CN105802879B - 类芽孢杆菌d7及其在降解纤维素中的应用 - Google Patents

类芽孢杆菌d7及其在降解纤维素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌D7及其在降解纤维素中的应用，本发明菌株经发酵培养后可以降解羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)、废次烟叶水提残渣的纤维素以及烟叶烟梗等纤维素材料，同时该菌产生的纤维素酶具有耐60℃高温、催化底物pH4‑8范围较广的特性，该菌在生长过程中对5g/L‑10g/L的尼古丁具有耐受性；与物理化学法、机械法降解纤维素相比该菌的降解条件更加温和；与真菌相比细菌的繁殖能力较强、易于培养、可逐步放大，后期有望实现工业化应用；产纤维素酶的细菌种类有解淀粉芽孢杆菌，热杆梭菌，类芽孢杆菌等。

Description

类芽孢杆菌D7及其在降解纤维素中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种纤维素的降解，特别涉及一种纤维素降解的新菌株-类芽孢杆菌D7(Paenibacillus sp.D7)及其在降解纤维素中的应用。
(二)背景技术
纤维素是地球上最广，含量最丰富的可再生的碳源物质，可以被纤维素酶降解成为葡萄糖，再进一步转化为食品、饮料或乙醇等，可以缓解粮食危机或能源危机。但是纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，不溶于水及一般有机溶剂。目前，纤维素的降解主要有以下几种方法：第一种酸碱降解，使用浓硫酸或碱液降解，但酸碱的回收成为一大难题，造成酸碱的浪费；第二种机械降解，机械降解不够彻底，只能够将结晶纤维素降解为大分子物质，不能够彻底变为小分子多糖；第三种热降解，纤维素在120℃左右不稳定，300℃以上发生剧烈降解，该方法需要消耗大量的能源，一般实验室或工厂难以达到；第四种光化学降解，纤维素在日光照射下发生光降解，一种是与氧无关的光解作用，一种是在光敏物质氧和水蒸气存在下的光解作用，此过程的降解周期较长；第五种也是目前常用的降解方法即酶解和微生物降解。无论是酶解，还是微生物降解都依赖于微生物能够产生纤维素酶。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度。由于细菌所产生的纤维素酶一般最适pH为中性至偏碱性，在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，使得细菌纤维素酶显示出良好的应用前景。
本发明以废次烟叶水提液作为原料，以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，采用刚果红纤维素鉴别培养基进行初筛，再利用添加有羧甲基纤维素钠的液体发酵培养基进行复筛，从中筛选一株纤维素降解菌Paenibacillus sp.D7，经研究其具有降解纤维素的能力，目前在国内外对类芽孢杆菌产纤维素酶研究还较少。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株具有降解纤维素能力的菌株--类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.D7)，及其在降解纤维素方面的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种新菌株--类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2016076，保藏日期：2016年02月28日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述类芽孢杆菌D7在降解纤维素中的应用。
进一步，所述纤维素为烟叶、烟梗、烟草废弃物水提后固液分离的固体或液体浓缩后的残渣；所述烟草废弃物水提方法是将烟草碎片、烟末或烟梗加水，在55℃～65℃浸提20min～80min，固液分离，获得固体和液体，液体经浓缩至无液体流出后进行水洗、干燥，获得浓缩后的残渣；；所述水的体积用量以烟草碎片、烟末或烟梗总质量计为6～10ml/g。
进一步，具体所述应用为：将类芽孢杆菌D7经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液为酶源，以纤维素为底物，在pH4～9、30℃-60℃(优选pH6～7、37℃)下进行降解反应，反应完全，实现纤维素的降解；所述粗酶液酶活为0.06-1.0U/ml(粗酶液比酶活为0.56-2U/mg)。
