CN105312310A

CN105312310A - 一种生物修复重金属污染土壤的方法

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Publication number: CN105312310A
Application number: CN201510058158.9A
Authority: CN
Inventors: 余秀梅; 陈强; 李杨昕; 李艳梅; 崔永亮; 辜运富
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN105312310B

Abstract

本发明涉及一种生物修复重金属污染土壤的方法。所述方法包括以下步骤：将水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中，再以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株将根瘤菌菌悬液喷洒到水黄皮幼苗根系周围土壤中，填土、并清水浇灌，即可。本发明所述重金属污染土壤优选为矿区土壤，将水黄皮种在矿区土壤中，可以捕获耐贫瘠和重金属耐受性较强的土著根瘤菌，并将优质根瘤菌接种种植在矿区土壤中的水黄皮根系，通过水黄皮与根瘤菌共生结瘤固氮提高水黄皮耐逆性、增加土壤氮积累，并利用水黄皮富集、转移重金属，改善矿区生态环境。

Description

一种生物修复重金属污染土壤的方法

方法领域

本发明涉及土壤修复方法，具体涉及一种联合生物修复废矿区、尾矿库、矿山等矿区重金属污染土壤的方法。

背景方法

矿产资源是国民经济的重要支柱，但过度开采会造成矿区土壤的严重破坏。据报道，全国采矿业形成的矿山、排土场、尾矿库等造成了达400万hm²的土地受到破坏，仍以每年4万hm²左右的速度增加。尽管近来年我国矿山治理取得了较大进展，废弃地复垦系数已达12％，但与发达国家100％复垦率相比，仍有很大差距。我国的矿山废弃地复垦任重道远。

攀枝花位于四川省西南部，是中国重要的钒钛钢铁基地。攀枝花地区矿产资源丰富，已发现76种矿产，潜在储量300亿吨以上，其中钒钛磁铁矿储量为96.6亿吨，钛储量为世界之最，占世界钛总量的35.2％。经过数十年的开采，攀枝花形成的废矿区面积达2724.93hm²，土地质量下降和土壤承载能力大大降低，土壤酸化、重金属污染、有机质和氮、磷含量较低以及持水能力差，土壤生态系统受到严重破坏。为此，攀枝花市市政府积极采取措施治理工矿废弃地，自2010开始对废弃矿地采取退建复耕或还林还草，取得了一定的成效，2012年6月成为国土资源部工矿废弃地复垦利用试点城市。但总体看，攀枝花废弃矿区环境污染和生态破坏的局面尚未得到根本改观。

土壤是矿产资源开发过程中直接污染物的受纳体而积累有不同浓度的重金属，矿区土壤不同程度地受到污染，因此攀枝花废矿区修复的关键点是降低土壤重金属含量。重金属具有难降解、可生物富集等特点，因而重金属污染土壤多以植物修复为主。植物修复方法以忍耐和超量积累污染物为基础，具有成本低、无二次污染、金属元素可回收利用性、处理简易性优点，还可促进生态重建，广泛应用于废矿区的土地复垦与生态环境修复。但由于攀枝花废矿区土壤贫瘠、气候特殊，采用植物修复还有许多问题需要解决，如植物生长困难、重金属含量过高严重影响植被的生长，矿区生物修复体系不稳定且效果不明显等。因此，选择适合在攀枝花生长、抗逆性强且具有较强生物修复功能和较高利用价值的植物是建立高效稳定生物修复方法的关键要素。

近年来，植物修复方法对攀枝花废矿区土壤修复的相关研究已有报道，但只集中于研究植物对某些重金属的吸附作用，或者调查研究废矿区生长植物对重金属的富集作用，实际应用于攀枝花钒钛磁铁矿废矿区污染修复的植物还较少。豆科植物具有重金属耐受性，并能提供氮源，如：鹰嘴豆和豇豆对含铅土壤的耐受性，豇豆和大豆能吸收铅、铜镍、孟等重金属，因而成为废矿区植物修复的最佳候选者。目前，尚无将豆科植物水黄皮和固氮微生物应用于矿区重金属土壤修复的报道。

