CN108440639B - 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108440639B
CN108440639B CN201810095020.XA CN201810095020A CN108440639B CN 108440639 B CN108440639 B CN 108440639B CN 201810095020 A CN201810095020 A CN 201810095020A CN 108440639 B CN108440639 B CN 108440639B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycoprotein
camellia oleifera
active
separating
purifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810095020.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108440639A (zh
Inventor
李婷婷
徐云巧
吴彩娥
范龚建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Forestry University
Original Assignee
Nanjing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Forestry University filed Critical Nanjing Forestry University
Priority to CN201810095020.XA priority Critical patent/CN108440639B/zh
Publication of CN108440639A publication Critical patent/CN108440639A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108440639B publication Critical patent/CN108440639B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用，包括油茶粉脱脂除皂素后，经热水提取无水乙醇沉淀，沉淀物冻干后，再依次经过DEAE Sepharose F.F.离子交换柱、Sephadex G‑100凝胶过滤柱、AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G‑75凝胶柱进行分离纯化，得到分子量为25 kDa的油茶活性糖蛋白；然后采用化学法和/或酶法对该糖蛋白进行构效改造。本发明的方法能够高效的实现糖蛋白的制备及其构效改造，改造后油茶糖蛋白的活性功能发生显著变化，有的被赋予了更高的活性，这为糖蛋白构效关系的解析提供了有效的技术途径。

Description

一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel.)为山茶科(Theaceae)山茶属植物，以产出油茶籽油而著称，是我国特有的优良木本油料植物，同时它也是兼具油料、饲料、医药、化工、观赏等功效为一体的多用途植物。传统医学所记载的油茶具有清热解毒，活血散瘀，止痛等功效，现代研究报道表明油茶含有皂素、多糖、黄酮等丰富的活性成分，具有调节免疫力、调节血脂和血糖、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等多种活性功能和药用价值，但目前油茶的开发利用主要途径是作为油料作物提取油脂，其他功能尚未被重视，这种优质的多用途资源的开发利用途径尚显单一。
糖蛋白广泛存在于生物体内，是由肽链和糖链通过共价键结合而形成的大分子。近年来的研究发现，存在于植物中的糖蛋白具有极大的利用价值，除了具有凝聚素、结构蛋白、酶、贮藏蛋白和毒素等方面的作用，众多文献还报道许多植物来源的糖蛋白具有增强免疫、消炎、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血糖、抗辐射等活性功效，目前在临床上早已应用的重组蛋白药物几乎全是糖蛋白，如必思添、乌司他丁以及万古霉素等。从细胞信号传导、蛋白质折叠、受体结合、激素调节、免疫识别到生物半衰期的调控等方面也均能发现糖蛋白的踪迹。尤其是在抗肿瘤方面，由于植物糖蛋白的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物靶向性的集中到病灶，正常组织的生长和免疫系统的功能却不受干扰，从而减少不良反应。
糖蛋白所具有的重要生理功能和应用价值，引发众多学者的积极探索，但糖蛋白研究起步较晚，糖蛋白结构复杂，兼有糖类和蛋白类的结构特点，结构已经研究透彻的糖蛋白数量屈指可数。目前根据糖链的连接位点，有N-连接糖蛋白、O-连接糖蛋白、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI)和C-连接糖蛋白。由于不同糖蛋白肽链和糖链各自的特异性和多样性，以及不同糖蛋白肽链和糖链链接的复杂性，其结构信息丰富多变，目前对糖蛋白的构效改造一直是个难题，尤其在糖蛋白的结构特征、功能活性、作用机理以及构效关系等未知领域有众多问题亟待解决。
