CN103103230B

CN103103230B - 一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法

Info

Publication number: CN103103230B
Application number: CN201310061837.2A
Authority: CN
Inventors: 陈琳; 洪枫
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: CN103103230A

Abstract

本发明涉及一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，包括：（1）将甘蔗渣风干粉碎，再用酸浸泡，甘蔗渣与酸的固液比为1:5～1:20，然后在100℃～240℃下反应50～90min，反应结束后抽滤，收集水解液；（2）水解液的脱毒；（3）取上述经过脱毒的水解液作为培养基碳源，补加0.1～2%的氮源，121℃灭菌15～20min后作为培养基；以5%～10%的接种量接入醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌，在25～30℃、160～250rpm振荡培养或25～30℃下静置培养6-25天，得到细菌纤维素。本发明制备的培养基碳源质量好，价格低，适合于工业化生产。

Description

一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法

技术领域

本发明属于细菌纤维素的制备领域，特别涉及一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法。

背景技术

细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）又称为微生物纤维素（Microbial Cellulose），是一种有着广阔应用前景的生物材料，与自然界中其它高等植物纤维素相比，它具有许多独特的性质，包括高纯度、高结晶度、高聚合度、高持水性，高抗张强度，强生物适应性等。因此，该纤维素材料在人工皮肤和血管、医用敷料、粘合剂、音响设备振动膜、造纸、纺织、复合膜等领域具有巨大的应用前景。然而细菌纤维素培养基成本高，纤维素产量和产率低等问题却是其工业化生产和推广应用的瓶颈。

细菌纤维素的生产依靠微生物发酵，最初人们生产细菌纤维素的常规发酵原料是废弃的椰子水，但椰子水来源有限，无法满足生产需要。后来人们开发了各种培养基以培养微生物制备细菌纤维素。这些培养基组成中包含碳源、氮源和无机盐，碳源是培养基的主要组成部分，用量较大，氮源的用量相对较少。葡萄糖、甘露醇等是细菌纤维素制备中常用的碳源，均是商品化试剂，应用这些商品化碳源使得细菌纤维素的成本较高。因此开发来源广泛、价格低廉的碳源对降低细菌纤维素生产成本起重要作用。

甘蔗在我国南方是主要的能源作物，榨糖后剩余的大量甘蔗渣一直未得到有效利用。甘蔗渣富含纤维素和半纤维素等多聚糖，是一种可再生资源，如果能将其中的多糖转化为可溶性糖，以其为碳源制备细菌纤维素，不仅为细菌纤维素的生产提供新途径，而且可以提高甘蔗的经济利用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，该方法制备的培养基碳源质量好，价格低，适合于工业生产。

本发明的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，包括：

（1）将甘蔗渣风干粉碎，再用酸浸泡，甘蔗渣与酸的固液比为1:5～1:20，然后在100℃～240℃下反应50～90min，反应结束后抽滤，收集水解液；

（2）水解液的脱毒：

方法1：离子交换树脂在pH10、室温或者50℃条件下反应30-60min，离心或过滤除去树脂，调水解液pH至4～6；

方法2：或者离子交换树脂在pH5.5、室温或者50℃条件下反应30-60min，离心或过滤除去树脂，调水解液pH至4～6；

方法3：或者用碱调水解液pH值至4～6，加入活性炭反应5min～60min，离心或过滤除去沉淀；方法4：或者用碱调水解液pH值至4.5～5.0，离心或过滤除去沉淀，加入20%的酶活为5U/mL的过氧化物酶，并每隔1小时加入50mM双氧水于30℃水浴下反应12～24小时，然后加入过氧化氢酶除去双氧水，调水解液pH值至4～6；

方法5：或者用碱调水解液pH值至9～11，于20～60℃水浴下反应12～24小时，离心或过滤除去沉淀，调水解液pH值至4～6；

方法6：或者用碱调水解液pH值至9～11，于20～60℃水浴下反应12～24小时，调水解液pH值至4～6，然后加入活性炭反应5min～60min，离心或过滤除去沉淀；