发明内容

本发明以修复重金属污染土壤为目的，将水黄皮种在矿区土壤中，以捕获耐贫瘠和重金属耐受性较强的土著根瘤菌，并将根瘤菌接种种植在矿区土壤中的水黄皮根系，通过水黄皮与根瘤菌共生结瘤固氮提高水黄皮耐逆性、增加土壤氮积累，并利用水黄皮富集、转移重金属，改善矿区生态环境。

本发明所述重金属污染土壤可为矿区、尾矿库、矿山等地区的重金属污染土壤，优选为钒钛磁铁矿区的重金属污染土壤。

本发明提供的方法包括以下步骤：将水黄皮栽种于重金属污染土上，以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株将根瘤菌菌悬液喷洒到水黄皮幼苗根系周围土壤中，即可。

本发明所述水黄皮(Pongamiapinnata)是能源豆科水黄皮属的半红树林植物，树冠伞形，高8-15米，根系发达，具有耐盐碱、耐旱、抗强风的特性，能在酸性、沙质、石质、重粘性土壤以及水生环境等贫瘠环境生长。近年的研究表明，水黄皮具有较强的重金属耐受能力，种植数月后，土壤中重金属含量可以得到有效降低。同时，水黄皮种子、尤其是种子产油量高，油脂组成比例好且含有较高比例的不饱和脂肪酸，是最佳生物燃油原材料。因此，可充分利用水黄皮的耐贫瘠和耐重金属特性，将其应用于重金属污染土壤的修复，可改善生态环境，并充分利用污染地区土地资源储备生物燃油原材料。

本发明选用根瘤菌与水黄皮共同作用。由于废矿中的土著固氮微生物能在高浓度的重金属离子环境中生长，且根瘤菌与豆科植物共生结瘤固氮可以增加豆科植物的抗逆性和土壤氮积累，因此豆科植物与根瘤菌共生体系具备独特的联合生物修复优势。耐逆性和耐贫瘠性超强的水黄皮能与慢生和快生根瘤菌属的根瘤菌共生结瘤固氮，既能促进氮循环和积累，向水黄皮提供氮素营养而增加抗逆性，提高水黄皮对土壤重金属的吸附能力，还能提高土壤有机质含量和氮积累，从而解决废矿区土壤氮素和有机质含量低的问题。

本发明所述根瘤菌优选为根瘤菌PZHK1，分离筛选于四川省攀枝花钒钛磁铁废矿土壤，该菌株已于2014年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCCNo.9911；该菌种的分类命名为：慢生根瘤菌Bradyrhizobiumsp.。

本发明所述的自然土壤的含义为：没有被重金属污染的土壤。

本发明所述水黄皮的栽种为将水黄皮种子直接播种于覆盖在矿区土壤之上的未被重金属污染的自然土壤中，或将水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中。

当将水黄皮种子播种于覆盖在矿区土壤之上的自然土壤中时，所述方法包括以下步骤：取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距1.5～2.5米播种于位于重金属污染土壤之上的、厚度为20-30厘米的自然土壤中，播种深度为距土壤表面1～2cm；待水黄皮芽长出土面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，不断补充水分，即可。

当将水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中时，所述幼苗可由育种法或扦插法获得。

所述育种法包括以下步骤：取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距4～6cm播种于厚度不得小于10cm的泥沙土壤基质中，点播完后覆盖一层厚度0.5～1.5cm的细沙，浇透水并遮阳，温度保持在25-35℃，保持土壤基质湿润；待水黄皮芽长出土壤表面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，培养2个月以上，即得水黄皮幼苗。

上述接种根瘤菌后水黄皮幼苗的培养过程中，培养条件优选为：白天17小时，平均温度25℃；夜晚7小时，平均温度17℃；湿度为90％,遮阳并适时补充水分。

所述扦插法包括以下步骤：选用直径为5～15厘米的粗壮纸条作为插穗，每段插穗带有至少3个叶芽；将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，在温度20～30℃、空气相对湿度75～85％的条件下培养，每天对插穗喷水雾3～5次，遮荫；至幼苗长到8～12厘米长，即得水黄皮幼苗。