发明人前期研究发现油茶中也含有活性糖蛋白，通过系列细胞试验以及动物体内实验均表明该油茶糖蛋白具有良好的抗肿瘤和抗氧化活性，然而对于油茶糖蛋白的结构和功能活性的构效关系尚未阐明，尤其是糖蛋白中糖基化位点与其活性功能的关系，糖链在糖蛋白活性功能中的权重，在细胞或分子水平上的机理研究依旧空白，油茶糖蛋白的精细量化利用还缺乏有效、广泛的数据支持。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对现有技术的空白，提供一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用，本发明提出糖蛋白构效关系研究的新途径，即通过结构改造将糖蛋白上的糖链进行部分或全部切除，促使其原始活性发生升高或降低的变化，从而为糖蛋白的构效解析提供依据。本发明提供了油茶糖蛋白中糖链结构改造的方法和过程，并对结构改造的变化进行验证，同时考察油茶糖蛋白结构改造前后抗氧化活性和抗肿瘤活性的变化，探索出工艺条件更合理、效率更高的油茶糖蛋白构效改造方法。
技术方案：一种构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，制备步骤为：(1)油茶活性糖蛋白的制备：油茶粉碎后经石油醚脱脂，再用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥后备用；将干燥后产物，按液料比为20mL/g在60-95℃条件下加水提取1-3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70％-90％，离心后将沉淀进行冷冻干燥，得干燥物；干燥物溶于 0.01-0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液pH为8且含0.02mol/L NaCl，用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，收集经0.2-0.5mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用Sephadex G-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为 25kDa的油茶活性糖蛋白；(2)油茶活性糖蛋白的构效改造：采用化学法和/或酶法改造，所述化学法是添加三氟甲基磺酸(TFMS)或高碘酸(NaIO4)进行结构改造；所述酶法是添加PNGase F酶、Endo H酶或O-糖苷酶中的任意一种进行结构改造。
使用三氟甲基磺酸时，称取10-100mg的油茶活性糖蛋白样品，加入50-500μLTFMS， -20℃条件下反应0.5-2h，加入150-1500μL甲醇，放入冰水浴中30min，加入5-50mL5％wt. 碳酸氢铵搅拌，蒸馏水透析，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。
使用高碘酸时，称取10-100mg的油茶活性糖蛋白样品加入1-10mL浓度为0.1-0.3mmol/L NaCl溶液，4℃下避光过夜；用0.1mol/L醋酸调节溶液pH至4.5，加入预冷的200mmol/L NaIO4，使得其最终浓度为50-100mmol/L，4℃下反应5h；随后加入总体积1/2量的100mmol/L碳酸氢钠，并用1mol/L NaOH调节pH至9-10.5，4℃下静置反应1h；用1-3mmol/L碳酸氢钠缓冲液进行透析过夜，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。
上述酶法是：称取20-100μg的油茶糖蛋白样品，加入1-5μL糖蛋白变性缓冲液以及9-25μL 蒸馏水，使其在温度为100℃加热反应10min，所述糖蛋白变性缓冲液为0.5wt.％SDS含40 mM DTT，冷冻离心后加入2-10μL 50mM pH6的醋酸钠、2-10μL 10％乙基苯基聚乙二醇 (NP-40)、5-25μL蒸馏水以及1-10μL酶，在37℃下培养0.5-2h，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，即得到结构改造的油茶糖蛋白。
上述制备方法制得的构效改造的油茶活性糖蛋白。
上述构效改造的油茶活性糖蛋白在制备促进原有油茶糖蛋白抗氧化活性产品中的应用。
上述构效改造的油茶活性糖蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
采用SDS-PAGE电泳、高效液相凝胶过滤色谱(HP-GPC)、傅里叶红外光谱等方法考察不同处理对油茶糖蛋白结构改造的变化。
采用ABTS自由基清除能力测定法、DPPH自由基清除能力测定法以及超氧阴离子清除能力测定法，对结构改造前后油茶糖蛋白的抗氧化功能进行了考察；采用MTT法，对结构改造前后油茶糖蛋白的体外抗肿瘤活性进行了考察，评价其构效改造的效果。
有益效果：本发明提出以改变糖蛋白中糖链的方式，改造其结构的方法进行糖蛋白的相关研究。由于不同的结构改造方法会产生复杂的空间构象变化，进而会引起油茶糖蛋白分子生物学功能发生变化，通过对油茶糖蛋白的糖链进行不同的处理，比较糖链改造前后、不同的改造方法的油茶糖蛋白，其对应的抗氧化和抗肿瘤活性功能上所发生的变化，有助于更全面地解析油茶糖蛋白的构效关系。本发明提供高效优化的构效改造方法、作用条件和过程，以制备所得的油茶活性糖蛋白为载体，进行结构的改造，考察不同改造方法处理后其在抗氧化和抗肿瘤活性功能的变化，为糖蛋白的构效解析提供参考。
附图说明
图1油茶糖蛋白经酶法改造后SDS-PAGE电泳图，其中A：考马斯亮蓝染色；B：糖蛋白PAS-Schiff染色。泳道1、2为O-糖苷酶改造；泳道3、6为marker；泳道4、5为Endo H 酶改造；泳道7、8为PNGase F酶改造；