（3）取上述经过脱毒的水解液作为培养基碳源，补加0.1～2%的氮源，121℃灭菌15～20min后作为培养基；以5%～10%的接种量接入醋酸杆菌（美国标准生物样品保藏中心ATCC提供：Acetobacter aceti subsp.xylinus（Gluconacetobacter xylinus）ATCC23770、Acetobacter acetisubsp.xylinus（Gluconacetobacter xylinus）ATCC53263、Gluconacetobacter xylinus ATCC53264、Gluconacetobacter xylinus ATCC53524、Gluconacetobacter xylinus ATCC53582、Gluconacetobacter xylinus ATCC53749、Gluconacetobacter xylinus ATCC53750、Gluconacetobacter xylinus ATCC700178、Gluconacetobacter hansenii ATCC10821、Gluconacetobacter hansenii ATCC23769）或葡萄糖氧化杆菌（Gluconobacter oxydans ATCC11894），在25～30℃、160～250rpm振荡培养或25～30℃下静置培养6-25天，得到细菌纤维素。

所述步骤（1）中的酸为硫酸或盐酸，浓度为0.5wt%～8wt%。

所述步骤（1）甘蔗渣与酸在100～150℃条件下反应50～90min进行预处理后，抽滤收集滤液与前述的完全酸水解液混合备用，滤渣中按每克干渣加入0.05～50FPU（滤纸酶活）的纤维素酶和0.05～50U的木聚糖酶，在50℃、pH4.0-6.0、90rpm条件下振荡水解6-48h，反应结束后抽滤，收集水解液。

所述步骤（2）中的离子交换树脂为阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。

所述步骤（2）中的碱为NaOH、Ca(OH)₂或氨水。

所述步骤（2）中的活性炭的加入量为1%-6%。

所述步骤（3）中的氮源为酵母浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、铵盐中的一种或几种。

所述步骤（3）中按10-100g/L的还原糖量（以葡萄糖计）将水解液配制成发酵培养基，氮源为酵母浸膏和胰蛋白胨，浓度分别为0.1-1%和0.1-0.5%，pH值为5.0。

甘蔗渣在水解过程中，由于反应条件剧烈，会生成许多对发酵微生物有毒性作用的抑制物，水解液中的抑制剂主要有：糠醛、羟甲基糖醛、乙酸、酚类化合物、丁香酸、羟基苯甲酸、香草醛及其它有毒化合物。所以在使用上述水解液进行微生物发酵过程中，需要对水解液脱毒，以减少这些有毒化合物对微生物发酵培养的影响。

其中方法6，Ca(OH)₂结合活性炭的方法制备细菌纤维素的效果最好，获得的细菌纤维素产量最高，可达15.4g/L。其次是方法3（14.8g/L）、方法1（13g/L）、方法2（12g/L）、方法4（11.2g/L）。方法5（8.3g/L）的脱毒效果相比于其他5种方法最弱。

经酸水解及脱毒处理后，所得水解液的糖浓度调整后，补加酵母浸膏和胰蛋白胨等氮源配制成培养基，以10%的接种量接入醋酸杆菌，30℃静止培养11天，所得细菌纤维素的产量为8-15g/L，比同样条件下以蔗糖、葡萄糖为碳源的分别提高35%和50%。

有益效果

（1）本发明简单，成本低廉，原料来源广泛，适合于工业化生产；

（2）本发明利用甘蔗渣这一价廉的原料，进行稀酸水解和脱毒，生产出一种可以用于培养细菌制备纤维素的培养基碳源，为工业化大规模生产细菌纤维素这一新兴生物材料提供新的思路和途径；甘蔗渣价格低廉，且易水解，因此生产细菌纤维素的培养基碳源的制备及其脱毒方法有着很高的实际应用价值，优势明显；经测试，本发明所生产的培养基碳源也可以用于其它工业微生物的培养，是一种价廉质优的碳源；

（3）甘蔗渣是一种可再生资源，用于发酵制备细菌纤维不仅提高了其经济利用价值，而且为细菌纤维素的工业化生产提供了新原料；

（4）脱毒时采用了离子交换树脂，可以高效除去水解液中微生物抑制物，工业化生产时可以装柱成反应器，操作简便，且可以再生重复使用，环保高效；

（5）脱毒时采用了过氧化物酶，可以专一高效除去水解液中酚类抑制物，以后可以固定在膜、颗粒等载体上，制备成膜生物反应器或装柱，处理量大，操作简便，且可以多次重复使用，环保高效。

附图说明

图1为不同脱毒方法制备的甘蔗渣水解液碳源生产的细菌纤维素的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（3%，w/v）在反应器中以1:6的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度180℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，4℃冰箱冷藏备用。

加入NaOH将水解清液pH值调到10左右，用滤纸过滤掉沉淀得到处理后水解液，再微调pH值到10.0。然后用膜封口，置于30℃水浴中反应12-24过夜，最后用稀酸将水解液pH值调到5.0。然后加入2%（质量百分比）活性炭，搅拌（室温条件下5-10min）后用滤纸过滤掉活性炭，得到脱毒水解清液，再用稀硫酸微调pH值到5.0-5.5。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素14.5g/L。