进一步，所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将类芽孢杆菌D7接种至斜面培养基，在37℃培养24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH为7.0；(2)种子培养：将步骤(1)斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，溶剂为水，pH为7.0；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在37℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，将发酵液在10000r/min、15℃离心5min，取上清液即为酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：羧甲基纤维素钠10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，溶剂为水，pH为7.0。
此外，本发明所述类芽孢杆菌D7在降解纤维素中的应用还可以是将类芽孢杆菌D7接种至含纤维素的培养基中，在37℃、180r/min条件下培养24h，实现对纤维素的降解；所述含纤维素的培养基终浓度组成为：纤维素10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，溶剂为水，pH为7.0，所述纤维素为烟丝、烟梗、烟叶废弃物、烟叶废弃物水提液固液分离后的固体或液体浓缩后的残渣。
本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选得到一株对纤维素有降解能力的新菌株Paenibacillus sp.D7，该菌株经发酵培养后可以降解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、废次烟叶水提残渣的纤维素以及烟叶烟梗等纤维素材料，同时该菌产生的纤维素酶具有耐60℃高温、催化底物pH4-8范围较广的特性，该菌在生长过程中对5g/L-10g/L的尼古丁具有耐受性。与物理化学法、机械法降解纤维素相比该菌的降解条件更加温和；与真菌相比细菌的繁殖能力较强、易于培养、可逐步放大，后期有望实现工业化应用；产纤维素酶的细菌种类有解淀粉芽孢杆菌，热杆梭菌，类芽孢杆菌等。但是细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，大多数对结晶纤维素无降解活性，且所产生的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度，Paenibacillus sp.D7的来源比较特殊，来源于废次烟叶水提液，该菌产生的纤维素酶为胞外酶，易于提取，同时为利用该微生物或酶制剂发酵技术能够促进烟叶、烟草薄片及烟梗内部大分子有机物质(如木质纤维素)的分解与转化，从而改善它们的品质和减少苯并芘、亚硝胺等有害物质的产生提供了可能。
(四)附图说明
图1菌株D7的纤维素刚果红鉴别图；
图2菌株D7扫描电镜图；a.菌株单菌体形态图；b.菌株周生鞭毛形态图；
图3菌株D7革兰氏染色与芽孢染色图；a.菌株革兰氏染色图；b.菌株芽孢染色图；
图4菌株D7的系统进化发育树；
图5葡萄糖标准曲线；
图6菌株D7菌体干重标准曲线；
图7菌株D7生长曲线；
图8菌株D7菌体干重及酶活力随时间的变化情况；
图9菌株D7尼古丁耐受性曲线；
图10不同温度对纤维素酶活力的影响；
图11不同pH对纤维素酶活力的影响；
图12不同温度下纤维素酶的耐受性情况；
图13菌株D7对烟丝的降解图；a.菌株对烟丝边缘降解情况(a1和a3为烟丝边缘降解图，a2为对照组(培养基中不接菌))；b.菌株对烟丝中间部位降解情况(b1为实验组，b2为对照组)。
图14造纸法烟草薄片生产工艺流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：纤维素降解菌的筛选
废烟叶提取液(tobacco waste extract，简称TWE)，国内现有的造纸法烟草薄片生产工艺(见图14所示)，具体制备方法为：将烟草碎片、烟末或烟梗加水，在55℃～65℃浸提20min～80min，水体积用量约为原料质量8倍左右。固液分离后，固体部分(可以直接作为纤维素用于类芽孢杆菌D7的降解)经制浆后制成纸基，而液体部分经浓缩后喷涂或浸润到纸基上，其中液体部分(即为废烟叶提取液)浓缩至无液体流出后，水洗，干燥，获得浓缩物。
取上述废烟叶提取液1ml，加水将废烟叶提取液分别稀释至10-4、10-5、10-6，涂布于富集培养基平板上，在37℃恒温培养箱中培养1-2d。将样品中富集纯化后的菌株接种于刚果红鉴定培养基平板上进行筛选，其中每个菌株做三次重复，在37℃恒温培养箱中培养1-2d，待菌落长出后，在每个平板上用0.5mg/L的刚果红溶液覆盖，静置30min后，倒掉染液并用生理盐水覆盖30min，观察有无透明圈的产生。选取生长良好同时透明圈直径与菌落直径之比值较大的单菌落(见图1所示)，保存于甘油保藏管中。将初筛得到的菌株分别接入装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中。置于37℃恒温摇床培养箱，180r/min培养24h。取发酵液2mL，于离心机10000r/min，15℃，离心5min，得到的上清液即为粗酶液。对各菌株的粗酶液进行酶活测定，挑选酶活力相对较高的菌株作为接下来的研究。