图2不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白的HP-GPC检测图；图中a：油茶活性糖蛋白；b：Endo H；c：O-糖苷酶；d：PNGaseF；e：NaIO4；f：TFMS；
图3不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白的红外光谱图；A：Endo H；B：O-糖苷酶；C：PNGaseF；D：TFMS；E：NaIO4；F：油茶糖蛋白；
图4不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白的体外抗氧化活性 图；A：对ABTS自由基的清除作用；B：对DPPH自由基的清除作用；C：对超氧阴离子的清除作用。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实例来进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
三氟甲基磺酸(TFMS)法改造油茶糖蛋白
油茶粉碎石油醚脱脂后，用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥备用。按液料比为20 mL/g在60℃条件下加水提取3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70％，离心后将沉淀进行冷冻干燥。干燥物溶于0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8，含0.02mol/LNaCl) 用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，以体外抗肿瘤和抗氧化活性的测定结果为依据，收集经0.2mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白。
取10mg油茶活性糖蛋白样品加入50μL TFMS，-20℃反应1h，再加入150μL甲醇冰水浴30min，随后加入5mL5wt.％碳酸氢铵搅拌，蒸馏水透析，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。
实施例2
高碘酸(NaIO4)改造油茶糖蛋白
油茶粉碎石油醚脱脂后，用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥备用。按液料比为20 mL/g在70℃条件下加水提取2.5h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为80％，离心后将沉淀进行冷冻干燥。干燥物溶于0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8，含0.02mol/L NaCl) 用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，以体外抗肿瘤和抗氧化活性的测定结果为依据，收集经0.3mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用Sephadex G-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白。
取100mg油茶活性糖蛋白加入10mL浓度为0.1mmol/L NaCl溶液，4℃下避光过夜。用 0.1mol/L醋酸调节溶液pH至4.5，加入预冷的200mmol/L NaIO4，使得其最终浓度为100mmol/L，4℃下反应5h。随后加入1/2体积的100mmol/L碳酸氢钠，并用1mol/L NaOH调节pH至10.5，4℃下静置反应1h。用3mmol/L碳酸氢钠缓冲液进行透析过夜，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥，完成油茶糖蛋白结构改造过程。
实施例3
PNGase F酶酶法改造油茶糖蛋白
油茶粉碎石油醚脱脂后，用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥备用。按液料比为20 mL/g在80℃条件下加水提取2h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为85％，离心后将沉淀进行冷冻干燥。干燥物溶于0.03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8，含0.02mol/LNaCl) 用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，以体外抗肿瘤和抗氧化活性的测定结果为依据，收集经0.4mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白。
取20μg油茶活性糖蛋白、1μL糖蛋白变性缓冲液(0.5％SDS含40mM DTT)以及9μL蒸馏水，使总反应体积为10μL。使其在温度为100℃加热反应10min，让糖蛋白变性。冷冻离心后，再加入2μL 50mM的醋酸钠(pH＝6)、2μL 10％NP-40、5μL蒸馏水以及1μL PNGase F，使混合溶液体积达到20μL。将上述混合溶液在37℃下培养30min，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，得到结构改造后油茶糖蛋白。
实施例4
Endo H酶法改造油茶糖蛋白