当扦插时间为早春时，选用去年生的老枝进行扦插；当扦插时间为春末秋初时，选用当年生的嫩枝进行扦插。

上述插穗后培养的过程中，培养条件优选为：温度20℃～30℃，空气相对湿度为75％～85％，每天对插穗喷水雾3～5次，适当遮荫。为了让水黄皮幼苗能够较快适应贫瘠且金属含量高的矿区土壤以及恶劣的环境并顺利成活，针对不同土壤环境，所述移栽的方法有所区别。

针对未用自然土闭库的矿区土壤或其他裸露废矿的矿区土壤，所述移栽具体为：在重金属污染土壤上以株距1.5～2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有15～25％有机肥的自然土壤，将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用重金属污染土壤将坑填满，并清水浇灌，即可。

针对已用自然土闭库的矿区土壤，所述移栽具体为：在覆盖于重金属污染土壤之上的自然土壤中，以株距为1.5～2.5米挖坑，坑的深度以自然土壤的底层为界，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有15～25％有机肥的自然土壤，将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，并清水浇灌，即可。

为了避免强烈的日光照射移栽幼苗从而影响树苗存活率，可在植株上方设置遮阳网等遮阳，直到移栽水黄皮幼苗长出新芽后移除遮阳网。

水黄皮幼苗移栽后，在多雨季节不用人工浇水，到旱季的时候可以根据干旱情况补充水分，如果水黄皮已经成活且根系生长发达，则不必人工补充水分。

水黄皮幼苗移栽至重金属土壤中时，所述有机肥应用不烧根的常用有机肥，优选为草炭。

本发明在水黄皮栽种到重金属土壤中后，根据水黄皮的实际生长情况和当地气候、环境等因素补充水分和营养，使水黄皮能够健康生长即可。所述营养为使水黄皮植物健康生长的常规营养物质。

水黄皮在营养贫乏并含有多种金属的钒钛磁铁尾矿土壤上生长良好，树苗成活率达90％以上，有大量绿色新叶和新芽长出，且接种根瘤菌的水黄皮植株根部接有大量的红色根瘤。本发明水黄皮对矿土中的微量金属元素Cd和Pb有很强的富集能力，对矿土中的大量金属元素Ti、Fe以及小量金属元素Ni、Cr、Cu有一定的富集能力，但对矿土中的大量金属元素V有屏蔽作用；而根瘤菌PZHK1能够有效地提高水黄皮对金属元素的富集能力。

本发明建立了一种稳定、高效、应用前景好且有应用价值的生物修复矿区重金属污染土壤的方法，即水黄皮-根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.PZHK1)联合生物修复方法，主要应用于修复矿区、尾矿库、矿山等矿区重金属污染土壤，尤其可利用于生物修复攀枝花大面积的钒钛磁铁矿区土壤，并改善矿区日益恶化的生态环境。同时，本发明引入能源植物水黄皮，将其种植在废矿区、尾矿库、矿山等矿区重金属污染土壤上，减少了土地资源的浪费，为全球面临的能源短缺问题储备可利用的生物质能源原材料。

附图说明

图1，为实验例1所得在室内种植的水黄皮，种植所用土壤中含有重金属；其中，a为接种根瘤菌，b为不接种根瘤菌。

图2，为实验例2所得种植在钒钛磁铁尾矿土上的水黄皮；其中，a，未种植水黄皮的钒钛磁铁尾矿库；b，种植在钒钛磁铁尾矿土壤上的水黄皮；c，种植在钒钛磁铁尾矿土壤上且根系接种根瘤菌(PZHK1)的水黄皮；d，接种根瘤菌(PZHK1)的水黄皮根系与根瘤。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明各实施例以我国攀枝花地区的钒钛磁铁尾矿土壤作为待修复土壤。

实施例1

按照以下步骤修复已用自然土闭库的尾矿土壤：

取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距1.5～2.5米播种于位于重金属污染土壤之上的、厚度为20-30厘米的自然土壤中，播种深度为距土壤表面1～2cm；待水黄皮芽长出土面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例2

按照以下步骤修复已用自然土闭库的尾矿土壤：

(1)取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距4～6cm播种于厚度不小于10cm的泥沙土壤基质中，点播完后覆盖一层厚度0.5～1.5cm的细沙，浇透水并遮阳，温度保持在25-35℃，保持土壤基质湿润；待水黄皮芽长出土壤表面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，培养2个月，即得水黄皮幼苗；