以下为所用培养基配方：
液体富集培养基：酵母膏5g，NaCl 10g，蛋白胨10g，水1000ml，固体培养基加琼脂15g，调pH为7，121℃灭菌30min。
刚果红纤维素筛选培养基：羧甲基纤维素钠10g，硫酸铵2g，七水合硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.5g,琼脂15g，水1000ml，调pH为7.0，121℃灭菌30min。
种子培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，水1000ml，调pH为7.0，121℃灭菌30min。
发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，酵母膏10g，蛋白胨10g，硫酸铵2g，七水合硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，氯化钠0.5g，水1000ml，调pH为7.0，121℃灭菌30min。
以下为酶活测定方法：
取2ml发酵液，于离心机10000r/min，15℃，离心5min，上清液即为粗酶液。取1ml粗酶液，沸水浴灭活10min，用作空白对照。取6支25mL刻度的具塞比色管，3支管作对照组，3支管作实验组。实验组中各加1mL粗酶液，对照组中加入灭活酶液1mL，置于37℃水浴锅中预热2min，在6支试管中分别加入1mL已预热至37℃的用pH为7磷酸盐缓冲液配制的质量浓度为1％CMC-Na溶液。摇匀后37℃水浴30min，反应结束后加入1mL DNS溶液。摇匀后将6支具塞比色管同时放入沸水浴中，准确计时5min，取出，迅速冷却至室温，纯水定容至20mL，540nm下测定吸光值。对照葡萄糖标准曲线(见图5所示)测算酶活力。
按照国际单位规定定义，酶活力单位定义为1mL纤维素酶液1min水解纤维素生成1μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
实施例2：纤维素降解菌的鉴定
在初筛培养基上分别挑取产生透明圈较大的三株菌接入到刚果红纤维素筛选培养基中进行复筛，将酶活最高的菌株命名为D7，因此后续纤维素酶的研究采用D7作为研究对象，D7产生透明圈的大小(见图1所示)菌落形态为圆形，乳白色，表面湿润，菌落直径与透明环径比值为2:7。透射电镜观察结果(见图2所示)，菌株D7呈杆状，有鞭毛。革兰氏染色阴性，产芽孢(见图3所示)。菌株生理生化特性测定结果为：淀粉水解、硝酸盐还原、接触酶实验、纤维素水解呈阳性，而吲哚试验、脲素实验、柠檬酸盐、H2S实验呈阴性。
以细菌16S rDNA通用引物对该菌株DNA进行PCR扩增，获得菌株16S rDNA，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的序列同源性最高，采用MEGA4.1软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16S rDNA序列进行分析比对，构建系统发育树，结果(见图4所示)。根据该菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，并参考《常见细菌鉴定手册》，该菌株与Paenibacillus属特征相符，故将该菌株命名为类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)D7。
实施例3：Paenibacillus sp.D7的生长特性和产酶情况
(1)斜面培养：将类芽孢杆菌D7接种至斜面培养基，在37℃培养24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH为7.0。
(2)种子培养：将步骤(1)斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，溶剂为水，pH为7.0。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在37℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液。取样测定菌体干重，制作菌体生物量标准曲线及菌体生长曲线和菌体生长与产酶的关系。
菌体生物量标准曲线的测定方法：
1)取50ml已培养24h的发酵液，于离心机12000r/min，4℃离心30min，弃上清。用去离子水重悬菌体后再次离心弃上清，于烘箱中45℃烘至恒重，测其干重，以此为依据计算出1ml、2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml菌液中菌体干重。