油茶粉碎石油醚脱脂后，用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥备用。按液料比为20 mL/g在90℃条件下加水提取1h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为90％，离心后将沉淀进行冷冻干燥。干燥物溶于0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8，含0.02mol/LNaCl) 用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，以体外抗肿瘤和抗氧化活性的测定结果为依据，收集经0.5mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白。
取50μg油茶活性糖蛋白、3μL糖蛋白变性缓冲液(0.5％SDS含40mM DTT)以及27 μL蒸馏水，使总反应体积为30μL。使其在温度为100℃加热反应10min，让糖蛋白变性。冷冻离心后，再加入18μL 50mM的醋酸钠(pH＝6)、18μL蒸馏水以及6μL Endo H。将上述混合溶液在37℃下培养1h，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，得到结构改造后油茶糖蛋白。
实施例5
O-糖苷酶酶法改造油茶糖蛋白
油茶粉碎石油醚脱脂后，用体积分数为90％的乙醇除去皂素，干燥备用。按液料比为20 mL/g在90℃条件下加水提取1h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为85％，离心后将沉淀进行冷冻干燥。干燥物溶于0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为8，含0.02mol/LNaCl) 用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，以体外抗肿瘤和抗氧化活性的测定结果为依据，收集经0.3mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用SephadexG-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25kDa的油茶活性糖蛋白。
称取50μg的油茶糖蛋白样品，加入5μL糖蛋白变性缓冲液(0.5％SDS含40mM DTT)以及15μL蒸馏水，使其在温度为100℃加热反应10min，冷冻离心后加入5μL 50mM的醋酸钠(pH＝6)、5μL 10％NP-40、15μL蒸馏水以及5μL O-糖苷酶，在37℃下培养2h，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，即得到结构改造的油茶糖蛋白。
实施例6
化学法和酶法协同改造油茶糖蛋白
本发明所用油茶糖蛋白化学法和酶法协同结构改造过程按照如下步骤处理：称取一定量的油茶糖蛋白样品，按照上述化学法改造的步骤处理至透析结束，取一定量的透析液，以体积比10:1加入糖蛋白变性缓冲液(0.5％SDS含40mM DTT)，使其在温度为100℃加热反应 10min，冷冻离心后，以10：1加入O-糖苷酶，上述混合溶液在37℃下培养0.5h，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，即得到结构改造后油茶糖蛋白。
油茶糖蛋白结构改造效果测定
SDS-PAGE电泳分析油茶糖蛋白结构改造效果
电泳条件为12％分离胶，4％浓缩胶。浓缩胶用80V电压跑30min，分离胶用150V电压跑1h。电泳结束后，将两块凝胶分别取下，一块胶进行考马斯亮蓝染色30min，最后脱色至凝胶背景至无色。另一块胶进行糖蛋白的PAS-Schiff染色。后使用凝胶成像分析系统软件进行分析。以酶法构效改造方法为例，油茶活性糖蛋白经不同酶处理前后SDS-PAGE电泳结果见图1。
经SDS-PAGE电泳分析，从图1：A可以看出经三种酶结构改造处理后的油茶糖蛋白(泳道1,2,4,5,7,8)，考马斯亮蓝染色后泳道上均有两个条带出现，第一个条带均为所用的酶，分别为O-糖苷酶147kDa(泳道1、2)，Endo H酶29kDa(泳道4、5)，PNGase F酶36kDa(泳道7、8)，第二个条带为改造后的油茶粕糖蛋白，结果表明其蛋白链保留，但其分子量减小为11kDa。从图1：B可以看出，改造后样品糖染(PAS染色)后，改造后样品的泳道上(泳道 1,2,4,5,7,8)已无任何糖蛋白条带出现，表明油茶糖蛋白的糖链已经全部被去除。酶法对糖蛋白去除糖链的结构改造效果明显。
高效液相凝胶过滤色谱(HP-GPC)分析结构改造效果
分析条件为色谱柱为Ultrahydrogel 100(7.8×300mm)，检测器为Waters-2410型示差折光检测器，进样量为10μL，流动相为纯水，流速为1mL/min。其结果见图2。
从图2：a可以看出油茶糖蛋白经高效液相凝胶过滤色谱(HP-GPC)的色谱峰为单一对称尖峰，表明所制得油茶糖蛋白为分子量相对单一的组分，而经过不同结构改造处理后，其色谱图2：b、c、d、e均为两个独立峰，表明油茶糖蛋白经不同结构改造处理后，其结构上的糖链被切分下来，分离成两个独立组分，分子量也发生相应变化，原有结构改造效果明显。而图2：f则呈现无明显尖峰，这表明油茶活性糖蛋白经TFMS处理后，其糖链部分改变巨大，糖蛋白核心结构遭到破坏。
傅里叶红外光谱分析油茶糖蛋白结构改造效果
1mg不同处理的油茶糖蛋白样品与100mg KBr混匀，研钵中研磨10min，压制成片，采用美国Thermo Electron Corp Nicolet380型傅里叶变换红外光谱仪，在500-4000cm-1区间进行扫描。其结果见图3。