(2)在覆盖于重金属污染土壤之上的自然土壤中，以株距为1.5～2.5米挖坑，坑的深度以自然土壤的底层为界，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有15～25％有机肥的自然土壤，将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，并清水浇灌，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例3

按照以下步骤修复已用自然土闭库的尾矿土壤：

(1)在秋初选用直径为5～15厘米的当年生嫩枝作为插穗，每段插穗带有至少3个叶芽；将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，在温度20～30℃、空气相对湿度75～85％的条件下培养，每天对插穗喷水雾3～5次，遮荫；至幼苗长到8～12厘米长，即得水黄皮幼苗；

(2)在尾矿库表面用于闭库的自然土壤上面以株距1.5～2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例4

按照以下步骤修复未用自然土闭库的尾矿土壤或裸露废矿土壤：

(2)在重金属污染土壤上以株距2米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有20％有机肥的自然土壤，将步骤(1)所得水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，并不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例5

(1)在早春进行选用直径为5～15厘米的去年生老枝作为插穗，每段插穗带有至少3个叶芽；将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，在温度20～30℃、空气相对湿度75～85％的条件下培养，每天对插穗喷水雾3～5次，遮荫；至幼苗长到8～12厘米长，即得水黄皮幼苗；

(2)在重金属污染土壤上以株距2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有20％有机肥的自然土壤，将步骤(1)所得水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例6

(2)在覆盖于重金属污染土壤之上自然土壤上面以株距1.5～2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/4左右的有机肥，然后覆盖5厘米左右的自然土后，将水黄皮幼苗的根系埋植于坑中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实施例7

在未用自然土壤闭库的尾矿土壤或裸露废矿土壤上面，以间距1.5～2.5米倒置自然土壤，厚度为10cm左右，直径不低于10cm，取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，播种于倒置的自然土壤中，播种深度为距土壤表面1～2cm；待水黄皮芽长出土面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，不断补充水分，并根据水黄皮的生长情况适当补充营养，使水黄皮健康生长，即可。

实验例1：重金属污染土壤修复及室内测试效果

以我国攀枝花地区的钒钛磁铁尾矿土壤作为待修复土壤。

水黄皮-根瘤菌(PZHK1)联合生物钒钛磁铁尾矿土壤的室内测试主要以我国攀枝花地区含有多种金属元素的钒钛磁铁尾矿土壤作为土壤基质进行温室盆栽实验，将水黄皮栽种于重金属污染土上，以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株将根瘤菌菌悬液喷洒到水黄皮幼苗根系周围土壤中，并以不接根瘤菌(PZHK1)作为阴性对照，整个培养过程中补充不含氮的营养液(KH₂PO₄0.2gL^-1,KCl0.5gL^-1,CaSO₄·2H₂O0.2gL^-1,CaCO₃2gL^-1,MgSO₄·7H₂O0.2g,Fe·EDTA,H₃BO₃1mgL^-1,ZnSO₄·7H₂O1mgL^-1,CuSO₄·5H₂O0.5mgL^-1,MnCl₂·4H₂O0.5mgL^-1,Na₂MoO₄·2H₂O0.1mgL^-1)，每个处理三个重复(即种植三株)。温室培养条件为白天16小时(25℃)，夜晚8小时(17℃)，湿度为90％。6个月后，收集水黄皮植株，测定不同处理水黄皮的营养元素含量和金属元素含量，并通过分析水黄皮对重金属的富集系数和转移系数来评估其修复重金属的能力。