2)在同一瓶菌液中另取1ml、2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml菌液，用去离子水定容至25ml，在600nm下测定其吸光值。
3)经换算后，以菌体干重为Y轴，OD600为X轴，制作菌体生物量标准曲线。
菌体生长曲线测试方法为:
1)分别测定步骤(3)培养0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h的发酵液3ml在600nm下的吸光值。
2)对照菌体生物量标准曲线换算出菌体干重。
3)以时间为横坐标、菌体干重为纵坐标绘制菌体生长曲线。
菌体生长与产酶的关系测试方法为：
1)分别取出步骤(3)培养12h、24h、48h、60h、72h的发酵液3ml，在600nm下测定其吸光值，对照菌体生物量标准曲线计算出菌体干重。
2)在相同时间点同一瓶菌液中另取1ml菌液，对照酶活测定方法测定酶活。
3)以时间为横坐标，菌体干重与酶活为纵坐标绘制菌体生长与产酶关系的曲线。
Paenibacillus sp.D7菌体生物量标准曲线(见图6所示)，纵坐标表示菌体干重，横坐标表示吸光度OD600。菌体生长曲线(见图7所示)，纵坐标表示菌体干重，横坐标表示时间。由图7可知在10h处和20h处有拐点，推测可能原因是10h以前优先利用酵母粉作为碳源进行生长，待酵母粉消耗完，Paenibacillus sp.D7开始利用CMC-Na作为碳源进行生长，生长速度比前期缓慢。在24h左右菌体干重开始下降，说明细菌在24h左右菌体量达到最大值随后开始衰亡，可能原因由于营养物质的缺乏、代谢产物增多对菌体生长有抑制作用以及菌体浓度过高造成。
菌体生长与产酶的关系(见图8所示)，纵坐标分别表示酶活与菌体干重，横坐标表示时间。从图中可知菌体生长曲线与酶活曲线变化趋势基本相同，在12h到24h之间随着时间的增长菌体干重与酶活不断的增长，在24h到48h之间菌体的生长处于平稳期此时的酶活变化幅度不大，但到了48h以后菌体干重以及纤维素降解酶酶活不断的下降。
菌体尼古丁耐受性测试方法为：
1)在步骤(3)发酵培养基中分别加入0g/L、10g/L、15g/L、20g/L的尼古丁。
2)将种子液以1％的接种量接入到上述培养基当中，在37℃、180r/min条件下。
3)每隔12h测定600nm下的吸光值，判断菌体的生长情况。
4)以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制不同尼古丁浓度下的菌体生长情况。
菌体生长与尼古丁的关系(见图9所示)，可以看出在尼古丁浓度为0g/L的培养基中菌体生长情况较好，在12h后菌体的生长量达到最大，在尼古丁浓度为5g/L的培养基中菌体的生长情况稍弱，在12h后菌体的生长量达到最大值之后，随着时间的增长菌体的数量在逐渐的减少，在尼古丁为10g/L的培养基中，菌体生长较弱几乎不生长，而在尼古丁浓度为15g/L和20g/L的培养基中菌体生长受到抑制，由此可以得出结论D7具有尼古丁耐受性，耐受范围在5g/L到10g/L之间。
实验例4：Paenibacillus sp.D7粗酶降解特性的研究
Paenibacillus sp.D7发酵液的制备同实施例3，取发酵液2mL，于离心机10000r/min，15℃，离心5min，得到的上清液即为粗酶液(酶活为0.06U/ml)。
粗酶液最适催化反应温度实验与实施例1测酶活方法相同，不同点在于水浴分别在37℃，40℃，50℃，60℃，70℃下进行，纵坐标表示纤维素酶活，横坐标表示时间，绘制纤维素酶在不同温度下的酶活曲线(见图10所示)。由图10可以看出随着温度的升高，纤维素酶活不断增加，在温度为60℃时，酶活达到最大值，60℃以后酶活急剧下降，可以得出结论Paenibacillus sp.D7产生的纤维素酶具有耐高温的特性，在60℃是酶的活力达到最高为酶触反应最适温度。
粗酶液的最适催化反应pH实验，在反应底物pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下测定纤维素酶活，以pH为横坐标，纤维素酶活为纵坐标，绘制纤维素酶在不同pH下的酶活曲线(见图11所示)。由图11可以看出pH在4.0到8.0之间纤维素酶活较高，在pH为9.0的条件下酶活显著下降，说明D7产生的纤维素酶最适催化pH范围在酸性至偏弱碱之间，在碱性条件下纤维素酶活显著下降，说明碱性条件下不利于酶催化反应的进行。
纤维素酶温度耐受性实验：将粗酶液分别置于37℃、40℃、50℃、60℃下水浴，间隔一段时间取出测定纤维素酶活，绘制纤维素酶活在不同温度下随时间变化的曲线。以纤维素酶活为纵坐标，时间为横坐标，绘制酶活随时间的变化图(见图12所示)。由图12可以看出纤维素酶在40℃时具有较好的温度耐受性，水浴24h后酶活有所下降，残留酶活为68.6％；40℃，50℃时9h后残留酶活分别为68.5％，75.8％；但在60℃时4h，6h后残留的酶活分别为42.5％，37.9％。结合上述两个温度实验图可以看出60℃酶的催化效果达到最优，但是酶在此温度下容易失活，因此纤维素酶催化反应适合在40℃到50℃之间进行。