可以看出从图3F中可以看出，油茶活性糖蛋白的红外光谱明显的特征峰主要显示为多糖的特征峰型并伴有蛋白质谱带，3308，2957，1402，1308，1124cm-1为糖基特征峰，1545， 1656cm-1为蛋白质谱带峰型。对比油茶糖蛋白经不同构效改造法处理后的红外光谱图(图3： A、B、C、E)，整体上看，EndoH、O-糖苷酶、PNGaseF、NaIO4这四个方法处理后，红外图谱的总体峰型上变化稳定，在1656cm-1和1545cm-1处仍然保留有中等强度的吸收尖峰，是蛋白质、氨基酸及其盐类中酰胺键和肽键的特征吸收峰，说明该四种方法结构改造处理温和，不破坏油茶糖蛋白分子蛋白部分的核心结构。而在，在3300以及2957cm-1处的吸收峰强度和位置发生了变化，说明这四种方法都能使油茶糖蛋白糖链部分发生变化。从图3：D中可以看出，1600-520cm-1区间的特征吸收带频率、强度和形状有较大的改变，TFMS改造法彻底改变了糖蛋白的核心结构，该结果也与HP-GPC的结构分析结果保持一致。
不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白抗氧化功能的变化
采用对ABTS自由基清除能力测定法、DPPH自由基清除能力测定法以及超氧阴离子清除能力测定法，对不同方法改造油茶糖蛋白前后的抗氧化功能进行了考察，其结果见图4。
从结果可以看出，不同改造方法处理后，油茶活性糖蛋白的抗氧化效果存在明显差异，同一种样品随着其浓度的增加其清除自由基的能力也随之增加。而不同改造方法由于其切断糖链的部位和程度不同，体外抗氧化效果表现为：化学法改造油茶糖蛋白后其抗氧化活性比原有油茶糖蛋白显著下降，酶法改造油茶糖蛋白后，构效改造的酶选择不同，其抗氧化效果变化也不同，其中Endo H酶改造后其抗氧化活性显著升高。这表明不同结构改造处理对油茶糖蛋白的结构有着不同的影响，结构的改变使其功能发生相应的变化，其中TFMS彻底破坏原有糖蛋白的核心结构，功能丧失最为严重。而其他不同改造方法的选择会引发油茶糖蛋白抗氧化活性降低或升高。
不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白体外抗肿瘤活性的变化
采用MTT法，选取人肝癌细胞(HepG2)、人淋巴癌细胞(CCRF-CEM)、人胃癌细胞(MGC-803)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)以及人正常肝细胞(LO2)为受试对象，对不同方法改造油茶糖蛋白前后的体外抗肿瘤功能进行了考察。其结果见表1。
从表1可以看出，不同改造方法处理后，其体外抗肿瘤效果存在明显差异，同一种样品随着其浓度的增加其对癌细胞的抑制能力也随之增加。而不同改造方法由于其切断糖链的部位和程度不同，体外肿瘤效果表现为：化学法和Endo H酶处理改造油茶糖蛋白后其抗肿瘤活性比原有油茶糖蛋白显著下降，而酶法中O-糖苷酶、PNGaseF处理后，其抗肿瘤活性保持稳定，O-糖苷酶处理后的抗肿瘤活性与处理前基本持平。此外，不同处理前后对人正常肝细胞均无不良影响。该结果表明不同改造处理对油茶糖蛋白的结构有着不同的影响，从而引发油茶糖蛋白抗肿瘤活性不同程度的变化，化学法由于破坏了油茶活性糖蛋白的核心结构域从而导致其抗肿瘤活性的下降，酶法相对比较温和，O-糖苷酶、PNGaseF进行糖蛋白结构改造时，未改变抗肿瘤活性的核心结构域，其抗肿瘤活性保持稳定。抗肿瘤活性的变化与抗氧化活性的变化均呈现一定的规律性，化学改造法会导致油茶糖蛋白抗肿瘤和抗氧化活性的显著下降，而酶法改造由于作用位点不同，其在两种活性上呈现不同的变化，这也说明油茶糖蛋白中起抗氧化活性的结构域与起抗肿瘤活性的结构域不同。
表1不同构效改造方法处理前后油茶糖蛋白的体外抗肿瘤活性
Figure BDA0001564770520000091

Claims (3)

1.一种构效改造的油茶活性糖蛋白的制备方法，其特征在于制备步骤为：（1）油茶活性糖蛋白的制备：油茶粉碎后经石油醚脱脂，再用体积分数为90%的乙醇除去皂素，干燥后备用；将干燥后产物，按液料比为20 mL/g在60-95℃条件下加水提取1-3h后过滤，滤液加入无水乙醇使乙醇终体积浓度为70%-90%，离心后将沉淀进行冷冻干燥，得干燥物；干燥物溶于0.01-0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液pH为8且含0.02mol/L NaCl，用DEAE Sepharose F.F.离子交换柱进行分离纯化，收集经0.2-0.5 mol/L NaCl洗脱液的部分，洗脱液透析除盐后，再用Sephadex G-100凝胶过滤柱分离纯化，收集第一个峰，再经AKTA蛋白质分离纯化仪SuperdexTM G-75凝胶柱进行分离纯化，收集第一个峰，冷冻干燥后，即得分子量为25 kDa的油茶活性糖蛋白；（2）油茶活性糖蛋白的构效改造：采用酶法改造，所述酶法是添加PNGase F酶或O-糖苷酶中的任意一种进行结构改造；称取20-100μg的油茶糖蛋白样品，加入1-5μL糖蛋白变性缓冲液以及9-25μL蒸馏水，使其在温度为100℃加热反应10min，所述糖蛋白变性缓冲液为0.5wt.% SDS含40 mM DTT，冷冻离心后加入2-10μL50mM pH6的醋酸钠、2-10μL 10%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、5-25μL蒸馏水以及1-10μL酶，在37℃下培养0.5-2h，经Sephadex G-75凝胶过滤柱去除酶，即得到结构改造的油茶糖蛋白。
2.权利要求1所述制备方法制得的构效改造的油茶活性糖蛋白。