表1：钒钛磁铁废矿土壤及水黄皮营养元素含量

结果表明(表1)，根瘤菌(PZHK1)与水黄皮在营养贫瘠且含有多种重金属的钒钛磁铁尾矿土壤中，能够共生结瘤，平均每株结瘤24个，并能够有效的固氮，水黄皮氮含量为22.6gkg^-1，其与施含氮营养液(CKN+)的水黄皮植株氮含量相当(22.52gkg^-1)，而高于加施不含氮营养液(CKN-)的水黄皮植株(40％)；根系接种根瘤菌(PZHK1)的水黄皮植株钾含量(7.53gkg^-1)与施含氮营养液的水黄皮钾含量(7.53gkg^-1)相当，而明显高于施不含氮营养液(CKN-)的水黄皮植株的钾含量(40％)；而施不含氮营养液(CKN-)的水黄皮植株的磷含量却都高于根系接种根瘤菌(PZHK1)水黄皮植株和施含氮营养液(CKN+)的水黄皮植株，但根系接种根瘤菌(PZHK1)水黄皮植株的磷含量仍然高于施含氮营养液(CKN+)的水黄皮植株(43％)。因此，接种根瘤菌(PZHK1)不仅能够与水黄皮共生结瘤固氮，还能够促进水黄皮对营养元素磷和钾的吸收，增加水黄皮生物量。

表2：钒钛磁铁废矿土壤和水黄皮重金属含量

表3：水黄皮对钒钛磁铁废矿土壤重金属的修复系数

在6个月室内盆栽实验中，水黄皮能够存活于含多种金属的钒钛磁铁尾矿土壤上，其对矿土中不同金属的修复能力各不相同(表2，表3)。水黄皮对矿土中含量较多的金属V有很好的屏蔽作用，除了根系接种根瘤菌PZHK1的水黄皮根系中含有少量的V(32.4mgkg-1)以外，其他处理的根和地上部分的茎叶几乎都不含有V，这说明水黄皮能够有效的阻止根系吸收金属V；而水黄皮富集了矿土中的大量金属元素Ti和Fe，根系接种根瘤菌(PZHK1)的水黄皮富集的Ti和Fe的量明显高于不接菌的对照CKN-和CKN+。虽然水黄皮根中Ti和Fe的含量并不低，但由于矿土中Ti和Fe的含量很高导致水黄皮对Ti和Fe的富集系数较小(0.9～7％)，其转移系数各不相同(4～16％)。攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤处理含有大量的V、Ti、Fe金属元素外，还含有少量的Ni、Cr、Cu和微量的Cd、Pb等金属元素。种植在此矿土上的水黄皮对微量金属元素Cd、Pb有较强的富集能力，其中根系接种根瘤菌PZHK1的水黄皮对Cd和Pb的富集量高达7789mgkg-1和2023.6mgkg-1，富集系数分别1497885％和29382％，明显高于不接根瘤菌PZHK1的对照(CKN+、CKN-)水黄皮。接种根瘤菌PZHK1的水黄皮对Cd的富集能力分别是不接菌的CKN+和CKN-水黄皮富集能力的384倍和10倍，而对Pb的富集能力分别是不接菌的CKN+和CKN-水黄皮富集能力的2.7倍和1.5倍；Cd和Pb在不同处理中水黄皮的转移系数各不相同，除不接菌的CKN-水黄皮对Pb的转移系数(79％)略高外，其余处理的转移系数差异不大(17-37％)，且接种根瘤菌PZHK1的水黄皮对Cd和Pb转移系数稍低于不接菌的CKN+和CKN-的转移系数。水黄皮对尾矿土中的少量金属元素Ni、Cr和Cu有一定的富集能力，其富集系数各不相同(9-64％)，且根系接种根瘤菌PZHK1水黄皮的富集系数高于对照处理CKN+和CKN-；除了CKN+的水黄皮对Cr的转移系数稍高(55％)，其余处理的水黄皮对Ni、Cr和Cu的转移系数都都为30％左右(18-37％)，而接种根瘤菌PZHK1的水黄皮对Ni、Cr和Cu的转移系数都低于对照处理CKN+和CKN-。

上述结果如图1所示。根据以钒钛磁铁尾矿土壤为机制的水黄皮盆栽实验结果分析，水黄皮对矿土中的微量金属元素Cd和Pb有很强的富集能力，对矿土中的大量金属元素Ti、Fe以及小量金属元素Ni、Cr、Cu有一定的富集能力，但对矿土中的大量金属元素V有屏蔽作用；而根瘤菌PZHK1能够有效地提高水黄皮对金属元素的富集能力，却降低了水黄皮对富集金属的转移能力。同时，水黄皮在营养贫乏并含有多种金属的钒钛磁铁尾矿土壤上生长良好，这说明水黄皮具有很强的耐逆性；而根瘤菌PZHK1能够与水黄皮共生结瘤固氮，增加植物氮含量，促进水黄皮对营养元素磷和钾的吸收，提高植物生物量，增强植物的抗逆性和对多种金属的富集能力。因此，水黄皮与根瘤菌PZHK1能够有效地联合生物修复重金属污染严重的钒钛磁铁尾矿土壤等，可以应用于生物修复重金属污染土壤、废矿土、尾矿土壤等。