实施例5：Paenibacillus sp.D7对废次烟叶提取物的降解情况
取实施例3方法制备的2ml发酵液，于离心机10000r/min，15℃，离心5min，上清液即为粗酶液。取其中1ml粗酶液(酶活为0.06U/ml)，以烟草薄片制造工艺中5ml废次烟叶水提液(参照实施例1)，在室温、8000r/min、10min离心，沉淀用蒸馏水洗涤(重复此操作3次)后的残渣(造纸法烟草薄片制造工艺中浓缩液(见图13所示))为底物，进行酶促反应，以灭活的酶(粗酶液100℃水浴10min)为对照，在37℃水浴30min测定还原糖的生成量，以此来验证酶液对底物残渣的降解情况。实验结果表明有0.28mg还原糖的产生，该酶对提取物残渣具有一定的降解效果。还原糖的产生表明残渣当中的纤维素得到了降解。
实施例6：Paenibacillus sp.D7对烟丝的降解情况
测试方法为：
1)参照实施例3，将发酵培养基中的碳源羧甲基纤维素钠以干重为1g的烟丝代替。
2)将种子液以1％的接种量接入到100ml上述发酵培养基中。
3)以不接菌的培养基为对照，24h后显微镜下定性观察烟丝降解情况。
将发酵培养基中的碳氮源以烟丝代替，10×10倍显微镜下观察D7对烟丝的降解情况(见图13所示)，图12中a1和a3为烟丝边缘降解图，a2为对照组(培养基中不接菌)，由a1和a3可以看出D7对烟丝边缘都有明显的降解。图12中b1和b2为烟丝中间部位的降解图，b1为实验组，b2为对照组，实验组可以看出烟丝的中间部位结构变得疏松脉络较为清晰颜色较浅，对照组的烟丝中间部位结构较为紧密颜色较深。由此可以得出结论D7对烟丝具有一定的降解能力。后续可以应用于制烟工业中烟梗废弃物残渣以及其它纤维素类物质的降解。

Claims (6)

1.类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2016076，保藏日期：2016年02月28日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述类芽孢杆菌D7在降解纤维素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述纤维素为烟草废弃物水提后固液分离的固体或液体浓缩后的残渣。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将类芽孢杆菌D7经发酵培养获得的发酵液离心，取上清液为酶源，以纤维素为底物，在pH4～9、30℃-60℃下进行降解反应，反应完全，实现纤维素的降解；所述纤维素制备方法为：将烟草碎片、烟末或烟梗加水，在55℃～65℃浸提20min～80min，水提液固液分离，获得固体和液体，液体经浓缩至无液体流出后进行水洗、干燥，获得浓缩后的残渣；所述水的体积用量以烟草碎片、烟末或烟梗总质量计为6～10ml/g。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：(1)斜面培养：将类芽孢杆菌D7接种至斜面培养基，在37℃-40℃培养24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，琼脂18-20g/L，溶剂为水，pH为7.0；(2)种子培养：将步骤(1)斜面菌体接种至种子培养基，在37℃-40℃培养24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，溶剂为水，pH为7.0；(3)发酵培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在37℃、180r/min条件下培养24h，获得发酵液，将发酵液在10000r/min、15℃离心5min，取上清液即为酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：羧甲基纤维素钠10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，溶剂为水，pH为7.0。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用是将类芽孢杆菌D7接种至含纤维素的培养基中，在37℃、180r/min条件下培养24h，实现对纤维素的降解；所述含纤维素的培养基终浓度组成为：纤维素10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.5g/L，溶剂为水，pH为7.0，所述纤维素为烟丝、烟梗、烟叶废弃物、烟叶废弃物水提液固液分离后的固体或液体浓缩后的残渣。
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