3.权利要求2所述构效改造的油茶活性糖蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
CN201810095020.XA 2018-01-31 2018-01-31 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用 Active CN108440639B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810095020.XA CN108440639B (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810095020.XA CN108440639B (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108440639A CN108440639A (zh) 2018-08-24
CN108440639B true CN108440639B (zh) 2021-09-07

Family

ID=63191420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810095020.XA Active CN108440639B (zh) 2018-01-31 2018-01-31 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108440639B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101535339A (zh) * 2006-09-01 2009-09-16 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 改性糖蛋白
CN102757992A (zh) * 2011-04-25 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法
CN103087212A (zh) * 2013-01-31 2013-05-08 安徽新世界绿洲茶油有限公司 一种从油茶籽粕中提取油茶籽多糖的方法
CN104177484A (zh) * 2014-05-29 2014-12-03 浙江海洋学院 一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用
CN106483294A (zh) * 2015-08-27 2017-03-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种选择性富集和鉴定n-连接糖肽的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101535339A (zh) * 2006-09-01 2009-09-16 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 改性糖蛋白
CN102757992A (zh) * 2011-04-25 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法
CN103087212A (zh) * 2013-01-31 2013-05-08 安徽新世界绿洲茶油有限公司 一种从油茶籽粕中提取油茶籽多糖的方法
CN104177484A (zh) * 2014-05-29 2014-12-03 浙江海洋学院 一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用
CN106483294A (zh) * 2015-08-27 2017-03-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种选择性富集和鉴定n-连接糖肽的方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Novel Approach for Chemically Deglycosylating O-Linked Glycoproteins, The Deglycosylation of Submaxillary and Respiratory Mucins;Thomas A. Gerken等;《Biochemistry》;19921231;第1992卷(第31期);第639-648页 *
Deglycosylation of glycoproteins with trifluoromethanesulphonic acid:elucidation of molecular structure and function;Albert S. B. EDGE;《Biochem. J.》;20031231;第2003卷(第376期);第339-350页 *
Immunochemical Analysis of the H and M Glycoproteins from Histoplasma capsulatum;ROSELY M. ZANCOPE-OLIVEIRA等;《CLINICAL AND DLAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY》;19940930;第1卷(第5期);第563-568页 *