实验例2：重金属污染土壤修复及室外测试效果

以我国攀枝花地区的钒钛磁铁尾矿土壤作为待修复土壤。

水黄皮种子油脂含量很高而容易被氧化导致水黄皮种子的生命期非常短，而且水黄皮种子的成熟期(10月)已经是攀枝花的干旱初期，尾矿土壤重金属含量高容易毒害种子，这都使得直接播种采集的新鲜种子很难成活。因此，水黄皮应用于攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤修复，需要采用冬春旱季连续浇水管理保种法或温室育苗保种方法，以使水黄皮能够在攀枝花的雨季移栽成功。

冬春旱季连续浇水管理保种法，即将水黄皮种子播种于覆盖在矿区土壤之上的自然土壤中；包括以下步骤：10月份采集成熟、饱满的当年水黄皮种子，直接将种子播种于已经闭库的尾矿库表面覆盖的自然土(厚度为20-30cm)中，或者直接将水黄皮种子播种在裸露矿土上挖坑(20-30cm)并填埋的自然土中；种子浅播深度为距离土表1-2cm，待种子长出土面2-3cm，在其根际周围以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接上根瘤菌PZHK1，并在整个冬春干旱季节加强管理，尤其要不断补充水分，以帮助水黄皮幼苗度过攀枝花的干旱季节。此方法是待水黄皮根系扎根入废矿土中，即开始修复工作，所以不用移栽，因此播种坑距为1.5～2.5米。

水黄皮温室育苗方法，即将培育所得水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中；包括以下步骤：10月份，采集并选择成熟、饱满的当年水黄皮种子播种于装有湿润蛭石或泥沙土壤的花盆中，室温(25℃)培养待种子长出土面2-3cm，在其根际周围以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接上根瘤菌PZHK1，培养至次年的6月份，在这个过程中不断补充水。温室培养条件为白天17小时(25℃)，夜晚7小时(17℃)，湿度为90％。

在攀枝花雨季初(6月份)，将温室内培育的水黄皮幼苗移栽到攀枝花尾矿库，即：为了让水黄皮幼苗能够较快适应贫瘠且金属含量高尾矿库土壤以及恶劣的环境并顺利成活，在尾矿库上以株距为2米挖坑(深：20-30厘米，直径：20-30厘米)，先往坑中放置10斤作用的自然土(自然土中混有20％的有机肥)；喷洒根瘤菌(PZHK1)菌悬液水黄皮根系，喷洒浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株，然后将水黄皮树苗根系埋置于自然土中，并用尾矿土壤覆盖后用清水浇灌；室外测试以喷洒不含根瘤菌(PZHK1)的培养液作为阴性对照，每个处理设置10个重复(10株水黄皮幼苗)。同时，为了避免攀枝花6月份强烈的日光照射移栽树苗，用竹条或树枝将遮阳网撑起以遮挡攀枝花夏日强烈的阳光照射，直到移栽水黄皮树苗长出新芽才移除遮阳网。由于攀枝花雨季多雨，6-11月份期间不用浇水，到旱季的时候可以根据干旱情况不定时补充水分，如果水黄皮已经成活且根系生长发达，就不必或适当在旱季补充水分。

水黄皮在攀枝花钒钛磁铁尾矿土壤上种植四个月后，观察其生长良好，树苗成活率90％，且有大量绿色新叶和新芽长出；同时，明显看出喷洒根瘤菌(PZHK1)菌悬液的水黄皮植株长势好于阴性对照，且接种根瘤菌的水黄皮植株根部接有大量的红色根瘤。