实施例2

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀盐酸（1%，w/v）在反应器中以1:10的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度240℃反应75分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，4℃冰箱冷藏备用。

加入Ca(OH)₂将水解清液pH值调到10左右，用滤纸过滤掉沉淀得到处理后水解液，再微调pH值到10.0。然后用膜封口，置于40℃水浴中反应12-24过夜，最后用稀酸将水解液pH值调到5.0。然后加入2%（质量百分比）活性炭，搅拌（室温条件下5-10min）后用滤纸过滤掉活性炭，得到脱毒水解清液，再用稀硫酸微调pH值到5.5。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素15.4g/L。

实施例3

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（2%，w/v）在反应器中以1:15的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度200℃反应80分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，4℃冰箱冷藏备用。

先用清水清洗阴离子交换树脂AG1-X8数次，滤去洗涤水备用。然后按3-10w/v%的添加量在水解液中加入离子交换树脂至pH值为10。在室温或者50℃条件下，90rpm振荡反应30-60min。过滤或离心除掉树脂后得到处理后水解液，再微调pH值到4-6。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素13g/L。

实施例4

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（3%，w/v）在反应器中以1:15的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度210℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，6℃冰箱冷藏备用。

先用清水清洗阴离子交换树脂AG1-X8数次，滤去洗涤水备用。然后按3-10w/v%的添加量在水解液中加入离子交换树脂至pH值为5.5。在室温或者50℃条件下，90rpm振荡反应30-60min。过滤或离心除掉树脂后得到处理后水解液，再微调pH值到4-6。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素12.3g/L。

实施例5

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（2%，w/v）在反应器中以1:15的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度160℃反应100分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，4℃冰箱冷藏备用。

先用清水清洗阳离子交换树脂AG50W-X8数次，滤去洗涤水备用。然后按3-10w/v%的添加量在水解液中加入离子交换树脂至pH值为10。在室温或者50oC条件下，90rpm振荡反应30-60min。过滤或离心除掉树脂后得到处理后水解液，再微调pH值到4-6。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素12g/L。

实施例6

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（2%，w/v）在反应器中以1:15的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度190℃反应80分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，4℃冰箱冷藏备用。

先用清水清洗阳离子交换树脂AG50W-X8数次，滤去洗涤水备用。然后按3-10w/v%的添加量在水解液中加入离子交换树脂至pH值为5.5。在室温或者50oC条件下，90rpm振荡反应30-60min。过滤或离心除掉树脂后得到处理后水解液，再微调pH值到4-6。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素11.6g/L。

实施例7

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（3%，w/v）在反应器中以1:30的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度220℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，6℃冰箱冷藏备用。

加入10M NaOH或25%氨水将水解清液pH值调到5.0，加入20w/v%酶活为5U/mL的辣根过氧化物酶，于30℃水浴下反应12～24小时，期间每隔1小时加入50mM双氧水，反应结束后加入过氧化氢酶除去双氧水，调水解液pH值至4～6。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素11.2g/L。

实施例8

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（6%，w/v）在反应器中以1:30的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度180℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，6℃冰箱冷藏备用。

加入10M NaOH或25%氨水将水解清液pH值调到4～6，加入活性炭反应5min～60min，反应结束后离心或过滤除去沉淀，调水解液pH值至5.0。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素14.8g/L。

实施例9

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（3%，w/v）在反应器中以1:30的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度180℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，6℃冰箱冷藏备用。

加入Ca(OH)₂将水解清液pH值调到11，于20～60℃水浴下反应12～24小时，反应结束后离心或过滤除去沉淀，调水解液pH值至5.0。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素8.3g/L。

实施例10

甘蔗渣先用植物粉碎机磨碎，再用稀硫酸（3%，w/v）在反应器中以1:30的甘蔗渣与稀酸液的固/液比浸泡过夜（12-24h），然后在温度130℃反应60分钟，接着将甘蔗渣残渣和酸液抽滤分开，收集水解液，6℃冰箱冷藏备用。

甘蔗渣进行酸预处理后，收集滤渣，以每克干渣0.05～50FPU（滤纸酶活）和0.05～50U的酶量加入纤维素酶和木聚糖酶，在50℃、pH4.0-6.0，90rpm条件下振荡水解6-48h，反应结束后抽滤，收集水解液；