Screening of Antioxidant and Antitumor Activities of Major Ingredients from Defatted Camellia oleifera Seeds;Tingting Li等;《Food Sci. Biotechnol.》;20141231;第23卷(第3期);第873-889页 *
李婷婷.油茶籽糖蛋白的分离纯化及其功能活性研究.《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》.2015,(第3期), *
油茶籽糖蛋白提取工艺优化及抗氧化性;李婷婷等;《农业机械学报》;20120430;第43卷(第4期);第148-155页 *
油茶籽糖蛋白的分离纯化及其功能活性研究;李婷婷;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20150315(第3期);第6页第1.2.2.3节，第24页第2.2.1节，第25页第2.2.4节，第39页第3.1节，第40页第3.2.3-3.2.5节，第45页第3.3.2.1节，第46页第3.3.2.2节，第47页第3.3.3节，第48页第3.3.5节 *
糖蛋白的去糖基化方法研究进展;徐云巧等;《中国生物工程杂志》;20171231;第37卷(第5期);第98页第1.1.1节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108440639A (zh) 2018-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xie et al. Separation of water-soluble polysaccharides from Cyclocarya paliurus by ultrafiltration process
Xia et al. Optimization and identification of antioxidant peptide from underutilized Dunaliella salina protein: Extraction, in vitro gastrointestinal digestion, and fractionation
CN104250285B (zh) 一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途
CN106434803B (zh) 一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用
JP4420470B2 (ja) あわび多糖類抽出方法
CN104926925A (zh) 一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途
Chen et al. Optimization of polysaccharide extraction process from grifola frondosa and its antioxidant and anti-tumor research
CN105861595A (zh) 一种利用瓜尔胶快速制备半乳甘露聚糖的方法
CN103275181B (zh) 一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途
Costa et al. Purification and characterization of a lectin with refolding ability from Genipa americana bark
CN104558115A (zh) 一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途
CN110343190A (zh) 一种同步提取猴头菇多糖和蛋白质的方法
CN102250215A (zh) 一种小麦抗氧化肽及其制备方法
CN115093456A (zh) 一种具有抗氧化活性的杏仁多肽及其提取方法、应用
CN108440639B (zh) 一种构效改造的油茶活性糖蛋白及其制备方法和应用
CN104530191A (zh) 一种抗前列腺癌血蚶蛋白多肽及其制备方法和用途
CN111087447B (zh) 一种鳄鱼抗氧化肽复合物及其制备方法和应用
CN117281885A (zh) 一种富硒山药糖蛋白作为免疫调节药物的应用
CN109369781B (zh) 一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用
Xu et al. Purification and Characterization of a Mannose‐binding Lectin from the Rhizomes of Aspidistra elatior Blume with Antiproliferative Activity
CN116987204A (zh) 一种均一银耳多糖的制备方法
CN113845565B (zh) 一种地龙生物活性小肽及其制备方法和应用
CN114656522B (zh) 一种抗氧化肽及其制备方法和应用
Yang et al. Extraction, purification and partial characterizations of polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis
CN108727474A (zh) 具有消脂护肝功能的毛木耳提取物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant