接种量接种在NBRIP液体培养基(含有难溶性Ca₅(PO₄)₃(OH))。在第0，1，3，5，7，9天分别取10ml悬液，使用离心机以6000rpm/min的速度离心10min后，上清使用0.2μm滤膜过滤后，使用电感耦合等离子体光谱仪(ICP-OES)测定溶解态P的含量。

设置对比例：按照上述方法，测定自然状态下难溶性磷的溶解能力，不同点：不加入任何菌剂。结果如图3所示。从图3中可以看出，接种罗氏假单胞菌的实验组中，溶解性P的含量在第9天达到703.5mg/L。自然状态(无菌对照)下，也就是不加入任何菌剂的条件下，并没有P溶解出来。表明罗氏假单胞菌具有溶磷能力。

试验验证，HP-7具有同样的溶磷能力。

实施例2接种罗氏假单胞菌后NBRIP液体培养基的pH变化

本实例用来说明接种罗氏假单胞菌后，NBRIP液体培养基的pH值的变化。

将上述得到的罗氏假单胞菌菌液以1％的接种量接种在NBRIP液体培养基，在第0，1，3，5，9天，分别取10ml悬液，使用pH计测定各自的pH值。

设置对比例：按照上述方法，测定自然状态下，也就是不加入任何菌剂的条件下，NBRIP液体培养基的pH值的变化。不同点：不加入任何菌剂。

结果如图4所示。从图4中可以看出，接种罗氏假单胞菌菌液后，培养液的pH立刻从6.3降低至4.2以下，并始终保持在4.3以下。对比例中在自然状态下(无菌对照)，培养液的pH基本不变。

试验验证，HP-7具有同样的使pH降低的作用。

实施例3罗氏假单胞菌在Pb²⁺胁迫下对难溶性磷的溶解能力试验

本实施例用来说明罗氏假单胞菌在Pb²⁺胁迫下对难溶性磷的溶解能力。

将上述得到的罗氏假单胞菌菌液以1％的接种量接种在分别含有0，100，200，300，400,600mg/L Pb²⁺的NBRIP液体培养基。在第0，1，3，5，9天分别取10ml悬液，使用离心机以6000rpm/min的速度离心10min后，上清使用电感耦合等离子体光谱仪(ICP-OES)测定溶解态P的含量。

结果如图5所示。从图5中可以看出，随着Pb²⁺浓度的增加，溶解性P的含量有所降低，这是因为溶解的P用于Pb²⁺固定而被消耗。即使在600mg/L Pb²⁺胁迫下，罗氏假单胞菌仍然可以在第9天溶解约500mg/L的P。这表明本发明提供的罗氏假单胞菌不仅具有重金属铅的抗性，还具有很强的溶磷能力。

实施例4

本实施例用来说明罗氏假单胞菌在修复铅污染前后，铅的转化过程。

将上述得到的罗氏假单胞菌菌液以1％的接种量接种在NBRIP液体培养基，并向培养液中分别添加0mg/L和100mg/L Pb²⁺，在第0天和第9天分别取10ml悬液，6000rpm/min离心10min后，倒去上清，沉淀冷冻干燥后，使用X射线衍射分析仪(XRD)表征铅污染修复后铅的存在形态。

结果如图6所示。从图6中可以看出，在第9天，接种本发明罗氏假单胞菌并加入100mg/L Pb²⁺的实验组，Pb²⁺已将被固定为Pb₅(PO₄)₃Cl，这表明本发明的罗氏假单胞菌具有固定铅的能力。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.罗氏假单胞菌具有修复重金属污染环境和/或具有重金属耐性的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重金属为铅。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重金属污染环境是指重金属污染土壤或重金属污染水体。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途是指溶解难溶性磷或溶磷的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途是指将不溶性或难溶性的磷溶解的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述不溶性或者难溶性的磷是指磷酸三钙，羟基磷灰石，磷酸铁中的至少一种。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述用途是指将铅转化为稳定的磷氯铅矿的用途。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述重金属耐性是指罗氏假单胞菌能在600mg/L的Pb²⁺溶液中生长。

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