水解液与前面的预处理水解液混合后，加入NaOH将水解清液pH值调到10-11，用滤纸过滤掉沉淀得到处理后水解液，再微调pH值到11。然后用膜封口，置于30℃水浴中反应12-24过夜，最后用稀酸将水解液pH值调到5.0。然后加入2%（质量百分比）活性炭，搅拌（室温条件下5-10min）后用滤纸过滤掉活性炭，得到脱毒水解清液，再用稀硫酸微调pH值到5.0。脱毒后的水解液经测糖，作为培养基碳源，再在其中0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨配成甘蔗渣水解液培养基用于微生物的培养。最后获得细菌纤维素15.1g/L。

实施例11

使用上述各种方法对甘蔗渣水解液脱毒，并调节水解液糖浓度为25g/L，同时分别配制同样浓度的葡萄糖、蔗糖，再在其中补加0.1%-1%的酵母浸膏和0.1%-0.5%胰蛋白胨分别配成50mL甘蔗渣水解液培养基、葡萄糖培养基、甘露醇培养基、蔗糖培养基。将醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌以6－10％的接种量接入甘蔗渣水解液培养基在30℃培养箱内静止培养8-15天，可得到较理想的细菌纤维素产品或较丰厚的细菌纤维素膜，实验结果见图1。

由图1可见，在细菌纤维素产量上，使用Ca(OH)₂结合活性炭的脱毒方法（方法6）的效果最好，获得的细菌纤维素产量最高，可达15.4g/L。其次是方法3（14.8g/L）、方法1（13g/L）、方法2（12g/L）、方法4（11.2g/L）。方法5（8.3g/L）的脱毒效果相比于其他5种方法最弱。

所以在同等条件下，使用脱毒甘蔗渣水解液配制的培养基生产的细菌纤维素产量略高于以蔗糖或葡萄糖为碳源的培养基，由于原料甘蔗渣来源广泛，价格低廉，因此该生产细菌纤维素的培养基碳源的制备及其脱毒方法有着很高的实际应用价值，优势明显。

Claims

1.一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，包括：

(1)将甘蔗渣风干粉碎，再用0.5～10w/v％酸浸泡，甘蔗渣与酸的固液比为1:5～1:20，然后在100℃～240℃下反应50～90min进行预处理后，抽滤，滤渣中按每克干渣加入0.05～50FPU的纤维素酶和0.05～50U的木聚糖酶，在50℃、pH4.0-6.0、90rpm条件下振荡水解6-48h，反应结束后抽滤，收集水解液；

(2)水解液的脱毒：

离子交换树脂在pH10、室温或者50℃条件下反应30-60min，离心或过滤除去树脂，调水解液pH至4～6；

或者离子交换树脂在pH5.5、室温或者50℃条件下反应30-60min，离心或过滤除去树脂，调水解液pH至4～6；

或者用碱调水解液pH值至4～6，加入活性炭反应5min～60min，离心或过滤除去沉淀；

或者用碱调水解液pH值至4.5～5.0，离心或过滤除去沉淀，加入20％的酶活为5U/mL的过氧化物酶，并每隔1小时加入50mM双氧水于30℃水浴下反应12～24小时，然后加入过氧化氢酶除去双氧水，调水解液pH值至4～6；

或者用碱调水解液pH值至9～11，于20～60℃水浴下反应12～24小时，离心或过滤除去沉淀，调水解液pH值至4～6；

或者用碱调水解液pH值至9～11，于20～60℃水浴下反应12～24小时，调水解液pH值至4～6，然后加入活性炭反应5min～60min，离心或过滤除去沉淀；其中，离子交换树脂为阴离子交换树脂AG 1-X8或阳离子交换树脂AG 50W-X8；

(3)取上述经过脱毒的水解液作为培养基碳源，补加0.1～2％的氮源，121℃灭菌15～20min后作为培养基；以5％～10％的接种量接入醋酸杆菌或葡萄糖氧化杆菌，在25～30℃、160～250rpm振荡培养或25～30℃下静置培养6-25天，得到细菌纤维素。

2.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酸为硫酸或盐酸。

3.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中甘蔗渣与酸在100℃～150℃条件下反应。

4.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的碱为NaOH、Ca(OH)₂或氨水。

5.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的活性炭的加入量为1％-6％。

6.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的氮源为酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、铵盐中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述蛋白胨为胰蛋白胨。

8.根据权利要求1所述的一种利用甘蔗渣制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中按10-100g/L的还原糖量将水解液配制成发酵培养基，氮源为酵母浸膏和胰蛋白胨，浓度分别为0.1-1％和0.1-0.5％，pH值为5.0。