上述结果如图2所示；结果表明：水黄皮与根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.PZHK1)是一种高效、稳定且应用前景很好的一种生物修复方法，可应用于废矿区、尾矿库、矿山等重金属污染土壤，并改善矿区生态环境；该方法还能够利用矿区废弃的土地资源储备生物能源，为解决全球面临的能源短缺问题提供可利用生物能源原材料，并提高了矿区废弃土地的复垦率。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域方法人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种生物修复重金属污染土壤的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将水黄皮栽种于重金属污染土上，以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株将根瘤菌菌悬液喷洒到水黄皮幼苗根系周围土壤中，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重金属污染土壤为矿区土壤；优选为钒钛磁铁矿区的土壤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根瘤菌为根瘤菌PZHK1。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述栽种为将水黄皮种子播种于覆盖在矿区土壤之上的自然土壤中；所述方法包括以下步骤：

取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距1.5～2.5米播种于位于重金属污染土壤之上的、厚度为20-30厘米的自然土壤中，播种深度为距土壤表面1～2cm；待水黄皮芽长出土面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，不断补充水分，并补充营养，即可；

或，在未用自然土壤闭库的尾矿土壤或裸露废矿土壤上面，以间距1.5～2.5米倒置自然土壤，厚度不低于10cm，直径不低于10cm，取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，播种于倒置的自然土壤中，播种深度为距土壤表面1～2cm；待水黄皮芽长出土面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，不断补充水分，并补充营养，即可。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述栽种为将水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中；所述方法包括以下步骤：

将由育种法或扦插法获得的水黄皮幼苗移栽到重金属污染土中，再以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株将根瘤菌菌悬液喷洒到水黄皮幼苗根系周围土壤中，填土、并清水浇灌，即可。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，水黄皮幼苗由育种法获得，所述育种法包括以下步骤：

取当年采集的成熟、饱满的水黄皮种子，去外壳后，以间距4～6cm播种于厚度不小于10cm的泥沙土壤基质中，点播完后覆盖一层厚度0.5～1.5cm的细沙，浇透水并遮阳，温度保持在25-35℃，保持土壤基质湿润；待水黄皮芽长出土壤表面2～3cm后，在水黄皮根周围以10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，培养2个月以上，即得水黄皮幼苗。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，水黄皮幼苗由扦插法获得；所述扦插在早春进行，包括以下步骤：

选用直径为5～15厘米的去年生老枝作为插穗，每段插穗带有至少3个叶芽；将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，在温度20～30℃、空气相对湿度75～85％的条件下培养，每天对插穗喷水雾3～5次，遮荫；至幼苗长到8～12厘米长，即得水黄皮幼苗。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，水黄皮幼苗由扦插法获得；所述扦插在春末或秋初进行，包括以下步骤：

选用直径为5～15厘米的当年生嫩枝作为插穗，每段插穗带有至少3个叶芽；将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，将插穗插在泥碳土、营养土或河沙上，在温度20～30℃、空气相对湿度75～85％的条件下培养，每天对插穗喷水雾3～5次，遮荫；至幼苗长到8～12厘米长，即得水黄皮幼苗。

9.根据权利要求5～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述重金属污染土壤为未用自然土壤闭库的尾矿土壤或裸露废矿土壤；所述方法包括以下步骤：

在重金属污染土壤上以株距1.5～2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有15～25％有机肥的自然土壤，将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用重金属污染土壤将坑填满，不断补充水分，并补充营养，即可。

10.根据权利要求5～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述重金属污染土壤为已用自然土壤闭库的尾矿土壤或废矿土壤；所述方法包括以下步骤：

在覆盖于重金属污染土壤之上的自然土壤中，以株距为1.5～2.5米挖坑，坑的深度以自然土壤的底层为界，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/2～3/4的混有15～25％有机肥的自然土壤，将水黄皮幼苗的根系埋植于自然土壤中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，不断补充水分，并补充营养，即可；

或，在覆盖于重金属污染土壤之上自然土壤上面以株距1.5～2.5米挖坑，坑的深度为20-30厘米，直径为20-30厘米；放入占坑体积1/4左右的有机肥，然后覆盖5厘米左右的自然土后，将水黄皮幼苗的根系埋植于坑中，并在根系周围土壤中以浓度为10⁸～10⁹个菌细胞/株接种根瘤菌，再用自然土壤将坑填满，不断补充水分，并补充营养，即可。